Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66735

⸱

19 juli 2024

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Samenvatting

Light sheet microscopie is de methodologie bij uitstek geworden voor live beeldvorming van zebravisembryo's over lange tijdschalen met minimale fototoxiciteit. Met name een multiview-systeem, dat rotatie van monsters mogelijk maakt, maakt beeldvorming van hele embryo's vanuit verschillende hoeken mogelijk. In de meeste beeldvormingssessies met een multiview-systeem is het monteren van monsters echter een lastig proces, omdat monsters meestal in een polymeerbuis worden voorbereid. Om hierbij te helpen, beschrijft dit protocol basismontagestrategieën voor het in beeld brengen van de vroege ontwikkeling van zebravissen tussen de 70% epiboly en vroege somietstadia. In het bijzonder biedt de studie statistieken over de verschillende posities die de embryo's standaard bereiken in de 70% epiboly- en knopstadia in het chorion. Verder wordt het optimale aantal hoeken en het interval tussen de hoeken besproken dat nodig is voor het afbeelden van hele zebravisembryo's in de vroege stadia van ontwikkeling, zodat informatie op cellulaire schaal kan worden geëxtraheerd door de verschillende weergaven samen te voegen. Ten slotte, aangezien het embryo het hele gezichtsveld van de camera beslaat, wat nodig is om een resolutie op cellulaire schaal te verkrijgen, beschrijft dit protocol het proces van het gebruik van kraalinformatie van boven of onder het embryo voor de registratie van de verschillende weergaven.

Inleiding

Het garanderen van minimale fototoxiciteit is een belangrijke vereiste voor het afbeelden van levende embryo's met een hoge spatiotemporele resolutie gedurende lange perioden. In het afgelopen decennium is lichte plaatmicroscopie de methodologie bij uitstek geworden om aan deze eis te voldoen 1,2,3,4,5,6,7. In het kort, in deze techniek die voor het eerst werd gebruikt in 2004 om ontwikkelingsprocessen8 vast te leggen, gaan twee uitgelijnde dunne vellen laser door het embryo vanaf tegengestelde uiteinden, waardoor alleen het interessante vlak wordt verlicht. Een detectieobjectief wordt orthogonaal geplaatst en vervolgens wordt het uitgezonden fluorescerende licht van alle verlichte punten in het monster tegelijkertijd verzameld. Vervolgens wordt een 3D-beeld verkregen door het embryo achtereenvolgens door de statische lichtplaat te bewegen.

Bovendien kunnen de monsters in een specifieke vorm van deze methodologie, multiview light sheet-microscopie genoemd, worden opgehangen in een polymeerbuis die kan worden gedraaid met behulp van een rotor, waardoor beeldvorming van hetzelfde embryo vanuit meerdere hoeken mogelijk is 9,10,11. Na beeldvorming worden de beelden vanuit meerdere hoeken samengevoegd op basis van registratiemarkers, die meestal bolvormige fluorescerende markers zijn in het embryo (bijv. kernen) of in de buis (bijv. fluorescerende kralen). Multiview-beeldvorming en fusie verbeteren de axiale resolutie aanzienlijk en bieden isotrope resolutie in alle drie de dimensies12. Hoewel dit een groot voordeel is, is een grote uitdaging van de multiview-methodologie de montage van monsters, waarbij embryo's moeten worden gemonteerd en op hun plaats moeten worden gehouden in de buisjes gedurende de gehele tijdsverloop van de beeldvorming.

Voor het uitvoeren van multiview-beeldvorming, om de embryo's op hun plaats te houden en beweging tijdens beeldvorming te voorkomen, kunnen embryo's worden ingebed in agarose. Dit leidt echter vaak tot nadelige groei en ontwikkeling, met name voor embryo's van zebravissen in een vroeg stadium13, het modelsysteem dat hier wordt besproken. Een tweede montagestrategie is het gebruik van een dunne buis die slechts iets groter is dan de diameter van het embryo, waarbij het embryo samen met het embryomedium in de buis kan worden getrokken, gevolgd door het sluiten van de bodem van de buis met een agaroseplug14. Bij deze methode, omdat de buis is gevuld met embryomedium, kunnen registratiemarkers zoals fluorescerende kralen niet worden gebruikt voor de samensmelting van de verschillende weergaven, en is registratie daarom afhankelijk van markers in het embryo. Over het algemeen fungeren kralen als betere registratiemarkers, omdat het signaal van de markers in het embryo verslechtert wanneer ze dieper in het monster worden bewogen als gevolg van zowel verlichtings- als detectiebeperkingen van een microscoop.

