Insulineklaring in de lever is van cruciaal belang voor het reguleren van de glucosehomeostase. Dit artikel beschrijft een gebruiksvriendelijke leverperfusieprocedure voor het direct evalueren van de insulineklaringssnelheid in de lever in situ bij muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van insulineklaring bij muizen via in situ leverperfusie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Insulineklaring in de lever is essentieel voor het behoud van glucosehomeostase en is nauw verbonden met stofwisselingsstoornissen zoals obesitas, insulineresistentie en diabetes. Nauwkeurige meting van de insulineklaring is van vitaal belang voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen van deze aandoeningen. Dit protocol biedt een eenvoudige en gebruiksvriendelijke leverperfusieprocedure bij muizen, speciaal ontworpen om de insulineklaringssnelheid in de lever direct te evalueren. De methode omvat nauwkeurige canulatie van de poortader en suprahepatische inferieure vena cava om een in situ perfusiesysteem te creëren dat fysiologische omstandigheden nabootst. Het protocol begeleidt onderzoekers door elke fase van de procedure, van chirurgische voorbereiding en het opzetten van het perfusiesysteem tot het verzamelen en analyseren van monsters. Er worden gedetailleerde instructies gegeven, samen met representatieve resultaten en belangrijke tips voor het optimaliseren van de procedure. Een video-tutorial begeleidt het geschreven protocol en biedt visueel diepgaande instructies en illustraties, waardoor het een toegankelijke en uitgebreide referentie is voor wetenschappers die de moleculaire mechanismen achter het insulinemetabolisme en de klaring van de lever onderzoeken.
Inleiding
De ontdekking van insuline is een van de mijlpalen van de vorige eeuw geworden. Er is veel bekend over de regulatie van insulinesynthese, secretie en de fysiologische functies ervan in metabole weefsels. Er is echter minder aandacht besteed aan insulineafbraak en de regulerende mechanismen ervan. Insulinemetabolisme kan worden opgevat als het samenspel tussen bètacelfunctie, insulineresistentie (IR) of gevoeligheid en insulineklaring. Naast insulinesecretie speelt insulineklaring in de lever een cruciale rol bij het handhaven van het homeostatische insulineniveau dat nodig is om perifere doelweefsels te bereiken en bij het bevorderen van een goede insulinewerking1. Meerdere onderzoeken hebben een verminderde insulineklaring geïdentificeerd als een cruciale factor in de pathogenese van hyperinsulinemie bij het metabool syndroom, evenals bij andere aandoeningen zoals diabetes type 2 2,3, niet-alcoholische steatohepatitis4 en polycysteus ovariumsyndroom5. Hyperinsulinemie secundair aan verminderde klaring kan dus een rol spelen in de pathogenese van stofwisselingsziekten. Strategieën die de insulineklaring verbeteren, hebben het potentieel om de ongunstige effecten van hyperinsulinemie bij deze personen om te keren.
Insuline heeft een uniek distributiepatroon. Het niveau van circulerende plasma-insuline hangt af van het evenwicht tussen insulinesecretie en -verwijdering. De alvleesklier scheidt insuline op een pulserende manier af in de poortader en leidt deze naar de hepatocyten. Als het eerste orgaan dat insulinesecretie tegenkomt, breekt de lever het grootste deel van de insuline af tijdens de eerste passage, goed voor 60%-70% van de totale insuline6. De resterende insuline verlaat de lever via de leverader en komt in de systemische circulatie terecht, waar het gedeeltelijk wordt gebruikt door perifere weefsels (voornamelijk spieren, vetweefsel en nieren) voordat het verder wordt geëxtraheerd door de lever tijdens de tweede passage door de leverslagader7.
