Methodenartikel

Menselijke darmorganoïden gebruiken om het epitheel van de dunne darm te begrijpen op transcriptioneel niveau van één cel

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66749

⸱

28 juni 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol combineert menselijke darmorganoïdetechnologie met transcriptomische analyse van één cel om aanzienlijk inzicht te geven in voorheen onontgonnen darmbiologie.

Samenvatting

Single cell transcriptomics heeft een revolutie teweeggebracht in ons begrip van de celbiologie van het menselijk lichaam. State-of-the-art menselijke organoïdeculturen in de dunne darm bieden ex vivo modelsystemen die de kloof tussen diermodellen en klinische studies overbruggen. De toepassing van single cell transcriptomics op menselijke intestinale organoïde (HIO) modellen onthult voorheen niet-herkende celbiologie, biochemie en fysiologie van het maagdarmkanaal. De geavanceerde single cell transcriptomics-platforms maken gebruik van microfluïdische partitionering en barcodering om cDNA-bibliotheken te genereren. Deze cDNA's met streepjescodes kunnen eenvoudig worden gesequenced door sequencingplatforms van de volgende generatie en worden gebruikt door verschillende visualisatietools om kaarten te genereren. Hier beschrijven we methoden om HIO's van menselijke dunne darm in verschillende formaten te kweken en te differentiëren en procedures voor het isoleren van levensvatbare cellen uit deze formaten die geschikt zijn voor gebruik in transcriptionele profileringsplatforms voor één cel. Deze protocollen en procedures vergemakkelijken het gebruik van HIO's in de dunne darm om een beter begrip te krijgen van de cellulaire respons van humaan darmepitheel op transcriptioneel niveau in de context van een verscheidenheid aan verschillende omgevingen.

Inleiding

Het epitheel van de dunne darm heeft twee verschillende zones: de crypte die de intestinale stamcel (ISC) herbergt en de villus, die bestaat uit gedifferentieerde cellen van de secretoire en absorberende lijnen. Deze complexiteit wordt nog vergroot door de regionale specificiteit van het epitheel dat unieke functionele eigenschappen biedt tussen de regio's van de dunne darm. Baanbrekend werk bracht kweekomstandigheden tot stand waarin zowel de menselijke dunne darmcrypte als de villuszones ex vivo kunnen worden gegenereerd uit chirurgisch weefsel of weefselbiopsieën1. Deze culturen overbruggen de kloof tussen dierstudies en klinische proeven en onthullen voorheen niet-herkende celbiologie, biochemie en fysiologie van het maagdarmkanaal. De HIO's worden gepropageerd als 3D-sferische structuren met behulp van een medium met groeifactoren die de levensvatbaarheid van stamcellen bevorderen en extracellulaire ondersteuningsmatrices. Deze omstandigheden resulteren in een crypte-achtig HIO-model dat voornamelijk bestaat uit voorlopercellen en stamcellen. Verwijdering van de groeifactoren bevordert ISC-differentiatie (villusachtig model) en productie van rijpe darmepitheelcellen (beker, entero-endocriene, plukje, enterocyt) in de juiste verhoudingen, samen met celproliferatie en -differentiatie, polarisatie, barrière-integriteit, regionale specifieke kenmerken en passende fysiologische reacties2. HIO-culturen zijn genetisch stabiel en kunnen voor onbepaalde tijd worden vermeerderd in hun crypte-achtige staat. Gemakkelijke toegang tot het apicale oppervlak van deze culturen wordt geboden door kweekomstandigheden die groei in een monolaagformaatmogelijk maken 3. HIO's maken het ook mogelijk om overwegingen van individuele variabiliteit van de gastheer, zoals genetica, leeftijd, geslacht, etniciteit en ziektestatus, op te nemen in biologische analyses. Analytische en functionele beoordelingsinstrumenten zijn identiek aan die welke worden gebruikt in benaderingen die gericht zijn op getransformeerde cellijnen en omvatten een verscheidenheid aan moleculaire technieken zoals flowcytometrie, microscopie, transcriptomics, proteomics en metabolomics.