Een derde benadering, die hier in detail zal worden beschrevenen eerder 5,13,14,15,16 zal worden gebruikt, is het afbeelden van vroege zebravisembryo's met een intact chorion en het vullen van de buis met een minimaal percentage agarose, dat kralen bevat als registratiemarkers. In dit scenario, omdat handmatige interventie voor het positioneren van embryo's in een chorion niet mogelijk is, biedt deze studie statistieken over de standaardoriëntatie waarin vroege zebravisembryo's vallen, met name gericht op 70% epiboly- en knopstadia. Vervolgens wordt het optimale aantal weergaven besproken dat nodig is voor het afbeelden van embryo's in een vroeg stadium met een resolutie op cellulaire schaal en wordt het fusieproces beschreven met behulp van BigStitcher, een op FIJI gebaseerde plug-in 10,17,18. Samen heeft dit protocol, dat gebruik maakt van een 20x/1 NA-objectief, tot doel zebravisembryologen te helpen bij het gebruik van multiview-lichtbladsystemen voor het afbeelden van embryo's met kernen en membraanmarkers van gastrulatie tot vroege somietstadia.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De onderhouds- en experimentele procedures voor zebravissen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierethiek, zie referentie TIFR/IAEC/2023-1 en TIFR/IAEC/2023-5. Embryo's verkregen door het kruisen van heterozygote vissen die Tg (actb2:GFP-Hsa.UTRN)19 tot expressie brengen, werden geïnjecteerd met H2A-mCherry mRNA (30 pg) in het eencellige stadium. H2A-mCherry mRNA werd gesynthetiseerd met behulp van het pCS2+ H2A-mCherry plasmide (een geschenk van het Oates lab, EPFL) door middel van in vitro transcriptie. Embryo's die beide markers tot expressie brengen, respectievelijk aangeduid als Utr-GFP en H2A-mCherry, in de rest van het protocol, werden afgebeeld in de 70% epiboly- en knopstadia. De details van de reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Monstervoorbereiding voor multiview-beeldvorming