De nauwkeurige meting van de insulineklaring is cruciaal. Het direct meten van de insulineklaring in de lever in studies bij mensen is een uitdaging omdat het verkrijgen van bloedmonsters uit de portale en leveraders moeilijk is. Zowel directe als indirecte methoden worden gebruikt om de insulineklaring bij mensen en diermodellen te schatten. Er worden ongeveer drie strategieën gebruikt om de insulineklaring indirect te meten. De beoordelingen die in de klinische praktijk het meest worden gebruikt, hebben betrekking op methoden die zijn gebaseerd op de molaire verhouding C-peptide/insuline8. Deze benadering is gebaseerd op de equimolaire secretie van beide peptiden en de afwezigheid van C-peptide-extractie door de lever9. De tweede groep methoden is afhankelijk van de wiskundige analyse van plasmavervalcurven van insuline na een bekende en specifieke input van het hormoon in de bloedsomloop 2,10,11. De derde methode is gebaseerd op het feit dat de infusie van insuline met een constante snelheid leidt tot stabiele niveaus van het hormoon in het bloed, waarbij de verwijderingssnelheid overeenkomt met de toedieningssnelheid12. Deze indirecte methoden weerspiegelen voornamelijk de algehele insulineklaring in het lichaam. Aangezien de lever de primaire plaats is waar insuline wordt geklaard en een cruciale rol speelt in dit proces, is het essentieel om de insulineklaring in de lever direct te evalueren.
Eerdere studies hebben insuline-extractie in de lever bij gezonde honden direct gemeten13,14. Studies hebben ook een geïsoleerd geperfuseerd rattenlevermodel gebruikt om insuline-extractie uit de lever te beoordelen 15,16. Vanwege de hoge beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen dienen muizen als waardevolle modellen voor het onderzoeken van moleculaire routes. Een paar studies17 hebben leverperfusie gebruikt om de insulineklaring in de lever direct in een muismodel te beoordelen. In deze onderzoeken wordt een perfusaat met humane insuline in de poortader toegediend en verzameld uit de inferieure vena cava. Het aandeel insuline dat door de lever wordt geabsorbeerd, geeft de klaring aan. De leverperfusietechniek houdt de lever onder bijna-fysiologische omstandigheden in stand door een warm, zuurstofrijk en met voedingsstoffen verrijkt perfusaat door het levervaatstelsel te laten circuleren. Er is echter onvoldoende praktische begeleiding en essentiële tips voor het bevorderen en verspreiden van deze techniek.
Hoewel de insulineklaring in de lever dus steeds meer aandacht heeft gekregen, blijft de rol ervan bij aandoeningen, evenals de moleculaire mechanismen, onduidelijk18. Daarom zijn geavanceerde technieken hard nodig op het gebied van wetenschappelijk onderzoek. Dit protocol stelt een gedetailleerde gewijzigde leverperfusieprocedure vast bij muizen voor het evalueren van de insulineklaring in de lever. Bovendien kan deze methode ook worden gebruikt om de effecten van geneesmiddelen op de lever te bestuderen, inclusief het first-pass-effect, transportprocessen van geneesmiddelen en verschillende andere aspecten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol is goedgekeurd door het Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee (IACUC-2105018) en volgde de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee. Alle C57BL/6N-muizen werden op een licht/donker-cyclus van 12 uur gehouden met vrije toegang tot voedsel en water. Zes weken oude muizen werden willekeurig verdeeld in een Chow-dieet (CD) -groep en een groep met een vetrijk dieet (HFD). De HFD-groep kreeg een 60% vetrijk dieet en bleef dit dieet volgen tot de leeftijd van 10 weken. Het gemiddelde lichaamsgewicht was 28,55 g ± 1,2 g voor de HFD-groep en 24,3 g ± 0,48 g voor de controlegroep. De details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Voorbereiding
- Voer de vereiste sterilisatie van chirurgische instrumenten en verbruiksartikelen uit door middel van autoclaveren.
- Plaats de chirurgische instrumenten, 6-0 zijden hechtdraad, steriele kleine katoenen applicator, natriumchloride-injectie (500 ml), wattenstaafjes en sponzen op de juiste manier op de operatietafel.
- Bereid 30 ml gehepariniseerde zoutoplossing voor met een eindconcentratie van 200 IE/ml.
