Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66752

⸱

26 april 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De huidige studie toont protocollen voor het beoordelen van de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen en het manipuleren van genexpressie in deze cellen.

Samenvatting

Folliculaire Helper T (TFH)-cellen worden gezien als een onafhankelijke CD4+ T-cellijn die verwante B-cellen helpt bij het produceren van antilichamen met hoge affiniteit, waardoor langdurige humorale immuniteit tot stand wordt gebracht. Tijdens acute virale infectie wordt de lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen bepaald in de vroege infectiefase, en onderzoeken naar de vroeg gedifferentieerde TFH-cellen zijn cruciaal om T-celafhankelijke humorale immuniteit te begrijpen en het vaccinontwerp te optimaliseren. In de studie, met behulp van een muismodel van acute lymfatische choriomeningitis virus (LCMV) infectie en de TCR-transgene SMARTA (SM) muis met CD4+ T-cellen die specifiek LCMV-glycoproteïne-epitoop I-AbGP66-77 herkennen, hebben we procedures beschreven om toegang te krijgen tot de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen op basis van flowcytometriekleuringen. Bovendien worden, door gebruik te maken van retrovirale transductie van SM CD4+ T-cellen, ook methoden geboden om genexpressie in vroeg gedifferentieerde virusspecifieke TFH-cellen te manipuleren. Daarom zullen deze methoden helpen bij studies die de mechanismen onderzoeken die ten grondslag liggen aan de vroege binding van virusspecifieke TFH-cellen .

Inleiding

Naïeve CD4+ T-cellen komen verschillende ziekteverwekkers of bedreigingen tegen en passen hun immuunresponsen aan door te differentiëren in verschillende helper T (TH) celsubsets met gespecialiseerde functies1. In het scenario van acute virale infectie differentieert een groot deel van de naïeve CD4+ T-cellen tot folliculaire helper T (TFH) -cellen die hulp bieden aan B-cellen 2,3. In tegenstelling tot andere CD4+ TH-celsubsets (bijv. TH1, TH2, TH9 en TH17-cellen), brengen TFH-cellen een aanzienlijk niveau van CXCR5 tot expressie, de chemokinereceptor voor de B-cel homing chemokine CXCL13, waardoor TFH-cellen kunnen migreren naar B-celfollikels. In de B-celfollikels helpen TFH-cellen verwante B-cellen bij het initiëren en onderhouden van kiemcentrumreacties, waardoor een snelle productie van antilichamen met hoge affiniteit en humoraal geheugen op lange termijn mogelijk wordt 2,3.

Bij acute virale infectie vindt de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen plaats binnen 72 uur 4,5 en wordt gecontroleerd door de transcriptionele repressor B-cellymfoom-6 (Bcl-6)5,6,7,8, die fungeert als de "hoofdregulator" die de lotsbeslissingen van TFH-cellen regelt. Deficiëntie van Bcl-6 verzwakt de differentiatie van TFH-cellen ernstig, terwijl ectopische expressie van Bcl-6 de lotsverbintenis van TFH-cellen aanzienlijk bevordert. Naast Bcl-6 zijn meerdere moleculen betrokken bij het instrueren van vroege lotsverbintenis van TFH-cellen. Transcriptiefactoren TCF-1 en LEF-1 initiëren TFH-celdifferentiatie via de inductie van Bcl-6 9,10,11. De remming van Blimp1, door zowel Bcl-6 als TCF-1, is vereist voor een vroege lotsverbintenis van TFH-cellen 11,12. STAT1 en STAT3 zijn ook nodig voor vroege TFH-celdifferentiatie 13. Bovendien helpen epigenetische modificaties door histonmethyltransferase EZH214,15 en m6A-methyltransferase METTL316 om transcriptieprogramma's van TFH-cellen (vooral Bcl6 en Tcf7) te stabiliseren en zo de vroege lotsverbintenis van TFH-cellen te stimuleren. Hoewel er vooruitgang is geboekt, waaronder de bovengenoemde moleculen en andere, die elders zijn samengevat3, in het begrijpen van de transcriptionele en epigenetische regulaties van vroege lotsverbintenis van TFH-cellen, moeten voorheen onbekende moleculen nog worden geleerd.