  1. Voorbereiding van FEP/PTFE-slangen
    1. Reinig FEP/PTFE-slangen volgens de eerder beschreven procedures14.
    2. Snijd de buisjes na het reinigen naar wens in lengtes van 2-2,5 cm en bewaar ze in microcentrifugebuisjes van 2 ml met dubbel gedestilleerd water. Buizen kunnen op deze manier ongeveer een maand worden bewaard.
    3. Verwarm de buizen vóór de monstervoorbereiding ongeveer 25 minuten op 70-75 °C om de buizen recht te trekken. Vermijd overbevolking in elke microcentrifugebuis om klonteren te voorkomen en zorg voor voldoende ruimte voor een effectieve rechttrekking van de buis.
      NOTITIE: Draag handschoenen tijdens de gehele procedure voor het hanteren van de buis, aangezien vingerafdrukken/stofdeeltjes die op de buizen achterblijven, de beeldvorming kunnen verstoren.
  2. Bereiding van agarose
    1. Bereid E3 buffer 50x voorraadoplossingen als volgt voor:
      1. Voorraad 1 - 3,252 g Na2HPO4, 0,285 g KH2PO4, 11,933 g NaCl, 0,477 g KCl in 1 L gedeïoniseerd water
      2. Voorraad 2 - 2.426 g CaCl2, 4.067 g MgSO4 in 1 L gedeïoniseerd water.
    2. Om 1x E3-buffer te maken, voegt u 20 ml olie 1 en 2 toe in 960 ml gedeïoniseerd water.
      OPMERKING: Voeg geen methyleenblauw toe aan de E3-buffer die wordt gebruikt voor beeldvorming, aangezien dit verstrooiing van licht veroorzaakt.
    3. Los agarose met een laag smeltpunt op in 1x E3 door verhitting op 70-75 °C op een warmteblok met roeren tot de oplossing helder wordt zonder klonten of kristallen.
    4. Voeg voor multiview-beeldvorming in de handel verkrijgbare fluorescerende korrels (zie Materiaaltabel) toe aan de agarose-oplossing, waardoor beeldregistratie tijdens de analyse mogelijk is. Sonificeer de kralen bij kamertemperatuur met een frequentie van 40-30 minuten gedurende 20-30 minuten in een ultrasoonapparaat met waterbad om de kralen uit elkaar te halen.
    5. Voeg na sonicatie 1 μL parels toe aan 10 ml agarose-oplossing in een buisje van 15 ml en draai het buisje goed om een gelijkmatige verspreiding van de korrels te garanderen.
      OPMERKING: De hoeveelheid pareloplossing die aan agarose moet worden toegevoegd, is afhankelijk van de voorraadoplossing en de fabrikant. Probeer een reeks volumes en kies een concentratie waarbij de kralen goed verspreid lijken wanneer ze worden afgebeeld in het lichtplaatsysteem. Te veel kralen kunnen zich samenvoegen ondanks sonicatie en vortexen, terwijl te weinig kralen de beeldregistratie kunnen beïnvloeden.
    6. Bewaar de agarosebuis met toegevoegde parels in een gesloten waterbad op 37 °C gedurende ten minste 30 minuten voordat u het monster bereidt. Dit zorgt ervoor dat de temperatuur van de agarose daalt van 70 °C naar 37 °C.
  3. Voorbereiding van het monster
    1. Zet de vissen 's avonds voor de dag van de beeldvorming in paren op met verdelers. Verwijder de verdelers gedurende ongeveer 15 minuten en verzamel embryo's volgens standaardprocedure20.
    2. Zodra de embryo's het stadium hebben bereikt dat ze nodig zijn voor de voorbereiding van het monster, giet u de volledige 10 ml agarose (met kralen) die op 37 °C wordt gehouden op een petrischaaltje van 6 cm.
    3. Wacht ongeveer 2-3 minuten om de temperatuur onder de 33 °C te brengen voordat u 10 tot 15 embryo's terugplaatst in de agarose-oplossing.
      OPMERKING: Dit is een belangrijke stap om een mogelijke hitteschok te voorkomen bij embryo's die naar de agarose zijn overgebracht.
    4. Zorg ervoor dat er zo min mogelijk E3-buffer aan de agaroseoplossing wordt toegevoegd tijdens het terugplaatsen van embryo's. Draai de petrischaal rond zodat de kleine buffer die zou zijn overgebracht, goed wordt verspreid.
    5. Draag handschoenen voor de rest van de monstervoorbereidingsprocedure.
    6. Neem een micropipet van 200 μl met een geschikte pipetpunt en steek een schoongemaakt recht buisje uit de microcentrifugebuis in de pipetpunt, zoals weergegeven in afbeelding 1A,B.
    7. Zuig een beetje agarose op in de buis, gevolgd door 2-3 embryo's met behulp van de micropipet (Figuur 1C,D). Zorg ervoor dat de embryo's zich dicht bij de bodem van de buis bevinden (Figuur 1E), wat belangrijk zal worden bij het opzetten van beeldvorming. Zorg er ook voor dat er een beetje agarose tussen de verschillende embryo's zit (Figuur 1E) zodat kralen in dit gebied als registratiemarkers kunnen worden gebruikt.
    8. Zonder de druk van de pipet te verminderen, maakt u het slangetje los van de pipetpunt en plaatst u het op het deksel van het petrischaaltje gevuld met E3 zodat de agarose kan stollen (Figuur 1F).
    9. Herhaal stap 1.3.6 tot en met 1.3.8 totdat alle embryo's in de petrischaal zijn teruggeplaatst in de buisjes.
    10. Zodra de agarose is gestold (dit kan 5-10 minuten duren en kan worden bevestigd door de agarose in de petrischaal te controleren), brengt u de buisjes over in een microcentrifugebuisje van 2 ml gevuld met E3 (Figuur 1G).
    11. Bewaar de buisjes met de embryo's in een incubator van 28 °C of 33 °C, indien nodig, voordat u overgaat tot multiview-beeldvorming.