- Bereid twee siliconen buisjes voor met een binnendiameter van 0,31 mm en een buitendiameter van 0,64 mm; een lengte van 4 cm voor gebruik als poortaderkatheter en de andere 10 cm lang voor gebruik als inferieure vena cava-katheter.
- Bereid de Krebs-Henseleit (KRBH) perfusiebuffer voor die 5,0 mmol/L glucose en 0,25% BSA bevat.
- Bereid de Krebs-Henseleit (KRBH) perfusiebuffer voor die 5,0 mmol/L glucose, 0,25% BSA en 4,0 ng/ml humane insuline bevat.
- Stel het leverperfusiesysteem in. Figuur 1 toont de belangrijkste componenten van het leverperfusiesysteem.
2. Chirurgische katheterisatie
- Bereid het verdovingsmengsel voor door de onderstaande stappen te volgen:
- Verdun Zoletil 50 (250 mg/5 ml) 10 keer met 0,9% natriumchlorideoplossing.
- Verdun Xylazinehydrochloride (200 mg/2 ml) 10 keer met 0,9% natriumchlorideoplossing.
- Meng de 0,5% Zoletil 50-oplossing met de 1% Xylazine-hydrochloride-oplossing in een verhouding van 1:1.
- Verdoof de muizen.
- Controleer en registreer het lichaamsgewicht van de muis. Dien het anesthesiemengsel toe via intraperitoneale injectie in een dosis van 5 ml/kg lichaamsgewicht (2,5 mg/ml Zoletil 50; 5 mg/ml xylazinehydrochloride). Het begin van de anesthesie treedt meestal op binnen 5-10 minuten na de injectie, wat blijkt uit het verlies van de oprichtreflex en een verminderde respons op externe stimuli.
- Breng de muis over naar de operatietafel. Zet de ledematen vast met plakband. Dien 2,5 E/g heparine intraperitoneaal toe om heparinisatie te bereiken.
- Gebruik een elektrisch scheerapparaat om de vacht op de buikhuid te trimmen en desinfecteer het gebied met een povidon-jodiumoplossing.
- Voer poortaderkatheterisatie uit.
- Maak een longitudinale incisie van 4 cm vanaf de onderbuik in de richting van de processus xiphoid langs de middelste buiklijn. Knip het buikvlies voorzichtig af met een schaar om beschadiging van de viscerale organen te voorkomen. Plaats de abdominale retractor van de muis om het operatieveld bloot te leggen.
- Beweeg de darmen naar rechts om de poortader, de rechternier en de inferieure vena cava te onthullen (Figuur 2A). Gebruik een slagadertang om de vena cava aan de bovenrand van de nier vast te klemmen.
- Isoleer de poortader (Figuur 2A) en ligate het distale uiteinde met een 6-0 zijden hechtdraad. Bind losjes een andere hechtdraad vast aan het proximale uiteinde van het blootgestelde vat.
- Maak met een veerschaar een incisie in de buurt van het afgeligde uiteinde en breng de katheter in. Beweeg de katheter door de incisie tot het niveau van de portaalvertakking.
- Zet beide ligaturen rond de katheter vast en bevestig de juiste afname door het vrije uiteinde van de katheter aan te sluiten op een bemonsteringsspuit. Spoel met gehepariniseerde zoutoplossing en klem de katheter vast (Figuur 2C).
- Verwijder het tractiehulpmiddel en reset de darmen. Bedek het operatiegebied met met zoutoplossing doordrenkt steriel gaas of katoen.
- Voer suprahepatische vena cava-katheterisatie uit.
- Maak een incisie langs het borstbeen van de processus xiphoid, waardoor het borstbeen bloot komt te liggen.
- Snijd het borstbeen verticaal open en snijd door het middenrif langs de ribrand om de borstholte bloot te leggen.
- Leg de suprahepatische inferieure vena cava bloot en isoleer deze (Figuur 2B). Lister het distale uiteinde voorzichtig met een 6-0 zijden hechtdraad. Bind losjes een andere hechtdraad vast aan het proximale uiteinde van het vat.