Single cell transcriptomics brengt een revolutie teweeg in ons begrip van de biologie en fysiologie van de dunne darm door inzicht te geven in de individuele bijdragen van elk celtype aan een biologisch proces. Baanbrekend werk met behulp van deze technologie heeft een landschap opgeleverd van de celtypen die aanwezig zijn in de inheemse menselijke darm 4,5,6. Platforms voor transcriptionele profilering van afzonderlijke cellen maken verkenning van het transcriptionele landschap van individuele cellen mogelijk, waardoor celheterogeniteit op de voorgrond van wetenschappelijke exploratie kan komen. In sommige transcriptionele profileringsplatforms voor één cel worden microfluïdische partitionering en barcodering gebruikt om cDNA-bibliotheken te genereren uit cellulaire gepolyadenyleerde mRNA's die zijn verkregen uit maximaal 10.000 cellen per monster. Op dit platform vormen druppeltjes met enkele cellen, oligonucleotiden met streepjescode, reverse transcriptiereagentia en olie een reactieblaasje dat ertoe leidt dat alle cDNA's van een enkele cel dezelfde streepjescode hebben. De cDNA's met streepjescodes kunnen vervolgens efficiënt worden gesequenced met behulp van sequencing van de volgende generatie. Gegenereerde gegevens kunnen worden verwerkt via software en visualisatietools, die de sequenties met streepjescodes omzetten in visualisatiekaarten en transcriptieprofielen van één cel. Celpopulaties kunnen worden geïdentificeerd met behulp van openbaar beschikbare databases van humaan dunne darmepitheel 4,5,6. Hoewel veel studies dit platform hebben gebruikt om darmorganoïden van muizen op celniveau te ondervragen, is de analyse van transcriptionele responsen van HIO's op basis van één cel achtergebleven bij 7,8,9,10,11,12.

Hier bieden we een stapsgewijze handleiding voor het isoleren van levensvatbare cellen uit HIO's in de dunne darm voor verwerking op transcriptionele profileringsplatforms voor één cel (Figuur 1). We bieden richtlijnen voor kweek en differentiatie, samen met mediacomponenten die zijn geoptimaliseerd voor epitheliale differentiatie. We schetsen celherstelmethoden voor drie verschillende kweekformaten: driedimensionale (3D) en monolaagculturen op plastic of op membraancelcultuurinzetstukken. We bieden steekproefclusteringgegevens die zijn verkregen met behulp van open-source software om differentieel tot expressie gebrachte genen in elk cluster af te leiden.

Protocol

De organoïdelijnen die hier worden gebruikt, zijn verkregen van het Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core. In het kort, om in eerste instantie organoïde lijnen vast te stellen, werden donorweefselmonsters gewassen en enzymatisch verteerd om de darmcrypten vrij te maken. Crypten werden ingebed in een basaalmembraan en gekweekt in een medium. De Institutional Review Board van het Baylor College of Medicine keurde het onderzoeksprotocol goed om weefselmonsters te verkrijgen waaruit organoïdelijnen werden vastgesteld, en er werd geïnformeerde toestemming verkregen van alle donoren om organoïdelijnen van het gedoneerde weefsel vast te stellen.

1. Passaging van 3D HIO's om uit te breiden voor differentiatie

  1. Verwijder het medium uit putjes met organoïden die zijn gekweekt in platen met 24 putjes (rond het vaste basale membraan) met een P1000-pipet. Voeg 300 μL 0,05% trypsine-EDTA toe aan het putje en breek organoïden mechanisch af door 5x op en neer te pipetteren met een P1000-pipet.
  2. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 4 min. Voeg 500 μL compleet medium zonder groeifactoren (CMGF-medium) met 10% FBS toe aan elk putje (tabel 1). Gebruik een P1000 pipet en pipet CMGF medium en HIO mengsel, 10x heen en weer in de put. Breng het volledige volume over in een tube van 15 ml. Combineer de doorgang van meerdere putjes in dezelfde buis van 15 ml. Combineer niet meer dan 10 putjes per buis.
  3. Spin-down cellen bij 4 °C met behulp van een zwenkrotorcentrifuge bij 100 x g gedurende 5 min. Verwijder al het medium en houd de pellet op de bodem van de buis. Houd de tube op ijs.
  4. Bereken de hoeveelheid basaalmembraan die nodig is voor het aantal HIO-platen en resuspendeer de HIO-pellet in 30 μL/putje basaalmembraan met behulp van koude P200-pipettepunten. Pipeteer het HIO-basaalmembraanmengsel als een druppel in het midden van een plaat met 24 putjes met behulp van koude P200-pipetpunten.
  5. Breng de plaat over naar een incubator van 37 °C. Laat het basaalmembraan 5-10 minuten stollen en voeg vervolgens 500 μL compleet medium op kamertemperatuur toe dat WNT, R-spondine, noggin, EGF en ROCK-remmer (WRNE+Y; Tabel 1) naar elke put en cultuur in een incubator van 37 °C. Ververs de cultuur met WRNE+Y om de dag gedurende 7 dagen.
    OPMERKING: Een gezonde HIO zal cystisch van vorm zijn met een glanzend ontluikend epitheel (Figuur 2). Cellen in het midden van de cyste kunnen niet worden gevisualiseerd. Een ongezonde HIO ziet er dof uit en heeft een dik epitheel met een stevig midden. Het belangrijkste kenmerk is het glanzende uiterlijk.