2. Multiview-beeldvorming

OPMERKING: Deze stap presenteert een algemene procedure voor multiview-beeldvorming van zebravisembryo's in hun vroege ontwikkelingsstadia. De hieronder beschreven methode kan eenvoudig worden aangepast aan elk multiview light sheet microscopiesysteem.

  1. Het lokaliseren van het embryo
    NOTITIE: Vul de monsterkamer van de microscoop met het embryomedium20 en stel de temperatuur van de monsterkamer in op de gewenste temperatuur ten minste 10 minuten voor de beeldvorming.
    1. Monteer de monsterhouder zoals eerder beschreven21, echter met één aanpassing. Aangezien beeldvorming via de buis wordt uitgevoerd, plaatst u de buis met embryo's rechtstreeks in een capillair met de juiste diameter, zodat deze op zijn plaats wordt gehouden zonder de agarose naar buiten te duwen en de embryo's aan de onderkant te verstoren (Figuur 1H).
      OPMERKING: Aangezien de monsterkamer een bepaalde hoogte heeft, zou het mogelijk zijn om het embryo in het gezichtsveld te positioneren zonder de vloer van de kamer te raken door ervoor te zorgen dat de embryo's zich tijdens de monstervoorbereiding naar de bodem van de buis bevinden (zoals vermeld in stap 1.3.7).
    2. Plaats de monsterhouder in het multiview-systeem en gebruik de x- en y-bedieningselementen om het embryo naar het midden van het gezichtsveld te brengen.
    3. Gebruik de z-regelaar van de preparaatnavigator om het embryo vervolgens scherp in beeld te brengen.
    4. Op dit punt zal de oriëntatie van het embryo in het chorion duidelijk zichtbaar zijn, en als deze niet bevredigend is, plaats dan een nieuwe buis en kies het embryo met een oriëntatie van interesse.
  2. Uitlijnen van de lichtvellen
    1. Zodra het embryo in positie is, stelt u alle experimentele instellingen in - lasers, lichtpad, filter, straalsplitser en camera.
    2. Als de software tijdens het instellen van de acquisitieparameters een optie biedt voor pivot scan, selecteert u deze. Een spilscan vermindert het schaduweffect dat uit de lichtplaat komt wanneer deze structuren of ondoorzichtige gebieden in het monster tegenkomt.
    3. Start het live scannen van het monster. Stel de bitgrootte, het laservermogen en de gewenste zoom in, die de dikte van de lichtplaat en dus de axiale resolutie bepalen.
    4. Om de lichtvellen uit te lijnen, schakelt u eerst over op enkelzijdige verlichting en wijzigt u de instellingen van de twee lichtvellen (links en rechts) achtereenvolgens. Zoom digitaal in op een gebied van de steekproef waar duidelijke interessante structuren zichtbaar zijn.
      OPMERKING: In deze studie werd een nucleaire (H2A-mCherry) of een membraan (Utr-GFP) marker gebruikt om de vellen uit te lijnen. Het wordt aanbevolen om de instellingen van de lichtplaat in de software te wijzigen, zodat het scherpste contrast van het signaal wordt bereikt in het betreffende gebied.
    5. Zodra de twee lichtvellen afzonderlijk zijn geoptimaliseerd om het beste signaal te bereiken, schakelt u beide lichtvellen in. Voer een tweede uitlijningsronde uit en zorg ervoor dat het flikkeren minimaal is, wat wijst op een redelijk goede uitlijning van de twee vellen.
    6. Zodra de uitlijning is voltooid, activeert u de optie om de afbeeldingen die door de twee vellen zijn gegenereerd automatisch samen te voegen, indien toegestaan door de software. Als alternatief kan men eerst de lichtvellen grof uitlijnen door zich te concentreren op kralen rond het monster en vervolgens de uitlijning verfijnen met behulp van informatie uit het monster.
