Dit protocol beschrijft een methodologie om Naegleria gruberi trofozoïeten te transfecteren met een construct dat wordt gehandhaafd tijdens het passeren van trofozoïeten in vitro, evenals door encystment en excystment.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Transfectie van een moleculaire kloon van Naegleria gruberi rDNA in N. gruberi Trophozoïeten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Alle ribosomale genen van Naegleria trophozoïeten worden onderhouden in een gesloten cirkelvormig extrachromosomaal ribosomaal DNA (rDNA) bevattend element (CERE). Hoewel er weinig bekend is over de CERE, toont een volledige genoomsequentieanalyse van drie Naegleria-soorten duidelijk aan dat er geen rDNA-cistrons in het nucleaire genoom voorkomen. Bovendien is een enkele DNA-oorsprong van replicatie in kaart gebracht in de N. gruberi CERE, wat de hypothese ondersteunt dat CERE onafhankelijk van het nucleaire genoom repliceert. Deze CERE-eigenschap suggereert dat het mogelijk zou kunnen zijn om gemanipuleerde CERE te gebruiken om vreemde eiwitten in Naegleria trophozoïeten te introduceren. Als eerste stap in het onderzoeken van het gebruik van een CERE als vector in Naegleria, ontwikkelden we een protocol om N. gruberi te transfecteren met een moleculaire kloon van de N. gruberi CERE gekloond tot pGEM7zf+ (pGRUB). Na transfectie werd pGRUB gemakkelijk gedetecteerd in N. gruberi trophozoïeten gedurende ten minste zeven passages, evenals door encystment en excystment. Als controle werden trofozoïeten getransfecteerd met de ruggengraatvector, pGEM7zf+, zonder de N. gruberi-sequenties (pGEM). pGEM werd niet gedetecteerd na de eerste passage na transfectie in N. gruberi, wat aangeeft dat het niet in staat is om te repliceren in een eukaryoot organisme. Deze studies beschrijven een transfectieprotocol voor Naegleria trophozoïeten en tonen aan dat de bacteriële plasmidesequentie in pGRUB een succesvolle transfectie en replicatie van de getransfecteerde CERE-kloon niet remt. Bovendien zal dit transfectieprotocol van cruciaal belang zijn voor het begrijpen van de minimale sequentie van de CERE die de replicatie ervan in trofozoïeten stimuleert, evenals voor het identificeren van regulerende regio's in de niet-ribosomale sequentie (NRS).
Inleiding
Het geslacht Naegleria omvat meer dan 45 soorten, hoewel het onwaarschijnlijk is dat alle leden van de soort zijn geïdentificeerd1. Naegleria kan in verschillende vormen voorkomen: als trofozoïeten (amoeben), als flagellaten, of, wanneer de middelen zeer beperkt zijn, als cysten 1,2,3,4. Het geslacht Naegleria staat bekend om zijn enige bijzonder gevaarlijke soort, Naegleria fowleri, bekend als 'de hersenetende amoebe' (besproken in 1,2,3,4,5,6,7), die de oorzaak is van de bijna universeel fatale primaire amoebische meningo-encefalitis.
Naegleria codeert hun rDNA op het CERE dat zich in de nucleolus bevindt. Volledige sequencing van het genoom van drie Naegleria-soorten bevestigt de afwezigheid van rDNA in het nucleaire genoom 8,9,10,11. Op basis van de beperkte CERE-sequenties van volledige lengte, varieert de CERE van ongeveer 10 kbp tot 18 kbp in lengte. CERE van elke soort Naegleria draagt een enkel rDNA-cistron (met het 5.8, 18 en 28S ribosomale DNA) op elk van ongeveer 4.000 CERE per cel 12,13,14. Anders dan rDNA heeft elke CERE een grote niet-rDNA-sequentie (NRS). De grootte van CERE varieert per soort; de verschillen zijn voornamelijk te wijten aan de variërende lengte van de NRS, aangezien de rDNA-sequenties sterk geconserveerd zijn in het geslacht 1,15,16,17,18,19,20. Het in kaart brengen van een enkele oorsprong van DNA-replicatie binnen de N. gruberi CERE NRS21 biedt sterke ondersteuning voor de hypothese dat Naegleria CERE onafhankelijk van het nucleaire genoom repliceert.
