Bereiding van zinkoxide nanodeeltjes en de evaluatie van hun antibacteriële effecten

Samenvatting

In deze studie werden zinkoxide nanodeeltjes gesynthetiseerd met behulp van een precipitatiemethode. Het antibacteriële effect van de gesynthetiseerde deeltjes werd getest tegen multiresistente meticilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en Pseudomonas aeruginosa.

Samenvatting

Nosocomiale bacteriële infecties zijn een steeds grotere uitdaging geworden vanwege hun inherente resistentie tegen antibiotica. De opkomst van multiresistente bacteriestammen in ziekenhuizen wordt toegeschreven aan het uitgebreide en gevarieerde gebruik van antibiotica, waardoor het probleem van antibioticaresistentie verder wordt verergerd. Metalen nanomaterialen zijn op grote schaal bestudeerd als een alternatieve oplossing voor het uitroeien van antibioticaresistente bacteriële cellen. Metalen nanodeeltjes vallen bacteriële cellen aan via verschillende mechanismen, zoals het vrijkomen van antibacteriële ionen, het genereren van reactieve zuurstofsoorten of fysieke verstoring, waartegen bacteriën geen resistentie kunnen ontwikkelen. Onder de actief onderzochte antimicrobiële metaalnanodeeltjes staan zinkoxide-nanodeeltjes, die door de FDA zijn goedgekeurd, bekend om hun biocompatibiliteit en antibacteriële eigenschappen. In deze studie hebben we ons gericht op het succesvol ontwikkelen van een precipitatiemethode voor het synthetiseren van zinkoxide nanodeeltjes, het analyseren van de eigenschappen van deze nanodeeltjes en het uitvoeren van antimicrobiële tests. Zinkoxide nanodeeltjes werden gekarakteriseerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), dynamische lichtverstrooiing (DLS), ultraviolette/zichtbare spectroscopie en röntgendiffractie (XRD). Antibacteriële tests werden uitgevoerd met behulp van de bouillon-microverdunningstest met de multiresistente stammen van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en Pseudomonas aeruginosa. Deze studie toonde het potentieel van zinkoxide nanodeeltjes aan bij het remmen van de proliferatie van antibioticaresistente bacteriën.

Inleiding

Multiresistente (MDR) bacteriële infecties vormen een aanzienlijke wereldwijde bedreiging voor de menselijke gezondheid¹. Aangezien deze infecties dodelijk kunnen zijn bij patiënten met onderliggende aandoeningen, probeert actief onderzoek dit probleem aan te pakken². Bacteriën zijn geëvolueerd om de werking van verschillende medicijnen te ontwijken. Penicilline, algemeen bekend en gecrediteerd voor het redden van miljoenen levens wereldwijd, is een β-lactam antibioticum dat de synthese van de bacteriële celwand remt^. Bacteriën zijn echter geëvolueerd om de werkzaamheid van geneesmiddelen te neutraliseren via verschillende mechanismen, zoals effluxpompen, transpeptidaseveranderingen of verminderde permeabiliteit⁴. Bovendien kunnen bacteriële cellen deze resistentiegenen doorgeven aan de volgende generatie, waardoor de overlevingskansen van de volgende generatie toenemen en het probleem van resistente stammen wordt versterkt^.

De toename van antibioticaresistente bacteriën heeft geleid tot de opkomst van MDR-bacteriën, die vaak resistent zijn tegen meerdere antibiotica. MDR-stammen worden het vaakst aangetroffen in ziekenhuisomgevingen, waar meerdere bacteriestammen worden blootgesteld aan en bijgevolg resistentie ontwikkelen tegen verschillende antibiotica⁶. Staphylococcus aureus, met name methicilline-resistente S. aureus (MRSA), is een grampositieve commensale bacterie die clusters vormt op de huid van ongeveer 30% van de mensen ^7,8. MRSA, dat voor het eerst werd geïdentificeerd in de jaren 1960, vertoont een verminderde gevoeligheid voor β-lactam-antibiotica, wat resulteert in een sterke toename van het aantal infecties sinds^{de jaren} 1990. Onder gramnegatieve bacteriën is Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) een van de meest voorkomende stammen die in ziekenhuizen worden verworven. Deze soort, een facultatieve staafvormige bacterie, veroorzaakt opportunistische infecties bij de mens¹⁰. Met name MDR-stammen die rechtstreeks van invloed zijn op de menselijke gezondheid zijn verantwoordelijk voor meer dan 50 % van de zorggerelateerde infecties¹¹. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de meest voorkomende multiresistente stammen in ziekenhuizen, MRSA en P. aeruginosa.

