Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Light-sheet beeldvorming om de hartstructuur in knaagdierharten te onthullen

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66707

⸱

29 maart 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Center for Imaging and Surgical Innovation, The University of Texas at Dallas, 3Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, UT Southwestern Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol maakt gebruik van geavanceerde light-sheet microscopie samen met aangepaste methoden voor het opruimen van weefsel om ingewikkelde hartstructuren in knaagdierharten te onderzoeken, met een groot potentieel voor het begrijpen van cardiale morfogenese en remodellering.

Samenvatting

Light-sheet microscopie (LSM) speelt een cruciale rol bij het begrijpen van de ingewikkelde driedimensionale (3D) structuur van het hart en biedt cruciale inzichten in fundamentele hartfysiologie en pathologische reacties. Hierbij verdiepen we ons in de ontwikkeling en implementatie van de LSM-techniek om de micro-architectuur van het hart in muismodellen op te helderen. De methodologie integreert een op maat gemaakt LSM-systeem met technieken voor het opruimen van weefsel, waardoor lichtverstrooiing in hartweefsel wordt verminderd voor volumetrische beeldvorming. De combinatie van conventionele LSM met beeldstitching en multiview-deconvolutiebenaderingen maakt het mogelijk om het hele hart vast te leggen. Om de inherente afweging tussen axiale resolutie en gezichtsveld (FOV) aan te pakken, introduceren we verder een axiaal geveegde lichtbladmicroscopie (ASLM)-methode om onscherp licht te minimaliseren en het hart gelijkmatig te verlichten in de voortplantingsrichting. Ondertussen verbeteren weefselopruimingsmethoden zoals iDISCO de lichtpenetratie, vergemakkelijken ze de visualisatie van diepe structuren en zorgen ze voor een uitgebreid onderzoek van het myocardium door het hele hart. De combinatie van de voorgestelde LSM en methoden voor het opruimen van weefsel biedt een veelbelovend platform voor onderzoekers bij het oplossen van hartstructuren in knaagdierharten, met een groot potentieel voor het begrip van cardiale morfogenese en remodellering.

Inleiding

Hartfalen blijft wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak, voornamelijk als gevolg van het gebrek aan regeneratief vermogen van rijpe cardiomyocyten. De ingewikkelde architectuur van het hart speelt een cruciale rol in zijn functie en geeft inzicht in ontwikkelingsprocessen. Een diepgaand begrip van de cardiale structuur is essentieel voor het ophelderen van de fundamentele processen van cardiale morfogenese en remodellering als reactie op een hartinfarct. Recente vooruitgang heeft aangetoond dat neonatale muizen de hartfunctie kunnen herstellen na een verwonding, terwijl volwassen muizen een dergelijk regeneratief vermogen missen. Dit legt een basis voor het onderzoeken van signalen die verband houden met structurele en functionele afwijkingen in muismodellen. Traditionele beeldvormingsmethoden, zoals confocale microscopie, hebben technische beperkingen, waaronder beperkte penetratiediepte, traag puntscanschema en fotoschade door langdurige blootstelling aan laserlicht. Deze belemmeren een uitgebreide driedimensionale (3D) beeldvorming van het intacte hart. In deze context komt light-sheet microscopie (LSM) naar voren als een krachtige oplossing, die de voordelen biedt van high-speed beeldvorming, verminderde fotoschade en uitzonderlijke optische sectiemogelijkheden 3,4,5. De unieke eigenschappen van LSM maken het tot een veelbelovende methode om de beperkingen van conventionele technieken te overwinnen en ongekende inzichten te bieden in cardiale ontwikkeling en remodelleringsprocessen 6,7,8.

