Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

Samenvatting

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Samenvatting

Light sheet microscopie is de methodologie bij uitstek geworden voor live beeldvorming van zebravisembryo's over lange tijdschalen met minimale fototoxiciteit. Met name een multiview-systeem, dat rotatie van monsters mogelijk maakt, maakt beeldvorming van hele embryo's vanuit verschillende hoeken mogelijk. In de meeste beeldvormingssessies met een multiview-systeem is het monteren van monsters echter een lastig proces, omdat monsters meestal in een polymeerbuis worden voorbereid. Om hierbij te helpen, beschrijft dit protocol basismontagestrategieën voor het in beeld brengen van de vroege ontwikkeling van zebravissen tussen de 70% epiboly en vroege somietstadia. In het bijzonder biedt de studie statistieken over de verschillende posities die de embryo's standaard bereiken in de 70% epiboly- en knopstadia in het chorion. Verder wordt het optimale aantal hoeken en het interval tussen de hoeken besproken dat nodig is voor het afbeelden van hele zebravisembryo's in de vroege stadia van ontwikkeling, zodat informatie op cellulaire schaal kan worden geëxtraheerd door de verschillende weergaven samen te voegen. Ten slotte, aangezien het embryo het hele gezichtsveld van de camera beslaat, wat nodig is om een resolutie op cellulaire schaal te verkrijgen, beschrijft dit protocol het proces van het gebruik van kraalinformatie van boven of onder het embryo voor de registratie van de verschillende weergaven.

Inleiding

Het garanderen van minimale fototoxiciteit is een belangrijke vereiste voor het afbeelden van levende embryo's met een hoge spatiotemporele resolutie gedurende lange perioden. In het afgelopen decennium is lichte plaatmicroscopie de methodologie bij uitstek geworden om aan deze eis te voldoen 1,2,3,4,5,6,7. In het kort, in deze techniek die voor het eerst werd gebruikt in 2004 om ontwikkelingsprocessen⁸ vast te leggen, gaan twee uitgelijnde dunne vellen laser door het embryo vanaf tegengestelde uiteinden, waardoor alleen het interessante vlak wordt verlicht. Een detectieobjectief wordt orthogonaal geplaatst en vervolgens wordt het uitgezonden fluorescerende licht van alle verlichte punten in het monster tegelijkertijd verzameld. Vervolgens wordt een 3D-beeld verkregen door het embryo achtereenvolgens door de statische lichtplaat te bewegen.

Bovendien kunnen de monsters in een specifieke vorm van deze methodologie, multiview light sheet-microscopie genoemd, worden opgehangen in een polymeerbuis die kan worden gedraaid met behulp van een rotor, waardoor beeldvorming van hetzelfde embryo vanuit meerdere hoeken mogelijk is ^9,10,11. Na beeldvorming worden de beelden vanuit meerdere hoeken samengevoegd op basis van registratiemarkers, die meestal bolvormige fluorescerende markers zijn in het embryo (bijv. kernen) of in de buis (bijv. fluorescerende kralen). Multiview-beeldvorming en fusie verbeteren de axiale resolutie aanzienlijk en bieden isotrope resolutie in alle drie de dimensies¹². Hoewel dit een groot voordeel is, is een grote uitdaging van de multiview-methodologie de montage van monsters, waarbij embryo's moeten worden gemonteerd en op hun plaats moeten worden gehouden in de buisjes gedurende de gehele tijdsverloop van de beeldvorming.

Voor het uitvoeren van multiview-beeldvorming, om de embryo's op hun plaats te houden en beweging tijdens beeldvorming te voorkomen, kunnen embryo's worden ingebed in agarose. Dit leidt echter vaak tot nadelige groei en ontwikkeling, met name voor embryo's van zebravissen in een vroeg stadium¹³, het modelsysteem dat hier wordt besproken. Een tweede montagestrategie is het gebruik van een dunne buis die slechts iets groter is dan de diameter van het embryo, waarbij het embryo samen met het embryomedium in de buis kan worden getrokken, gevolgd door het sluiten van de bodem van de buis met een agaroseplug¹⁴. Bij deze methode, omdat de buis is gevuld met embryomedium, kunnen registratiemarkers zoals fluorescerende kralen niet worden gebruikt voor de samensmelting van de verschillende weergaven, en is registratie daarom afhankelijk van markers in het embryo. Over het algemeen fungeren kralen als betere registratiemarkers, omdat het signaal van de markers in het embryo verslechtert wanneer ze dieper in het monster worden bewogen als gevolg van zowel verlichtings- als detectiebeperkingen van een microscoop.

Een derde benadering, die hier in detail zal worden beschreven^{en eerder} 5,13,14,15,16 zal worden gebruikt, is het afbeelden van vroege zebravisembryo's met een intact chorion en het vullen van de buis met een minimaal percentage agarose, dat kralen bevat als registratiemarkers. In dit scenario, omdat handmatige interventie voor het positioneren van embryo's in een chorion niet mogelijk is, biedt deze studie statistieken over de standaardoriëntatie waarin vroege zebravisembryo's vallen, met name gericht op 70% epiboly- en knopstadia. Vervolgens wordt het optimale aantal weergaven besproken dat nodig is voor het afbeelden van embryo's in een vroeg stadium met een resolutie op cellulaire schaal en wordt het fusieproces beschreven met behulp van BigStitcher, een op FIJI gebaseerde plug-in 10,17,18. Samen heeft dit protocol, dat gebruik maakt van een 20x/1 NA-objectief, tot doel zebravisembryologen te helpen bij het gebruik van multiview-lichtbladsystemen voor het afbeelden van embryo's met kernen en membraanmarkers van gastrulatie tot vroege somietstadia.

Protocol

De onderhouds- en experimentele procedures voor zebravissen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierethiek, zie referentie TIFR/IAEC/2023-1 en TIFR/IAEC/2023-5. Embryo's verkregen door het kruisen van heterozygote vissen die Tg (actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ tot expressie brengen, werden geïnjecteerd met H2A-mCherry mRNA (30 pg) in het eencellige stadium. H2A-mCherry mRNA werd gesynthetiseerd met behulp van het pCS2+ H2A-mCherry plasmide (een geschenk van het Oates lab, EPFL) door middel van in vitro transcriptie. Embryo's die beide markers tot expressie brengen, respectievelijk aangeduid als Utr-GFP en H2A-mCherry, in de rest van het protocol, werden afgebeeld in de 70% epiboly- en knopstadia. De details van de reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Monstervoorbereiding voor multiview-beeldvorming