In het muismodel van acute lymfatische choriomeningitis virus (LCMV) -infectie, ondergaan adoptief overgedragen congene TCR-transgene SMARTA (SM) CD4+ T-cellen, die specifiek het LCMV-glycoproteïne-epitoop I-AbGP66-77 herkennen, ofwel TFH- of TH1-celdifferentiatie tijdens virale infectie. Dit TFH/TH 1bifurcatiedifferentiatiepatroon ondersteunt de vooruitgang van het SM/acute LCMV-infectiemodel bij het bestuderen van de biologie van virusspecifieke TFH-cellen. Het SM/acute LCMV-infectiemodel is inderdaad op grote schaal gebruikt in het onderzoeksveld van TFH-cellen en heeft een cruciale rol gespeeld bij baanbrekende ontdekkingen in de biologie van TFH-cellen. Dit omvat de identificatie van het eerder genoemde Bcl-6 als de afstammingsbepalende transcriptiefactor van TFH-cellen 5,6, evenals andere belangrijke transcriptionele factoren (bijv. Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 en Itch19) die de differentiatie van TFH-cellen, posttranscriptionele regelgeving ( bijv. METTL316 en miR-17~9220) van T FH-celdifferentiatie, TFH-celgeheugen en plasticiteit21,22, en rationele vaccinatiestrategieën gericht op TFH-cellen (bijv. selenium23).

De huidige studie beschrijft reproduceerbare methoden om toegang te krijgen tot de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen , waaronder (1) het opzetten van een acuut LCMV-geïnfecteerd SM-chimaera-muismodel dat geschikt is voor toegang tot vroeg gedifferentieerde TFH-cellen , (2) het uitvoeren van flowcytometriekleuringen van moleculen die verband houden met vroeg gedifferentieerde TFH-cellen , en (3) het uitvoeren van retrovirale vectorgebaseerde genmanipulatie in SM CD4+ T-cellen. Deze methoden zullen nuttig zijn voor studies die de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens procedures die waren goedgekeurd door de Institutionele Comités voor Dierverzorging en Gebruik van de Derde Militaire Medische Universiteit. De volgende muizenstammen werden in deze studie gebruikt: C57BL/6J (B6) muis (beide geslachten), in de leeftijd van 6 tot 8 weken, met een gewicht van 25-30 g; CD45.1+SM TCR transgene muis (B6 CD45.1 × SM TCR transgeen), beide geslachten, in de leeftijd van 6 tot 8 weken, met een gewicht van 25-30 g; en CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR transgene muis (B6 CD45.1 × SM TCR transgene × CXCR5-GFP knock-in), beide geslachten, in de leeftijd van 6 tot 8 weken, met een gewicht van 25-30 g. De transgene soorten werden gegenereerd naar aanleiding van een eerder gepubliceerd rapport24. De details van de reagentia, buffers en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Het oogsten van CD45.1+ SM CD4+ T-cellen voor adoptieve overdracht