In dit protocol introduceren we een beeldvormingsstrategie die geavanceerde LSM combineert met aangepaste weefselopruimingsbenaderingen9, waardoor volledige muizenharten kunnen worden afgebeeld zonder de noodzaak van specifieke etikettering en mechanische sectie. We stellen verder voor dat conventionele LSM-beeldvorming kan worden verbeterd door middel van multiview deconvolutie10 of axiaal geveegde lichtbladmicroscopie (ASLM) technieken 11,12,13,14,15 om de axiale resolutie te verbeteren. Bovendien kan de integratie van beeldstitching met een van deze methoden de afweging tussen ruimtelijke resolutie en gezichtsveld (FOV) effectief overwinnen, waardoor de beeldvorming van volwassen muizenharten wordt bevorderd. De integratie van talrijke benaderingen voor weefselopruiming, waaronder hydrofobe, hydrofiele en op hydrogel gebaseerde methoden, maakt een diepere lichtpenetratie mogelijk voor het vastleggen van de morfologie van het hele hart 16,17,18,19.

Hoewel meerdere opruimmethoden compatibel zijn met de huidige LSM-systemen, is het doel om fotonverstrooiing te minimaliseren en de lichtpenetratie in weefsels, zoals het hart, te verbeteren door lipiden te vervangen door een medium dat nauw aansluit bij de brekingsindex. iDISCO werd gekozen als de representatieve20,21 en aangepast voor autofluorescentiebeeldvorming in dit protocol vanwege de snelle verwerking en hoge transparantie (Figuur 1A). Gezamenlijk biedt de integratie van de geavanceerde LSM-benadering met weefselopruimingstechnieken een veelbelovend kader om ingewikkelde cardiale anatomie in knaagdierharten te ontrafelen, met een aanzienlijk potentieel voor het vergroten van ons begrip van cardiale morfogenese en pathogenese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierprotocollen en -experimenten zijn goedgekeurd en uitgevoerd onder toezicht van de University of Texas in Dallas Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC #21-03). C57BL6-muizen, waaronder pasgeborenen op postnatale dag 1 (P1) en volwassenen van 8 weken oud, werden in deze studie gebruikt. Er werd geen verschil waargenomen tussen mannen en vrouwen. Alle gegevensverzameling en nabewerking van afbeeldingen werden uitgevoerd met behulp van open-source software of platforms met onderzoeks- of educatieve licenties. De bronnen zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de auteurs.