2. HIO-differentiatie: 3D-formaat

  1. Gebruik 1 week na het kweken 1 week na het kweken één putje 3D HIO's voor 3 putjes 3D gedifferentieerde HIO's.
  2. Verwijder media uit putten. Dispergeer het basaalmembraan en de HIO's met behulp van een P1000-pipet en voeg koude 500 μL CMGF- per put toe en pipte minstens 5x omhoog en omlaag. Centrifugeer HIO's bij 4 °C met behulp van een zwenkrotorcentrifuge bij 100 x g gedurende 5 minuten. Verwijder al het medium en houd de pellet op de bodem van de buis.
  3. Voeg 30 μL basaalmembraan toe per putje HIO's dat wordt geplateerd. Pipetteer de druppel van 30 μl basaalmembraan met HIO's in een putje van een plaat met 24 putjes. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 min. Voeg 500 μL WRNE+Y/Diff (50/50) media toe.
  4. Schakel het medium na 24 uur over op differentiatiemedium voor 3 extra dagen en ververs het medium om de dag. Bereid 3 putjes per monster voor op de pool om de technische variabiliteit te verminderen.

3. HIO-differentiatie: Monolayer-formaat

  1. Smeer de inserts of putjes van de membraancelcultuur van een plaat met 96 putjes in met 100 μl/putje humaan placentacollageen IV (1 mg/ml in 100 mM azijnzuur) verdund in koud H2O (1:30). Incubeer bij 37 °C gedurende minimaal 1,5 uur of maximaal een nacht. Voeg voor het inzetstuk van de membraancelcultuur steriele H2O toe aan de plaatruimte om de plaat te bevochtigen; voor een plaat met 96 putjes steriel H2O toevoegen in de ongebruikte putjes.
  2. Verzamel 3D HIO's gekweekt in WRNE gedurende 7 dagen door de media te verwijderen en het basale membraan en de cellen te herstellen door 500 μL/putje koude 0,5 mM EDTA toe te voegen (0,5 M EDTA verdund 1:1000 in steriele PBS). Gebruik een P1000-pipet om organoïden en oplossing 5x op en neer te spuiten en over te brengen naar een microcentrifugebuis van 15 ml. Verzamel niet meer dan 10 putjes organoïden per buis. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g in een zwenkbare emmerrotor bij 4 °C.
    OPMERKING: Om 3 putjes op een plaat met 96 putjes te bereiden, gebruikt u 1 putje 3D HIO's. Om 1 membraancelcultuurinzetstuk voor te bereiden, gebruikt u 1 putje 3D HIO's (de zaaidichtheid van enkele cellen is ongeveer 1-2 x 105 cellen/putje voor een plaat met 96 putjes, 2,5-3 x 105 cellen/putje voor een membraancelcultuurinzetstuk).
  3. Verwijder 500 μL media en laat de pellet op de bodem van de buis liggen. Dissocieer de HIO's door 500 μL 0,05% trypsine/0,5 mM EDTA toe te voegen en gedurende 4-5 minuten bij 37 °C te incuberen. Krachtig op en neer pipetteren voor ~50x met behulp van een P1000. Voorkom dat er luchtbellen ontstaan door tegen de zijkant van de buis te pipetteren.
  4. Inactiveer de trypsine door 1 ml CMGF toe te voegen, dat 10% FBS bevat. Filter grote klonten onverteerde cellen eruit door een celzeef van 40 μm te bevochtigen met 1 ml CMGF- bevattende 10% FBS en de cellen toe te voegen aan de bovenkant van de celzeef. Gebruik de zwaartekracht om de cellen door de zeef te laten gaan en gooi de celzeef met celklompjes weg.
  5. Verzamel de cellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 400 x g in een zwenkbare emmerrotor bij kamertemperatuur.
  6. Verwijder de vloeistof uit het met collageen beklede membraancelcultuurinzetstuk of van de plaat met 96 putjes. Resuspendeer de HIO-pellet in 100 μl/putje WRNE met 10 μM Y-27632 en pipet vervolgens in het bovenste compartiment van het membraancelcultuurinzetstuk of in de plaat met 96 putjes. Voeg voor het inbrengen van membraancellen 600 μL WRNE met 10 μM Y-27632 toe aan het onderste compartiment van het putje.
  7. Verwijder het medium na 24 uur uit zowel het bovenste als het onderste deel van het membraancelcultuurinzetstuk of van de plaat met 96 putjes en vervang het gedurende 5 dagen door differentiatiemedium. Bereid 3 putjes per monster voor op de pool om de technische variabiliteit te verminderen.

