Methodenartikel

In vitro differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in muizen

3.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66718

⸱

25 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, Department of Critical Care Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Department of Pathogenic Biology and Immunology, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine, School of Medicine, Southeast University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in vitro. In combinatie met een op flowcytometrie gebaseerde benadering met meerdere parameters kan met behulp van deze differentiatiemethode een zuiverheid van 90% van pathogene Th17-cellen worden verkregen uit naïeve CD4+ T-cellen.

Samenvatting

In vitro T-celdifferentiatietechnieken zijn essentieel voor zowel functioneel als mechanistisch onderzoek van CD4+ T-cellen. Pathogene Th17-cellen zijn de laatste tijd in verband gebracht met een breed scala aan ziekten, waaronder multiple sclerose (MS), reumatoïde artritis, acuut respiratoir distress syndroom (ARDS), sepsis en andere auto-immuunziekten. De momenteel bekende in vitro differentiatieprotocollen hebben echter moeite met het bereiken van een hoge zuiverheid van pathogene Th17-cellen, waarbij de inductie-efficiëntie vaak onder de 50% ligt, wat een belangrijke uitdaging is bij in vitro experimenten. In dit protocol stellen we een verbeterd in vitro kweek- en differentiatieprotocol voor pathogene Th17-cellen voor, dat wordt gebruikt om naïeve CD4+ T-cellen geïsoleerd uit milt van muizen direct te differentiëren tot pathogene Th17-cellen. Dit protocol geeft gedetailleerde instructies over de isolatie van splenocyten, de zuivering van naïeve CD4+ T-cellen en de differentiatie van pathogene Th17-cellen. Via dit protocol kunnen we een differentiatiezuiverheid van ongeveer 90% bereiken voor pathogene Th17-cellen, wat voldoet aan de basisbehoeften van veel cellulaire experimenten.

Inleiding

Na het verlaten van de thymus passeren naïeve CD4+ T-lymfocyten secundaire lymfoïde organen. Antigeenpresenterende cellen die homologe antigenen overbrengen naar naïeve CD4+ T-cellen, activeren ze en starten een reeks differentiatieprogramma's die uiteindelijk resulteren in de productie van zeer gespecialiseerde T-helper (Th) cellijnen1. De productie van interleukine 17 (IL-17) kenmerkt Th17-cellen, een subpopulatie van pro-inflammatoire Th-cellen2. Th17-cellen spelen een rol bij de afweer van de gastheer tegen extracellulaire pathogenen en bij de pathogenese van veel auto-immuunziekten, zoals auto-immuunuveïtis en multiple sclerose. Signalen van T-celreceptoren en cytokinen IL-6 en transformerende groeifactor-β (TGF-β) induceren de differentiatie van naïeve T-cellen in Th17-cellen door de fosforylering van signaaltransducer en activator van transcriptie (STAT)33. STAT3 wordt verder versterkt in een positieve feedbacklus door signalering gemedieerd door IL-23 en IL-21 4,5. Fosforylering van STAT3 kan de expressie van de transcriptiefactoren RORγt en RORα induceren, die fungeren als hoofdschakelaars die het cytokineprofiel van IL-17A, IL-17F, IL-21 en IL-22 in Th17-cellen reguleren6. Er is echter gemeld dat IL-6- en TGF-β-geïnduceerde Th17-cellen onvoldoende zijn om auto-immuunziekten te veroorzaken, die co-stimulatie door IL-23 of afzonderlijke co-stimulatie van IL-6, IL-1β en IL-23 vereisen in afwezigheid van TGF-β 7,8.

Th17-subgroepen die experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) niet effectief kunnen induceren, worden soms niet-pathogene Th17 genoemd, terwijl Th17-subsets die EAE kunnen induceren bekend staan als pathogene Th179. Huidige studies hebben aangetoond dat, hoewel pathogene Th17 en niet-pathogene Th17 samen de kerntranscriptiefactor RORγt tot expressie brengen, er grote verschillen zijn in het vermogen om IL-17A te produceren en pro-inflammatoire en ontstekingsremmende eigenschappen10. Naast de hoge expressie van RORγt, CCR6, STAT4 en RUNX4, die gemeenschappelijke kenmerkende transcriptiefactoren van Th17 zijn, vertonen pathogene Th17-cellen ook aanvullende kenmerken van gensignaalexpressie die verband houden met de ziekte, zoals TBX21, IFN-γ en CXCR3, die de kenmerken hebben van Th1-celsubsets. Pathogene Th17-cellen kunnen hoge niveaus van granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF), IFN-γ, TNF-α en andere cytokines afscheiden11,12. Het fenotype van niet-pathogene Th17-cellen is onstabiel en alleen onder stimulatie van CD3 en cytokine IL-2 kunnen sommige van deze cellen differentiëren tot pathogene Th17-cellen. Daarom oefenen pathogene Th17-cellen in veel voorkomende klinische ziektemodellen zoals reumatoïde artritis, multiple sclerose en acuut respiratoir distress syndroom voornamelijk pathogene effecten uit.

Pathogene en niet-pathogene Th17-cellen kunnen in vitro differentiëren onder invloed van verschillende cytokines. In de afgelopen jaren hebben verschillende studies methoden voorgesteld voor het induceren van de differentiatie van Th17-cellen met behulp van verschillende soorten en concentraties cytokines. Th17-cellen worden gestimuleerd door een combinatie van IL-6, IL-1β en IL-23 13,14,15,16. Het is bewezen dat IL-6 en TGF-β, twee cytokinen die nodig zijn voor Th17-celdifferentiatie, de expressie van RORγt- en Th17-celdifferentiatie synergetisch reguleren door interactie met twee verschillende geconserveerde niet-coderende DNA-sequenties op de Rorc-genlocus 17. De stabiele fase van pathogene Th17-cellen wordt voornamelijk in stand gehouden door IL-2318,19. IL-23 bindt zich aan zijn receptor en activeert de JAK-STAT-signaleringsroute20, waardoor fosforylering van Jak2 en Tyk2 wordt veroorzaakt en fosforylering van STAT1, STAT3, STAT4 en STAT5 wordt bevorderd. IL-4 en IFN-γ zijn negatieve regulatoren van deze route. Studies hebben echter aangetoond dat IL-1β de transcriptie van Rorα en Rorγt positief kan reguleren via de mTOR-route om de stabiliteit van het Th17-celfenotype21 te behouden.