- Maak met een veerschaar een incisie net onder het afgeligde uiteinde en breng een katheter van 10 cm in. Beweeg de katheter naar voren totdat de punt van de katheter zich dicht bij de lever bevindt en bind beide ligaturen stevig vast. Bevestig de juiste afname en klem het vrije uiteinde van de katheter vast (Figuur 2D).
- Spoel het operatiegebied af met een zoutoplossing. Bedek het oppervlak met met zoutoplossing doordrenkt steriel gaasje.
3. Lever perfusie
- Euthanaseer de muis door een overdosis verdoving en thoracotomie te gebruiken in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren, en zorg ervoor dat alle procedures worden uitgevoerd op een manier die het lijden tot een minimum beperkt.
- Stel het leverperfusiesysteem in, dat een oxygenator, een temperatuurmodulatieapparaat, een infuuspomp en infuusslangen omvat, zoals weergegeven in afbeelding 1.
- Zorg voor een continue gasstroom van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide naar de oxygenator.
- Zet het waterbad aan en verwarm de orgelkamer voor op 37 °C.
- Bereid de KRBH-perfusiebuffer voor met en zonder insuline. Vul het slangsysteem voor met de perfusiebuffer die in een waterbad bij 37 °C is geïncubeerd.
LET OP: De KRBH is vrij van BSA en glucose. De KRBH-perfusiebuffer zonder humane insuline bevat 5,0 mmol/L glucose en 0,25% BSA, terwijl de KRBH-perfusiebuffer met humane insuline 5,0 mmol/L glucose, 0,25% BSA en 4,0 ng/ml humane insuline bevat. - Plaats de muis in een bak met een omgevingstemperatuur van ongeveer 37 °C. Gebruik een warmhoudkussen om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden.
- Breng de KRBH-buffer toe via de poortaderkatheter. Stel de infusiesnelheid in op 0,2 ml/min via een minipompje.
- Merk op dat de lever binnen enkele seconden bleek wordt, wat aangeeft dat de perfusiebuffer door de lever stroomt. Om meer resterende bloedcellen in de lever weg te spoelen, pauzeert u de infusie gedurende 1 minuut op de tijdstippen van 4 minuten en 8 minuten, waarbij u de timing begint bij het begin van de perfusie.
- Doordrenk de lever met KRBH-buffer gedurende in totaal 10 minuten (exclusief de twee pauzes van 1 minuut), wat de evenwichtsperiode vertegenwoordigt. Verzamel het basale monster van de inferieure vena cava-katheter.
- Doordrenk de lever met dezelfde oplossing verrijkt met insuline (4,0 ng/ml humane insuline) gedurende nog eens 30 minuten.
- Verzamel elke 2 minuten alle monsters uit de inferieure vena cava buis.
- Noteer het levergewicht na perfusie. Verzamel levermonsters van verschillende lobben, vries ze onmiddellijk in vloeibare stikstof in en breng ze vervolgens over naar -80 °C voor opslag.
- Centrifugeer alle verzamelde perfusiemonsters bij ~1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel de bovenstaande middelen en breng ze over naar -80 °C voor opslag.
OPMERKING: De insulineconcentratie in perfusiemonsters wordt gemeten met behulp van ELISA-kits (Human Insulin Enzyme-linked Immunosorbent Assay). - Zorg er na de procedure voor dat al het biologisch afval wordt verwijderd volgens de veiligheidsvoorschriften.
4. Gegevensanalyse
- Presenteer de gegevens in XY-grafieken die de output van de insulineconcentratie in de loop van de tijd laten zien.