      OPMERKING: Tijdens beeldvorming met twee fluoroforen (zoals nucleaire en membraanmarkers) is de optimale uitlijning meestal marginaal verschillend voor de twee structuren. Kies in dit scenario een instelling op basis van beperkingen voor downstreamverwerking. Als bijvoorbeeld celgrenzen moeten worden gesegmenteerd, wat relatief meer verwerkingsintensief is, lijnt u de lichtvellen uit op basis van de membraanmarkering.
  3. Multiview-beeldvorming instellen
    1. Activeer na het uitlijnen van de lichtvellen de opties voor het uitvoeren van een z-stack en multiview-beeldvorming.
    2. Begin met live scannen en navigeer met behulp van de sample-navigator om de eerste weergave te selecteren. Stel in deze weergave het segmentinterval in, gevolgd door de eerste en laatste segmenten van de z-stapel. Voeg deze positie toe in het dialoogvenster voor meerdere weergaven, waarin de positie en z-stapelinformatie voor deze weergave worden genoteerd.
    3. Ga naar de volgende weergave door de hoek in de samplenavigator te wijzigen. Stel de z-stack in voor de tweede weergave en voeg de informatie toe in het dialoogvenster voor meerdere weergaven.
    4. Herhaal hetzelfde voor extra weergaven.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er in elke weergave een bepaald minimumaantal segmenten wordt afgebeeld, zodat er voldoende overlap is tussen de verschillende weergaven, wat uiteindelijk zal helpen bij het registreren van de weergaven tijdens de verwerking. Het minimale aantal segmenten is afhankelijk van de zoomfactor en van het aantal hoeken dat voor de beeldvorming is gekozen.
    5. Nadat je alle weergaven hebt ingesteld, sla je deze informatie op in een tekstbestand (bijvoorbeeld 'embryo-posities' genoemd), dat z-stack-informatie, (x, y, z) coördinaten van de buis bevat, evenals specificaties van de hoek voor elke weergave. Wis na het opslaan alle posities uit het dialoogvenster met meerdere weergaven.
    6. Omdat beeldvorming wordt gedaan met een intact chorion, dat relatief groot is, is het niet mogelijk om de kralen in de buis met dezelfde instellingen te bekijken. Daarom moet de informatie over de kraal vanuit een andere positie in de buis worden verkregen. Om dit te doen, vertaalt u naar een andere 'y'-coördinaat weg van het embryo waar kralen zichtbaar zijn. Voeg deze positie toe aan het multiview-dialoogvenster en sla deze positie op in een tekstbestand (bijvoorbeeld met de naam 'beads-y').
      OPMERKING: Beeld de korrels zo dicht mogelijk bij het embryomonster af om de effecten van mogelijke verschillen in buiskromming op de twee posities te minimaliseren. Als er meerdere embryo's in het buisje worden gemonteerd, is het daarom belangrijk om een beetje agarose tussen de buisjes te laten om kralen af te beelden (zoals vermeld in stap 1.3.7).
    7. Ga naar de map waar de tekstbestanden zijn opgeslagen en dupliceer het bestand 'embryo-posities' naar een nieuw bestand met de naam 'kralen-posities'. Vervang de y-coördinaat voor alle aanzichten in het bestand 'kralenposities' door de y-coördinaat uit het 'kralen-y' bestand. Dit zorgt ervoor dat kralen worden afgebeeld met hetzelfde aantal weergaven, z-stapels en x-coördinaten, maar op een andere y-positie in de buis.
    8. Keer terug naar de beeldvormingssoftware en laad het bestand 'kraalposities' in de software. Als de optie tijdreeksen is geactiveerd, selecteert u één cyclus en start u het experiment. Sla kralenafbeeldingen op als 'kralen', die worden gebruikt voor het registreren van de verschillende weergaven tijdens de beeldverwerking.
    9. Nadat u de kralenfoto's hebt gemaakt, wist u de posities en laadt u het eerste 'embryo-posities'-bestand in de software. Stel het gewenste aantal cycli in met een geschikt tijdsinterval en start het experiment.