Vanwege de heterogeniteit van talrijke onderzoeken hebben we de inductieprotocollen voor pathogene en niet-pathogene Th17-cellen uit het laatste onderzoek gekozen als controles22. De resultaten geven aan dat, ervan uitgaande dat alles volgens dit protocol wordt uitgevoerd, na 5 dagen cultuur onder de voorwaarde dat pathogene Th17 wordt gegenereerd, meer dan 90% van de overlevende cellen pathogene Th17-cellen kunnen zijn.

Protocol

De Institutional Review Committee for Animal Studies aan de Southeast University keurde alle dierstudies goed die in deze studie worden beschreven, die werden uitgevoerd in overeenstemming met zowel lokale als institutionele kantoornormen. Miltmonsters werden genomen van C57BL6/J-muizen. Zowel vrouwelijke als mannelijke muizen, in de leeftijd tussen 5 en 8 weken, werden in deze studie opgenomen. Het kweekmedium en de buffer werden maximaal 1 maand bij 4 °C bewaard. Chirurgische instrumenten werden voor gebruik geautoclaveerd. Draag latex handschoenen en maskers om besmetting van huid, ogen en kleding met reagentia te voorkomen; Gebruik veel water of spoeling met zoutoplossing voor de huid en ogen.

1. De 24-well weefselkweekplaat voorcoaten met anti-CD3

  1. Verdun anti-CD3 tot een eindconcentratie van 1 μg/ml in steriel 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of RPMI 1640-medium.
  2. Vul een weefselkweekplaat met 24 putjes met 1 ml anti-CD3-oplossing (1 μg/ml); Bedek vervolgens de put met parafilm.
  3. Plaats de anti-CD3 gecoate plaat 16 uur in de koelkast (2 °C-8 °C) of houd deze 2-3 uur op 37 °C in een celincubator.

2. Isolatie van de milt van muizen en bereiding van de eencellige suspensie van de milt

  1. Induceer volledige anesthesie in C57BL/6J met 3% isofluraan en euthanaseer door 100% kooldioxide gedurende 2 minuten in te ademen. Week ze onmiddellijk na de dood van de muizen in 75% ethanol voor desinfectie om besmetting te voorkomen.
  2. Plaats de muis in rugligging op de schone bank, snijd deze open langs de middellijn van de buik en scheid de buikstructuren laag voor laag. Open het grotere omentum en de maag voorzichtig met een pincet, trek de milt voorzichtig uit met het gastrosplenische ligament en scheid de milt botweg van de omliggende weefsels en ligamenten om een intacte milt te verkrijgen (zorg ervoor dat de milt niet wordt verpletterd of gescheurd).
    NOTITIE: Om een steriele toestand te behouden, wordt de volgende handeling uitgevoerd in een steriele superschone bank.
  3. Plaats een celfilter van 70 μm in een steriel kweekschaaltje van 100 mm, voeg de milt toe aan de celzeef en plet deze met een spuitzuiger. Voeg tegelijkertijd 5-8 ml homogenaat spoelvloeistof toe om alle cellen door het filter in de kweekschaal te duwen.
    OPMERKING: De samenstelling van de vloeistofkit voor het scheiden van lymfocyten is te zien in de Materiaaltabel.
  4. Centrifugeer het filtraat bij 450 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.
  5. Resuspendeer de celpellet met het monsterverdunningsmiddel dat bij de lymfocytscheidingskit is geleverd of met PBS- of RPMI 1640-medium. Stel de celconcentratie van de celsuspensie in op 2 × 108-1 × 109 cellen/ml.
    OPMERKING: Doorgaans is 4-6 ml monsterverdunningsmiddel nodig voor één milt.
  6. Neem in een centrifugebuisje dezelfde hoeveelheid oplossing voor het scheiden van lymfocyten als de eencellige suspensie in het weefsel. Pipetteer de eencellige suspensie voorzichtig op het oppervlak van de lymfocytscheidingsoplossing en centrifugeer bij 800 × g, 25 °C gedurende 30 minuten. Stel de versnelling en vertraging van de centrifuge in op een geschikt bereik (bijv. ingesteld op 3 als er de gebruikelijke versnellingen van 1 tot 9 zijn).
    OPMERKING: De oplossing voor het scheiden van lymfocyten mag niet minder zijn dan 3 ml.
  7. Bekijk na het centrifugeren de vier lagen in de centrifugebuis van boven naar beneden. De eerste laag komt overeen met het verdunningsmiddel van het monster, gevolgd door de ringvormige melkwitte lymfocytenlaag. De derde laag is de scheidingsvloeistof en de vierde laag bestaat uit rode bloedcellen.
  8. Gebruik een pipet om de tweede laag ringvormige melkwitte lymfocytenlaag voorzichtig in een andere centrifugebuis te trekken en voeg 10 ml reinigingsoplossing toe aan de centrifugebuis om de cellen te mengen.
  9. Centrifugeer bij 250 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg. Gebruik 10 ml RPMI 1640 medium om de celpellet te resuspenderen voor het tellen van cellen.

3. Zuivering van naïeve CD4+ T-cellen op basis van negatieve selectie van magnetische kralen

OPMERKING: Isoleer onaangeroerde en sterk gezuiverde naïeve CD4+ T-cellen (CD4+CD44lowCD62Lhigh) uit muizensplenocyten door immunomagnetische negatieve selectie.