1. Monstervoorbereiding en weefselopruiming (6 - 10 dagen)

  1. Bereid alle chemische oplossingen in de tabel met materialen die nodig zijn voor de weefselverwijderingsmethode voordat u de weefselreinigingsprocedure start.
    NOTITIE: Voer alle procedures uit in een zuurkast terwijl u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, vooral bij het hanteren van giftige chemicaliën.
  2. Euthanaseer dieren met CO2 door ze op de gewenste tijdstippen, zoals P1 en 8 weken, in een CO2 -kamer te plaatsen voor het verzamelen van het hele hart en dompel het vers geïsoleerde hart onder bij kamertemperatuur (RT) in 0,2 M KCl om te arresteren in diastole16.
  3. Fixeer het hart door onderdompeling in 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met zachte agitatie op een tuimelschakelaar 's nachts om de hartanatomie bij 4 °C te behouden, zie tabel 1.
    LET OP: PFA is een giftige chemische stof en moet onder een zuurkast worden uitgevoerd.
  4. Was het hart met 1x PBS op RT gedurende 30 min, 3x.
    OPMERKING: Optioneel: Sluit het hart in agarosegel in om een hartassemblage te maken voor het op maat gemaakte LSM-systeem in stap 2, zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid de 1% agarose-oplossing voor door agarose op te lossen in PBS en verwarm het mengsel in de magnetron tot het volledig is opgelost. Giet de oplossing in een vorm om een onderlaag te creëren totdat de oplossing is afgekoeld tot 40 °C.
    2. Plaats het hart in de vorm en vul de vorm met agarosegel tot deze stolt. Verwijder eventuele luchtbellen in de agarosegel om artefacten in de beeldvorming te minimaliseren.
      OPMERKING: Het inbedden van het monster vermindert het risico op mogelijke schade aan de anatomie van het hart tijdens de montage.
      LET OP: Gebruik agarose met een laag smeltpunt en plaats het hart niet rechtstreeks in verwarmde agarose om het risico te verkleinen dat het monster wordt blootgesteld aan verhoogde temperaturen.
  5. Dehydrateer het hart met behulp van gradiënten van methanol gemengd met gedeïoniseerd water (Figuur 1B), verwerking door middel van opeenvolgende concentraties van 20%, 40%, 60%, 80% en 100% zoals aangegeven in tabel 1. Herhaal dit 1x met verse 100% methanol om volledige uitdroging te garanderen. Dehydrateer neonatale muizenharten gedurende 1 uur in elk methanolmengsel met schudden. Stel de incubatietijd in op 2 uur voor 8 weken oude muizenharten en rattenharten.
    LET OP: Methanol is een vluchtige, irriterende en ontvlambare chemische stof.
  6. Vervang en koel het hart door verse 100% methanol gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  7. Vervang de oplossing en bleekt het hart met 5% waterstofperoxide (H2O2) in methanol in een volumeverhouding van 1:5 (30% H2O2 tot 100% methanol) 's nachts bij 4 °C om de pigmenten te verwijderen.
    OPMERKING: De verwijdering van pigmenten zorgt voor een minimalisering van de opname van fotonen, wat leidt tot een verbeterde beeldkwaliteit met minder artefacten.
  8. Vervang de oplossing en incubeer het hart in 100% methanol gedurende 1 uur bij RT.
  9. Ontvet het hart met de oplossing met 66% dichloormethaan (DCM) en 33% methanol gedurende 3 uur door te schudden. Zorg ervoor dat het hart aan het einde van deze stap naar de bodem van de injectieflacon zakt. Als dit niet het geval is, vernieuw dan de oplossing (66% DCM / 33% methanol) en verleng de incubatietijd (bijv. nog 1 uur) om volledige delipidatie te bereiken. Breng het hart snel over in een verse oplossing om uitdroging te voorkomen, aangezien DCM zeer vluchtig is.
    LET OP: Gebruik polypropyleen of glaswerk voor het experiment, aangezien DCM niet compatibel is met polystyreen.
  10. Gebruik dibenzylether (DBE) voor het matchen van de brekingsindex (RI = 1,56). Voor neonatale muizenharten duurt het proces van brekingsindexaanpassing 2 dagen, terwijl het voor 8 weken oude muizenharten 5 dagen duurt met licht schudden. Vervang het door verse DBE en verleng de incubatietijd totdat het hart volledige transparantie bereikt.
    LET OP: DBE is gevaarlijk. Vermijd elk contact met de huid.

2. Steekproefmontage (1 dag)

OPMERKING: Als een commercieel LSM-systeem wordt gebruikt, volg dan het specifieke protocol van het bedrijf om het hart te repareren en sla stap 2.1 - 2.9 over.