N. gruberi is een niet-pathogene amoebe die vaak wordt gebruikt om de biologie van Naegleria te bestuderen. We ontwikkelden een methodologie voor het transformeren van N. gruberi trofozoïeten met een CERE-kloon van dezelfde soort om de hypothese te testen dat Naegleria amoeben CERE tolereren en onafhankelijk repliceren binnen de trofozoïeten. Dit werd bereikt door N. gruberi met een volledige kloon van N. gruberi CERE te transformeren in trofozoïeten en het lot van de donor-CERE-kloon te volgen door polymerasekettingreactie (PCR). Een algemeen overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. De hierin gepresenteerde gegevens tonen aan dat de donorkloon kan worden gedetecteerd via ten minste zeven passages in weefselkweek en kan worden gehandhaafd door encystment en excystment. Deze studies vormen de basis voor een middel om te ontleden hoe CERE repliceert, en om het gebruik ervan als vector om Naegleria te transfecteren te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De details van de soorten, reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. De sequentie van de 17.004 basenpaar pGRUB-constructie is opgenomen in aanvullend bestand 1.
1. Kweken van trofozoïeten
- Ontdooi bevroren N. gruberi trofozoïeten bij 37 °C gedurende 3 min.
- Inoculeer trofozoïeten in T25-kolven in gemodificeerd pepton/gistextract/nucleïnezuur/foliumzuur/hemin met 10% foetaal kalfsserum (PYNFH) media plus 2% buffer (dinatriumfosfaat, kaliumdiwaterstoffosfaat).
- Kweek de trofozoïeten bij 25 °C tot ~80% samenvloeiing, waar ze een amoeboïde morfologie vertonen (Figuur 2A).
OPMERKING: Bij het voor het eerst doen herleven van een cultuur van trofozoïeten uit hun bevroren toestand, kan het tot 5-7 dagen duren voordat een T25 samenvloeit. Decanteer media elke 3-4 dagen en vervang ze door nieuwe media. - Leg de confluente kolven 5-10 minuten op ijs om de aangehechte trofozoïeten van het plastic los te maken. Draai de kolf voorzichtig rond om eventuele resterende aanhangende cellen los te maken. De trofozoïeten hebben nu een 'afgeronde' morfologie (Figuur 2B).
- Verdeel de culturen 1:2 tot 1:4 in nieuwe weefselkweekkolven.
- Verwijder de PYNFH en vervang deze door steriele encystmentmiddelen (120 mM natriumchloride, 0,03 mM magnesiumchloride, 1 mM dinatriumfosfaat, 1 mM kaliumdiwaterstoffosfaat, 0,03 mM calciumchloride, 0,02 mM ijzerchloride, pH 6,8)22 om de N. gruberi te encysteren.
OPMERKING: De meeste trofozoïeten raken na 72 uur ingekapseld (Figuur 2C). De excystatie moet binnen 72 uur zijn voltooid. - Verwijder de cysten uit de kolven, centrifugeer bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C en resuspendeer cysten in PYNFH-media met 10% foetaal kalfsserum om de cellen te excysteren. Incubeer bij 25 °C gedurende 24 uur tot de trofozoïeten beginnen te verschijnen.
2. Transfectie van trofozoïeten
- Leg de trofozoïeten op een weefselkweekplaat met 6 putjes platte bodem (1 ml van 1 x 106 trofozoïeten/ml) en kweek bij 25 °C.
- Transfecteer de cellen wanneer ze 70%-80% confluent bereiken (~10,4 x 104 cellen/cm, 2 in clusters met 6 putjes). Verwarm het transfectiereagens voor gebruik tot kamertemperatuur.
- Bereid het plasmide-transfectie-reagensmengsel als volgt voor: 75 ng plasmide-DNA en 0,225 μl transfectiereagens in 200 μl PYNFH-media zonder FBS. Bereid voldoende plasmide-transfectie-reagensmengsel voor om transfectie in tweevoud uit te voeren.