  1. Euthanaseren (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) van het vereiste aantal 6 tot 8 weken oude CD45.1+ TCR-transgene SM-muizen24. Maak een incisie van 1 inch aan de linkerkant van de buikvlieswand van de geëuthanaseerde muizen met een chirurgische schaar, ontleed de milt van het buikvlies en scheur het bindweefsel achter de milt25,26.
  2. Plaats elke milt in een celzeef van 70 μm in een petrischaaltje (60 mm × 15 mm) en maal de milt met 3 ml lysisbuffer voor rode bloedcellen (RBC) met behulp van een zuiger van 1 ml.
    OPMERKING: Gebruik de ronde kant van de zuiger van de spuit om de milt te slijpen totdat er alleen bindweefsel overblijft.
  3. Voeg 6 ml RPMI + 2% FBS (RPMI 2%) toe aan elk gerecht om 3 ml RBC-lysisbuffer te verdunnen. Pipeteer de celsuspensies in een conische buis van 15 ml uit de schaal. Spoel de schaal af met een extra 3 ml 2% RPMI en breng over naar dezelfde conische buis.
  4. Centrifugeer de celsuspensies bij 800 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans weg door decanteren. Resuspendeer de cellen met een isolatiebuffer en pas de celdichtheid aan naar ~1 × 108 cellen per ml. Plaats de buis op ijs.
  5. Bereid een 1x gebiotinyleerde antilichaamcocktail tegen CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c en Ter119 in isolatiebuffer voor de verrijking van CD4+ T-cellen.
    OPMERKING: Voeg gebiotinyleerde antilichamen toe aan de isolatiebuffer in de aangegeven verdunning zoals vermeld in de materiaaltabel. Houd het volume van de antilichaamcocktail gelijk aan dat van de isolatiebuffer in stap 1.4.
  6. Centrifugeer de celsuspensies bij 800 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans weg door decanteren.
  7. Resuspendeer de celpellet met de aangegeven 1x gebiotinyleerde antilichaamcocktail in de conische buis.
  8. Leg de conische buis 30 minuten op ijs in een shaker op 45 tpm.
  9. Bereid tijdens de incubatie met gebiotinyleerde antilichamen het vereiste volume met streptavidine-gecoate korrels volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: De totale splenocyten van één naïeve muis hebben 200 μL met streptavidine beklede bolletjes nodig.
  10. Was de cellen door te centrifugeren bij 800 x g met 8-10 ml isolatiebuffer gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap nog twee keer.
  11. Resuspendeer de celpellet met bereide met streptavidine gecoate korrels.
  12. Leg de tube 40 minuten op ijs in een shaker op 45 tpm.
  13. Plaats de buis vervolgens 3-4 minuten op een magnetische standaard totdat alle kralen aan de magnetische kant zijn gemonteerd.
  14. Verzamel het supernatans voorzichtig en doe het in een nieuwe conische buis van 15 ml.
  15. Centrifugeer de celsuspensies bij 800 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans weg door decanteren.
    OPMERKING: Er zijn andere commerciële kits beschikbaar voor CD4+ T-celverrijking, die kunnen worden gebruikt als vervanging voor de CD4+ T-celverrijkingsprocedure beschreven in stappen 1.5-1.15.
  16. Resuspendeer de celpellet met 2-3 ml 2% RPMI. Aspireer 50 μL celsuspensie voor flowcytometrieanalyse van de efficiëntie van CD4+ T-celverrijking (CD4 en Vα2) en cellevensvatbaarheid.
  17. Centrifugeer de celsuspensies bij 800 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans weg door decanteren. Resuspendeer de celpellet met RPMI en pas de celdichtheid aan op 1 × 107 CD4+Vα2+ SM-cellen per ml. Zet de buis op ijs en ga in de volgende stap verder met adoptieve celoverdracht.

2. Vaststelling van het acute LCMV-geïnfecteerde SM-chimaera-muismodel voor toegang tot vroeg gedifferentieerde SM TFH-cellen

  1. Verwarm de 6 tot 8 weken oude C57BL/6-ontvangende muizen met een infraroodlamp om de staartader te verwijden voor intraveneuze injectie.
  2. Zuig 100 μL celsuspensie met 1 ×10 6 SM-cellen bereid in stap 1.17 op met een insulinespuit.
    OPMERKING: Het injectievolume moet door elke onderzoeker worden gewijzigd en mag het maximale injectievolume dat is toegestaan door de institutionele en lokale wetgeving niet overschrijden.
  3. Houd de muizen op hun plaats met een muizenfixator, maak de staart recht en veeg de staart af met 75% ethanol met een watje om de staartader zichtbaar te maken.
  4. Steek de naald van de insulinespuit in de staartader en injecteer de celsuspensies soepel en langzaam. Laat de ontvangende muizen vervolgens een nacht rusten.
  5. Verdun de volgende dag de LCMV Armstrong-virusvoorraad met RPMI-medium om een eindconcentratie van 1 × 107 plaquevormende eenheden/ml te bereiken.
  6. Injecteer 100 μL verdunde LCMV Armstrong-oplossing (bestaande uit 1 × 106 plaquevormende eenheden) in de staartader van de ontvangende muizen.
    OPMERKING: Elke onderzoeker moet voorzichtig zijn over de vraag of de aanbevolen infectieuze titer is toegestaan door institutionele en lokale wetgeving.