  1. Personaliseer een kamer en een houder die bestand zijn tegen de oplossing voor het matchen van de brekingsindex (bijv. DBE in de aangepaste iDISCO-benadering) met behulp van een 3D-printer en Onyx-materialen (Figuur 2A)16.
  2. Bevestig een magneet aan de onderkant van de kamer om een snelle verbinding en nauwkeurige lokalisatie onder het LSM-systeem mogelijk te maken (Figuur 2B).
  3. Bevestig een afdekglaasje van 25 mm x 50 mm x 0,17 mm met transparante siliconenlijm aan de kamer en controleer de waterdichtheid van de kamer door deze na 1 dag met DBE te vullen en op lekken te controleren.
  4. Pas een klemhouder aan met behulp van een 3D-printer en bevestig een magneet voor het monteren van de hartconstructie in de kamer (Figuur 2C) of steek een naald in de agarosegel voor het monteren van de hartconstructie.
  5. Voer de ontwikkeling uit van een intern LSM-systeem met behulp van een cilindrische lens en continuous-wave diode-pumped solid-state (DPSS) lasers, zoals eerder gerapporteerd 16,22. Gebruik de excitatiegolflengte van 532 nm om autofluorescentie van het myocardium op te vangen (Figuur 2D).
  6. Monteer de kamer op een 6-dimensionale tafel en zoek de optimale positie waar de kamer loodrecht staat op de richting van de laservoortplanting.
  7. Gebruik een magnetische klemhouder om het monster in het midden van de kamer te plaatsen en sluit de houder aan op een 4-dimensionale gemotoriseerde tafel (X, Y, Z en Yaw; Figuur 2D).
  8. Dompel de hartassemblage onder in de kamer gevuld met DBE met behulp van de gemotoriseerde tafel en bepaal het scanbereik langs de detectieas (Z-richting).
  9. Bepaal de scansnelheid (Vz) van de motor langs de Z-richting op basis van de stapgrootte (S) en acquisitietijd van een afbeelding (T) met behulp van de volgende vergelijking:
    figure-protocol-1
    OPMERKING: De relatie tussen de stapgrootte en de axiale resolutie van het beeldvormingssysteem voldoet aan de bemonsteringsstelling van Nyquist-Shannon. Zo werd de stapgrootte vastgesteld op 1 μm, gegeven het feit dat de axiale resolutie 2,91 μm bedroeg, zoals aangegeven in het vorige rapport16.
  10. Om de ruimtelijke resolutie te verifiëren en mogelijke opaciteitsproblemen op verschillende diepten te minimaliseren, meet u de puntspreidingsfunctie (PSF) van het systeem door fluorescerende parels af te beelden met een diameter van 0,53 μm verdund in agarosegel met een laag smeltpunt van 1% met een concentratie van 1:1,5 x 105. Bereken de PSF over de gehele steekproef door de volledige breedte te meten bij de helft van het maximum (FWHM)16.

3. Afbeelding stikken (4-8 uur)

  1. Bereken het aantal tegels dat nodig is om het hele muizenhart te bedekken, rekening houdend met de beperkte FOV. Voor elke tegel komen de afmetingen overeen met het gezichtsveld van het LSM-systeem. Voor een neonataal muizenhart met een doorsnede van 3 x 3,6mm2 zijn bijvoorbeeld 2 x 2 tegels nodig voor dekking in de op maat gemaakte LSM (Figuur 3A). Een muizenhart van 8 weken oud van 5 x 8mm2 heeft daarentegen 3 x 4 tegels nodig om de hele hartstructuur te bedekken (Figuur 3B).
    OPMERKING: Beeldstitching is vereist als de conventionele LSM een beperkt gezichtsveld heeft voor het afbeelden van het hele hart.
  2. Maak afbeeldingen van het hart vanaf tegel 1, d.w.z. de tegel in de linkerbovenhoek van het hart (Figuur 3A-B).
  3. Maak achtereenvolgens afbeeldingen van de resterende tegels met een overlapping van 10% tussen opeenvolgende tegels totdat het hele hart bedekt is, zoals geïllustreerd in figuur 3C.
  4. Download en installeer Fiji23 open-source software. Download en installeer de Fiji-plug-in, BigStitcher24.
  5. Navigeer naar het Help-menu, selecteer Bijwerken, kies Update site beheren en kies voor BigStitcher. Klik vervolgens op Sluiten, gevolgd door Wijzigingen toepassen. Start na het voltooien van het downloaden van de plug-in de Fiji-software opnieuw op.
  6. Open de BigStitcher-plug-in en importeer alle benodigde tegels via de map met afbeeldingsbestanden. Sla de dataset op als een HDF5-bestand.
  7. Organiseer tegels door Tegel verplaatsen op normaal raster te kiezen, selecteer het patroon dat wordt gebruikt voor het verplaatsen van het hart en selecteer een overlapping van 10% tussen elke tegel. Naai de tegels met behulp van de optie Stitching Wizard.
  8. Exporteer de samengevoegde gegevens met behulp van Image Fusion om een tiff-bestand te genereren.