1. Voorbereiding van FEP/PTFE-slangen
   1. Reinig FEP/PTFE-slangen volgens de eerder beschreven procedures¹⁴.
   2. Snijd de buisjes na het reinigen naar wens in lengtes van 2-2,5 cm en bewaar ze in microcentrifugebuisjes van 2 ml met dubbel gedestilleerd water. Buizen kunnen op deze manier ongeveer een maand worden bewaard.
   3. Verwarm de buizen vóór de monstervoorbereiding ongeveer 25 minuten op 70-75 °C om de buizen recht te trekken. Vermijd overbevolking in elke microcentrifugebuis om klonteren te voorkomen en zorg voor voldoende ruimte voor een effectieve rechttrekking van de buis.
      NOTITIE: Draag handschoenen tijdens de gehele procedure voor het hanteren van de buis, aangezien vingerafdrukken/stofdeeltjes die op de buizen achterblijven, de beeldvorming kunnen verstoren.
2. Bereiding van agarose
   1. Bereid E3 buffer 50x voorraadoplossingen als volgt voor:
      1. Voorraad 1 - 3,252 g Na₂HPO₄, 0,285 g KH₂PO₄, 11,933 g NaCl, 0,477 g KCl in 1 L gedeïoniseerd water
      2. Voorraad 2 - 2.426 g CaCl₂, 4.067 g MgSO₄ in 1 L gedeïoniseerd water.
   2. Om 1x E3-buffer te maken, voegt u 20 ml olie 1 en 2 toe in 960 ml gedeïoniseerd water.
      OPMERKING: Voeg geen methyleenblauw toe aan de E3-buffer die wordt gebruikt voor beeldvorming, aangezien dit verstrooiing van licht veroorzaakt.
   3. Los agarose met een laag smeltpunt op in 1x E3 door verhitting op 70-75 °C op een warmteblok met roeren tot de oplossing helder wordt zonder klonten of kristallen.
   4. Voeg voor multiview-beeldvorming in de handel verkrijgbare fluorescerende korrels (zie Materiaaltabel) toe aan de agarose-oplossing, waardoor beeldregistratie tijdens de analyse mogelijk is. Sonificeer de kralen bij kamertemperatuur met een frequentie van 40-30 minuten gedurende 20-30 minuten in een ultrasoonapparaat met waterbad om de kralen uit elkaar te halen.
   5. Voeg na sonicatie 1 μL parels toe aan 10 ml agarose-oplossing in een buisje van 15 ml en draai het buisje goed om een gelijkmatige verspreiding van de korrels te garanderen.
      OPMERKING: De hoeveelheid pareloplossing die aan agarose moet worden toegevoegd, is afhankelijk van de voorraadoplossing en de fabrikant. Probeer een reeks volumes en kies een concentratie waarbij de kralen goed verspreid lijken wanneer ze worden afgebeeld in het lichtplaatsysteem. Te veel kralen kunnen zich samenvoegen ondanks sonicatie en vortexen, terwijl te weinig kralen de beeldregistratie kunnen beïnvloeden.
   6. Bewaar de agarosebuis met toegevoegde parels in een gesloten waterbad op 37 °C gedurende ten minste 30 minuten voordat u het monster bereidt. Dit zorgt ervoor dat de temperatuur van de agarose daalt van 70 °C naar 37 °C.
3. Voorbereiding van het monster
   1. Zet de vissen 's avonds voor de dag van de beeldvorming in paren op met verdelers. Verwijder de verdelers gedurende ongeveer 15 minuten en verzamel embryo's volgens standaardprocedure²⁰.
   2. Zodra de embryo's het stadium hebben bereikt dat ze nodig zijn voor de voorbereiding van het monster, giet u de volledige 10 ml agarose (met kralen) die op 37 °C wordt gehouden op een petrischaaltje van 6 cm.
   3. Wacht ongeveer 2-3 minuten om de temperatuur onder de 33 °C te brengen voordat u 10 tot 15 embryo's terugplaatst in de agarose-oplossing.
      OPMERKING: Dit is een belangrijke stap om een mogelijke hitteschok te voorkomen bij embryo's die naar de agarose zijn overgebracht.
   4. Zorg ervoor dat er zo min mogelijk E3-buffer aan de agaroseoplossing wordt toegevoegd tijdens het terugplaatsen van embryo's. Draai de petrischaal rond zodat de kleine buffer die zou zijn overgebracht, goed wordt verspreid.
   5. Draag handschoenen voor de rest van de monstervoorbereidingsprocedure.
   6. Neem een micropipet van 200 μl met een geschikte pipetpunt en steek een schoongemaakt recht buisje uit de microcentrifugebuis in de pipetpunt, zoals weergegeven in afbeelding 1A,B.
   7. Zuig een beetje agarose op in de buis, gevolgd door 2-3 embryo's met behulp van de micropipet (Figuur 1C,D). Zorg ervoor dat de embryo's zich dicht bij de bodem van de buis bevinden (Figuur 1E), wat belangrijk zal worden bij het opzetten van beeldvorming. Zorg er ook voor dat er een beetje agarose tussen de verschillende embryo's zit (Figuur 1E) zodat kralen in dit gebied als registratiemarkers kunnen worden gebruikt.
   8. Zonder de druk van de pipet te verminderen, maakt u het slangetje los van de pipetpunt en plaatst u het op het deksel van het petrischaaltje gevuld met E3 zodat de agarose kan stollen (Figuur 1F).
   9. Herhaal stap 1.3.6 tot en met 1.3.8 totdat alle embryo's in de petrischaal zijn teruggeplaatst in de buisjes.
   10. Zodra de agarose is gestold (dit kan 5-10 minuten duren en kan worden bevestigd door de agarose in de petrischaal te controleren), brengt u de buisjes over in een microcentrifugebuisje van 2 ml gevuld met E3 (Figuur 1G).
   11. Bewaar de buisjes met de embryo's in een incubator van 28 °C of 33 °C, indien nodig, voordat u overgaat tot multiview-beeldvorming.

2. Multiview-beeldvorming

OPMERKING: Deze stap presenteert een algemene procedure voor multiview-beeldvorming van zebravisembryo's in hun vroege ontwikkelingsstadia. De hieronder beschreven methode kan eenvoudig worden aangepast aan elk multiview light sheet microscopiesysteem.