4. Bereiding van single cell suspensies van gedifferentieerde 3D HIO's voor single cell transcriptomics

  1. Plaats het reagens voor enzymatische celvertering bij 37 °C in een CO2 -incubator om te ontdooien en op te warmen 30 minuten voordat de 3D HIO-vergisting begint. Controleer de HIO's met een helderveldmicroscoop bij 10x om de gezondheid van de cel te garanderen.
  2. Verwijder het medium uit de putjes en voeg 500 μL koudecelhersteloplossing toe aan de putjes. Pipeteer een paar keer op en neer om de cellen los te maken van het basale membraan met behulp van een P1000-pipet en standaard pipetpunten. Breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml.
    OPMERKING: Het gebruik van replicate wells zorgt voor voldoende celaantallen en vermindert well-to-well-variatie. Combineer geen putjes vóór stap 4.7 hieronder.
  3. Incubeer de buisjes met cellen gedurende 10 minuten op ijs en pipetteren elke 5 minuten op en neer. Verzamel de cellen door centrifugeren gedurende 3 minuten bij 400 x g bij 4 °C.
  4. Verwijder de vloeistof uit de buis en zorg ervoor dat u de celkorrel niet verstoort. Resuspendeer de cellen in 500 μl voorverwarmd enzymatisch celverteringsreagens. Pipette op en neer met een P1000 minimaal 10x.
  5. Incubeer de HIO's gedurende 30 minuten bij 37 °C in een CO2 -incubator. Pipeteer elke 10 minuten 10x het hele volume met een P1000-pipet om de cellen te helpen dissociëren. Vermijd het introduceren van luchtbellen in de celsuspensie.
  6. Pelleteer de cellen gedurende 3 minuten op 400 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen in 1 ml differentiatiemedia en bewaar ze op ijs.
    OPMERKING: Vanaf dit punt moeten de HIO's altijd op ijs worden bewaard.
  7. Pipeteer de cellen 50x snel op en neer met behulp van een P1000 om ervoor te zorgen dat HIO's worden gedissocieerd in afzonderlijke cellen. Zorg ervoor dat er bij deze stap geen luchtbellen ontstaan, omdat dit celverlies veroorzaakt.
  8. Filtreer het volledige volume door een topzeef van 70 μm met behulp van een P1000-pipetpunt. Gebruik een microcentrifugebuisje van 1,5 ml om het eluaat op te vangen.
    OPMERKING: De filtertip raakt niet verstopt als de verteringstijd voldoende is. Gebruik meerdere filtertips als het filter verstopt raakt; Forceer het volume niet door het filter.
  9. Herhaal stap 4.8 met een tipzeef van 40 μm. Bewaar monsters op ijs.
  10. Tel levensvatbare afzonderlijke cellen in een celtelkamer met behulp van uitsluiting van trypanblauw door 5 μL 0,4% trypanblauw toe te voegen aan 5 μL celsuspensie. Verdun het monster indien nodig tot 1000 cellen/μl. Als de celdichtheid minder dan 1000 cellen/μl is, pelletcellen gedurende 2 minuten bij 400 x g bij 4 °C, verwijder de oorspronkelijke media en resuspendeer ze in celkweekmedia. Dit protocol levert doorgaans 5 x 105-1 x 106 cellen op.
    OPMERKING: De bereiding van een suspensie van hoge kwaliteit (90% levensvatbaar en 90% enkelvoudige cellen) is essentieel voor gegevens van hoge kwaliteit met één cel. De ervaring leert echter dat een levensvatbaarheid van slechts 75% kan worden geaccepteerd in gevallen waarin behandeling, zoals infectie of toepassing van kleine moleculen, de levensvatbaarheid beïnvloedt.
  11. Bereid DNA-bibliotheken voor op transcriptionele profileringsplatforms voor één cel volgens de protocollen van de fabrikant. Verwerk de gegevens volgens best practice-protocollen voor scRNAseq-gegevensanalyse13,14.