3. Flowcytometrie kleuringen van vroeg gedifferentieerde SM TFH-cellen

  1. Offer de muizen (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) uit stap 2.6 op dag 3 na infectie en verwerk lymfocyten uit milten zoals beschreven in stap 1. Pas de celdichtheid aan op ongeveer 2 × 107 cellen per ml.
  2. Laad 50 μL celsuspensies (~1 × 10,6 cellen) op een rondbodemplaat met 96 putjes en vul aan met 150 μL kleuringsbuffer per putje. Houd de plaat op ijs.
  3. Bereid de gezuiverde CXCR5-antilichaamcocktail tegen ratten (d.w.z. CXCR5 primair antilichaam) in een verdunning van 1:50 in 50 μL T FH-celkleuringsbuffer voor elk monster in een buis. Draai de buis grondig en centrifugeer deze bij 15.000 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C om de deeltjes samen te voegen. Houd de tube op ijs.
  4. Centrifugeer de plaat met 96 putjes bij 800 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C, gooi het supernatans weg door decanteren, draai de plaat kort in een vortex en voeg 200 μl kleuringsbuffer per putje toe.
  5. Herhaal stap 3.4 en resuspendeer de cellen met 50 μL het primaire CXCR5-antilichaam per putje. Meng goed door op en neer te pipetteren en 1 uur op ijs te incuberen.
  6. Bereid de gebiotinyleerde antilichaamcocktail van geiten tegen ratten (d.w.z. CXCR5 secundair antilichaam) in een verdunning van 1:200 in 50 μL T FH-celkleuringsbuffer voor elk monster in een nieuw buisje. Draai de buis in een draaikolk en centrifugeer deze bij 15.000 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C om de deeltjes samen te voegen. Houd de tube op ijs.
  7. Centrifugeer de plaat bij 800 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C, gooi het supernatans weg door decanteren, draai de plaat kort in een vortex en voeg 200 μL kleuringsbuffer per putje toe.
  8. Herhaal stap 3.7 twee keer en houd de plaat op het ijs.
  9. Voeg 50 μL CXCR5 secundair antilichaam per putje toe aan de plaat. Meng goed door op en neer te pipetteren en 30 minuten op ijs te incuberen.
  10. Bereid fluorescentie-geconjugeerd streptavidine (d.w.z. CXCR5 tertiair antilichaam) in een verdunning van 1:200 in 50 μL T FH-celkleuringsbuffer voor elk monster. Voeg ondertussen andere antilichamen tegen oppervlaktemarkers toe (bijv. CD45.1, CD4, PD-1, CD25 en andere geïnteresseerde moleculen) en de dode celkleuring samen met het CXCR5 tertiaire antilichaam.
  11. Draai de buis en centrifugeer deze bij 15.000 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C om de deeltjes samen te voegen. Houd de tube op ijs.
  12. Centrifugeer de plaat bij 800 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C, gooi het supernatans weg door decanteren, draai de plaat kort in een vortex en voeg 200 μL kleuringsbuffer per putje toe.
  13. Herhaal stap 3.12 twee keer en houd de plaat op het ijs.
  14. Voeg 50 μL CXCR5 tertiaire antilichaamcocktail per putje toe aan het bord. Meng goed door op en neer te pipetteren en incubeer 30 minuten op ijs in het donker.
  15. Bereid voor elk putje 200 μL fixatie-/permeabilisatiebuffer voor volgens de instructies van de fabrikant.
  16. Centrifugeer de plaat bij 800 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C, gooi het supernatans weg door decanteren, draai de plaat kort in een vortex en voeg 200 μL kleuringsbuffer per putje toe.
  17. Herhaal stap 3.16 twee keer en houd de plaat in het donker op ijs.
  18. Voeg 200 μL fixatie-/permeabilisatiebuffer toe aan elk putje. Meng goed door op en neer te pipetteren en 30 minuten (in het donker) op kamertemperatuur te incuberen.
    OPMERKING: Bereid de permeabilisatiebuffer (1x) voor volgens de instructies van de fabrikant.
  19. Bereid de antilichaamcocktail voor tegen transcriptiefactoren, waaronder Bcl-6, TCF-1, T-bet en andere geïnteresseerde moleculen, in 50 μL permeabilisatiebuffer (1x) voor elk putje in een nieuwe buis.
  20. Draai de buis en centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C om de deeltjes te aggregeren.
  21. Centrifugeer de plaat bij 800 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C, gooi het supernatans weg door te decanteren, draai de plaat kort in een draaikolk en voeg 50 μl transcriptionele factor-antilichaamcocktail per putje toe. Meng goed en incubeer 30 minuten op ijs in het donker.
  22. Centrifugeer de plaat bij 800 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C, gooi de supernatant weg, draai de plaat kort in een draaikolk door decanteren en voeg 200 μL permeabilisatiebuffer (1x) per putje toe.
  23. Herhaal stap 3.22.
  24. Voeg 200 μl kleuringsbuffer toe aan elk putje, centrifugeer de plaat bij 800 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C, gooi het supernatans weg door te decanteren en draai de plaat kort rond.
  25. Resuspendeer de celkorrel in elk putje met 200 μL kleuringsbuffer en breng de cellen over in flowcytometriebuisjes voor onmiddellijke analyse van de flowcytometer.
    OPMERKING: Als alternatief kunnen de monsters binnen 3 dagen worden gedetecteerd in de omstandigheden waarbij 200 μl 2% PFA aan elke buis wordt toegevoegd en in het donker bij 4 °C wordt bewaard.