  1. Bereid het monster voor om 1 × 108 cellen/ml te hebben binnen het volumebereik van 0,1-2 ml.
  2. Voeg 50 μl/ml rattenserum toe en breng het monster over in een buis van 5 ml polystyreen met ronde bodem.
    OPMERKING: De samenstelling van de naïeve CD4 T-celsorteerset is te zien in de Materiaaltabel.
  3. Voeg 50 μL/ml isolatiecocktail toe aan het monster, meng goed en incubeer gedurende 7,5 minuut bij kamertemperatuur.
  4. Voeg 50 μL/ml Depletion Cocktail toe aan het monster, meng goed en incubeer gedurende 2,5 minuut bij kamertemperatuur.
  5. Draai de magnetische kralen om een gelijkmatige verspreiding te garanderen. Voeg 75 μL/ml van de magnetische kralen toe aan het monster, meng goed en incubeer gedurende 2,5 minuut bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: De deeltjes moeten gelijkmatig verspreid lijken; De vortextijd mag niet minder zijn dan 30 s.
  6. Vul het monster bij met RPMI 1640 medium tot een eindvolume van 2,5 ml. Meng meerdere keren door zachtjes op en neer te pipetteren.
  7. Plaats de tube (zonder deksel) in de magneet en incubeer gedurende 2,5 minuut bij kamertemperatuur.
  8. Pak de magneet op, keer de magneet en de buis in één continue beweging om en giet de verrijkte celsuspensie in een nieuwe buis.
    NOTITIE: Houd de buis en de magneet 2-3 s omgekeerd voordat u ze rechtop zet. Verstoor geen druppels die op de mond van de tube kunnen achterblijven.
  9. Bepaal het celnummer met behulp van een hemocytometer.
  10. Voer flowcytometrische analyse uit voor naïeve CD4+ T-cellen voor en na isolatie (Figuur 1).
  11. Breng de cellen over in een nieuwe centrifugebuis, centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.
  12. Resuspendeer de cellen in 200-500 μL RPMI 1640 medium (aangevuld met 10% foetaal runderserum). Voeg voor elke 1 ml celcultuur (bijv. ~106 cellen/ml) 2 μL leukocytenactiveringscocktail toe en meng deze. Kweek de cellen in een CO2-incubator bij 37 °C en verzadigde vochtigheid gedurende 4-6 uur.
    OPMERKING: De cellen werden eens in de 1-2 uur gewerveld.
  13. Centrifugeer de cellen bij 400 × g, 4 °C gedurende 5 min. Gooi het supernatans voorzichtig weg en resuspendeer de cellen in 200 μL PBS. Voeg 1 μL Fc-blokker toe aan de cellen (bijv. ~106 cellen/ml). Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  14. Was de cellen eenmaal met 1 ml PBS door te centrifugeren bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 200 μL PBS.
  15. Voeg een antilichaamcocktail toe (Fixable Viability Dye, 1:1.000; anti-CD4, 1:200; anti-CD44, 1:200; anti-CD62L, 1:200) en incubeer de cellen gedurende 15-20 minuten in het donker bij 4 °C.
  16. Was de cellen met 2 x 1 ml PBS en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 4 °C bij 400 × g .
  17. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de cellen in 250 μL vaste buffer en incubeer ze gedurende 40-60 minuten in het donker bij 4 °C.
    OPMERKING: De fixbuffer wordt geleverd met de Foxp3/transcriptiefactorkleuringsbuffer, een 4x voorraadoplossing die moet worden verdund met permeabilisatieverdunningsmiddel.
  18. Voeg 1 ml 1x permeabilisatiebuffer toe om de cellen 2x te wassen door de cellen te centrifugeren bij 300 × g, 4 °C gedurende 5 min.
  19. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de cellen in 200 μL permeabilisatiebuffer en voeg het antilichaam (Foxp3 [nucleair], 1:200) toe aan de cellen. Na fixatie en membraanbreuk de cel-antilichaammengsels 40-60 minuten in het donker incuberen, af en toe schudden gedurende korte perioden bij 4 °C.
    NOTITIE: De Permeabilisatie/Wasoplossing is een 10x bouillonoplossing die voor gebruik met PBS moet worden verdund.

4. Inductie van pathogene Th17-cellen in vitro

  1. Verwijder voor gebruik steriel PBS van de voorgecoate 24-wells platen.
  2. Gebruik Th17-celkweekmedium (tabel 1) en contrastmiddel voor cultuur, inclusief Th0-celkweekmedium (tabel 1), klassiek niet-pathogeen Th17-kweekmedium (tabel 1) en klassiek pathogeen Th17-kweekmedium (tabel 1). Resuspendeer de verrijkte naïeve CD4 + T-cellen en doseer in verschillende putjes in dezelfde plaat met 24 putjes (voorgecoat met anti-CD3), waarbij de concentratie wordt aangepast naar 4 × 105 cellen/ml, met 1 ml medium in elk putje.
  3. Voeg 1 μL/ml anti-CD28-oplossing (eindconcentratie: verdund met medium tot 2 μg/ml) toe aan elk putje. Kweek de cellen in een 5% CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 5 dagen.
  4. Vervang het bovendrijvende medium van de celcultuur door een kweekmedium (Th0, niet-pathogene Th17, klassieke pathogene Th17 en objectieve Th17) door zorgvuldig te pipetteren om de cellen gelijkmatig te verdelen, gooi de helft van het medium met de cellen weg en voeg vervolgens een nieuw medium toe dat gelijk is aan het weggooivolume op dag 2. Herhaal op dag 4.
  5. Observeer de cellen onder een optische microscoop op dag 5 (Figuur 2). Verzamel de celsupernatanten van elke groep en cryoconserveer ze bij -80 °C.

