Een in vitro test om de migratie van bloedplaatjes te bestuderen met behulp van RGD-gefunctionaliseerde avidine-biotine-tethers

Samenvatting

Er wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor het in beeld brengen van enkelvoudig migrerende bloedplaatjes met behulp van RGD-gefunctionaliseerde avidine-biotinebindingen met instelbare dichtheid, waaruit blijkt dat bloedplaatjes voldoende kracht genereren om de avidine-biotinebinding te verbreken.

Samenvatting

Ondanks dat het ontkernde celfragmenten zijn, worden bloedplaatjes nu algemeen erkend vanwege hun veelzijdige capaciteiten. Ze vormen niet alleen bloedstolsels om bloedingen na een verwonding te voorkomen, maar ze bestrijden ook infecties en behouden de vasculaire integriteit tijdens ontstekingsziekten. Hoewel hemostatische pluggen de collectieve activering en aggregatie van bloedplaatjes vereisen, wordt hun rol bij het beschermen van ontstoken bloedvaten uitgevoerd op eencellig niveau. In deze context hebben recente gegevens aangetoond dat bloedplaatjes autonoom kunnen migreren, een proces dat afhankelijk is van de mechanosensing van hun adhesieve omgeving. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor het in beeld brengen van de migratie van enkelvoudige bloedplaatjes gepresenteerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van een drielaags coatingsysteem bestaande uit een poly-L-lysinetransplantaatpoly (ethyleenglycol) (PLL-PEG)-biotine-ruggengraat (1), een fluorescerende avidine linker (2) en biotine-cyclisch Arg-Gly-Asp (cRGD) (3) als het integrine-bindende motief van de bloedplaatjes. Deze reductionistische benadering maakt een nauwkeurige controle van de hechtingseigenschappen van het substraat mogelijk en dient als een eenvoudige, gestandaardiseerde in vitro test om de mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan de migratie van bloedplaatjes. De resultaten geven aan dat migrerende bloedplaatjes die binden aan cRGD krachten uitoefenen die de avidine-biotinebinding kunnen verstoren. Bovendien heeft de dichtheid van biotine-cRGD een significante invloed op zowel de verspreiding van bloedplaatjes als de migratie.

Inleiding

Bloedplaatjes zijn kleine celfragmenten met ontkerning die zijn afgeleid van megakaryocyten in het beenmerg. Geactiveerde bloedplaatjes assembleren zich tot aggregaten die de basis vormen van een bloedstolsel om vasculaire laesies bij fysiologische hemostase af te dichten of om zieke bloedvaten af te sluiten bij pathologische trombose¹. In de afgelopen decennia is echter duidelijk geworden dat bloedplaatjes ook een centrale rol spelen in de pathofysiologie van ontstekingen, infecties en maligniteiten, waarbij veelzijdige interacties met immuuncellen, kankercellen en binnendringende ziekteverwekkers van cruciaal belang zijn voor het vormgeven van de immuunrespons van de gastheer ^2,3. Recente gegevens hebben aangetoond dat bloedplaatjes het vermogen hebben om autonoom te migreren⁴. Als reactie op systemische bacteriëmie worden bloedplaatjes gerekruteerd naar de sinusoïden van de lever, waar ze zich hechten en migreren. Door migratie kunnen bloedplaatjes bacteriën vangen en binden, wat op zijn beurt de activering van leukocyten ondersteunt. Met name bloedplaatjes blijven tijdens dit proces intravasculair en migreren niet naar het sub-endotheelweefsel⁴. Bovendien zijn bloedplaatjes schildwachten van vasculaire ontsteking, die ontstoken bloedvaten scannen op microverwondingen veroorzaakt door extravaserende immuuncellen⁵ en migratie gebruiken om ontstoken bloedvaten te beschermen ^6,7. Hier gebruiken bloedplaatjes hun integrinen om fibrinogeen te binden dat op het ontstoken endotheel is afgezet. Bloedplaatjes vormen dan lamellipodiale uitsteeksels waarmee ze de adhesieve eigenschappen van hun omgeving kunnen scannen. Bloedplaatjes polariseren vervolgens en migreren naar hogere dichtheden van fibrinogeen, een proces dat bekend staat als haptotaxis. Gerichte migratie van bloedplaatjes ondersteunt uiteindelijk de positionering bij endotheliale microlaesies die bloedingen in ontstoken weefsels, waaronder spieren en longen, voorkomen.