4. Productie van retrovirussen

  1. Kweek de 293T-cellen (met minder dan tien passages) met DMEM 10% medium in een kweekschaal van 10 cm gedurende 2-3 passages.
  2. Wanneer de cellen 90% samenvloeiing hebben bereikt, gooit u het oude medium weg en wast u de cellen voorzichtig twee keer met PBS, gevolgd door een korte trypsinisatie van 293T-cellen met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
  3. Stop het verteringsproces door de cellen te resuspenderen in 2 ml voorverwarmd 10% DMEM-medium, ze over te brengen in een conische buis van 15 ml en te centrifugeren bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  4. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet door het op en neer pipetteren van kweekmedia met 2 ml voorverwarmd 10% DMEM-medium.
  5. Kwantificeer het aantal cellen en plaat 5 × 105 cellen in 2,5 ml 10% DMEM-medium per putje in een plaat met 6 putjes.
    NOTITIE: Draai de schaal voorzichtig rond zodat de 293T-cellen zich gelijkmatig over de plaat kunnen verspreiden.
  6. Wanneer de samenvloeiing van 293T-cellen meer dan 80% bedraagt, bereidt u de transfectiereagentia voor zoals beschreven in stap 4.7 tot en met 4.9.
  7. Voeg voor elk putje van een plaat met 6 putjes 250 μl voorverwarmd Opti-MEM-medium toe aan een steriel buisje van 1,5 ml. Voeg vervolgens 3 μg plasmide-DNA (met 2 μg retrovirale vector en 1 μg pCL-Eco) toe aan het Opti-MEM-medium, gevolgd door voorzichtig op en neer pipetteren om volledige menging te garanderen.
    OPMERKING: De retrovirale vectoren die in deze studie als voorbeeld worden gebruikt, zijn MigR1 en gemodificeerde MigR1-vector met Bcl6 CDS-regio stroomopwaarts van IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. Voeg vervolgens 7,5 μl voorverwarmd transfectiereagens (in de handel verkrijgbaar) toe aan het mengsel en pipetteer voorzichtig op en neer om een grondige menging te garanderen.
  9. Incubeer het mengsel 20 minuten op kamertemperatuur.
  10. doseer het mengsel druppelsgewijs in verschillende delen van de 293T-celgekweekte put, gevolgd door het kweekvat zachtjes heen en weer en zijwaarts te schudden om een gelijkmatige verdeling van het mengsel te garanderen.
  11. Incubeer de 293T-cellen gedurende 72 uur in een incubator van 37 °C die 5% CO2 bevat.
  12. Detecteer de tag van de retrovirale vector als proxy voor transfectie-werkzaamheid in de getransfecteerde 293T-cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop of flowcytometrie.
    OPMERKING: We hebben bijvoorbeeld het GFP-fluorescentiesignaal bevestigd in een aanzienlijk deel van de MigR1-vectorgetransfecteerde 293T-cellen, wat wijst op transfectie van hoge kwaliteit.
  13. Verzamel het celkweekmedium en centrifugeer bij 2.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om celresten te verwijderen. Het resulterende supernatans moet zorgvuldig worden verzameld en opgeslagen voor langdurige bewaring bij -80 °C of tijdelijk bij 4 °C worden bewaard.