5. Flowcytometrische analyse voor pathogene Th17- en Th0-celdifferentiatie

  1. Oogst alle cellen (per putje) na 5 dagen na het starten van de kweek. Voer de stappen 3.12-3.15 uit.
  2. Voeg een antilichaamcocktail toe (Fixable Viability Dye, 1:1.000; anti-CD4, 1:200) en incubeer de cellen gedurende 15-20 minuten in het donker bij 4 °C.
  3. Voer de stappen 3.17-3.19 uit.
  4. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de cellen in 200 μL permeabilisatiebuffer en voeg de antilichaamcocktail toe (IL-17A [intracellulair], 1:200; RORγT [nucleair], 1:200) naar de cellen. Na fixatie en membraanbreuk de cel-antilichaammengsels 40-60 minuten in het donker incuberen, af en toe schudden gedurende korte perioden bij 4 °C.
  5. Voeg 1 ml 1x Permeabilisatie/Wasoplossing toe om de cellen 2x te wassen en centrifugeer de cellen bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C; Gooi vervolgens de supernatant weg.
  6. Onderzoek de cellen op een flowcytometer en analyseer de gegevens met behulp van de software (Figuur 3).
    1. Schakel de flowcytometer in en schakel het zelfstartende reinigings- en kalibratieproces in.
    2. Selecteer het laserkanaal dat in dit experiment wordt gebruikt en stel een lege buis, enkelvoudig gekleurde buizen en monsterbuizen in.
    3. Klik op de optie voor een lege buis en test op de machine; Stel de spanning zo in dat de celgebeurtenis zich zoveel mogelijk in het midden van de verzamelbox bevindt.
    4. Verzamel enkelvoudig gekleurde buiscellen en voer spectrale detectie uit van de overeenkomstige kanalen om te bevestigen dat het fluorescerende antilichaam correct is toegevoegd.
    5. Klik op de unmix-knop en laat de machine automatisch de spectrale compensatie aanpassen. Pas met andere flowcytometrie-instrumenten de fluorescentiecompensatie normaal aan.
    6. Verzamel elke cel van de monsterbuis, sla het gegevensformaat op als FCS-bestanden en exporteer. Analyseer en plot in de relevante software voor gegevensanalyse van flowcytometrie.
      1. Omcirkel de hoofdcelpopulatie en verwijder mogelijke celverklevingen door de diagonale cirkelpoorten van FSC-H en FSC-A.
      2. Omcirkel levende cellen volgens het FVS-negatieve cirkelgebied; omcirkel vervolgens de CD4+-celpopulatie.
      3. Construeer de kruispoort met de horizontale as als IL-17 A en de verticale as als RORγT; de dubbele positieve selectie in het Q2-gebied is de Th17-celpopulatie.

6. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor detectie van IL-17A-secretie geïnduceerd door verschillende media

  1. Ontdooi de in punt 4.5 verzamelde bevroren celsupernatanten.
  2. Voeg 100 μL van de verdunde standaard, blanco en monster toe aan de daarvoor bestemde putjes. Gebruik de sealer om de plaat af te dekken en incubeer gedurende 90 minuten bij 37 °C.
    NOTITIE: Voeg de oplossingen goed toe aan de bodem van de micro-ELISA-plaat zonder de binnenwand aan te raken of schuimvorming te veroorzaken.
  3. Decanteer de vloeistof uit elk putje en voeg onmiddellijk 100 μL Biotinylated Detection Antibody werkoplossing toe. Gebruik een nieuwe sealer om de plaat af te dekken en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
  4. Decanteer de oplossing en voeg 350 μL wasbuffer toe aan elk putje. Zuig of decanteer na 1 minuut de oplossing uit elk putje en dep het droog tegen schoon absorberend papier. Herhaal deze wasstap 3x.
  5. Voeg 100 μL van de mierikswortelperoxidase Geconjugeerde werkoplossing toe aan elk putje. Gebruik een nieuwe sealer om de plaat af te dekken en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  6. Decanteer de oplossing uit elk putje en herhaal het wasproces 5x zoals beschreven in stap 6.4.
  7. Voeg 90 μl van het substraatreagens toe aan elk putje en incubeer ongeveer 15 minuten bij 37 °C met een nieuwe sealer, die de plaat tegen licht beschermt.
    NOTITIE: De reactietijd kan worden gewijzigd op basis van de werkelijke kleurverandering, maar mag niet langer zijn dan 30 minuten. Laat de microplaatlezer ~15 minuten opwarmen voordat u de OD-meting uitvoert.
  8. Voeg 50 μL/putje Stop Solution toe in dezelfde volgorde als de substraatoplossing.
  9. Bepaal de optische dichtheid (OD-waarde) van elk putje in één keer met een microplaatlezer die is ingesteld op 450 nm.
  10. Verkrijg de OD-waarden voor de standaardmonsters en dupliceer putjes van de monsters, en trek de OD-waarden van de lege putjes af om de gecorrigeerde waarden te verkrijgen. Voer vervolgens een lineaire fitting uit met concentratie als de abscis en OD-waarde als de ordinaat. Bereken op basis van de aangepaste vergelijking de IL-17A-concentratiewaarden voor de monsterputjes.
    OPMERKING: Na 4 dagen differentiatie wordt het gehalte aan IL-17A in het supernatans van elke groep weergegeven in figuur 4. De aanpasmethode kan verwijzen naar de Orgin21-software. De standaardcurve die uit dit experiment is verkregen, heeft een R2-waarde van 0,9946.

7. T-celdifferentiatie door middel van signatuur genexpressietesten via kwantitatieve PCR (qPCR)

OPMERKING: Om de mogelijkheid van instabiliteit van flowcytometrie als gevolg van de effecten van kleurstoffen en fixatie/ruptuur uit te sluiten, hebben we de expressie van karakteristieke genen gedetecteerd door qPCR om het differentiatie-effect van pathogene Th17 op transcriptioneel niveau op te helderen.