Het gebruik van nanodeeltjes (NP's) voor antimicrobiële doeleinden is uitgebreid onderzocht om het probleem van antibioticaresistentie aan te pakken. Met name metallische NP's induceren bacteriële celdood via verschillende mechanismen, wat een mogelijke oplossing biedt voor het probleem van resistentie tegen geneesmiddelen. Metallische NP's oefenen antimicrobiële activiteit uit via meerdere mechanismen, waaronder de afgifte van antimicrobiële ionen, het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en fysieke verstoring van cellen, naast^{andere middelen.} NP's bestaande uit zilver, koper, zinkoxide (ZnO) en titaniumoxide hebben een hoge antimicrobiële werkzaamheid en worden daarom actief onderzocht¹³.

ZnO NP's zijn goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor gebruik bij mensen. Omgekeerd wordt het gebruik van zilver en koper NP's, ondanks hun hoge antimicrobiële werkzaamheid, beperkt door hun hoge cytotoxiciteit. ZnO NP's worden echter vaak aangetroffen in het dagelijks leven en zijn zelfs aanwezig in veelgebruikte zonnebrandcrèmeformuleringen¹⁴. Merk op dat Zn^2+- ionen die vrijkomen uit ZnO NP's zeer effectief zijn bij de behandeling van bacteriën, waarbij bacteriële celdood wordt geïnduceerd door het genereren van ROS en andere fysieke schademechanismen¹⁵.

Deze studie schetst het protocol voor het synthetiseren van ZnO-nanodeeltjes (NP's) met behulp van een precipitatiemethode en introduceert een antimicrobiële testbenadering met behulp van een microbouillonverdunningsmethode met klinische monsters van MRSA en P. aeruginosa. De precipitatiemethode voor ZnO NP's omvat het synthetiseren van onoplosbare vaste ZnO NP's door pH en temperatuur aan te passen met behulp van oplosbare precursoren zoals zinkacetaat of zinknitraat¹⁶. Samen met een relatief gemakkelijke en snelle productie, zorgt deze methode voor herhaalbaarheid in de synthese en vergemakkelijkt het de controle over de deeltjesgrootte en morfologie¹⁷. In dit syntheseprotocol werd natriumhydroxide (NaOH), een van de meest gebruikte precipitatiemiddelen, gebruikt om zinkacetaat neer te slaan, en een kleine hoeveelheid hexadecyltrimethylammoniumbromide (CTAB) werd gebruikt om de ongecontroleerde synthese van de^{nanodeeltjes te} remmen. Onder verschillende antimicrobiële tests werd de antibacteriële activiteit van ZnO-nanodeeltjes geëvalueerd met behulp van de microbouillonverdunningsmethode, die optische interferentie van metaaloxide-nanodeeltjes vermijdt en directe koloniemeting mogelijk maakt voor het bepalen van MIC¹⁹.