5. In vivo activering, retrovirustransductie en adoptieve overdracht van SM CD4+ T-cellen

  1. Injecteer één CD45.1+ SM-muis (6 tot 8 weken oud) intraveneus met 200 μg LCMV GP61-77 peptide11,14 in een volume van 100 μL RPMI-medium.
    OPMERKING: Het injectievolume moet door elke onderzoeker worden gewijzigd en mag het maximale injectievolume dat is toegestaan door de instelling en de lokale wetgeving niet overschrijden.
  2. Euthanaseer de SM-muis 16-18 uur na peptide-injectie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Verkrijg de splenocyten volgens de bovengenoemde procedures in stap 1.
    OPMERKING: Als alternatief kan in vitro anti-CD3/anti-CD28-stimulatiemethode27,28 worden gebruikt om SM CD4+ T-cellen te activeren in plaats van in vivo peptidestimulatie beschreven in stap 5.1 en 5.2.
  3. Suspendeer de splenocyten met 2% RPMI en pas de celdichtheid aan tot ongeveer 1 × 10,8 cellen per ml in een conische buis van 15 ml. Houd de tube op ijs.
  4. Doseer 50 μl celsuspensie in een rondbodemplaat met 96 putjes en vul aan met 150 μl kleuringsbuffer per putje.
  5. Centrifugeer de plaat met 96 putjes bij 800 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C om de cellen te pelleteren, verwijder het supernatans voorzichtig door decanteren, draai de plaat kort in een vortex en voeg 200 μl kleuringsbuffer per putje toe.
  6. Herhaal stap 5.5 en resuspendeer de cellen met 50 μL oppervlakte-antilichaamcocktail, inclusief CD4, CD25 en CD69, om de activeringsstatus van SM CD4+ T-cellen te detecteren. Meng grondig door op en neer te pipetteren en incubeer 30 minuten in het donker op ijs.
  7. Vul elk putje bij met een kleuringsbuffer tot 200 μl, gevolgd door centrifugeren van de plaat bij 800 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Gooi het supernatans weg door te decanteren en draai de plaat kort in een draaikolk.
  8. Herhaal stap 5.7 twee keer.
  9. Resuspendeer de cellen in 200 μL kleuringsbuffer en breng ze over in een flowcytometriebuis.
  10. Analyseer de fluorescentie-geconjugeerde antilichaam-gekleurde cellen met een flowcytometrie om de activeringsstatus van SM CD4+ T-cellen te beoordelen.
    OPMERKING: Geactiveerde SM CD4+ T-cellen vertoonden overvloedige CD25- en CD69-expressies in vergelijking met naïeve cellen, waardoor daaropvolgende transductieprocedures mogelijk waren.
  11. Voeg 1 × 106 SM CD4+ T-cellen (uit stap 5.3) per putje toe aan een plaat met 24 putjes. Centrifugeer de cellen bij 800 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C en verwijder het medium vervolgens voorzichtig door te decanteren.