1. Het lokaliseren van het embryo
   NOTITIE: Vul de monsterkamer van de microscoop met het embryomedium²⁰ en stel de temperatuur van de monsterkamer in op de gewenste temperatuur ten minste 10 minuten voor de beeldvorming.
   1. Monteer de monsterhouder zoals eerder beschreven²¹, echter met één aanpassing. Aangezien beeldvorming via de buis wordt uitgevoerd, plaatst u de buis met embryo's rechtstreeks in een capillair met de juiste diameter, zodat deze op zijn plaats wordt gehouden zonder de agarose naar buiten te duwen en de embryo's aan de onderkant te verstoren (Figuur 1H).
      OPMERKING: Aangezien de monsterkamer een bepaalde hoogte heeft, zou het mogelijk zijn om het embryo in het gezichtsveld te positioneren zonder de vloer van de kamer te raken door ervoor te zorgen dat de embryo's zich tijdens de monstervoorbereiding naar de bodem van de buis bevinden (zoals vermeld in stap 1.3.7).
   2. Plaats de monsterhouder in het multiview-systeem en gebruik de x- en y-bedieningselementen om het embryo naar het midden van het gezichtsveld te brengen.
   3. Gebruik de z-regelaar van de preparaatnavigator om het embryo vervolgens scherp in beeld te brengen.
   4. Op dit punt zal de oriëntatie van het embryo in het chorion duidelijk zichtbaar zijn, en als deze niet bevredigend is, plaats dan een nieuwe buis en kies het embryo met een oriëntatie van interesse.
2. Uitlijnen van de lichtvellen
   1. Zodra het embryo in positie is, stelt u alle experimentele instellingen in - lasers, lichtpad, filter, straalsplitser en camera.
   2. Als de software tijdens het instellen van de acquisitieparameters een optie biedt voor pivot scan, selecteert u deze. Een spilscan vermindert het schaduweffect dat uit de lichtplaat komt wanneer deze structuren of ondoorzichtige gebieden in het monster tegenkomt.
   3. Start het live scannen van het monster. Stel de bitgrootte, het laservermogen en de gewenste zoom in, die de dikte van de lichtplaat en dus de axiale resolutie bepalen.
   4. Om de lichtvellen uit te lijnen, schakelt u eerst over op enkelzijdige verlichting en wijzigt u de instellingen van de twee lichtvellen (links en rechts) achtereenvolgens. Zoom digitaal in op een gebied van de steekproef waar duidelijke interessante structuren zichtbaar zijn.
      OPMERKING: In deze studie werd een nucleaire (H2A-mCherry) of een membraan (Utr-GFP) marker gebruikt om de vellen uit te lijnen. Het wordt aanbevolen om de instellingen van de lichtplaat in de software te wijzigen, zodat het scherpste contrast van het signaal wordt bereikt in het betreffende gebied.
   5. Zodra de twee lichtvellen afzonderlijk zijn geoptimaliseerd om het beste signaal te bereiken, schakelt u beide lichtvellen in. Voer een tweede uitlijningsronde uit en zorg ervoor dat het flikkeren minimaal is, wat wijst op een redelijk goede uitlijning van de twee vellen.
   6. Zodra de uitlijning is voltooid, activeert u de optie om de afbeeldingen die door de twee vellen zijn gegenereerd automatisch samen te voegen, indien toegestaan door de software. Als alternatief kan men eerst de lichtvellen grof uitlijnen door zich te concentreren op kralen rond het monster en vervolgens de uitlijning verfijnen met behulp van informatie uit het monster.
      OPMERKING: Tijdens beeldvorming met twee fluoroforen (zoals nucleaire en membraanmarkers) is de optimale uitlijning meestal marginaal verschillend voor de twee structuren. Kies in dit scenario een instelling op basis van beperkingen voor downstreamverwerking. Als bijvoorbeeld celgrenzen moeten worden gesegmenteerd, wat relatief meer verwerkingsintensief is, lijnt u de lichtvellen uit op basis van de membraanmarkering.
3. Multiview-beeldvorming instellen
   1. Activeer na het uitlijnen van de lichtvellen de opties voor het uitvoeren van een z-stack en multiview-beeldvorming.
   2. Begin met live scannen en navigeer met behulp van de sample-navigator om de eerste weergave te selecteren. Stel in deze weergave het segmentinterval in, gevolgd door de eerste en laatste segmenten van de z-stapel. Voeg deze positie toe in het dialoogvenster voor meerdere weergaven, waarin de positie en z-stapelinformatie voor deze weergave worden genoteerd.
   3. Ga naar de volgende weergave door de hoek in de samplenavigator te wijzigen. Stel de z-stack in voor de tweede weergave en voeg de informatie toe in het dialoogvenster voor meerdere weergaven.
   4. Herhaal hetzelfde voor extra weergaven.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er in elke weergave een bepaald minimumaantal segmenten wordt afgebeeld, zodat er voldoende overlap is tussen de verschillende weergaven, wat uiteindelijk zal helpen bij het registreren van de weergaven tijdens de verwerking. Het minimale aantal segmenten is afhankelijk van de zoomfactor en van het aantal hoeken dat voor de beeldvorming is gekozen.
   5. Nadat je alle weergaven hebt ingesteld, sla je deze informatie op in een tekstbestand (bijvoorbeeld 'embryo-posities' genoemd), dat z-stack-informatie, (x, y, z) coördinaten van de buis bevat, evenals specificaties van de hoek voor elke weergave. Wis na het opslaan alle posities uit het dialoogvenster met meerdere weergaven.
   6. Omdat beeldvorming wordt gedaan met een intact chorion, dat relatief groot is, is het niet mogelijk om de kralen in de buis met dezelfde instellingen te bekijken. Daarom moet de informatie over de kraal vanuit een andere positie in de buis worden verkregen. Om dit te doen, vertaalt u naar een andere 'y'-coördinaat weg van het embryo waar kralen zichtbaar zijn. Voeg deze positie toe aan het multiview-dialoogvenster en sla deze positie op in een tekstbestand (bijvoorbeeld met de naam 'beads-y').
      OPMERKING: Beeld de korrels zo dicht mogelijk bij het embryomonster af om de effecten van mogelijke verschillen in buiskromming op de twee posities te minimaliseren. Als er meerdere embryo's in het buisje worden gemonteerd, is het daarom belangrijk om een beetje agarose tussen de buisjes te laten om kralen af te beelden (zoals vermeld in stap 1.3.7).
   7. Ga naar de map waar de tekstbestanden zijn opgeslagen en dupliceer het bestand 'embryo-posities' naar een nieuw bestand met de naam 'kralen-posities'. Vervang de y-coördinaat voor alle aanzichten in het bestand 'kralenposities' door de y-coördinaat uit het 'kralen-y' bestand. Dit zorgt ervoor dat kralen worden afgebeeld met hetzelfde aantal weergaven, z-stapels en x-coördinaten, maar op een andere y-positie in de buis.
   8. Keer terug naar de beeldvormingssoftware en laad het bestand 'kraalposities' in de software. Als de optie tijdreeksen is geactiveerd, selecteert u één cyclus en start u het experiment. Sla kralenafbeeldingen op als 'kralen', die worden gebruikt voor het registreren van de verschillende weergaven tijdens de beeldverwerking.
   9. Nadat u de kralenfoto's hebt gemaakt, wist u de posities en laadt u het eerste 'embryo-posities'-bestand in de software. Stel het gewenste aantal cycli in met een geschikt tijdsinterval en start het experiment.