Protocol

De reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van zinkoxide nanodeeltjes

1. Meet 200 ml absolute ethylalcohol af en giet deze in een glazen kolf met ronde bodem.
2. Plaats de kolf met ronde bodem op een verwarmingsmantel en blijf roeren op 25-40 °C.
3. Meet 500 mg CTAB af in een injectieflacon van 50 ml en voeg dit toe aan de ethylalcohol in de kolf. Roer tot CTAB volledig is opgelost.
4. Voeg 1,4 g zinkacetaat toe aan de oplossing en roer tot het volledig is opgelost.
5. Verhoog de temperatuur van de oplossing door de temperatuur van de verwarmingsmantel in te stellen op 70 °C.
6. Voeg 25 ml 0,5 M NaOH-oplossing toe aan het mengsel en laat het 1 uur reageren tot de heldere oplossing wit van kleur is.
7. Aliquot de oplossing aan conische buizen van 50 ml, centrifugeer bij 15000 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant vervolgens weg.
8. Voeg 10 ml gedestilleerd water toe aan een van de conische buizen en resuspendeer de nanodeeltjes door de oplossing te soniseren. Breng de gesuspendeerde oplossing over in een andere conische buis met de ZnO-pellet en herhaal dit totdat alle ZnO-oplossingen in één conische buis zijn verzameld.
9. Was de nanodeeltjes door centrifugatie bij 15000 × g gedurende 15 minuten (kamertemperatuur), verwijder het supernatant en resuspendeer in gedestilleerd water. Controleer de pH van de bovendrijvende oplossing met behulp van pH-testpapier en herhaal dit totdat de pH van de oplossing neutraal wordt.
   OPMERKING: Wanneer de pH van de supernatansoplossing neutraal wordt (pH = 7), gooi de supernatansoplossing dan weg en repuseer deze niet opnieuw met gedestilleerd water.
10. Droog de monsterpallet gedurende 24 uur vacuüm bij 60 °C en verkrijg het ZnO NP-poeder.