5. Bereiding van eencellige suspensies van HIO's gedifferentieerd op membraancelcultuurinzetstuk

  1. Plaats het enzymatische celvergistingsreagens bij 37 °C in een CO2 - incubator om te ontdooien en op te warmen 30 minuten voordat de vertering van de HIO-membraancelkweek wordt gestart. Verdeel het voorverwarmde reagens voor enzymatische celvertering in aliquots van 200 μl in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml, 1 buisje per membraancelcultuurinzetstuk. Bewaar de buisjes in de incubator van 37 °C tot ze klaar zijn voor gebruik.
  2. Bereid PBS-EDTA voor door 5 μL 0,5 M EDTA toe te voegen aan 5 ml PBS. Aliquot 500 μL PBS-EDTA in een plaat met 24 putjes, 1 putje per membraancelcultuurinzetstuk.
  3. Was de cellen met PBS-EDTA: breng de membraancelcultuurinzetstukken over van putjes met groeimedia naar de putjes die PBS-EDTA bevatten. Verwijder het celkweekmedium van de apicale zijde en vervang het door 100 μL PBS-EDTA. Zorg ervoor dat u de cellaag niet verstoort.
  4. Gooi de PBS-EDTA die aan de apicale zijde van de membraancelcultuurinserts is toegevoegd, onmiddellijk weg. Verwijder het inzetstuk van de membraancelcultuur uit de put, dep het af door voorzichtig de rand van een papieren handdoek aan te raken en keer het vervolgens om op het werkblad. Gebruik een scherp scalpelmesje om het membraan van het inzetstuk te verwijderen door rond de binnenomtrek van het membraan te snijden. Werk snel om uitdroging te voorkomen.
  5. Gebruik een pincet om het membraan over te brengen naar de voorverwarmde microcentrifugebuis van 1,5 ml gevuld met reagens voor enzymatische celvertering en zorg ervoor dat het membraan volledig is ondergedompeld. Herhaal dit voor alle extra inzetstukken voor membraancelculturen.
    OPMERKING: Het verhogen van het volume van het reagens voor enzymatische celvertering tot 500 μL kan helpen bij het dissociëren van dichte monolagen.
  6. Dissocieer de cellen door buisjes met membranen bij 37 °C in een CO2 - incubator te incuberen. Meng door 5x voorzichtig het volledige volume te pipetteren met een pipet van 200 μL om de 10 minuten gedurende in totaal 30 minuten. Vermijd luchtbellen en zuiging van het membraan om de levensvatbaarheid te behouden.
  7. Breng elke 10 minuten een klein aliquot cellen (1-2 μL) over naar een glasplaatje om de dissociatie te beoordelen door het percentage afzonderlijke cellen kwalitatief te beoordelen. Het kan tot 50 minuten duren met extra pipetteren om 80%-90% enkelvoudige cellen te bereiken, afhankelijk van het HIO-type. Schraap het membraan voorzichtig af met een pipetpunt tijdens de mengstappen om dissociatie te bevorderen, vooral voor moeilijk te dissociëren cellen, maar schrapen kan de levensvatbaarheid beïnvloeden.
  8. Combineer 3 duplicaatputjes per toestand in een enkele microcentrifugebuis van 1,5 ml (600 μl in totaal). Voeg 400 μL celkweekmedia (diff) + 10 μM ROCKi (1 ml totaal volume) toe. Meng voorzichtig door te pipetteren.
    OPMERKING: Het gebruik van replicate wells zorgt voor voldoende celaantallen en vermindert well-to-well-variatie. Putten moeten bij deze stap worden samengevoegd.
  9. Filtreer het volledige volume door een zeef van 70 μm met behulp van een pipetpunt van 1 ml. Vang de doorstroom op in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    OPMERKING: De filtertip raakt niet verstopt als de verteringstijd voldoende is. Gebruik meerdere filtertips als het filter verstopt raakt; Forceer het volume niet.
  10. Herhaal stap 5.9 met een tipzeef van 40 μm. Bewaar monsters op ijs.
  11. Tel levensvatbare afzonderlijke cellen in een celtelkamer met behulp van uitsluiting van trypanblauw door 5 μL 0,4% trypanblauw toe te voegen aan 5 μL celsuspensie. Verdun het monster indien nodig tot 1000 cellen/μL. Als de celdichtheid minder is dan 1000 cellen/μL, centrifugeer dan 2 minuten op 400 x g bij 4 °C om de cellen te pelleteren, verwijder de originele media en resuspendeer in WRNE+Y bij de gewenste celdichtheid. Dit protocol levert doorgaans 4 x 105 - 6 x 105 cellen op.
    OPMERKING: De bereiding van hoogwaardige suspensie (90% levensvatbare en 90% enkelvoudige cellen) is essentieel voor gegevens van hoge kwaliteit op basis van eencellige cellen. De ervaring leert echter dat een levensvatbaarheid van slechts 75% kan worden geaccepteerd in gevallen waarin behandeling, zoals infectie of toepassing van kleine moleculen, de levensvatbaarheid beïnvloedt.
  12. Bereid DNA-bibliotheken voor op de transcriptionele profileringsplatforms voor één cel volgens de protocollen van de fabrikant. Verwerk de gegevens volgens best practice-protocollen voor scRNAseq-gegevensanalyse13,14.