3. Multiview-beeldanalyse

OPMERKING: Voor het samenvoegen van de multiview-afbeeldingen wordt een FIJI-plug-in, BigStitcher, de nieuwste versie van de Multiview Reconstruction-plug-in, gebruikt 10,17,18. De plug-in kan worden geïnstalleerd door de BigStitcher-plug-in toe te voegen in de functie 'Update Sites beheren', die toegankelijk is in de optie 'Update' onder het menu 'Help'. Eenmaal geïnstalleerd, verschijnt de plug-in onder het menu 'Plug-ins'. De brede stappen die bij fusie betrokken zijn, zijn als volgt: (1) Definieer .xml/.h5-bestandsparen voor zowel de kralen als de embryo's; (2) Registreer alle weergaven met het kralenbestand; (3) Extract Point Spread Function (PSF) voor de kralen, die kan worden gebruikt voor deconvolutie (figuur 2A); (4) Breng de registratie- en PSF-informatie over van het kralenbestand naar het embryobestand en begin met multiview-deconvolutie. De meeste van deze stappen zijn eerder in detail beschreven21, en hier worden de stappen beschreven die anders worden verwerkt.

  1. Een .xml dataset definiëren
    1. Definieer een nieuwe dataset voor zowel de kralen als het embryo als respectievelijk 'beads.xml' en 'embryo.xml', zoals eerder beschreven21.
  2. Detectie en registratie met behulp van interessepunten
    1. Nadat de export van het beads.xml bestand is geslaagd, selecteert u de weergaven die nodig zijn voor registratie in het dialoogvenster 'Multiview Explorer' (Figuur 2B). Klik met de rechtermuisknop en kies Interessepunten detecteren. Ga te werk als volgt als beschreven21.
    2. Nadat u interessepunten hebt gedetecteerd, selecteert u alle weergaven, klikt u met de rechtermuisknop en kiest u Registreren met interessepunten. Volg het protocol zoals beschreven21.
    3. Controleer zorgvuldig of de hielregistratie goed heeft gewerkt. Bij succesvolle registratie worden overlappende kralen van verschillende weergaven over elkaar heen gelegd (Figuur 2C). Om te controleren hoe de registratie precies heeft gewerkt, selecteert u twee opeenvolgende aanzichten, gaat u naar het overlappende gebied en schakelt u tussen de twee aanzichten om te zien of de kralen die vanuit verschillende hoeken zijn afgebeeld, over elkaar heen zijn gelegd. Herhaal dit voor elke opeenvolgende weergave.
    4. Als de overlapping niet nauwkeurig is, probeer dan de registratie opnieuw uit te voeren door de vereiste significantie voor registratie en/of de acceptabele overlappingsfout te versoepelen (in het dialoogvenster 'Registratie' 'RANSAC-fout' genoemd).
    5. Klik na een succesvolle registratie op Opslaan in het venster 'Multiview Explorer' om het bijgewerkte .xml bestand op te slaan.
      OPMERKING: Sla ook het logbestand op, want het bevat meer gedetailleerde informatie over de efficiëntie van de registratie. Om de registratie-informatie van de kralen naar het embryo te vertalen, volgt u de onderstaande stappen.
    6. Open het bead.xml bestand in een tekstverwerker naar keuze en kopieer het hele blok onder "ViewRegistrations".
    7. Open de embryo.xml en vervang het blok "ViewRegistrations" door het blok dat is gekopieerd uit het kralenbestand. Als er meerdere kanalen zijn, vervang dan de registratie-informatie voor elk kanaal zoals hierboven. De registratie-informatie kan handmatig worden overgedragen of met behulp van de op maat geschreven MATLAB-code die hier kan worden gedownload: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
    8. Open het embryo.xml bestand in "BigStitcher" en controleer zorgvuldig of de registratie succesvol is verlopen voor het embryo. Herhaal hetzelfde als voor de kralen, door de overlapping van interessante structuren in elke twee opeenvolgende weergaven te controleren.
      OPMERKING: Af en toe kan embryoregistratie niet zo wenselijk zijn, ondanks dat de kralen perfect worden geregistreerd. Dit is mogelijk als er kleine veranderingen zijn in de kromming van de buis van de positie waar de kralen zijn afgebeeld naar de embryopositie. Bovendien kunnen er subtiele bewegingen van het embryo tussen weergaven zijn, omdat het vrij in het chorion zweeft. Voer in dit geval een tweede registratieronde uit met behulp van een nucleaire marker in het embryo.
    9. Om dit te doen, opent u het embryo.xml bestand in "BigStitcher", klikt u met de rechtermuisknop op alle weergaven met de nucleaire markering en kiest u Interessepunten detecteren.
    10. Hernoem de interessepunten naar 'kernen' en ga verder met de stappen zoals uitgevoerd voor kralen.
    11. Zorg er bij het instellen van 'Verschil van Gaussian'-parameters voor dat de meeste, zo niet alle, kernen worden gedetecteerd en dat er geen ectopische nucleaire detectie is. Klik vervolgens op Gereed.
    12. Registreer vervolgens deze weergaven door te kiezen voor Registreren met interessepunten en kies voor de optie Nauwkeurige descriptor (vertaling-invariant). Zorg ervoor dat de optie 'vergelijk alle weergaven en interessepunten' is geselecteerd en gebruik 'kernen' als interessepunten. Gebruik de optie voor het corrigeren van de eerste weergave en map niet terug.
    13. Gebruik voor registratie een affien model met rigide regularisatie en de standaardparameters in de plug-in.
    14. Controleer het succes van de registratie opnieuw door elke twee opeenvolgende weergaven te vergelijken.
    15. Klik na een succesvolle registratie op Opslaan in het venster 'Multiview Explorer' om het bijgewerkte .xml bestand op te slaan.