OPMERKING: In dit onderzoek werd een bacterieel plasmide gebruikt dat een kloon van volledige lengte van N. gruberi CERE (pGRUB) bevatte. Leeg plasmide (pGEM) werd gebruikt als negatieve controle (Figuur 3). - Incubeer het plasmide-transfectie-reagensmengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Verwijder ~800 μL medium uit de trofozoiet-monolagen vlak voor transfectie.
- Breng het plasmide-transfectie-reagensmengsel aan op de trofozoïeten.
- Draai de plaat elke 15 minuten voorzichtig rond om te voorkomen dat het medium zich aan de randen van de plaat ophoopt.
- Was de monolagen eenmaal met 2 ml groeimedium na 1 uur incubatie bij 25 °C.
- Behandel de monolagen met 10 U DNase in 1 ml 10x DNase-buffer gedurende 15 minuten bij 37 °C om achtergebleven plasmide-DNA te verwijderen, was eenmaal met groeimedium, voeg 2 ml verse media toe en plaats bij 25°C. Incubeer de plaat gedurende 24-36 uur.
- Leg de plaat 10 minuten op ijs om de cellen los te maken.
- Splits een put (1:2) in twee nieuwe putten.
- Verzamel trofozoïeten uit de resterende putten voor experimentele doeleinden.
OPMERKING: Alle culturen worden in tweevoud uitgevoerd. Voor elke aandoening wordt 1 put gebruikt voor doorgang en 1 voor CERE-isolatie.
3. CERE isoleren van Naegleria
- Bereken het aantal trofozoïeten in elk putje dat wordt gebruikt voor CERE-isolatie door trypanblauwe uitsluitingskleuring en een hemocytometer23.
- Doe de trofozoïeten in een buisje van 2,0 ml.
- Was trofozoïeten eenmaal in 100 mM natriumchloride (pH 7,5) via centrifugatie (600 x g, 10 min, 4 °C).
OPMERKING: Natriumchloride voorkomt dat de trofozoïeten zich aan de zijkanten van de buis hechten. - Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellets in 100 μl 100 mM EDTA (pH 7,5).
- Plaats de buis gedurende 15 minuten in een warmteblok bij 98 °C om de cellen te lyseren en de enzymen in de trofozoïeten te inactiveren.
OPMERKING: Deze stap inactiveert DNasen, die overvloedig aanwezig zijn in Naegleria trophozoïeten. DNases kunnen interfereren met het vermogen om native CERE en de moleculaire kloon in stap 4 te detecteren. De DNA-opbrengst neemt af wanneer meer dan ~3 x 106 cellen worden gebruikt in stap 3.4. - Centrifugeer de buizen op topsnelheid (16.000 x g) bij 4 °C gedurende 10 minuten om het puin te pelleteren.
- Breng de supernatanten over in een nieuwe buis.
- Ethanol precipiteert de supernatanten met 0,5 volume 7,5 M ammoniumacetaat (pH 7,5), 3 volumes absolute ethanol en 1 μL 10 mg/ml glycogeen als drager.
- Keer de buis meerdere keren om en plaats de buis bij -80 °C gedurende minimaal 1 uur of een nacht.
- Verwarm de monsters tot kamertemperatuur.
- Centrifugeer de buisjes gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 16.000 x g.
- Verwijder het supernatans en was de pellet met 70% ethanol door centrifugeren gedurende 5 minuten op 16.000 x g (bij kamertemperatuur).
- Verwijder ethanol en laat de pellet 5 minuten aan de lucht drogen.
- Resuspendeer de gedroogde pellet in steriel gedeïoniseerd (DI) water. Normaliseer het volume tot 10.000 trofozoïeten per μL.
- Bewaren bij -80 °C tot gebruik in PCR.
4. PCR-detectie van getransformeerde trofozoïeten
- Gebruik 20.000 celequivalenten DNA, 600 nM-primers (tabel 1) en Taq-polymerase en voer de PCR24 uit.