4. Multiview deconvolutie (5 dagen)

  1. Gebruik fluorescerende kralen voor beeldregistratie van multiview-reconstructie langs het hart (Figuur 3D).
    1. Bereid hars25 voor door bisfenol-A-diglycidylether (D.E.R. 332), isoforondiamine, 5-amino-1,3,3-trimethylcyclohexaanmethylamine (IPDA) en polypropyleenglycoldiglycidylether (DER 736) te mengen in een volumeverhouding van 4:1:1.
    2. Centrifugeer 10 μL fluorescentieparels bij 161 x g gedurende 5 minuten en voeg 20 μL methanol toe om de bewaaroplossing van de korrels te vervangen. Herhaal het 3x.
    3. Bereid een oplossing van 10 ml met een concentratie van 1:1 x 105 korrels door de op methanol gebaseerde pareloplossing te mengen met de in stap 4.1.1 bereide hars.
    4. Ontgas de oplossing gedurende 3 uur in een vacuümkamer om luchtbellen en luchtbellen te verwijderen.
    5. Giet de oplossing in een siliconen mal of een plastic rietje en wacht 2 tot 3 dagen tot het stolt. Na 1 dag voordat de hars vast wordt, plaatst u de glazen buis in de mal en wacht u tot de buis aan de hars hecht. Verwijder de hars uit de mal met de glazen buis (Figuur 3D).
    6. Plaats het hart in de glazen buis, vul deze met DBE en monteer de glazen buis in de kamer gevuld met DBE.
  2. Maak opeenvolgende beelden van het hart van de muis samen met de kralen uit het verlichte gedeelte door de hartconstructie over de detectie-as (Z-as; Figuur 3E-F).
    OPMERKING: Implementeer het samenvoegen van afbeeldingen in stap 3 om afzonderlijke stapels afbeeldingen te genereren als de hartgrootte groter is dan het gezichtsveld.
  3. Draai het muishart 60° langs de Y-as om opeenvolgende stapels vanuit meerdere hoeken vast te leggen, d.w.z. 0°, 60°, 120°, 180°, 240° en 300° (Figuur 3E-F).
  4. Open de BigStitcher-plug-in en importeer alle afbeeldingen via de map met afbeeldingsbestanden. Sla de dataset op als een HDF5-bestand.
  5. Kies Interessepunten detecteren en selecteer handmatig interessante kralen voor registratie.
  6. Selecteer Affien transformatiemodel voor registratie. Kies de functie Puntspreiding en wijs PSF toe aan alle weergaven.
  7. Klik op Multiview Deconvolutie en kies het type iteratie als Efficiënt Bayesiaans. Definieer het aantal iteraties als 10 en voer hetuit 26.
  8. Klik op Image Fusion om een tiff-bestand te exporteren.
    OPMERKING: Meer gedetailleerde informatie over de multiview-deconvolutie is te vinden in andere rapporten of protocollen 24,27,28.

5. Axiaal geveegd lichtvelsysteem hardware (1 dag)

  1. Installeer een elektrisch afstembare lens (ETL) op het Fouriervlak van de cilindrische lens (CL)27 (Figuur 2D) om de laserstraal axiaalte scannen 14. Zorg ervoor dat de vloeistofinterface in ETL horizontaal is om vervorming van het golffront door zwaartekracht te voorkomen. Lijn ETL nauwkeurig uit om bundeldecentrering en optische aberraties van hogere orde te minimaliseren30.
  2. Installeer een DAQ-kaart in het werkstation en sluit een BNC-kabel aan op de DAQ-kaart om de belichting van de camera en ETL-scannen te synchroniseren.
  3. Open de behuizing van de ETL-driver en verwijder het deksel (Figuur 4).
  4. Soldeer de signaaldraad van de BNC-kabel aan de analoog in B-pin, zoals aangegeven op de onderkant van de printplaat (Figuur 4).
  5. Soldeer de aardingsdraad van de BNC-kabel aan de GND-pen; sluit daarna het andere uiteinde van de BNC-kabel aan op AO (analoge uitgang) in de DAQ-kaart (Figuur 4).
  6. Sluit het ETL-stuurprogramma aan op de USB-poort van het werkstation, sluit het stuurprogramma aan op de ETL met behulp van een hirose-kabel en installeer de Lens Driver Controller-software.
  7. Wijzig de bedieningsmodus in de Lens Driver Controller-software naar analoog om de ETL te bedienen met een trigger die is gegenereerd door de DAQ-kaart.
  8. Zet in de software van de sCMOS-camera de Capture-modus op Extern (Light-sheet). Zorg ervoor dat de actieve scanrichting van de pixel loodrecht staat op de scanrichting van de laser om de synchronisatie te vergemakkelijken.
  9. Sluit de externe triggerpoort aan de achterkant van de sCMOS-camera aan op de AO van de DAQ-kaart met behulp van een BNC-kabel (Figuur 4).