    16. Open het embryo.xml bestand in een teksteditor naar keuze en kopieer de registratie-informatie van de nucleaire markers naar de andere kanalen.
  3. Extractie en toewijzing van puntspreidingsfuncties
    1. Om multiview-deconvolutie uit te voeren, extraheert u de PSF van het beeldvormingssysteem uit de dataset van geregistreerde kralen en past u deze toe op het embryobestand.
    2. Als u deze informatie wilt ophalen, selecteert u alle weergaven in het kralenbestand, klikt u met de rechtermuisknop en kiest u Puntspreidingsfuncties en Extraherenopties .
    3. Zorg er in het dialoogvenster dat verschijnt voor Zorg ervoor dat Overeenkomstige interessepunten gebruiken en Minusintensiteitsprojecties van PSF verwijderen zijn aangevinkt, ga verder met de standaard PSF-formaten en klik op OK.
      OPMERKING: Als de PSF-extractie voor alle weergaven is geslaagd, wordt in het logbestand 'Geëxtraheerde n/n PSF's' weergegeven
    4. Sla hierna het .xml bestand opnieuw op. Er verschijnt een aangevinkt selectievakje in de PSF-kolom van het dialoogvenster 'Multiview Explorer' en er wordt een 'psf'-map gegenereerd in de betreffende map met alle uitgepakte PSF's.
    5. Open het embryo.xml bestand en wijs de PSF toe aan elke weergave afzonderlijk. Klik met de rechtermuisknop op "een weergave" → klik op Puntspreidingsfuncties → kies Toewijzen → selecteer Geavanceerd, gevolgd door Nieuwe PSF toewijzen aan alle geselecteerde weergaven. Klik op Bladeren, ga naar het .xml bestandspad en open de psf-map .
    6. Kies de overeenkomende PSF met de bijbehorende ID in de geselecteerde weergave en klik op OK, waarna het selectievakje PSF aangevinkt verschijnt in het venster 'Multiview Explorer'.
    7. Herhaal het proces voor alle andere weergaven.
  4. Multiview fusie en deconvolutie
    1. Nadat de puntspreidingsfunctie voor alle weergaven is toegewezen, klikt u met de rechtermuisknop en kiest u Multiview-deconvolutie.
    2. Selecteer het begrenzingsvak als momenteel geselecteerde weergaven. Voor dit werk werken de standaard OSEM-versnelling en het aantal iteraties goed.
    3. Downsample de afbeeldingen indien nodig als snellere berekeningen gewenst zijn of als het CPU-geheugen beperkt is.
      OPMERKING: Als het vereiste RAM-geheugen het bestaande geheugen overschrijdt, verschijnt er een waarschuwingsfoutmelding in rode kleur onder aan het venster. Start de deconvolutie niet als deze waarschuwing verschijnt, omdat de plug-in op een bepaald moment tijdens de verwerking vastloopt en niet meer reageert.
    4. Om de voortgang van de deconvolutie te beoordelen, controleert u het logbestand, dat elke 5 iteraties de resultaten weergeeft.
    5. Om de rekensnelheid te verhogen, voert u multiview-deconvolutie uit in GPU indien eerder geïnstalleerd.
      OPMERKING: Aan het einde van dit proces verschijnt er een venster met gesmolten afbeeldingen, dat kan worden opgeslagen als een tiff-bestand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het op een nauwkeurige manier oriënteren van het monster is een essentieel onderdeel van het efficiënt gebruik van een microscopie-opstelling. Het handmatig oriënteren van monsters is echter vaak niet mogelijk bij gebruik van een multiview lichtplaatsysteem, gezien de vereiste om de monsters in een buis voor te bereiden. Daarom, om te controleren of er stereotiepe posities zijn die embryo's innemen in het chorion, werden zebravisembryo's afgebeeld op 70% epiboly (ongeveer 7 uur na de bev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het positioneren van een embryo in de juiste richting om het interessegebied in beeld te brengen, is een van de snelheidsbeperkende stappen die vaak resulteert in een mislukte microscopiesessie voor een gebruiker. Dit is meer het geval bij een multiview lichtplaatmicroscoop waar handmatige manipulatie van de oriëntatie moeilijk is omdat de monsters in een buis zijn ingebed. Om bij dit proces te helpen, rapporteert deze studie de statistieken van verschillende posities waarin een zebravis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdig belang.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Kalidas Kohale en zijn team voor het onderhoud van de visfaciliteit en KV Boby voor het onderhoud van de lichtplaatmicroscoop. SRN erkent financiële steun van het Department of Atomic Energy (DAE), Govt. of India (Project Identification no. RTI4003, DAE OM no. 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 d.d. 11.02.2020), het Max Planck Society Partner Group-programma (M.PG. A MOZG0010) en de Science and Engineering Research Board Start-up Research Grant (SRG/2023/001716).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarose, lage geleertemperatuurSigma-AldrichA9414
Calcium Chloride dihydraatSigma-Aldrich12022
FIJIVersie: ImageJ 1.54f
Latexkralen, carboxylaat-gemodificeerd polystyreen, fluorescent rood, 0.5 μm gemiddelde deeltjesgrootte, waterige suspensieSigma-AldrichL3280
Magnesiumsulfaat heptahydraatSigma-AldrichM2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 TranscriptiekitThermoFischer ScientificAM1340Voor in vitro transcriptie van H2A-mCherry plasmid
KaliumchlorideSigma-AldrichP9541
Kaliumfosfaat monobasischSigma-AldrichP0662
PTFE-huls AWG 15L - 1,58 mm ID x 0,15 mm Wand +/-0,05 Adtech Innovations in FluoroplasticsSTW15PTFE-buizen
NatriumchlorideSigma-AldrichS3014
Natriumfosfaat dibasischSigma-Aldrich71640
UltrasoonreinigerLabmanLMUC3Ultrasoonapparaat
Zeiss LightSheet 7 SysteemZeiss