2. Antibacteriële tests met MRSA en P. aeruginosa

1. Bacteriecultuur
   OPMERKING: Klinische MDR-bacteriestammen werden verkregen uit het Chung-Ang University Hospital, Seoul, Zuid-Korea.
   1. Haal MRSA- en P. aeruginosa-bacteriestammen opgeslagen in tryptische sojabouillon (TSB) uit de diepvriezer.
   2. Na het ontdooien van de bacteriële oplossingen, veegt u de oplossing op een Tryptic Soy Agar (TSA) plaat met behulp van een wegwerpinoculatielus. Plaats de gestreepte agarplaten in de broedmachine en broed ze 24 uur incuberen.
      OPMERKING: Een enkele kolonie geplukt van de TSA-plaat werd toegevoegd aan 10 ml TSB-media in een conische buis van 50 ml met behulp van een bacteriële inoculatielus. Bacteriën werden gedurende 24 uur gekweekt. Bacteriën werden gekweekt onder aërobe kweekomstandigheden bij 37 °C.
   3. Om de concentratie van de bacterieoplossing te meten, verdunt u de gekweekte oplossing met behulp van 10-voudige seriële verdunning tot ^10-6 met gedestilleerd water. Plaats daarna 50 μL van de verdunde oplossing op TSA-platen en verdeel de oplossing met behulp van een L-vormige spreider.
   4. Incubeer de platen 24 uur in de incubator.
      OPMERKING: Kolonies werden optisch geteld en de concentratie van de gekweekte oplossing werd berekend door de verdunningsfactoren te vermenigvuldigen met het aantal getelde kolonies.
2. Bacteriële bemonstering
   1. Om een breed scala aan ZnO-concentraties te testen, bereidt u 2 mg/ml ZnO NPs-oplossing met behulp van Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) en voert u 2-voudige seriële verdunning uit om verschillende concentraties te maken.
      OPMERKING: 1000 μg/ml, 500 μg/ml, 250 μg/ml, 125 μg/ml en 62,5 μg/ml werden getest.
   2. Voeg 100 μL toe voor elk van de geteste concentraties van ZnO NP's aan een plaat met 96 putjes.
      OPMERKING: Gebruik het dubbele (2x) van de uiteindelijk gewenste concentratie ZnO NP's, aangezien elk monster in de put wordt verdund met de toevoeging van 100 μL bacteriecultuur. Gebruik een 2% antibiotica-antimycoticum (A/A) oplossing als positieve controle en DPBS als negatieve controle. A/A is een antibioticumcomplex van penicilline en streptomycine, dat effectief is tegen respectievelijk grampositieve en gramnegatieve bacteriën.
   3. Verdun de bacteriecultuur tot 1 ×^{10 6} kve/ml met behulp van TSB-media en voeg 100 μl toe aan elk putje dat verschillende concentraties ZnO NP's bevat.
      OPMERKING: De initiële concentraties van MRSA- en P. aeruginosa-kweekoplossing waren 3 x 10⁹ kve/ml. Bacteriecultuurconcentratie 1 x 10⁶ kve/ml werd gemaakt door 1/20 en 1/150 verdunning van de kweekoplossing. Na menging met 100 μL ZnO NP's zal de uiteindelijke concentratie bacteriën 5 × 10⁵ kve/ml zijn.
   4. Plaats de plaat met 96 putjes in een incubator van 37 °C en incubeer gedurende 24 uur.
3. Bacteriële verspreiding
   1. Pipetteer 100 μL uit elk putje en bereid verschillende 10-voudige seriële verdunningen voor tot ^10-6.
      OPMERKING: Voeg 100 μL ZnO NP's met bacteriële oplossing toe aan 900 μL gesteriliseerd gedestilleerd water en herhaal 6 keer.
   2. Pipetteer 50 μl uit vier verdunde oplossingen en voeg toe aan TSA-mediaplaten. Gebruik een L-vormige celverdeler om de bacteriële suspensie op de agarplaat te verspreiden.
      OPMERKING: Gebruik de verdunningen 10⁰, ^10-2, ^10-4 en ^10-6 . Voer alle experimenten in drievoud uit. Spreid uit totdat alle bacteriële oplossing op de agarplaat is opgenomen.
   3. Plaats de agarplaten in een incubator van 37 °C en incubeer gedurende 24 uur.
4. Bacteriële CFU tellen
   1. Selecteer een verdunningsfactor die voor elke groep telbaar is. Markeer alle kolonies in de telbare verdunningsplaat en bereken opnieuw zodat de concentratie # kve/ml wordt.
      OPMERKING: De telbare verdunningsfactor geeft platen aan die 20-100 CFU op een individuele plaat hebben. Aanvankelijk getelde concentratieresultaten # van getelde kve/50 μl. Bepaal met behulp van de uitgespreide plaat met de onverdunde bacterieoplossing de potentiële minimale bacteriedodende concentratie.
   2. Gebruik de verkregen gegevens om het percentage levende bacteriën weer te geven ten opzichte van die in de negatieve controlegroep.
      OPMERKING: Percentage levende bacteriën (%) =

Resultaten

De succesvolle synthese van ZnO NP's werd bevestigd met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), zoals weergegeven in figuur 1A. De verkregen ZnO NP's bleken rond van vorm te zijn, met een gemiddelde deeltjesgrootte van 35,35 nm en een standaarddeviatie van 6,81 nm. De precipitatie van deze nanodeeltjes werd waargenomen door een dubbele verplaatsingsreactie door NaOH-oplossing toe te voegen aan zinkacetaat, waar Zn²⁺ -ionen hydrolyse on...

Discussie

De synthese van ZnO NP's via neerslag is relatief eenvoudig en ongecompliceerd. Om ZnO NP's met succes te synthetiseren met behulp van deze methode, is roeren cruciaal om ervoor te zorgen dat de voorloper (zinkacetaat) volledig is opgelost in het oplosmiddel. Bovendien helpt het verhogen van de temperatuur om een succesvolle dubbele verplaatsingsreactie te induceren. Bij de synthese van ZnO NP's zijn er veel factoren die de grootte en vorm bepalen, waaronder het neerslagmiddel, ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DLS	Zetasizer Pro
Ethyl alcohol, absolute	DAEJUNG	4023-2304
Microplate reader	BioTeck
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
TEM	JEOL JEM-F200
TSA	DB difco	236950
TSB	DB difco	211825
XRD	NEW D8-Advance
Zinc acetate	Sigma-Aldrich	383317