6. Bereiding van eencellige suspensies van HIO's gedifferentieerd als monolagen met 96 putjes

  1. Plaats het reagens voor enzymatische celvergisting bij 37 °C in een CO2 -incubator om 30 minuten voor aanvang van de monolaagse HIO-vergisting te ontdooien en op te warmen.
  2. Bereid PBS-EDTA voor door 5 μL 0,5 M EDTA toe te voegen aan 5 ml PBS. Gooi de celkweekmedia van de plaat met 96 putjes weg en vervang deze door 100 μl PBS-EDTA. Zorg ervoor dat u de cellaag niet verstoort.
  3. Dissocieer de cellen: Gooi de PBS-EDTA weg en voeg 100 μL warme enzymatische celvergistingsreagens toe aan elk putje. Plaats de plaat in de 37 °C in een 5% CO2 -incubator en meng door 5x zachtjes het volledige volume te pipetteren met een pipetpunt van 200 μL om de 10 min gedurende 20-30 min. Vermijd luchtbellen om de levensvatbaarheid te behouden.
    OPMERKING: Het verhogen van het volume van het reagens voor enzymatische celvertering tot 500 μL kan helpen bij het dissociëren van dichte monolagen.
  4. Breng elke 10 minuten een kleine hoeveelheid cellen (1-2 μL) over naar een glasplaatje om de dissociatie te beoordelen. Het kan tot 50 minuten duren om 80%-90% enkele cellen te bereiken, afhankelijk van het HIO-type. Schraap tijdens de mengstappen voorzichtig met de pipetpunt over de plaat om dissociatie te bevorderen, vooral voor moeilijk te dissociëren cellen; Schrapen kan echter de levensvatbaarheid beïnvloeden.
  5. Combineer 3 duplicaatputjes per toestand in een enkele microcentrifugebuis van 1,5 ml (300 μl in totaal). Voeg 700 μL celkweekmedia (diff) + 10 uM ROCKi (1 ml totaal volume) toe. Meng voorzichtig door te pipetteren.
    OPMERKING: Het gebruik van gerepliceerde gekweekte putten zorgt voor voldoende celaantallen en vermindert de variatie van put tot put.
  6. Filtreer het volledige volume door een zeef van 70 μm met behulp van een pipetpunt van 1 ml. Vang de doorstroom op in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    OPMERKING: De filtertip raakt niet verstopt als de verteringstijd van het enzymatische celvergistingsreagens voldoende is. Gebruik meerdere filtertips als het filter verstopt raakt; Forceer het volume niet.
  7. Herhaal stap 6.6 met een tipzeef van 40 μm. Bewaar monsters op ijs.
  8. Tel levensvatbare afzonderlijke cellen in een celtelkamer met behulp van uitsluiting van trypanblauw door 5 μL 0,4% trypanblauw toe te voegen aan 5 μL celsuspensie. Verdun indien nodig tot 1000 cellen/μL. Als de celdichtheid minder is dan 1000 cellen/μL, centrifugeer dan 2 minuten op 400 x g 4 °C om de cellen te pelleteren, verwijder de oorspronkelijke media en resuspendeer in celkweekmedia + ROCKi bij de gewenste celdichtheid. Dit protocol levert doorgaans 2 x 105 - 6 x 105 cellen op.
    OPMERKING: De bereiding van hoogwaardige suspensie (90% levensvatbare en 90% enkelvoudige cellen) is essentieel voor gegevens van hoge kwaliteit op basis van eencellige cellen. De ervaring leert echter dat een levensvatbaarheid van slechts 75% kan worden geaccepteerd in gevallen waarin behandeling, zoals infectie of toepassing van kleine moleculen, de levensvatbaarheid beïnvloedt.
  9. Bereid DNA-bibliotheken voor volgens de protocollen van de fabrikant van het single cell transcriptionele profileringsplatform. Verwerk de gegevens volgens best practice-protocollen voor scRNAseq-gegevensanalyse13,14.

Resultaten

Eencellige suspensies werden samengevoegd uit 2-3 putjes van membraancelcultuurinsert, monolaag en 3D HIO's om voldoende celopbrengst te garanderen en well-to-well-variatie te verminderen. Bibliotheken met één cel werden voorbereid met behulp van reagentia die specifiek zijn voor het transcriptionele profileringsplatform voor één cel. en gesequenced met gepaarde eindlezingen op een sequencingplatform van de volgende generatie, 30.000 lezingen/cel. Metingen werden in kaart gebracht, geteld en geanalyseerd met behulp van analytische tools voor single cell genomics. Cellen van lage kwaliteit met meer dan 20% mitochondriale aflezing, of minder dan 200 getelde genen, werden uitgesloten van de analyse. Om de kwaliteit van de cellen te beoordelen, hebben we het aantal genen, UMI's en percentage mitochondriale lezingen per cel uitgezet (Figuur 3); hoogwaardige cellen bevatten ongeveer 3500 genen, 15.000 UMI's en 10% mitochondriale metingen. Na filtering verkregen we 4000 tot 9500 afzonderlijke cellen, afhankelijk van het HIO-groeiformaat. Ongecontroleerde clustering en reductie van UMAP-dimensies identificeerden verschillende clusters die verwachte celtypen vertegenwoordigen, waaronder absorberende enterocyten en secretoire cellen (Figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de protocolstappen. Schema's die de belangrijkste stappen schetsen bij het plateren van HIO's in verschillende formaten voor de gegevensworkflow met één cel. Deze afbeelding is gemaakt met behulp van Biorender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Heldere veldbeelden. HIO's die klaar waren voor verwerking werden afgebeeld met behulp van een helderveldmicroscoop met een vergroting van 5x. Links, 3D organoïden; middelste plaat met 96 putjes; Juist, Transwell. Schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Kwaliteitscontrole van data. Voorbeeldmetriek van geanalyseerde afzonderlijke cellen geïsoleerd uit jejunale HIO's gekweekt als monolagen op platen met 96 putjes. Viooldiagrammen tonen het aantal genen (nFeature_RNA), UMI's (nCount_RNA) en percentage mitochondriale lezingen (percent.mt) per cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: UMAP's van geanalyseerde individuele cellen. (A) In totaal werden 9952 enkele cellen geïsoleerd uit gedifferentieerde jejunale HIO's gekweekt in platen met 96 putjes. (B) In totaal werden 5623 afzonderlijke cellen geïsoleerd uit gedifferentieerde jejunale HIO's gekweekt op inserts van membraancellen. (C) In totaal werden 4402 afzonderlijke cellen geïsoleerd uit gedifferentieerde ileale 3D HIO's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