6. Axiaal geveegde lichtbladsysteemsynchronisatie (7 dagen)

  1. Definieer de belichtingstijd op basis van de aanvaardbare signaal-achtergrondverhouding (SBR), die voor het voorgestelde onderzoek ten minste 10 is. Verhoog de belichtingstijd als de SBR lager is dan 10.
    OPMERKING: Een belichtingstijd van 10 tot 50 ms zorgt voor een acceptabele SBR in dit project.
  2. Definieer de opnametijd van een afbeelding (T) en het lijninterval (L) op basis van de belichtingstijd (E) voor de camera en de ETL-frequentie (f) met behulp van de volgende vergelijkingen:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    Waarbij P het aantal pixelkolommen op de camerasensor aangeeft. De representatieve parameters voor de referentie zijn respectievelijk f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 ms en L = 243 μs.
  3. In het LabVIEW-programma Trigger Generator.vi genereert het zowel vierkante als driehoekige triggers voor synchronisatie (Figuur 5).
    OPMERKING: Het aangepaste LabVIEW-programma is op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de auteurs.
  4. Monteer fluorescerende kralen verdund in agarosegel met een laag smeltpuntvan 1% 16 met een concentratie van 1:1 x 103 om de positie van de taille van de straal in het beeld te lokaliseren (Figuur 6A).
  5. Identificeer in het programma het begin- en eindpunt van de laserstraal onder het gezichtsveld door de spanning in de scanrichting te veranderen.
  6. Om de sCMOS-camera en ETL te synchroniseren, scant u de laserstraal langs de X-as en actieve pixels langs de Y-as om een 2D-beeld te genereren (Afbeelding 6B). De helderdere en scherpere kralen langs de diagonaal in het beeld geven de precieze synchronisatie tussen de sCMOS en ETL aan.
    OPMERKING: De synchronisatie van de scansnelheid van ETL- en sCMOS-pixelactivering is van cruciaal belang voor de beeldkwaliteit. Verschillende veelvoorkomende asynchrone fouten worden samengevat in figuur 6C-F.
  7. Nadat u de optimale synchronisatieparameters voor synchronisatie hebt bepaald, draait u de sCMOS-camera 90° rond de Z-as om de actieve pixelrichting uit te lijnen met de laserscanrichting.
  8. Herhaal stap 2.10 en meet de FWHM van de PSF. Gebruik dezelfde methode als aangegeven in het vorige rapport16, met de gemiddelde laterale en axiale resoluties van ASLM als respectievelijk 2,18 μm en 2,88 μm (Figuur 7).
    OPMERKING: Uniforme verlichting en resolutie over het gehele gezichtsveld zijn onder ideale omstandigheden haalbaar (Figuur 7A-B). Asynchrone werking van de ETL met de sCMOS-camera, evenals verkeerde uitlijning van de verlichting en detectie, kan resulteren in een niet-uniforme ruimtelijke resolutie (Figuur 7C-D).
  9. Voor cardiale beeldvorming gaat u na het uitlijnen van het systeem en het bepalen van de optimale parameters voor systeemsynchronisatie verder met stap 2.6 tot 2.9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Van LSM is aangetoond dat het cardiale studies bevordert 31,32,33,34,35,36,37 vanwege het minimale risico op fotoschade, hoge ruimtelijke resolutie en optische doorsnede in tegenstelling tot andere optische beeldvormingsmethoden zoals helderveld- en puntscantechnieken 6,8,38,39,40

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De vooruitgang van beeldvormings-, berekenings- en weefselopruimingsmethoden heeft een ongeëvenaarde kans geboden om de hartstructuur en -functie uitgebreid te onderzoeken. Dit heeft een groot potentieel voor het verdiepen van ons begrip van cardiale morfogenese en pathogenese met behulp van een intact knaagdierhartmodel. In tegenstelling tot in vivo studies van het hart van zebravissen met een vergelijkbare benadering 40,41,42,43

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflict bekend te maken.