3. Multiview-beeldanalyse

OPMERKING: Voor het samenvoegen van de multiview-afbeeldingen wordt een FIJI-plug-in, BigStitcher, de nieuwste versie van de Multiview Reconstruction-plug-in, gebruikt 10,17,18. De plug-in kan worden geïnstalleerd door de BigStitcher-plug-in toe te voegen in de functie 'Update Sites beheren', die toegankelijk is in de optie 'Update' onder het menu 'Help'. Eenmaal geïnstalleerd, verschijnt de plug-in onder het menu 'Plug-ins'. De brede stappen die bij fusie betrokken zijn, zijn als volgt: (1) Definieer .xml/.h5-bestandsparen voor zowel de kralen als de embryo's; (2) Registreer alle weergaven met het kralenbestand; (3) Extract Point Spread Function (PSF) voor de kralen, die kan worden gebruikt voor deconvolutie (figuur 2A); (4) Breng de registratie- en PSF-informatie over van het kralenbestand naar het embryobestand en begin met multiview-deconvolutie. De meeste van deze stappen zijn eerder in detail beschreven²¹, en hier worden de stappen beschreven die anders worden verwerkt.

1. Een .xml dataset definiëren
   1. Definieer een nieuwe dataset voor zowel de kralen als het embryo als respectievelijk 'beads.xml' en 'embryo.xml', zoals eerder beschreven²¹.
2. Detectie en registratie met behulp van interessepunten
   1. Nadat de export van het beads.xml bestand is geslaagd, selecteert u de weergaven die nodig zijn voor registratie in het dialoogvenster 'Multiview Explorer' (Figuur 2B). Klik met de rechtermuisknop en kies Interessepunten detecteren. Ga te werk als volgt als beschreven²¹.
   2. Nadat u interessepunten hebt gedetecteerd, selecteert u alle weergaven, klikt u met de rechtermuisknop en kiest u Registreren met interessepunten. Volg het protocol zoals beschreven²¹.
   3. Controleer zorgvuldig of de hielregistratie goed heeft gewerkt. Bij succesvolle registratie worden overlappende kralen van verschillende weergaven over elkaar heen gelegd (Figuur 2C). Om te controleren hoe de registratie precies heeft gewerkt, selecteert u twee opeenvolgende aanzichten, gaat u naar het overlappende gebied en schakelt u tussen de twee aanzichten om te zien of de kralen die vanuit verschillende hoeken zijn afgebeeld, over elkaar heen zijn gelegd. Herhaal dit voor elke opeenvolgende weergave.
   4. Als de overlapping niet nauwkeurig is, probeer dan de registratie opnieuw uit te voeren door de vereiste significantie voor registratie en/of de acceptabele overlappingsfout te versoepelen (in het dialoogvenster 'Registratie' 'RANSAC-fout' genoemd).
   5. Klik na een succesvolle registratie op Opslaan in het venster 'Multiview Explorer' om het bijgewerkte .xml bestand op te slaan.
      OPMERKING: Sla ook het logbestand op, want het bevat meer gedetailleerde informatie over de efficiëntie van de registratie. Om de registratie-informatie van de kralen naar het embryo te vertalen, volgt u de onderstaande stappen.
   6. Open het bead.xml bestand in een tekstverwerker naar keuze en kopieer het hele blok onder "ViewRegistrations".
   7. Open de embryo.xml en vervang het blok "ViewRegistrations" door het blok dat is gekopieerd uit het kralenbestand. Als er meerdere kanalen zijn, vervang dan de registratie-informatie voor elk kanaal zoals hierboven. De registratie-informatie kan handmatig worden overgedragen of met behulp van de op maat geschreven MATLAB-code die hier kan worden gedownload: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
   8. Open het embryo.xml bestand in "BigStitcher" en controleer zorgvuldig of de registratie succesvol is verlopen voor het embryo. Herhaal hetzelfde als voor de kralen, door de overlapping van interessante structuren in elke twee opeenvolgende weergaven te controleren.
      OPMERKING: Af en toe kan embryoregistratie niet zo wenselijk zijn, ondanks dat de kralen perfect worden geregistreerd. Dit is mogelijk als er kleine veranderingen zijn in de kromming van de buis van de positie waar de kralen zijn afgebeeld naar de embryopositie. Bovendien kunnen er subtiele bewegingen van het embryo tussen weergaven zijn, omdat het vrij in het chorion zweeft. Voer in dit geval een tweede registratieronde uit met behulp van een nucleaire marker in het embryo.
   9. Om dit te doen, opent u het embryo.xml bestand in "BigStitcher", klikt u met de rechtermuisknop op alle weergaven met de nucleaire markering en kiest u Interessepunten detecteren.
   10. Hernoem de interessepunten naar 'kernen' en ga verder met de stappen zoals uitgevoerd voor kralen.
   11. Zorg er bij het instellen van 'Verschil van Gaussian'-parameters voor dat de meeste, zo niet alle, kernen worden gedetecteerd en dat er geen ectopische nucleaire detectie is. Klik vervolgens op Gereed.
   12. Registreer vervolgens deze weergaven door te kiezen voor Registreren met interessepunten en kies voor de optie Nauwkeurige descriptor (vertaling-invariant). Zorg ervoor dat de optie 'vergelijk alle weergaven en interessepunten' is geselecteerd en gebruik 'kernen' als interessepunten. Gebruik de optie voor het corrigeren van de eerste weergave en map niet terug.
   13. Gebruik voor registratie een affien model met rigide regularisatie en de standaardparameters in de plug-in.
   14. Controleer het succes van de registratie opnieuw door elke twee opeenvolgende weergaven te vergelijken.
   15. Klik na een succesvolle registratie op Opslaan in het venster 'Multiview Explorer' om het bijgewerkte .xml bestand op te slaan.
   16. Open het embryo.xml bestand in een teksteditor naar keuze en kopieer de registratie-informatie van de nucleaire markers naar de andere kanalen.
3. Extractie en toewijzing van puntspreidingsfuncties
   1. Om multiview-deconvolutie uit te voeren, extraheert u de PSF van het beeldvormingssysteem uit de dataset van geregistreerde kralen en past u deze toe op het embryobestand.
   2. Als u deze informatie wilt ophalen, selecteert u alle weergaven in het kralenbestand, klikt u met de rechtermuisknop en kiest u Puntspreidingsfuncties en Extraherenopties .
   3. Zorg er in het dialoogvenster dat verschijnt voor Zorg ervoor dat Overeenkomstige interessepunten gebruiken en Minusintensiteitsprojecties van PSF verwijderen zijn aangevinkt, ga verder met de standaard PSF-formaten en klik op OK.
      OPMERKING: Als de PSF-extractie voor alle weergaven is geslaagd, wordt in het logbestand 'Geëxtraheerde n/n PSF's' weergegeven
   4. Sla hierna het .xml bestand opnieuw op. Er verschijnt een aangevinkt selectievakje in de PSF-kolom van het dialoogvenster 'Multiview Explorer' en er wordt een 'psf'-map gegenereerd in de betreffende map met alle uitgepakte PSF's.
   5. Open het embryo.xml bestand en wijs de PSF toe aan elke weergave afzonderlijk. Klik met de rechtermuisknop op "een weergave" → klik op Puntspreidingsfuncties → kies Toewijzen → selecteer Geavanceerd, gevolgd door Nieuwe PSF toewijzen aan alle geselecteerde weergaven. Klik op Bladeren, ga naar het .xml bestandspad en open de psf-map .
   6. Kies de overeenkomende PSF met de bijbehorende ID in de geselecteerde weergave en klik op OK, waarna het selectievakje PSF aangevinkt verschijnt in het venster 'Multiview Explorer'.
   7. Herhaal het proces voor alle andere weergaven.
4. Multiview fusie en deconvolutie
   1. Nadat de puntspreidingsfunctie voor alle weergaven is toegewezen, klikt u met de rechtermuisknop en kiest u Multiview-deconvolutie.
   2. Selecteer het begrenzingsvak als momenteel geselecteerde weergaven. Voor dit werk werken de standaard OSEM-versnelling en het aantal iteraties goed.
   3. Downsample de afbeeldingen indien nodig als snellere berekeningen gewenst zijn of als het CPU-geheugen beperkt is.
      OPMERKING: Als het vereiste RAM-geheugen het bestaande geheugen overschrijdt, verschijnt er een waarschuwingsfoutmelding in rode kleur onder aan het venster. Start de deconvolutie niet als deze waarschuwing verschijnt, omdat de plug-in op een bepaald moment tijdens de verwerking vastloopt en niet meer reageert.
   4. Om de voortgang van de deconvolutie te beoordelen, controleert u het logbestand, dat elke 5 iteraties de resultaten weergeeft.
   5. Om de rekensnelheid te verhogen, voert u multiview-deconvolutie uit in GPU indien eerder geïnstalleerd.
      OPMERKING: Aan het einde van dit proces verschijnt er een venster met gesmolten afbeeldingen, dat kan worden opgeslagen als een tiff-bestand.