  1. Meet het aantal cellen aan het einde van de T-celcultuur. Verzamel de cellen in centrifugebuisjes van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g . Gooi alle supernatanten voorzichtig weg.
  2. RNA-extractie
    OPMERKING: Het extractieproces moet worden uitgevoerd in een zuurkast of een ultraschone bank om besmetting met RNA-enzymen te voorkomen.
    1. Voeg 500 μL lysisbuffer (bijv. aan 1-2 × 106 cellen) toe aan het monsterbuisje (stap 7.1), schud en meng onmiddellijk tot er geen celmassa meer is en laat het 1 minuut staan.
    2. Voeg het mengsel toe aan de adsorptiekolom die in een opvangbuis is geplaatst, centrifugeer bij 13.400 × g gedurende 30 s en gooi het filtraat weg.
    3. Voeg de aangegeven hoeveelheid absolute ethanol toe aan de wasbufferfles voordat u deze voor de eerste keer gebruikt. Voeg 500 μL wasbuffer toe aan de adsorptiekolom, centrifugeer bij 13.400 × g gedurende 30 s en gooi het filtraat weg.
    4. Herhaal het wassen in stap 7.2.3.
    5. Plaats de adsorptiekolom RA in de lege opvangbuis en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 13.400 × g om de spoeloplossing te verwijderen.
      OPMERKING: De spoeloplossing moet worden verwijderd om te voorkomen dat de resterende ethanol in de spoeloplossing de stroomafwaartse reactie remt.
    6. Verwijder de adsorptiekolom RA en plaats deze in een schone RNasevrije centrifugebuis. Voeg 50 μL RNase-vrij H2O toe aan het midden van het adsorptiemembraan, laat het 1 minuut staan bij kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 1 minuut op 9.600 × g .
  3. Meet de zuiverheid en concentratie van RNA.
  4. Synthetiseer de eerste streng cDNA door de instructies van de fabrikant van de kit te volgen.
    1. Genoom-DNA verwijderen. Neem 500 ng van het geëxtraheerde sjabloon-RNA in een RNase-vrije centrifugebuis; voeg RNase-vrije ddH2O en 4x gDNA-mix toe om een mengsel te vormen. Meng voorzichtig met een pipet en plaats in een waterbad van 42 °C gedurende 2 min.
      OPMERKING: De hoeveelheid van het reactiemengsel en de toegevoegde hoeveelheid zijn gerelateerd aan de RNA-concentratie; Raadpleeg de instructies in detail. In dit experiment werd het reactiesysteem van 20 μL gebruikt.
    2. Voeg direct een 5x reverse transcriptie reactiesysteem toe aan de reactiebuis van de vorige stap. Neem 4 μl van het omgekeerde transcriptiereactiesysteem en 16 μl van het mengsel van de vorige stap en meng voorzichtig met een pipet.
      OPMERKING: Het reverse transcriptiesysteem bevat alle vereiste reverse transcriptase, wat een direct geconfigureerd reverse transcriptiesysteem is.
    3. Stel de omgekeerde transcriptiereactie in: 37 °C 15 min, 85 °C, 5 s en koel tenslotte af tot 4 °C.
  5. Stel de PCR-reactie in volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Voeg 10 μL 2x PCR-reactie-enzymmengsel toe aan de qPCR-buis, 0,4 μL primer 1, 0,4 μL primer 2, 0,4 μL 50x ROX Reference Dye 1, 2 μL sjabloon cDNA en 6,8 μL ddH2O om een mengsel van 20 μL te bereiden.
    2. Voer PCR uit in het real-time kwantitatieve PCR-instrument voor fluorescentie met behulp van de volgende instellingen: fase 1, 95 °C, 30 s, Rep x 1; fase 2, eerst 95 °C, 10 s, dan 60 °C, 30 s, Rep x 40; fase 3, eerst 95 °C, 15 s, vervolgens 60 °C, 60 s, tenslotte 95 °C, 15 s, Rep x 1.
      OPMERKING: Na 4 dagen differentiatie worden de relatieve expressieniveaus van Il17a, Il17f, Rara en Il23r in naïeve CD4+ T-cellen weergegeven in figuur 5.

Resultaten

Ons protocol is ontwikkeld op basis van eerder onderzoek naar pathogene Th17-celdifferentiatie. De eerste stap van het experiment is het detecteren van de zuiverheid van naïeve CD4+ T-cellen geïsoleerd uit de milt door magnetische kralensortering, wat de basis is voor het succes van onze daaropvolgende pathogene Th17-celdifferentiatie. De zuiverheid van naïeve CD4+ T-cellen werd gedetecteerd met behulp van oppervlaktemarkers CD62L23 en CD4424 , terwijl FOXP325 werd gebruikt als marker van Treg-cellen. We ontdekten dat het gehalte aan Treg-cellen aanzienlijk was verminderd na het sorteren en dat de zuiverheid van naïeve CD4+ T-cellen ten minste 95% kon bereiken (Figuur 1). Om de differentiatie van pathogene Th17-cellen te vergelijken, werden naïeve CD4+ T-cellen gedurende in totaal 5 dagen gekweekt met Th0-medium (Tabel 1) en Th17-differentiatiemedium (Tabel 1). Het bleek dat T-cellen clustergroei vertoonden in zowel Th0- als Th17-media (Figuur 2).

Vervolgens werden de cellen gefixeerd, gepermeabiliseerd en gelabeld met antilichamen tegen verschillende cytokines in gedifferentieerde CD4+ T-cellen op basis van flowcytometrie. We onderzochten IL17A26 en RORγT27 als de kenmerkende cytokinen van Th17-celdifferentiatie en ontdekten dat 90% van de naïeve CD4+ T-cellen met succes differentieerde tot pathogene Th17-cellen onder stimulatie van nieuw Th17-celkweekmedium (Figuur 3). Figuur 5 toont de kenmerkende genen van Th17-cellen gedetecteerd door PCR, wat bewees dat de pathogene Th17-cellen die we door differentiatie verkregen, stabiel tot expressie kwamen.