Dankbetuigingen

We spreken onze dank uit aan de groep van Dr. Eric Olson in het UT Southwestern Medical Center voor het genereus delen van de diermodellen. We waarderen alle constructieve opmerkingen van D-incubator-leden van UT Dallas. Dit werk werd ondersteund door NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) en UT Dallas STARS-programma (Y.D.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1% Agarose
Low melting point agaroseThermo Fisher16520050
Deionized water--
Chemicals for tissue clearing 
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and transSigma-Aldrich118184
D.E.R.™ 332Sigma-Aldrich31185
D.E.R.™ 736Sigma-Aldrich31191
Dibenzyl ether (DBE)Sigma-Aldrich33630
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997
Fluorescent beadsSpherotechFP-0556-2
Hydrogen peroxide (H2O2)Sigma-Aldrich216736
MethanolSigma-Aldrich439193
Paraformaldehyde (PFA)Thermo Fisher47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-Aldrich79383
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Software and algorithms
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
BigStitcherHörl et al.22
Fiji-ImageJSchindelin et al.201.54f
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
Key components of the customized light-sheet system
0.63 - 6.3X Zoom bodyOlympusMVX-ZB10 
10X Illumination objectiveNikonMRH00105
1X detection objectiveOlympusMV PLAPO 1X/0.25 
473nm DPSS LaserLaserglow TechnologiesLRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS laserLaserglow TechnologiesLRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSS laserLaserglow TechnologiesLRS-0589-GFF-00100-05
BNC connectorNational InstrumentBNC-2110
Cylindrical lensThorlabsACY254-050-A
DC-Motor Controller, 4 axesPhysik InstrumenteC-884.4DC
ETLOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETL CableOptotuneCAB-6-300
ETL Lens DriverOptotuneEL-E-4i
FilterChromaET525/30
FilterChromaET585-40
FilterChromaET645-75
Filter wheel Shutter InstrumentLAMBDA 10-B
Motorized translation stagePhysik InstrumenteL-406.20DG10
Motorized translation stagePhysik InstrumenteL-406.40DG10
Motorized translation stagePhysik InstrumenteM-403.4PD
NI multifunction I/ONational InstrumentPCIe-6363
sCMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
Stepper motorPololu1474
Tube lensOlympusMVX-TLU

Referenties

  1. Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
  2. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  3. Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73(2021).
  4. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002(2018).
  5. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
  6. Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396(2018).
  7. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209(2017).
  8. Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  10. Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  11. Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
  12. Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
  13. Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924(2018).
  14. Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
  15. Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795(2021).
  16. Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278(2023).
  17. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
  18. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
  19. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
  20. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  21. Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821(2020).
  22. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769(2018).
  23. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
  24. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
  25. Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149(2014).
  26. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  27. Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
  28. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
  29. Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
  30. Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
  31. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  32. Sands, G. B., et al. It's clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
  33. Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol - Hear Circ Physiol. 323, H257(2022).
  34. Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
  35. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754(2018).
  36. Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
  37. Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
  38. Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
  39. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  40. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112(2023).
  41. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
  42. Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
  43. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263(2024).
  44. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  45. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807(2021).
  46. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271(2018).
  47. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  48. Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
  49. Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
  50. Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678(2017).
  51. Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101(2019).
  52. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072(2017).
  53. Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Light-sheetmicroscopiebeeldvorming van hartstructurenweefselklaringbeeldvorming van knagerhartenmyocardiale microstructuuraxiaal gescande microscopieimage stitchingmulti-view deconvolutionbrekingsindexmatchingcardiale remodellering
Light-sheet beeldvorming om de hartstructuur in knaagdierharten te onthullen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.