Resultaten

Het op een nauwkeurige manier oriënteren van het monster is een essentieel onderdeel van het efficiënt gebruik van een microscopie-opstelling. Het handmatig oriënteren van monsters is echter vaak niet mogelijk bij gebruik van een multiview lichtplaatsysteem, gezien de vereiste om de monsters in een buis voor te bereiden. Daarom, om te controleren of er stereotiepe posities zijn die embryo's innemen in het chorion, werden zebravisembryo's afgebeeld op 70% epiboly (ongeveer 7 uur na de bevruchting (hpf)), aangezien time-lapse-beeldvorming van gastrulatie tot vroege somietstadia de focus van deze studie was. Toen monsters onmiddellijk voor de beeldvorming op 70% epiboly werden voorbereid, vertoonden de embryo's geen specifieke oriëntatie die vaak wordt waargenomen in monsters. Omdat dit vaak niet wenselijk is, werden de monsters ruim voor de gastrulatie voorbereid en tot het begin van de beeldvorming in microcentrifugebuisjes bij de juiste temperatuur bewaard. Onder deze omstandigheden konden de embryo-oriëntaties bij 70% epiboly (N = 3; n = 87 embryo's) worden ingedeeld in (1) Horizontaal, wanneer de dier-plantaardige (AV) as van het embryo loodrecht stond op de lange as van de polymeerbuis, (2) Verticaal, wanneer de AV-as evenwijdig was aan de lange as van de polymeerbuis, en, (3) Schuin, wanneer de AV-as zich in een scherpe hoek bevond (Figuur 3A). De horizontale positie was het minst vertegenwoordigd, terwijl de verticale en schuine posities gelijk werden waargenomen (figuur 4).

Toen de embryo's in de buisjes werden achtergelaten, waren de embryo's stabiel in deze respectievelijke posities tot 90% epiboly, waarna de meeste embryo's van oriëntatie veranderden. Daarom was een tweede ronde van documentatie van oriëntaties in het knopstadium van de embryogenese (ongeveer 10 hpf) nodig om rekening te houden met de veranderde oriëntaties. Dit werd uitgevoerd voor onafhankelijk geprepareerde monsters. Voor het in beeld brengen van vroege somietstadia werd eerder gemeld dat een embryo met zijn notochord loodrecht op de lange as van de polymeerbuis de ideale oriëntatie was, omdat het visualisatie mogelijk maakt van meerdere bilaterale somieten die langs de as¹⁵ worden gevormd. Wanneer monsters werden voorbereid vóór gastrulatie (N = 3, n = 93 embryo's), vertoonde ongeveer 25% van de embryo's deze oriëntatie (Figuur 4) en deze embryo's bleven stabiel in deze oriëntatie tot ten minste het 8-somietstadium, in overeenstemming met eerdere rapporten¹⁵. De rest van de embryo's vertoonden verschillende andere oriëntaties in het knopstadium (geclassificeerd in figuur 3B en figuur 4); Velen van hen heroriënteerden zich echter naar de horizontale positie tijdens de vroege somietvorming. Interessant is dat een vergelijkbaar percentage embryo's een horizontale oriëntatie vertoonde in het knopstadium, ongeacht of het monster was geprepareerd vóór gastrulatie, bij 70% epiboly of onmiddellijk vóór het knopstadium. De timing van de monstervoorbereiding lijkt dus minder kritisch voor de horizontale oriëntatie die van belang is voor beeldvorming van somietstadia, in tegenstelling tot wat werd waargenomen voor beeldvorming bij 70% epiboly.

Het voordeel van een multiview-systeem is de mogelijkheid om hetzelfde monster vanuit meerdere hoeken te bekijken. Voor zebravisembryo's in de genoemde stadia is het aantal weergaven dat nodig is om cellulaire resolutie over het hele embryo te verkrijgen echter niet duidelijk. Om dit te karakteriseren, werden zebravisembryo's afgebeeld met behulp van een 20x/1 NA-objectief in de detectiearm met een zoomfactor van 1, wat overeenkwam met een lichte plaatdikte van 4,57 μm. Onder deze instellingen besloeg het embryo het volledige gezichtsveld van een sCMOS-camera met een pixelgrootte van 6,5 μm en een gebied van 1920 bij 1920 pixels. Micro-injectie van mRNA voor een histon-gelabelde fluorofoor (H2A-mCherry) in embryo's in het 1-cellige stadium, verkregen uit een transgene lijn die gemarkeerde actinefilamenten (Utr-GFP) visualisatie van zowel kernen als celmembranen in het embryo mogelijk maakte. Om de multiview-fusie van embryo's met verschillende hoekintervallen uit te voeren, werd 360°-acquisitie van de dubbele transgene embryo's en kralen in de buis uitgevoerd om de 30° (n = 3 embryo's bij 70% epiboly; n = 3 embryo's in het knopstadium) of 45° (n = 3 embryo's bij 70% epiboly; n = 3 embryo's in het knopstadium) intervallen met ongeveer 100 plakjes in elke hoek en een plakinterval van 2 μm. Door tijdens de beeldverwerking alternatieve hoeken over te slaan, leverden de 30°- en 45°-acquisities bovendien de 60°- en 90°-datasets op.