WRNE Groei MediumDifferentiatie medium
BestanddeelVolumeUiteindelijke concentratieWRNE medium zonder L-WRN geconditioneerd medium, Nicotinamide en SB202190
*Y-27632 (5 mM) optioneel200 μL10 μM
Een 83-01 (500 μM)100 μL500 nM.
Geavanceerde DMEM/F1245 ml
B272 ml
EGF (50 μg/ml)100 μL50 ng/ml
Gastrine (10 μM)100 μL10 miljoen
GlutaMax (100X)1 ml
HEPES 1 M1 ml
L-WRN Con- Media50 ml~50%
N21 ml
N-acetylcysteïne (500 mM)100 μL500 μM
Nicotinamide 1 M1 ml10 mM
SB202190 (10 mM)100 μL10 μM
Totaal volume100 ml
CMGF- Gemiddeld
Geavanceerde DMEM/F12500 ml
Glutamax5 ml100X
1 m Hepes5 ml

Tabel 1: Samenstelling van verschillende gebruikte media.

Discussie

Met behulp van eencellige genomics-platforms kunnen complexe biologische systemen, zoals weefselafgeleide HIO-culturen die het darmepitheel modelleren, worden afgebroken om individuele cellulaire bijdragen aan de algehele biologische respons te leveren 4,5,6. Cellulaire heterogeniteit en zeldzame celpopulaties kunnen ook worden geïdentificeerd en ondervraagd. Mobiele invoer moet worden geoptimaliseerd om de uitvoer te maximaliseren met behulp van op transcriptomics gebaseerde platforms met één cel. Hier beschrijven we protocollen die zeer levensvatbare en hoogwaardige single cell suspensies zullen opleveren die de kans op het verkrijgen van downstream transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit zullen vergroten. Bekendheid met het protocol is van het grootste belang en het wordt aanbevolen om verschillende oefenruns uit te voeren voordat u doorgaat met de voorbereiding van de bibliotheek. Reproduceerbare realisatie van levensvatbare eencellige suspensies wordt aanbevolen voordat de cellen worden gebruikt voor bibliotheekvoorbereiding. De snelheid waarmee het protocol wordt geïmplementeerd is van het grootste belang, aangezien snelheid recht evenredig is met de levensvatbaarheidsresultaten. Op basis hiervan wordt geadviseerd om het aantal monsters dat tegelijk wordt behandeld te beperken. Het wordt aanbevolen om contact op te nemen met de entiteit die de bibliotheken voorbereidt voordat deze protocollen worden gestart voor hulp bij het oplossen van problemen.

De levensvatbaarheid van HIO heeft een directe invloed op de DNA-bibliotheek die voor sequencing wordt verzonden. De levensvatbaarheid van de HIO per cel hangt af van verschillende stappen in de bereiding van de eencellige suspensie, waaronder dissociatie, centrifugatie, buffers, pipetteren en telnauwkeurigheid. Het doel van het voorbereiden van de HIO's voor het platform is om het behoud van de levensvatbaarheid van de cellen in evenwicht te brengen met de kwaliteit van het monster. Cruciaal voor het verkrijgen van gegevens van hoge kwaliteit is het minimaliseren van cellulaire aggregaten, dode cellen, niet-cellulaire nucleïnezuren en biochemische remmers van reverse transcriptie. Stervende cellen verhogen de nucleïnezuurruis en dragen bij aan het samenklonteren van cellen, wat leidt tot gegevens- en platformstoringen 7,8,9,10,11,12. Filteren met een geschikte filtergrootte kan helpen bij het verwijderen van grote aggregaten en het verbeteren van de gegevenskwaliteit.