OPMERKING: Primers die onderscheid maken tussen native CERE en de gekloonde CERE staan vermeld in Tabel 1, evenals de PCR-omstandigheden. Figuur 3 toont de locatie van de primers op de constructies. PCR vereist optimalisatie, afhankelijk van de gebruikte primers en de specifieke PCR-mix die wordt gebruikt. - Magnetron 0,8% agarose in 1x Tris-base, azijnzuur en EDTA (TAE) buffer totdat de agarose is opgelost.
- Koel de agarose af tot ~50 °C bij kamertemperatuur.
- Giet de oplossing in een gelgietbak met een kam om putjes te vormen.
- Laat de gel op kamertemperatuur staan tot hij gestold is.
- Plaats de gel in het elektroforese-apparaat.
- Decanteer 1x TAE in de elektroforesekamer totdat de gel bedekt is.
- Verwijder de kam.
- Voeg 6x ladende kleurstof (0,25% bromfenolblauw, 0,25% xyleencyanol, 30% glycerol) toe aan monsters en laad de gel. Gebruik een DNA-ladder om de grootte van het PCR-product te bepalen.
- Sluit de elektrode aan, schakel de voeding in en laat de gel ~1,5-2 uur op 80 V draaien.
- Schakel de stroom uit en verwijder de gel.
- Kleur de gel met DNA-kleurstof (bijv. 10 μl 10 mg/ml ethidiumbromide) in 100 ml DI-water gedurende 10 minuten.
- Ontkleur de gel gedurende 20 minuten in DI water.
- Visualiseer gel op een ultraviolet (UV) lichtsysteem en documenteer de resultaten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
PCR van trofozoïeten die zijn getransfecteerd met pGRUB toont aan dat de getransfecteerde CERE wordt gedetecteerd door ten minste zeven passages van de trofozoïeten, evenals encystment en excystment (Figuur 4). De primers die in de PCR worden gebruikt, gloeien naar zowel de pGEM-vector als de CERE-sequentie, waardoor ervoor wordt gezorgd dat de PCR geen native CERE detecteert. PCR na transfectie van pGEM in trofozoïeten gaf aan dat pGEM negatief was (Figuur 4), ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hierin beschreven protocol is zeer eenvoudig, hoewel elk construct waarschijnlijk een zekere mate van optimalisatie vereist, met name van de DNA-transfectie-reagensverhouding, afhankelijk van de aard van het construct en de gebruikte soort Naegleria . We hebben slechts één in de handel verkrijgbare transfectiereagens getest met behulp van dit protocol, maar het is waarschijnlijk dat meerdere andere effectief kunnen zijn. Aangezien een kloon van volledige lengte van de CERE wordt gebruikt, die een functionele...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er werden geen financiële belangenconflicten gemeld.
Dankbetuigingen
Deze studies werden gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie van het George F. Haddix Fund van Creighton University (KMD). Figuur 1 wordt gegenereerd in biorender.com en Figuur 3 wordt gegenereerd in benchling.com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose | Bio Rad | 161-3102 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | A-7330 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C-4901 | |
| Crushed ice | |||
| Culture Flasks, T-75 | Thermo Scientific | 130190 | |
| Culture Plate, 6-well | Corning | 3506 | |
| DNAse | Sigma Aldrich | D-4527 | |
| EDTA, 0.5 M | Affymetrix | 15694 | |
| Electropheresis Gel Apparatus | Amersham Biosciences | 80-6052-45 | |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Tubes, 2 mL | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol, 100% | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethidium Bromide | Sigma Aldrich | E-8751 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | |
| Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876-25G | |
| GeneRuler 1 kb Plus Ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | UN2789 | |
| GoTaq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Heating Block | Thermo Scientific | 88871001 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Hemin | Sigma Aldrich | 51280 | |
| Iron Chloride | Sigma Aldrich | 372870-256 | |
| Ligase | NEB | M2200S | |
| Magneisum Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Microfuge | Thermo Scientific | MySpin 12 | |
| Microscope | Nikon | TMS | |
| N. gruberi | ATCC | 30224 | |
| Nucleic Acid | Chem Impex Int’l | #01625 | |
| Peptone | Gibco | 211677 | |
| pGEM | Promega | P2251 | |
| Potassium Phosphate | Sigma Aldrich | P0662-500G | |
| PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit | Bio Rad | 1645052 | |
| Sodium Chloride | MCB Reagents | SX0420 | |
| Sodium Phosphate, dibasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Tabletop Centrifuge | eppendorf | 5415R | |
| Tris, base | Sigma Aldrich | T1503-1KG | |
| Trypan Blue, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| ViaFect Reagent | Promega | E4981 | |
| Weigh Scale | Denver Instruments | APX-60 | |
| Yeast Extract | Gibco | 212750 |
Referenties
- De Jonckheere, J. F. What do we know by now about the genus Naegleria. Exp Parasitol. 145, Suppl S2-S9 (2014).