  12. Voeg 1 ml retrovirusmedium toe zoals beschreven in stap 4.13 en 8 μg polybrene aan elk putje.
  13. Spin-transduceer de cellen bij 800 × g gedurende 2 uur bij 37 °C.
  14. Gooi het retrovirusmedium voorzichtig weg door te pipetteren en voeg 1 ml voorverwarmde 10% RPMI aangevuld met 10 ng/ml recombinant muizen IL-2 toe aan elk putje.
  15. Incubeer de cellen gedurende 48 uur in een incubator van 37 °C die 5% CO2 bevat.
  16. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en draai de cellen rond bij 800 × g gedurende 6 minuten bij 4 °C.
  17. Verwijder het supernatans door decantatie en resuspendeer de cellen met een geschikt volume van 2% RPMI om een celdichtheid van 1 × 108 cellen per ml te maken in een kegelvormige buis van 15 ml. Houd de tube op ijs.
  18. Doseer 50 μl celsuspensie in een rondbodemplaat met 96 putjes en vul aan met 150 μl kleuringsbuffer per putje.
  19. Centrifugeer de plaat met 96 putjes bij 800 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C om de cellen te pelleteren, verwijder het supernatans voorzichtig door decanteren, draai de plaat kort in een vortex en voeg 200 μl kleuringsbuffer per putje toe.
  20. Herhaal stap 5.19 en resuspendeer de cellen met 50 μL oppervlakte-antilichaamcocktail, inclusief CD4, Vα2 en vectortag-geassocieerd antilichaam. Meng grondig door op en neer te pipetteren en incubeer 30 minuten in het donker op ijs.
  21. Vul elk putje bij met een kleurbuffer tot 200 μl, gevolgd door centrifugeren van de plaat bij 800 × g gedurende 1 minuut. Gooi het supernatans weg door te decanteren en draai de plaat kort in een draaikolk.
  22. Herhaal stap 5.21 twee keer.
  23. Resuspendeer de cellen in 200 μL kleuringsbuffer en breng ze over in een flowcytometriebuis.
  24. Analyseer de fluorescentie-geconjugeerde antilichaam-gekleurde cellen met flowcytometrie om de transductie-efficiëntie in SM CD4+ T-cellen te beoordelen.
    OPMERKING: Efficiënt getransduceerde SM CD4+ T-cellen vertoonden in het onderzoek een hoge expressie van de tag van retrovirus, zoals GFP.
  25. Centrifugeer de celsuspensies uit stap 5.17 bij 800 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans weg door te decanteren. Resuspendeer de celpellet met RPMI en pas de celdichtheid aan op 1 × 107 CD4+Vα2+ SM-cellen/ml.
  26. Breng op adoptiewijze een totaal aantal van 1 × 106 CD45.1+ SM CD4+ T-cellen over naar elke C57BL/6-ontvangende muis (6 tot 8 weken oud) door een intraveneuze injectie van 100 μL celsuspensie in stap 5.25.
  27. Infecteer de volgende dag C57BL/6-ontvangende muizen met 1 × 106 plaquevormende eenheden LCMV Armstrong via intraveneuze injectie.