De verkregen beelden werden vervolgens geregistreerd met behulp van de kraalinformatie en de registratiegegevens werden overgebracht naar de embryo-dataset zoals beschreven in het protocolgedeelte. Succesvolle registratie met behulp van de BigStitcher-plug-in is bereikt voor de verschillende acquisities, met uitzondering van de 90°-dataset, die waarschijnlijk te wijten is aan minder dekking van de steekproef vanuit elke hoek. Om dit te verhelpen, werden embryo's elke 90° afgebeeld met ongeveer 400 plakjes in elke hoek en een plakinterval van 2 μm, zowel in 70% epiboly- als knopstadia, die met succes werden geregistreerd (n = 3 embryo's voor elke fase).

De volgende stap was het uitvoeren van multiview fusie en deconvolutie van de geregistreerde datasets. Dit werd gedaan met 4x downsampling om de berekening te versnellen. Zoals te zien is in de weergave van kernen vanuit individuele weergaven en een multi-view gereconstrueerd embryo (Figuur 5), beslaan de individuele weergaven een kleiner gezichtsveld, dat bij fusie een beeld van het hele embryo opleverde. Voor de weergave werden kernen gedetecteerd met behulp van Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon), een op FIJI gebaseerde plug-in, die kan worden toegevoegd in het gedeelte "Manage Update Sites" van het menu "Help" in FIJI en toegankelijk is onder het plug-insmenu zodra het is toegevoegd. Voor de detectie werden de respectievelijke beelden eerst geconverteerd naar XML/hdf5-formaat en vervolgens werd nucleaire detectie uitgevoerd met behulp van de 'Detection'-plugin van Mastodon met een DoG-detector (diameter 6 μm en kwaliteitsdrempel 80).

Van de verschillende samengevoegde beelden vertoonde de 90°-dataset een zeer hoge achtergrond dieper in de steekproef, waardoor deze ongeschikt was voor het uitvoeren van kwantificering. Dus, in tegenstelling tot kleinere monsters zoals Drosophila-embryo's, die in andere onderzoeken vaak met een interval van 90° zijn afgebeeld ^9,22, wordt hetzelfde niet aanbevolen voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's met behulp van een 20x/1 NA-objectief. Tussen de 30°, 45° en 60° gefuseerde datasets was er kwalitatief geen wezenlijk verschil in kerninformatie (Figuur 6B, bovenste rij); fijnere structuren zoals celgrenzen leken echter veel beter opgelost met de 30° gefuseerde dataset in vergelijking met de rest (Figuur 6C, bovenste rij).

Om deze waarneming te bevestigen, werd Mastodon gebruikt om kernen te detecteren in de gefuseerde beelden die werden verkregen door beeldvorming om de 30°, 45° en 60°. Voor de analyse werden drie regio's in de samengevoegde beelden gekozen, één op een diepte van 20 μm (figuur 6A), 50 μm en 100 μm van het oppervlak van het embryo. Om de efficiëntie van de detectie van kernen in verschillende beelden te vergelijken, werd de detectie uitgevoerd zoals hierboven beschreven, met identieke parameters voor gefuseerde beelden van verschillende hoekintervallen. In alle geanalyseerde regio's werd elke kern gedetecteerd, ongeacht gefuseerde beelden die werden verkregen door beeldvorming om de 30°, 45° of 60° (Figuur 6B, onderste rij). Bolvormige structuren zoals kernen kunnen dus op elk van de bovenstaande hoekintervallen worden afgebeeld zonder verlies van informatie.

Voor het analyseren van celgrenzen werd Tissue Analyzer²³ gebruikt, een FIJI-plug-in die routinematig wordt gebruikt voor het segmenteren van cellen 24,25,26. Net als bij Mastodon kan de Tissue Analyzer-plug-in worden toegevoegd in het gedeelte "Update Sites beheren" van het menu "Help" in FIJI en toegankelijk zijn via het plug-insmenu zodra het is toegevoegd. Celgrenzen werden gesegmenteerd met behulp van het waterscheidingsalgoritme met standaardparameters en een sterke vervaging variërend van 1,5 tot 2, afhankelijk van de weefseldiepte en een zwakke vervaging van 1. Deze parameters werden in alle analyses constant gehouden, waardoor een eenvoudige vergelijking mogelijk was. Toen de gesegmenteerde afbeeldingen handmatig werden vergeleken met de originele invoerafbeeldingen, werden fouten waargenomen, waarbij de software geen celgrens kon detecteren of niet-bestaande celgrenzen tekende (Figuur 6C, onderste rij). Het aantal fouten dat door de plug-in voor weefselanalysator werd gemaakt, werd genormaliseerd naar het totale aantal bindingen dat in de regio werd gedetecteerd en berekend als 'Boundary segmentation error'. Hoewel deze fouten aanwezig waren in alle geanalyseerde regio's, nam het aantal fouten drastisch toe in gefuseerde beelden verkregen uit beeldvorming met hoekintervallen van 45° en 60°, vergeleken met 30° (Figuur 6D). Dit gaf aan dat de resolutie in de gefuseerde beelden steeds slechter werd naarmate het hoekinterval werd verhoogd. Voor het segmenteren van fijnere structuren zoals celgrenzen maakt een strakker hoekinterval een eenvoudigere stroomafwaartse verwerking mogelijk.