- Bereken de gemiddelde insulineklaringssnelheid in de lever (HICRAVE) met behulp van de volgende formule:
HICRAVE = (1−Cf/Ci) × 100%
waarbij Ci = initiële insulineconcentratie van de infusiebuffer, Cf = uiteindelijke gemiddelde insulineconcentratie in de laatste 10 minuten van suprahepatische inferieure vena cava.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol beschrijft de procedure voor leverinfusie om de insulineklaring in de lever direct te berekenen. Dit model is betrouwbaar en reproduceerbaar. Een voorbeeld van de resultaten van een experiment is weergegeven in figuur 3. Na een evenwichtsperiode van 10 minuten werd de KRBH-buffer aangevuld met 4,0 ng/ml humane insuline gedurende 30 minuten door de poortader geperfundeerd. Perfusievloeistof werd met tussenpozen van 2 minuten uit de katheter in de...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritieke stappen in het protocol
De hierboven beschreven chirurgische ingrepen moeten met zachte zorg worden uitgevoerd om te voorkomen dat er laesies in de lever ontstaan. Bovendien maakt de fragiele structuur van de wand van de leverader deze kwetsbaar voor punctie en daaropvolgende bloedingen als er niet voorzichtig mee wordt omgegaan tijdens de canulatie. In dit protocol worden zachtere siliconenslangen gebruikt om schade aan bloedvaten te minimaliseren. Het wordt...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er werden geen belangenconflicten gemeld.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82200948, 82270921, 82170882).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 60% high-fat diet | Research Diets, USA | D12492 | |
| Alanine aminotransferase Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C009-2-1 | |
| Anhydrous Glucose | Sangon Biotech | 50-99-7 | 500 G |
| Aspartate aminotransferase Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C010-2-1 | |
| Bovine Serum Albumin | GeminiBio | 700-107P | Fatty Acid-Free |
| Contour TS Blood Glucose Meter | Bayer | PH220800019 | |
| Contour TS Blood Glucose Test Strips | Bayer | DP38M3F05A | |
| Heparin Sodium | Changzhou Qian hong Bio-pharma | H32022088 | 12500 U/2mL |
| Human insulin | Novo Nordisk | S20191007 | 300 U/3mL |
| Human insulin immunoassay kit | Ezassay Biotechnology | HM200 | |
| KRBH buffer (Sugar, BSA free) | coolaber | SL65501 | 500 mL |
| Membrane oxygenator | Xi'an Xijing Medical Appliance | 5 | |
| Microscopic scissors | Shanghai Jinzhong | YBC020 | |
| Micro-serrefine clamp | Ningbo Medical Needle | 180709 | |
| Microsurgery forceps | Shanghai Jinzhong | WA3010, WA3020 | |
| Needle type filter | N-buliv | LG05-133-2 | |
| Povidone-iodine Solution | Shanghai likang Disinfectant Hi-Tech | 20231016J | |
| pump 11 Elite | Harvard Apparatus | PC5 70-4500 | |
| Retractor | Globalebio (Beijing) Technology | GEKK-10mm | 10 mm |
| Silicone Tubing | scientific commodities | #BB518-12 | 0.31 mm × 0.64 mm |
| Silicone Tubing | Fisher Scientific | #11-189-15A | ID 0.5 mm |
| Sodium Chloride Injection | Baxter | S2402023 | 4.5 g/500 mL |
| Surgical silk suture | Yangzhou Huanyu Medical Equipment | 6-0 | |
| Temperature modulation | Xi'an Xijing Medical Appliance | 6 | |
| Thermostatic water bath | Jiaxing Junsi Electronics | HIH-1 | 220 V 50 HZ |
| Three-way Joint | YISAI | AQTCY1.6 | ID 0.4 mm |
| Xylazine Hydrochloride Injection | ShengXin | 20240106 | 200 mg/2mL |
| Zoletil 50 | Virbac | WK001 | 250 mg/5mL |
Referenties
- Najjar, S. M., Perdomo, G. Hepatic insulin clearance: Mechanism and physiology. Physiology (Bethesda). 34 (3), 198-215 (2019).
- Fu, Z., et al. Impaired insulin clearance as the initial regulator of obesity-associated hyperinsulinemia: Novel insight into the underlying mechanism based on serum bile acid profiles. Diabetes Care. 45 (2), 425-435 (2022).