6. Flowcytometrie-analyse van retrovirus-getransduceerde SM TFH-cellen in het vroege acute stadium van LCMV-infectie

  1. Verkrijg de splenocyten van C57BL/6-muizen vanaf stap 5.25 op dag 3 na infectie.
  2. Voer flowcytometriekleuring uit van oppervlaktemarkers, waaronder CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 en andere geïnteresseerde moleculen, in splenocyten zoals beschreven in stap 3.
  3. Voor de detectie van transcriptionele factoren in SM CD4+ T-cellen getransduceerd met retrovirus gelabeld door fluorescerende eiwitten, voeg 200 μL 2% PFA toe aan elk putje en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten in het donker.
  4. Voer fixatie/permeabilisatie uit, flowcytometriekleuring van de geïnteresseerde transcriptiefactoren en voer flowcytometrieanalyse uit zoals beschreven in stap 3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kenmerken van vroeg gedifferentieerde virusspecifieke TFH-cellen tijdens acute LCMV-infectie
Om de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen te onderzoeken, werden naïeve congene SM CD4+ T-cellen die specifiek LCMV GP-epitoop I-AbGP66-77 herkennen, adoptief overgebracht naar CD45.2+ C57BL/6-ontvangers. De volgende dag werden deze ontvangers intraveneus geïnfecteerd met een hoge dosering van de acuut verdwenen LCMV Armstrong ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het onderzoek op het gebied van TFH-cellen is benadrukt sinds de ontdekking van de gespecialiseerde functie van TFH-cellen bij het helpen van B-cellen. Cumulatieve studies gaven aan dat TFH-celdifferentiatie een meerfasig en multifactorieel proces is30, waarbij de lotsverbintenis van TFH-cellen in het vroege stadium5 wordt bepaald. Daarom is een beter begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan vroeg gedifferentieerde T...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 32300785 tot X.C.), het China National Postdoctoral Program for Innovative Talents (nr. BX20230449 aan X.C.), en het National Science and Technology Major Project (nr. 2021YFC2300602 aan L.Y.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm cell strainerMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1)Biolegend1278121:200 verdunning
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20)Biolegend1107241:200 verdunning
APC anti-mouse CD25 (clone PC61)Biolegend1019101:200 verdunning
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) muisThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8)Biolegend1231061:200 verdunning
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend1173041:200 verdunning
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend1155041:200 verdunning
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7)Biolegend1007041:200 verdunning
Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136)Biolegend1087041:200 verdunning
Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119)Biolegend1162041:200 verdunning
bovine serum albumin, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend6448161:100 verdunning
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend1352201:200 verdunning
C57BL/6J (B6) muisThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter muisIn house; the CXCR5-GFP knock-in muis line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5.
DMEM 10% mediumDMEM medium containing 10% FBS
DMEM mediumGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Fetal bovine serum, FBSSigmaF8318
FlowJo (version 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer.
Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 verdunning
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation bufferFACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA
LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chinese Peptide Company
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL101991:200 verdunning
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 verdunning
PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91)BD Biosciences5615221:50 verdunning
Phosphate buffered saline, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8)BD Biosciences5519611:50 verdunning
Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5)Biolegend1005381:200 verdunning
recombinant murine IL-2Gibco212-12-1MG
Red Blood Cell Lysis BufferBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 mediumSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medium containing 2% FBS
SMARTA (SM) TCR transgen muisSM TCR transgen line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this muis line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450).
Staining bufferPBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 verdunning
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)Cell signaling technology6444S1:400 verdunning
TFH cell staining bufferFACS buffer containing 1% BSA and 2% muis serum
TransIT-293 reagentMirus BioMIRUMIR2700
```

Referenties

  1. O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  2. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  3. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
  4. Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
  5. Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
  6. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  7. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  8. Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  9. Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
  10. Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
  11. Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
  12. Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
  13. Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
  14. Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
  15. Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).
  16. Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).
  17. Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
  18. Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
  19. Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
  20. Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
  21. Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
  22. Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
  23. Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
  24. Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
  25. Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).
  26. Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).
  27. Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
  28. Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931(2021).
  29. He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
  30. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
  31. Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  32. Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
  33. Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).
  34. Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

folliculaire helper-T-cellenvirus-specifieke T-cellenacute LCMV-infectieflowcytometrieretrovirale transductieCD4-positieve T-cellenvroege T-celdifferentiatieBCL6-expressielotbepaling van T-cellenvaccinontwikkeling
Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.