Figuur 1: Monstervoorbereiding met behulp van polymeerbuisjes. (A) Met een pincet wordt een polymeerbuisje uit de opgeslagen microcentrifugebuisjes genomen. (B) Het buisje bevestigen aan de punt van een micropipet van 200 μl. (C) Embryo's met behulp van een pipet in de buis zuigen. (D,E) Een polymeerbuis met embryo's in het knopstadium zichtbaar naar de bodem van de buis. (F) De polymeerbuisjes worden op een petrischaaltje met E3 geplaatst om de agarose te laten stollen. (G) Opslag van de polymeerbuisjes in een microcentrifugebuisje gevuld met E3. (H) Geassembleerde monsterhouder met de gemonteerde polymeerbuis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Multiview beeldanalyse workflow en registratie met behulp van kralen. (A) De multiview-pijplijn voor beeldanalyse. (B) De afbeelding toont het "Multiview Explorer"-venster in BigStitcher, een FIJI-plug-in, waar elke weergave als een enkele rij verschijnt en informatie bevat over de hoek, het kanaal, de registratie, interessepunten en PSF. Alle opdrachten die in het protocol worden besproken, verschijnen wanneer een weergave wordt geselecteerd en gevolgd door een klik met de rechtermuisknop, zoals weergegeven in het pop-upmenu. De geselecteerde weergaven kunnen worden gevisualiseerd in het BigDataViewer-venster, zoals weergegeven. (C) Een representatief beeld van de kraal voor (links) en na registratie (rechts) verkregen door beeldvorming met hoekintervallen van 30°. Alle hoekaanzichten zijn geselecteerd en weergegeven. Schaalbalken: 75 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Overzicht van de standaard embryo-oriëntaties. Representatieve beelden van de oriëntaties waarin de embryo's vallen binnen het chorion bij 70% epiboly (A) en knopstadia (B). De bovenste rij in elk paneel toont helderveldafbeeldingen die zijn verkregen uit het lichtvelsysteem en de onderste rij toont representatieve cartoons. Pijlen in (B) geven de positie van het notochord aan, dat werd gebruikt om de oriëntatie te bepalen. Ap, dierlijke pool; Vp, plantaardige pool; A, voorkant; P, achteraan. Schaal balken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Statistieken van verschillende embryo-oriëntaties. (A) De gestapelde kolom geeft de percentages embryo's aan die in de aangegeven oriëntaties vallen op 70% epiboly wanneer monsters worden voorbereid vóór gastrulatie. (B) De gestapelde kolommen geven de percentages embryo's aan die in de aangegeven oriëntaties vallen in de knopstadia wanneer monsters worden voorbereid vóór gastrulatie (links), bij 70% epiboly (midden) en in knopstadia (rechts). N, het aantal onafhankelijke legsels waaruit embryo's zijn verkregen; n, het totale aantal embryo's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Weergave van kernen uit een multiview gereconstrueerd embryo. (EEN)Het 3D-spreidingsdiagram vertegenwoordigt kernen die zijn gedetecteerd in een multiview-gereconstrueerd embryo dat is afgebeeld met een hoekinterval van 30°. Elke cirkel vertegenwoordigt een kern en het zwaartepunt van de kernposities wordt uitgezet. De nucleaire coördinaten werden verkregen met behulp van Mastodon, een FIJI-plug-in. (B) 3D-verstrooiingsdiagrammen van kernen van drie representatieve weergaven van hetzelfde embryo - de afbeeldingen zijn 60° uit elkaar. Kleuren voor elke kern werden willekeurig toegewezen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Vergelijking van informatie op cellulaire schaal in samengevoegde beelden. (A) De afbeelding aan de linkerkant toont een momentopname van een multiview-gereconstrueerd embryo op een diepte van 20 μm van het oppervlak. De gele cirkel geeft het gebied weer dat wordt gebruikt voor verdere analyse. Schaalbalken: 50 μm (in alle panelen). (B) Representatieve ruwe beelden van kernen op een diepte van 20 μm vanaf het oppervlak van het embryo uit drie datasets die respectievelijk elke 30°, 45° en 60° zijn afgebeeld (boven). Kernen gedetecteerd (in groen) in dezelfde afbeeldingen door Mastodon, een FIJI-plug-in (onder). (C) Representatieve onbewerkte beelden op een diepte van 20 μm vanaf het oppervlak van het embryo uit drie datasets die respectievelijk om de 30°, 45° en 60° zijn afgebeeld met behulp van de actinemarker, Utr-GFP (boven). Grenzen die zijn gesegmenteerd door Tissue Analyzer, een FIJI-plug-in, worden weergegeven voor dezelfde afbeeldingen (onderaan). Pijlen geven fouten aan die door de weefselanalysator zijn gemaakt bij grenssegmentatie, waarbij de gele pijl een ontbrekende grens vertegenwoordigt en de witte pijl ten onrechte gedetecteerde grenzen vertegenwoordigt wanneer er visueel geen grenzen lijken te bestaan. (D) De boxplot geeft het percentage fouten weer dat de weefselanalysator heeft gemaakt tussen multiview gereconstrueerde embryo's die elke 30°, 45° en 60° op verschillende diepten zijn afgebeeld. Foutbalken geven 1,5 keer de interkwartielafstand aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het positioneren van een embryo in de juiste richting om het interessegebied in beeld te brengen, is een van de snelheidsbeperkende stappen die vaak resulteert in een mislukte microscopiesessie voor een gebruiker. Dit is meer het geval bij een multiview lichtplaatmicroscoop waar handmatige manipulatie van de oriëntatie moeilijk is omdat de monsters in een buis zijn ingebed. Om bij dit proces te helpen, rapporteert deze studie de statistieken van verschillende posities waarin een zebravisembryo tussen 70% epiboly en vroege somietstadia in een chorion inneemt wanneer de polymeerbuis met embryo's rechtop wordt gehouden in een microcentrifugebuis.

Bij 70% epibolie bieden verticaal of horizontaal georiënteerde embryo's aanvullende informatie over gebeurtenissen in het hele embryo. Terwijl de horizontale oriëntatie visualisatie mogelijk maakt van de cellulaire dynamiek in de dierlijke pool en de dynamiek van cellen die epiboly ondergaan gezien vanaf de plantaardige pool, maakt de verticale oriëntatie visualisatie van dorsale en ventrale zijden van het embryo mogelijk, inclusief cellulaire dynamiek in de dorsale organisator, internalisatie van cellen tijdens gastrulatie en convergentie-extensiestromen. Deze studie toont aan dat er een grote kans is om puur door toeval een embryo in verticale oriëntatie te krijgen als de monsters een paar uur voor de beeldvorming worden voorbereid; De horizontale oriëntatie lijkt in deze stadia echter veel minder voor te komen. Voor stadia voorafgaand aan 70% epiboly, wordt aanbevolen dat gebruikers vergelijkbare statistieken van embryo-oriëntatie in het chorion documenteren voordat ze doorgaan met time-lapse-beeldvorming, omdat het vooraf hebben van deze informatie op de lange termijn tijd bespaart.

Vanaf het knopstadium is de beste oriëntatie voor beeldvorming een horizontaal gepositioneerd embryo, omdat dit het mogelijk maakt om de cellulaire dynamiek langs de gehele anteroposterieure lichaamsas van embryo's te volgen¹⁵. Het is relatief eenvoudig om een embryo in deze oriëntatie te krijgen, aangezien ongeveer 25% van de embryo's in deze stabiele positie valt, ongeacht wanneer het monster wordt voorbereid. Over het algemeen wordt aanbevolen om voor het afbeelden van elk stadium van interesse ongeveer 15 buisjes met twee tot drie embryo's in elke buis voor te bereiden, wat zorgt voor een grote kans op het verkrijgen van embryo's in de gewenste oriëntatie en dus voor een succesvolle microscopiesessie op een bepaalde dag. Bovendien wordt aanbevolen om de buizen ongeveer een uur voor het stadium van interesse te sorteren om een embryo te kiezen met de juiste oriëntatie voor time-lapse-beeldvorming.