figure-results-1
Figuur 1: Gating-strategie voor analyse van kenmerkende cytokinen in C57BL/6J-muizen voor en na naïeve CD4+ T-celisolatie. Afkortingen: FSC-H = voorwaartse verstrooiingspiekhoogte; SSC-H = zijwaartse scatter-peah hoogte; FSC-A = voorwaarts verstrooiingspiekgebied; FITC = fluoresceïne isothiocyanaat; PE = fycoerythrine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve beelden van muizennaïeve CD4+ T-cellen die gedurende 5 dagen onder pathogene Th17- en Th0-omstandigheden zijn gekweekt. (A) Th0-cellen; B) pathogene Th17-cellen. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Flowcytometrieanalyse na differentiatie geïnduceerd door Th0-celkweekmedium en Th17-celkweekmedium. Afkortingen: FSC-H = voorwaartse verstrooiingspiekhoogte; SSC-H = zijwaartse scatter-peah hoogte; FSC-A = voorwaarts verstrooiingspiekgebied; FITC = fluoresceïne isothiocyanaat; PE = fycoerythrine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Het gehalte van IL-17A in het supernatans van Th0 celkweekmedium en Th17 celkweekmedium na inductie van differentiatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Representatieve resultaten van de expressieniveaus van kenmerkende cytokinen in gedifferentieerde CD4+ T-cellen van C57BL/6J muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Doelpathogeen Th17-celkweekmediumTh0 celkweek mediumKlassiek niet-pathogeen Th17-celkweekmediumKlassiek pathogeen Th17 celkweekmedium.
ReagensUiteindelijke concentratieAantalUiteindelijke concentratieAantalUiteindelijke concentratieAantalUiteindelijke concentratieAantal
Penicilline-Streptomycine (100x)1x500 μL1x500 μL1x500 μL1x500 μL
Foetaal runderserum10%5 ml10%5 ml10%5 ml10%5 ml
β-mercaptoethanol50 μM50 μL50 μM50 μL50 μM50 μL50 μM50 μL
GlutaMAXTM supplement (100x)1x500 μL1x500 μL1x500 μL1x500 μL
Natriumpyruvaatoplossing (100x)1 mM500 μL1 mM500 μL1 mM500 μL1 mM500 μL
Anti-muis IFN-gamma (1 mg/ml)5 μg/ml250 μL10 μg/ml500 μL10 μg/ml500 μL
Anti-muis IL-4 (2 mg/ml)5 μg/ml125 μL5 μg/ml250 μL10 μg/ml250 μL
Muis rIL-1 bèta (20 μg)20 ng/mlN.v.t.
Muis rIL-6 (20 μg)20 ng/mlN.v.t.50 ng/mlN.v.t.50 ng/mlN.v.t.
Muis rIL-23 (50 μg)50 ng/mlN.v.t.10 ng/mlN.v.t.
Muis TGF bèta (100 μg)3 ng/mlN.v.t.1 ng/mlN.v.t.1 ng/mlN.v.t.
Muizen IL-2 (5 μg)20 ng/mlN.v.t.
RPMI 1640N.v.t.Tot 50 mlN.v.t.Tot 50 mlN.v.t.Tot 50 ml
TotaalN.v.t.50 mlN.v.t.50 mlN.v.t.50 ml

Tabel 1: Doelpathogene Th17-celcultuur, Th0-celcultuur, klassieke niet-pathogene en pathogene Th17-celcultuurmedia.

Discussie

Deze procedure bood een productieve manier om het aantal muizen milt-naïeve CD4+ T-cellen te verhogen voor de in vitro productie van pathogene Th17-cellen. Hoewel we meer cytokinen gebruiken dan andere gerapporteerde Th17-celkweekmedia, zetten we ons in om de groeiomstandigheden van pathogene Th17-cellen te optimaliseren. We overwegen om ons geïnduceerde differentiatieprotocol verder te optimaliseren.

Hier gebruikten we gewoon flowcytometrie en qPCR om de productie van kenmerkende cytokines te onderzoeken. Met een paar kleine aanpassingen kan deze aanpak ook worden gebruikt voor andere functietests, zoals celproliferatie.

We gebruikten een in China geproduceerde isolatiekit voor lymfocyten om miltlymfocyten van muizen te isoleren, omdat dit effectief en tijdbesparend is. Oplossingen voor het scheiden van lymfocyten op basis van andere merken kunnen ook het doel bereiken om miltlymfocyten van muizen via verschillende stappen te scheiden. Een andere methode is om de rode bloedcellen van de verkregen miltcelsuspensie direct te lyseren; We ontdekten echter dat rode bloedcellen van de milt vaak niet in één keer kunnen worden gelyseerd.

Tijdens de uitvoering van dit protocol kunnen zich enkele problemen voordoen. Ten eerste kan het aantal naïeve CD4+ T-cellen verkregen door magnetische kralensortering zeer laag zijn (protocolstap 3). Dit kan worden toegeschreven aan het feit dat het proces van het verpletteren van organen onvoldoende is. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het orgaan goed wordt gehomogeniseerd. Door de frequentie van het spoelen tijdens het homogenisatieproces te verhogen, wordt het herstelpercentage verbeterd. Om een hoger aantal milt-naïeve CD4+ T-cellen te verkrijgen, raden we aan om jongere muizen (6-10 weken oud) te gebruiken. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het scheiden van miltlymfocyten en het rendement kan variëren afhankelijk van de gebruikte scheidingsvloeistof. Het wordt aanbevolen om een universeel gecertificeerde scheidingsvloeistof te gebruiken en te proberen de lymfocytenlaag zoveel mogelijk te extraheren.

Ten tweede kan het aandeel CD4+ T-cellen in flowcytometrie <80% zijn (protocolstap 5). Een mogelijke oorzaak van dit probleem kan een onnauwkeurig aantal splenocyten zijn, wat resulteert in een celgetal dat groter is dan dat van de extra antilichaamcocktail en magnetische kralen. Om de effectiviteit van naïeve CD4+ T-celzuivering te vergroten, moet het tellen van cellen nauwkeurig zijn. Bovendien kunnen 10% meer antilichaamcocktail en magnetische kralen worden gebruikt dan wat dit protocol aanbeveelt. Ten slotte kan flowcytometrie onmiddellijk na het sorteren van naïeve CD4+ T-cellen worden uitgevoerd.

Ten derde zijn er mogelijk niet veel T-celclusters gevormd tijdens de kweek en zijn de meeste cellen mogelijk afgestorven tijdens de differentiatie van T-cellen (protocolstap 4). De mogelijke reden voor dit probleem kan de onnauwkeurige bepaling van het aantal cellen voor naïeve CD4+ T-cellen zijn vóór het zaaien, wat resulteert in een lage celdichtheid. Het wordt aanbevolen om een nauwkeurigere telmethode toe te passen om de gewenste celdichtheid van ongeveer 4 × 105 cellen/ml te bereiken voor elk putje in een plaat met 48 putjes. Een andere mogelijke oorzaak kunnen technische problemen met de CO2 -incubator zijn, zoals een verkeerde temperatuur of CO2 -concentratie. Ten slotte kan overmatige kracht tijdens het veranderen van het celkweekmedium mogelijk celdood veroorzaken.