Referenties

  1. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  2. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  3. Keller, P. J., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  4. Keller, P. J. Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights. Science. 340 (6137), 1234168(2013).
  5. Schmid, B., et al. High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).
  6. Strnad, P., et al. Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development. Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).
  7. McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
  8. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  9. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).
  10. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
  11. Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  12. Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications. Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).
  13. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  14. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119(2014).
  15. Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension. Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).
  16. Shah, G., et al. Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish. Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Hörl, D., et al. BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).
  19. Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
  20. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  21. Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. J Vis Exp. (110), e53966(2016).
  22. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
  23. Aigouy, B., Prud'homme, B. Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues. Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).
  24. Mancini, L., et al. Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression. Science Adv. 9, 7519(2023).
  25. Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations. bioRxiv. , (2023).
  26. Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding. Science Adv. 9, 2154(2023).
  27. Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy. Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).
  28. Chen, B. C., et al. Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
  29. York, H. M., et al. Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism. Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).
  30. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  31. Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers. J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).
  32. Rohde, L. A., et al. Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern. eLife. , 13:RP93764 (2024).
  33. Haynes, E. M., et al. KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior. eLife. 11, e74270(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Multiview-beeldvormingmonsterfixatielive-beeldvormingembryonale ontwikkelingmonsterrrotatiekwantitatieve analysecellulaire resolutiebeeldsregistratie
Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.