- De Jonckheere, J. F. A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).
- Fulton, C. Cell differentiation in Naegleria gruberi. Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).
- Grace, E., Asbill, S., Virga, K. Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options. AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).
- Moseman, E. A. Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri. PLOS Pathog. 16 (4), e1008406(2020).
- Marciano-Cabral, F. Biology of Naegleria spp. Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).
- Piñero, J. E., Omaña-Molina, M., Chávez-Munguía, B., Lorenzo-Morales, J. Naegleria fowleri. Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).
- Zysset-Burri, D. C., et al. Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri. BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).
- Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. The genome of Naegleria lovaniensis, the basis for a comparative approach to unravel pathogenicity factors of the human pathogenic amoeba N. fowleri. BMC Genom. 19, 654-665 (2018).
- Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri. Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).
- Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology. Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).
- Clark, C. G., Cross, G. A. M. rRNA genes of Naegleria gruberi are carried exclusively on a 14-kilobase-pair plasmid. Mol Cell Biol. 7 (9), 3027-3031 (1987).
- Clark, C. G., Cross, G. A. M. Circular ribosomal RNA genes are a general feature of schizopyrenid amoebae. J Protozool. 35 (2), 326-329 (1988).
- Dao, F. Y., et al. Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two-step feature selection technique. Bioinformatics. 35 (12), 2075-2083 (2019).
- Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the circular extrachromosomal element of Naegleria gruberi strain EGB ribosomal DNA. Genome Announc. 6 (6), e00020-e00021 (2018).
- Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element. Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055(2020).
- Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know. Plasmid. 115, 102567(2021).
- Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397). Microbiol Resource Announce. 12, e0032123(2023).
- Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400). Microbiol Resource Announce. 12 (4), 0006123(2023).
- Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh). Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).
- Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Mapping the single origin of replication in the Naegleria gruberi extrachromosomal DNA element. Protist. 170, 141-152 (2019).
- Sohn, H. J., et al. Efficient liquid media for encystation of pathogenic free-living amoebae. Korean J Parasitol. 55 (3), 233-238 (2017).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2001).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
- Jeong, S. R., et al. Expression of the nfa1 gene cloned from pathogenic Naegleria fowleri in non-pathogenic N. gruberi enhances cytotoxicity against CHO target cells in vitro. Infect Immun. 73 (7), 4098-4105 (2005).
- Clark, C. G., Cross, G. A. M., De Jonckheere, J. F. Evaluation of evolutionary divergence in the genus Naegleria by analysis of ribosomal DNA plasmid restriction patterns. Mol Biochem Parasitol. 34 (3), 281-296 (1989).
- De Jonckheere, J. F. Sequence variation in the ribosomal internal transcribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp. Protist. 149 (3), 221-228 (1998).
- Rawal, P., et al. Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: Role in Escherichia coli global regulation. Genome Res. 16 (5), 644-655 (2006).
- Yadav, V. K., Abraham, J. K., Mani, P., Kulshrestha, R., Chowdhury, S. QuadBase: Genome-wide database of G4 DNA - occurrence and conservation in human, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes. Nucleic Acids Res. 36, D381-D385 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