Ten vierde kunnen de relatieve expressieniveaus van de kenmerkende cytokinegenen laag zijn (protocolstap 7). Om de authenticiteit van het geëxtraheerde RNA te garanderen, wordt aanbevolen om een nanodruppeldetectieconcentratie van meer dan 100 ng/ml te gebruiken. De mogelijke reden voor de afname van de concentratie kan de ongezonde aard van gekweekte cellen zijn, zoals een groot deel van de verzamelde cellen is dood of aan het sterven is. Om de werkelijke RNA-concentratie te verkrijgen, is het noodzakelijk om de situatie op te lossen die kan leiden tot slechte groei tijdens de celcultuur. Een alternatieve reden achter deze bezorgdheid zou het te lage uiteindelijke celgetal kunnen zijn dat wordt bereikt tijdens RNA-extractie, mogelijk als gevolg van onbedoeld celverlies tijdens de verwijdering van het supernatans. Het gebruik van geavanceerde RNA-extractietechnieken, zoals eenstaps RNA-extractiekits, kan voordelig zijn. De ideale OD260/OD280-verhouding, zoals gemeten door Nanodrop, zou binnen het bereik van 1,9-2,1 moeten liggen. Bij een te lage verhouding wordt eiwitcontaminatie mogelijk. Het verhogen van de frequentie van RNase-vrije bufferwassen kan helpen om dit probleem te verminderen. Omgekeerd impliceert een ongewoon lage verhouding mogelijke RNA-degradatie. Om dit probleem tegen te gaan, wordt aanbevolen om RNasevrij water te gebruiken en buisjes van 1,5 ml te gebruiken voor RNase-ontsmettingsdoeleinden.

Concluderend beschrijft het huidige protocol het gebruik van nieuw celkweekmedium om naïeve CD4+ T-cellen direct te induceren om in vitro te differentiëren tot pathogene Th17-cellen. Vergeleken met directe scheiding lijdt het geen twijfel dat deze methode directer, goedkoper en efficiënter is. De configuratie van het medium is ook heel eenvoudig, zodat de geconstrueerde Th17-cellen intuïtiever kunnen worden gebruikt voor latere experimenten, wat een zeer goed celmodel oplevert voor de studie van vele ziekten.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Dankbetuigingen

Het werk werd ondersteund door het National Key R&D-programma van China (nr. 2022YFC2304604), de National Natural Science Foundation of China (nr. 81971812), de National Natural Science Foundation of China (nr. 82272235), de Science Foundation van de Commissie voor Gezondheid van de provincie Jiangsu (nr. ZDB2020009), Jiangsu Province Key Research, Development Program (Social Development) Special Project (No.BE2021734), National Key R & D-programma van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (No.2020YFC083700), Jiangsu Provincial Key Laboratory of Critical Care Medicine (BM2020004), Sleutelproject van de National Natural Science Foundation of China (81930058), National Natural Science Foundation of China (82171717), Central Universities Basic Research Funds (2242022K4007), en het algemene project van de Jiangsu Provincial Natural Science Foundation (BK20211170).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen
Rat anti-mouse CD62L, BV650, clone MEL-14, 1:200 verdunningBDCat# 564108; RRID: AB_2738597
Rat monoklonaal anti-CD4, FITC, clone RM4-5, 1:200 verdunningBioLegendCat#100509; RRID: AB_312712
Rat monoklonaal anti-IL-17A, PE, clone TC11-18H10.1, 1:200 verdunningBioLegendCat#506903; RRID: AB_ 315463
Rat monoklonaal anti mouse/human CD44, APC, clone IM&, 1:200 verdunningBioLegendCat#103012; RRID: AB_312963
Rat monoklonaal anti-RORγT, APC, clone B2D, 1:200 verdunningInvitrogenCat#17-6981-80; RRID: AB_2573253
Rat monoklonaal FOXP3 antilichaam, PE, clone FJK-16s, 1:200 verdunningInvitrogenCat#12-5773-82; RRID: AB_465936
Chemicaliën, peptiden en recombinante eiwitten
Anti-Mouse CD3 SAFIRE gezuiverdbiogemsCat#05112-25
Anti-Mouse CD28 SAFIRE gezuiverdbiogemsCat#10312-25
Anti-Mouse IFN gammabiogemsCat#80822-25
Anti-Mouse IL-4biogemsCat#81112-25
EthanolXilong scientificCat#64-17-5
Foetaal bovien serumGibcoCat#10437-028
FcR Blocking reagensMiltenyi BiotecCat#130-092-575
GlutaMAX supplementgibcoCat#35050079
Mouse rIL-1 betaSino BiologicalCat#50101-MNAE
Mouse rIL-6Sino BiologicalCat#50136-MNAE
Mouse rIL-23Sino BiologicalCat#CT028-M08H
Mouse TGF beta 1Sino BiologicalCat#50698-M08H
PBSProcellCat#PB180327
Recombinant Murine IL-2peprotechCat#212-12
RPMI 1640 met L-glutamineGibcoCat#11875-119
Penicilline-streptomycine oplossingGibcoCat#15070063
β-mercaptoethanolSigma-AldrichCat#M6250-100ML
Kritische commerciële assays
Animal Organ Lymphocyte Separation Solution KitTbdscienceCat#TBD0018SOPBevat dierlijke spleen weefsel lymfocyt separatie vloeistof, weefsel monster verdunning (kat nr. 2010C1119), monster reinigingsoplossing (kat nr. 2010X1118), monster wasoplossing (kat nr. TBTDM-W), weefsel homogenaat spoelvloeistof (F2013TBD)
ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)VazymeCat#Q341-02https://www.vazymebiotech.com/product-center/chamq-sybr-qpcr-master-mix-high-rox-premixed-q341.html.
Fixatie/permeabilisatie ConcentraatinvitrogenCat#00-5123-43
Fixatie / Permeabilisatie DiluentinvitrogenCat#00-5223-56
Fixable Viability Dye EF506invitrogenCat#65-0866
HiScript II Q RT SuperMix voor qPCR (+gDNA wiper)VazymeCat#R223-01https://www.vazymebiotech.com/product-center/hiscript-ii-q-rt-supermix-for-qpcr-gdna-wiper-r223.html.
Leukocyte Activatie CocktailBDCat#550583
Mouse IL-17A (Interleukine 17A) ELISA KitElabscience®Cat#E-EL-M0047
Naïve CD4+ T cellen isolatie kit, muisSTEMCELLCat#19765EasySep kit bevat muis CD4+ T cel isolatie cocktail [kat nr. 19852C.1], muis geheugen T cel depletie cocktail [kat nr. 18766C], streptavidin RapidSphered 50001 [kat nr. 50001], normaal rat serum [kat nr. 13551]); bewaar alleen rat serum op -20 °C; andere componenten moeten worden bewaard bij 2-8 °C.
Permeabilisatie BufferinvitrogenCat#00-8333-56
SPARKeasy Cell RNA KitSparkjadeCat#AC0205-Bhttps://www.sparkjade.com/product/detail?id=85
Experimentele modellen: Organismen/stammen
Muis: C57BL/6GempharmatechCat#000013
Oligonucleotiden
Mouse Il17a TaqMan primers met proberibobioNA
Mouse Il17f TaqMan primers met proberibobioNA
Mouse Il23r TaqMan primers met proberibobioNA
Mouse Rora TaqMan primers met proberibobioNA
β-actine TaqMan primers met proberibobioNA
Software en algoritmen
Cytek AuroraCytekhttps://spectrum.cytekbio.com/
FlowJo v10.8.1Tree Starhttps://www.flowjo.com
GraphPad prism 9GraphPad Softwarehttps://www.graph