Er moet met verschillende factoren rekening worden gehouden om HIO-celdood te minimaliseren bij de bereiding van eencellige suspensies. Het verkrijgen van ten minste 80% levensvatbare cellen is noodzakelijk, en >90% levensvatbaarheid is nog wenselijker. Monsters met een groot aantal niet-levensvatbare cellen kunnen worden verbeterd met behulp van strategieën om dode cellen te verwijderen, zoals microbeads op basis van kolommen, hoewel deze meer initiële cellen en grotere monstervolumes vereisen als gevolg van verlies tijdens het hanteren. HIO's zijn bijzonder gevoelig voor buffers en zullen celdood ondergaan als ze in bepaalde buffers te lang op RT worden gelaten. Organoïde media resulteren in de minste hoeveelheid celverlies en aggregaatvorming. Pieteren kan ook de levensvatbaarheid van HIO beïnvloeden tijdens dissociatie. Normale boorpunten kunnen organoïden afschuiven, waardoor ze uiteenvallen in eencellige suspensies; Te snel pipetteren met een normale boortip kan echter HIO-celbeschadiging veroorzaken door de schuifkrachten. Langzaam pipetteren met brede boringen minimaliseert de belasting van de HIO-cellen en verbetert het aantal levensvatbare cellen stroomafwaarts aanzienlijk. Centrifugeren, wassen en resuspenderen zijn andere factoren die de kwaliteit van HIO single cells suspensies kunnen beïnvloeden. Centrifugeren met een zwaaiende emmer resulteert in een zachtere pelletvorming van HIO-cellen, wat resulteert in een lager aantal dode cellen terwijl celverlies wordt geminimaliseerd. Ten slotte is de nauwkeurigheid van het tellen om de concentratie te bepalen essentieel om ervoor te zorgen dat het maximale aantal cellen het platform bereikt voor bibliotheeksynthese. Aandacht voor deze details zal resulteren in het minimaliseren van de stress op de HIO-cellen tijdens het isolatieproces en zorgen voor de hoogste kans op gegevensretournering na verwerking.

Hoewel single cell transcriptomics een krachtig hulpmiddel is om biologische profielen en reacties op single cell niveaute ontleden 4,5,6, zijn er verschillende beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het toepassen van de technologie om menselijke darmorganoïdculturen te analyseren. Ten eerste kan er aanzienlijke transcriptionele variatie zijn als gevolg van technische variabiliteit die optreedt tijdens de voorbereiding en sequencing van de bibliotheek of als gevolg van batcheffecten als gevolg van monstervoorbereiding. Bovendien kan sequencing leiden tot dekkingsbias waarbij er sprake is van een ongelijke sequencingdiepte tussen genen of cellen. Dit veroorzaakt uitdagingen bij het detecteren van genen die laag tot expressie komen of het identificeren van zeldzame celpopulaties. Ten tweede kan de identificatie van celtypen moeilijk zijn vanwege de cellulaire en transcriptionele heterogeniteit van de organoïdeculturen en een minder gedifferentieerd cellulair profiel in vergelijking met het oorspronkelijke darmepitheel. Het koppelen van transcriptionele responsen aan functionele fenotypes is ook een uitdaging en vereist aanvullende validatie met behulp van andere benaderingen of assays. Ten derde houdt deze benadering geen rekening met de ruimtelijke context of de temporele dynamiek van de cellen. De dissociatieprocedure verwijdert de mogelijkheid om cel-celinteracties af te leiden uit de transcriptiegegevens. Het biedt slechts een enkele momentopname in de tijd van de cellulaire toestand in plaats van een biologisch continuüm. Ten slotte kunnen transcriptionele benaderingen van één cel kostbaar zijn en gespecialiseerde rekenhulpmiddelen en expertise op het gebied van bio-informatica vereisen. Deze benadering blijft echter nog steeds een dominant state-of-the-art hulpmiddel voor het begrijpen van cellulaire heterogeniteit en het identificeren van nieuwe celtypen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 subsidies en NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG914510 nM
0.05% Trypsin-EDTAInvitrogen25300054
0.4% Trypan blueMillipore-SigmaT8154
0.5 M EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-Corning21-040-CM
24 mm TranswellCostar3412
24 well Nunclon delta surface tissue culture dishThermo Scientific142475
40 µm cell strainerFalcon352340
40 µm Flowmi tip strainerSP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 µm Flowmi tip strainerSP Bel-Art LabwareH13680-0070
96 well plateCorning3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
B27 supplementInvitrogen17504-0441X
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.110x GenomicsPN-1000128
Collagen IVSigma-AldrichC5533-5MG33 µg/mL
Corning Cell Recovery Solution VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 mM
HEPES 1MInvitrogen15630-08010 mM
L-WRN conditioned mediaATCCCRL-3276
Matrigel, GFR, phenol freeCorning356231
mouse recombinant EGFInvitrogenPMG804350 ng/mL
N2 supplementInvitrogen17502-0481X
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165-5G500 µM
NicotinamideSigma-AldrichN063610 mM
SB202190Sigma-AldrichS706710 µM
TranswellCorning3413
Y27632Stem Cell Technologies7230810 µM

Referenties

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Blutt, S. E., et al. Gastrointestinal microphysiological systems. Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).
  3. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  4. Elmentaite, R., et al. Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).
  5. Hickey, J. W., et al. Organization of the human intestine at single-cell resolution. Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).
  6. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  7. Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).
  8. Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).
  9. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).
  10. Beumer, J., et al. BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states. Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).
  11. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).
  12. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).
  13. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  14. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Transcriptomics van enkelcellenorgano dkweekcel dissociatietranscriptionele profileringmicroflu dische partitioneringnext generation sequencingceltype identificatielichtveldmicroscopie

Gerelateerde artikelen