Na het verkrijgen van een embryo in de juiste oriëntatie, is het belangrijk om rekening te houden met het aantal weergaven en het hoekinterval tussen de weergaven voor beeldvorming. Dit is afhankelijk van de minimaal vereiste ruimtelijke en temporele resolutie. Hoe meer hoeken van waaruit een bepaalde structuur of regio van het embryo wordt afgebeeld, hoe beter de ruimtelijke resolutie (zoals weergegeven in figuur 6), maar dit leidt tot een compromis op de temporele resolutie. In dit protocol, met een systeem met twee verlichtings- en één detectiearmen, duurde het ongeveer 3 minuten voor één tijdstip om twee kanalen over een volledige 360° met een hoekinterval van 30° en ongeveer 100 z-plakjes in elke hoek met een plakafstand van 2 μm af te beelden. Hoewel dit voldoende is om cellen in vroege embryonale stadia te volgen, moet een kleiner aantal hoeken worden verkregen om gebeurtenissen met een snellere dynamiek vast te leggen, wat zorgt voor een betere temporele resolutie, maar met een compromis op ruimtelijke resolutie, vooral als fijnere structuren zoals celgrenzen moeten worden gesegmenteerd. Een tweede optie om te overwegen om de temporele resolutie te verbeteren, is het gebruik van een multiview-systeem met twee detectiearmen, dat de acquisitiesnelheid aanzienlijk zal verhogen, zoals onlangs werd gebruikt voor het volgen van celbewegingen tijdens gastrulatie in zebravisembryo's¹⁶. Hoewel in dit protocol alleen het 20x/1 NA-objectief is getest, moet bovendien afhankelijk van het monster dat wordt afgebeeld, de vereiste ruimtelijke resolutie en het gezichtsveld, het juiste objectief worden overwogen. Alles bij elkaar genomen, op basis van de vereiste stroomafwaartse verwerking en kwantificering voor een bepaald monster en gezichtsveld, moeten het aantal weergaven en het hoekinterval zorgvuldig worden gekozen. Voor het afbeelden van hele vroege zebravisembryo's, met name met een resolutie op cellulaire schaal vanuit meerdere hoeken, lijkt een 20x/1 NA-objectief echter optimaal te zijn, aangezien een objectief met een lagere vergroting en NA (bijvoorbeeld 10x/0,5 NA-objectief) een veel lagere resolutie zal hebben, wat waarschijnlijk leidt tot meer segmentatiefouten, terwijl een objectief met een hogere vergroting en NA niet haalbaar zal zijn om het hele embryo in het gezichtsveld van de camera te bedekken.

In deze studie, om montage- en beeldvormingsstrategieën te bespreken, werden een actinemarker gebruikt, die kan worden gebruikt als een proxy voor het traceren van celgrenzen, en een histonmarker, voor het detecteren en volgen van kernen. In feite hebben de meeste van de eerder gepubliceerde onderzoeken die een multiview-lichtbladsysteem hebben gebruikt, bij voorkeur vergelijkbare markeringen gebruikt 5,7,15,16,27. De belangrijkste reden om voor deze markers te kiezen, is dat multiview light sheet-microscopie voornamelijk wordt gebruikt voor het volgen van de dynamiek op cellulaire schaal (bijv. celvorm en celherschikking), hetzij op weefselschaal of over het hele embryo gedurende lange perioden van enkele uren tot dagen. Aan de andere kant, als er behoefte is aan het verkrijgen van subcellulaire resolutie, kan een andere transgene lijn worden gebruikt die het interessegebied markeert, maar in dit scenario is een multiview lichtplaatmicroscoop misschien niet de beste instrumentkeuze, en eerder een confocaal, een superresolutiesysteem of zelfs een roosterlichtplaatmicroscoop^{28, 29} past misschien beter bij het probleem dat wordt onderzocht.

Het besproken protocol werkt goed van gastrulatie tot 15-somite stadium zebravisembryo's³⁰ (ongeveer 17 hpf) zonder enige aanpassingen, en hoewel het hier niet is getest, zal het waarschijnlijk ook werken voor eerdere embryo's vóór het gastrulatiestadium. Na het 15-somietstadium beginnen spontane spiersamentrekkingen^30,31, die kunnen worden onderdrukt door tricaïne, een verdovingsmiddel, zowel in de buis als in de monsterkamer toe te voegen. Bovendien begint bij ongeveer 18 hpf de staarteversie weg van de dooier³⁰, waardoor het embryo uit het gezichtsveld wordt verwijderd. Om hiervoor te zorgen, moet een volgalgoritme worden gebruikt dat het verlengde uiteinde volgt om het embryo scherp te houden³². Bovendien moet voor het afbeelden van embryo's in een later stadium wanneer ze verstoken zijn van een chorion, zoals voor het volgen van neurale ontwikkeling, een alternatieve montagestrategie worden gebruikt, zoals onlangs uitgevoerd³³.

Voor het afbeelden van zebravisembryo's met een intact chorion is het niet mogelijk om zowel de kralen, die als registratiemarkers fungeren, als het embryo in hetzelfde gezichtsveld vast te leggen met behulp van een 20x/1 NA-objectief. Deze studie biedt een eenvoudig alternatief door de verschillende weergaven te registreren met informatie van kralen die boven of onder het monster aanwezig zijn, gevolgd door het verschuiven van de registratie van de kralen naar het embryo tijdens de verwerking. Zodra het embryomonster op deze manier is geregistreerd, kan een tweede registratieronde worden uitgevoerd met behulp van kernen als registratiemarkers, die in het monster aanwezig zijn, om de initiële registratie verder te verfijnen. Bij het uitvoeren van time-lapse-beeldvorming kan de kerninformatie op zijn beurt worden gebruikt voor de registratie van opeenvolgende tijdstippen, zoals eerder is gerapporteerd²¹. Een alternatief voor dit protocol is om af te zien van kralen en in plaats daarvan de kerninformatie te gebruiken voor de eerste registratie. Maar de registratie mislukte vaak (hier niet getoond) in de BigStitcher-plug-in, mogelijk vanwege een combinatie van veel kernen die tijdens de verwerking niet dieper in het embryo werden gedetecteerd en ook vanwege een relatief kleiner aantal kernen die vanuit bepaalde hoeken in het embryo aanwezig zijn (bijvoorbeeld wanneer ze ventraal worden bekeken in late epiboly-stadia).

In dit protocol kan men dit protocol gebruiken voor het afbeelden van alleen specifieke interessegebieden, maar met een hoge vergroting vanuit verschillende hoeken in plaats van het hele embryo, omdat de informatie over de parel van boven of onder het monster wordt gebruikt voor registratie en er geen noodzaak is om kralen af te beelden in dezelfde weergave als het monster. Bovendien is het eenvoudig om dit protocol aan te passen voor het afbeelden van meerdere monsters die verticaal in de buis zijn gestapeld door kraalinformatie van tussen de monsters te gebruiken voor registratie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose, lage geleertemperatuur	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydraat	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Versie: ImageJ 1.54f
Latexkralen, carboxylaat-gemodificeerd polystyreen, fluorescent rood, 0.5 μm gemiddelde deeltjesgrootte, waterige suspensie	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesiumsulfaat heptahydraat	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcriptiekit	ThermoFischer Scientific	AM1340	Voor in vitro transcriptie van H2A-mCherry plasmid
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P9541
Kaliumfosfaat monobasisch	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE-huls AWG 15L - 1,58 mm ID x 0,15 mm Wand +/-0,05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE-buizen
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S3014
Natriumfosfaat dibasisch	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasoonreiniger	Labman	LMUC3	Ultrasoonapparaat
Zeiss LightSheet 7 Systeem	Zeiss