Referenties

  1. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  2. Bhaumik, S., Basu, R. Cellular and molecular dynamics of Th17 differentiation and its developmental plasticity in the intestinal immune response. Front Immunol. 8, 254(2017).
  3. Bettelli, E., Korn, T., Oukka, M., Kuchroo, V. K. Induction and effector functions of T(H)17 cells. Nature. 453 (7198), 1051-1057 (2008).
  4. Korn, T., et al. IL-21 initiates an alternative pathway to induce proinflammatory T(H)17 cells. Nature. 448 (7152), 484-487 (2007).
  5. Bettelli, E., et al. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441 (7090), 235-238 (2006).
  6. Yang, X. O., et al. T helper 17 lineage differentiation is programmed by orphan nuclear receptors ROR alpha and ROR gamma. Immunity. 28 (1), 29-39 (2008).
  7. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
  8. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  9. McGeachy, M. J., et al. The interleukin 23 receptor is essential for the terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo. Nat Immunol. 10 (3), 314-324 (2009).
  10. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323 (2021).
  11. Ramesh, R., et al. Pro-inflammatory human Th17 cells selectively express P-glycoprotein and are refractory to glucocorticoids. J Exp Med. 211 (1), 89-104 (2014).
  12. Basdeo, S. A., et al. Ex-Th17 (nonclassical Th1) cells are functionally distinct from classical Th1 and Th17 cells and are not constrained by regulatory T cells. J Immunol. 198 (6), 2249-2259 (2017).
  13. Cua, D. J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421 (6924), 744-748 (2003).
  14. Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182 (10), 5904-5908 (2009).
  15. Jäger, A., Dardalhon, V., Sobel, R. A., Bettelli, E., Kuchroo, V. K. Th1, Th17, and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different pathological phenotypes. J Immunol. 183 (11), 7169-7177 (2009).
  16. Lee, Y., Collins, M., Kuchroo, V. K. Unexpected targets and triggers of autoimmunity. J Clin Immunol. 34, Suppl 1 (0 1) S56-S60 (2014).
  17. Chang, D., et al. The conserved non-coding aequences CNS6 and CNS9 control cytokine-induced Rorc transcription during T helper 17 cell differentiation. Immunity. 53 (3), 614-626 (2020).
  18. Bunte, K., Beikler, T. Th17 cells and the IL-23/IL-17 axis in the pathogenesis of periodontitis and immune-mediated inflammatory diseases. Int J Mol Sci. 20 (14), 3394(2019).
  19. Zhao, Y., Liu, Z., Qin, L., Wang, T., Bai, O. Insights into the mechanisms of Th17 differentiation and the Yin-Yang of Th17 cells in human diseases. Mol Immunol. 134, 109-117 (2021).
  20. Berghmans, N., et al. Interferon-γ orchestrates the number and function of Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Interferon Cytokine Res. 31 (7), 575-587 (2011).
  21. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic Th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  22. Du, L., et al. Growth hormone releasing hormone signaling promotes Th17 cell differentiation and autoimmune inflammation. Nat Commun. 14 (1), 3298(2023).
  23. Ernst, D. N., Weigle, W. O., Noonan, D. J., McQuitty, D. N., Hobbs, M. V. The age-associated increase in IFN-gamma synthesis by mouse CD8+ T cells correlates with shifts in the frequencies of cell subsets defined by membrane CD44, CD45RB, 3G11, and MEL-14 expression. J Immunol. 151 (2), 575-587 (1993).
  24. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  25. El-Hindi, K., et al. T-cell-specific CerS4 depletion prolonged inflammation and enhanced tumor burden in the AOM/DSS-induced CAC model. Int J Mol Sci. 23 (3), 1866(2022).
  26. Cooney, L. A., Towery, K., Endres, J., Fox, D. A. Sensitivity and resistance to regulation by IL-4 during Th17 maturation. J Immunol. 187 (9), 4440-4450 (2011).
  27. Zhu, X., et al. A novel interleukin-2-based fusion molecule, HCW9302, differentially promotes regulatory T cell expansion to treat atherosclerosis in mice. Front Immunol. 14, 1114802(2023).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Th17 celdifferentiatieisolatie van muismiltcellenmagnetische kraalsorteringflowcytometriecelcultuurmediumauto immuunziektemodellenlymfocytenscheiding
In vitro differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.