- Koh, H. E., Cao, C., Mittendorfer, B. Insulin clearance in obesity and type 2 diabetes. Int J Mol Sci. 23 (2), 596(2022).
- Bril, F., et al. Relationship between disease severity, hyperinsulinemia, and impaired insulin clearance in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 59 (6), 2178-2187 (2014).
- Herman, R., Sikonja, J., Jensterle, M., Janez, A., Dolzan, V. Insulin metabolism in polycystic ovary syndrome: Secretion, signaling, and clearance. Int J Mol Sci. 24 (4), 3140(2023).
- Najjar, S. M., Caprio, S., Gastaldelli, A. Insulin clearance in health and disease. Annu Rev Physiol. 85, 363-381 (2023).
- Polidori, D. C., Bergman, R. N., Chung, S. T., Sumner, A. E. Hepatic and extrahepatic insulin clearance are differentially regulated: Results from a novel model-based analysis of intravenous glucose tolerance data. Diabetes. 65 (6), 1556-1564 (2016).
- Castillo, M. J., Scheen, A. J., Letiexhe, M. R., Lefebvre, P. J. How to measure insulin clearance. Diabetes Metab Rev. 10 (2), 119-150 (1994).
- Rubenstein, A. H., Pottenger, L. A., Mako, M., Getz, G. S., Steiner, D. F. The metabolism of proinsulin and insulin by the liver. J Clin Invest. 51 (4), 912-921 (1972).
- Terris, S., Steiner, D. F. Binding and degradation of 125i-insulin by rat hepatocytes. J Biol Chem. 250 (21), 8389-8398 (1975).
- Ooms, H. A., Arnould, Y., Rosa, U., Pennisi, G. F., Franckson, J. R. Total metabolic clearance of crystalline insulin and radio-iodide substitued insulin. Pathol Biol. 16 (5), 241-245 (1968).
- Defronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: A method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
- Asare-Bediako, I., et al. Assessment of hepatic insulin extraction from in vivo surrogate methods of insulin clearance measurement. Am J Physiol Endocrinol Metab. 315 (4), E605-E612 (2018).
- Kim, S. P., Ellmerer, M., Kirkman, E. L., Bergman, R. N. Beta-cell "rest" accompanies reduced first-pass hepatic insulin extraction in the insulin-resistant, fat-fed canine model. Am J Physiol Endocrinol Metab. 292 (6), E1581-E1589 (2007).
- Kotsis, T., et al. Insulin metabolism and assessment of hepatic insulin extraction during liver regeneration. A study in a rat model. J Invest Surg. 33 (1), 69-76 (2020).
- Mondon, C. E., Olefsky, J. M., Dolkas, C. B., Reaven, G. M. Removal of insulin by perfused rat liver: Effect of concentration. Metabolism. 24 (2), 153-160 (1975).
- Tamaki, M., et al. The diabetes-susceptible gene SLC30A8/ZnT8 regulates hepatic insulin clearance. J Clin Invest. 123 (10), 4513-4524 (2013).
- Ghadieh, H. E., Gastaldelli, A., Najjar, S. M. Role of insulin clearance in insulin action and metabolic diseases. Int J Mol Sci. 24 (8), 7156(2023).
- Winther-Sorensen, M., Kemp, I. M., Bisgaard, H. C., Holst, J. J., Wewer Albrechtsen, N. J. Hepatic glucose production, ureagenesis, and lipolysis quantified using the perfused mouse liver model. J Vis Exp. 200, e65596(2023).
- Rydell-Tormanen, K., Johnson, J. R. The applicability of mouse models to the study of human disease. Methods Mol Biol. 1940, 3-22 (2019).
- Zaidi, S., et al. Loss of ceacam1 in hepatocytes causes hepatic fibrosis. Eur J Clin Invest. 54 (7), e14177(2024).
- Piccinini, F., Bergman, R. N. The measurement of insulin clearance. Diabetes Care. 43 (9), 2296-2302 (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