De migratie van bloedplaatjes is kritisch afhankelijk van de mechanische eigenschappen van het hechtende substraat ^4,8. De taak van het waarnemen en transduceren van de mechanische eigenschappen van de omgeving wordt voornamelijk gemedieerd door integrinereceptoren, dit zijn transmembraan heterodimere eiwitten die zijn samengesteld uit een α- en β-subeenheid waarbij het extracellulaire domein bindt aan het ligand op de extracellulaire matrix en het intracellulaire domein bindt aan het actinecytoskelet via adaptereiwitten ^9,10. Het meest voorkomende integrine van bloedplaatjes is α_IIbβ_3, en het belangrijkste ligand is fibrine(ogeen)¹¹. Integrine-ligand-betrokkenheid activeert signaleringsgebeurtenissen die culmineren in de vorming van een Arp2/3-aangedreven lamellipodium dat de voorrand vormt van een aanhangend bloedplaatje⁷. Hechtende bloedplaatjes onderzoeken onmiddellijk de mechanische eigenschappen van hun kleefomgeving door eraan te trekken⁴. Wanneer myosine IIa-afhankelijke trekkrachten de mechanische stabiliteit van de extracellulaire matrix overwinnen (bijv. fibrine(ogeen)), scheuren bloedplaatjes mechanisch de verzwakte liganden en gebruiken ze hun lamellipodiale uitsteeksels om de micro-omgeving te scannen op adhesieve liganden, nieuwe substraatbindingen tot stand te brengen en weg te migreren van de ligandverarmde omgeving⁶. Celmigratie aangedreven door niet-proteolytische, mechanische liganddepletie speelt waarschijnlijk een rol die verder gaat dan de bloedplaatjesfunctie, aangezien het een algemeen fenomeen lijkt te zijn dat wordt waargenomen in cellen die in staat zijn hun adhesieve matrix mechanisch te hermodelleren⁸. De snelheid van liganddepletie bepaalt de migratiesnelheid en is afhankelijk van zowel de ligandstabiliteit als de liganddichtheid van het substraat⁸. Bloedplaatjes met een lage liganddichtheid zijn in staat om mechanisch gemanipuleerde integrineliganden (cyclisch Arg-Gly-Asp (cRGD))^6,7 gebonden aan glazen dekglaasjes te verstoren met biotine-avidine tethers met een ontbindende kracht van ongeveer 160 piconewton (pN)^12,13,14,15.

Hier worden deze waarnemingen gebruikt om een eenvoudig in vitro protocol te ontwikkelen voor het genereren van ligandlabiele adhesieve oppervlakken, waardoor de studie van bloedplaatjesmigratiemechanismen wordt vergemakkelijkt. De in dit protocol beschreven adhesieve coating bestaat uit drie essentiële elementen: (1) een PLL-PEG-biotine-backbone en (2) een neutravidine-fluoresceïne-isothiocyanaat (NA-FITC) linker die de binding van (3) biotine-cRGD (een adhesieve ligand) aan de PLL-PEG-biotine-backbone vergemakkelijkt (zie ook figuur 1B). De stabiliteit van dit construct hangt af van de sterkte van de biotine-avidine binding, die kan breken bij de (A) PLL-PEG-biotine-NA-FITC of (B) FITC-NA-biotine-cRGD interface. Bovendien kan de dichtheid van adhesieve liganden worden afgestemd door de verhouding van PLL-PEG-biotine tot PLL-PEG in de onderlaag aan te passen. Verstoring van de binding (A) resulteert in het vrijkomen van FITC uit de coating, wat leidt tot een afname van het fluorescentiesignaal onder migrerende bloedplaatjes. Samen zorgt de coating die in dit protocol wordt beschreven daarom voor een nauwkeurige afstelling van mechanische en adhesieve substraateigenschappen en zorgt voor een gemakkelijke fluorescentie-gebaseerde uitlezing van de migratie van bloedplaatjes.

Protocol

Dierproeven die in dit onderzoek zijn uitgevoerd, zijn uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante ethische voorschriften voor onderzoeken met muizen en zijn goedgekeurd door de lokale wetgeving inzake de bescherming van dieren (Regierung von Oberbayern, München, 190-15, 2015). Vrouwelijke en mannelijke C57BL/6-muizen van 8-10 weken oud (lichaamsgewicht 20-25 g) werden in dit onderzoek gebruikt. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Biotine-neutravidine-biotine cRGD coating

1. Sonicaat glazen dekglaasjes (24 mm x 24 mm; # 1.5) binnen 20% HNO₃ gedurende 1 minuut, gevolgd door sonicatie in isopropanol, ethanol en H₂O gedurende 1 minuut. Spoel de dekglaasjes na elke sonicatie uitgebreid af met gedestilleerd water (ddH₂O) en droog ze tenslotte af in de couveuse.
2. Behandel voorgereinigde dekglaasjes met O₂ plasma in een plasmareiniger gedurende 2 minuten en zet ze vervolgens in elkaar met plakglaasjes zoals eerder beschreven¹⁶. Kleverglaasjes en glazen dekglaasjes vormen een kanaal ertussen (zoals weergegeven in figuur 1A).
   OPMERKING: Efficiënte plasmabehandeling is belangrijk. Gebruik O₂ als plasmabron.
3. Vul het kanaal met 2,5 μL PLL-PEG-biotine (1 mg/ml) verdund in 97,5 μL PLL-PEG (1 mg/ml) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT), daarna driemaal wassen met PBS. PLL-PEG-biotine bindt neutravidine in de volgende stap, terwijl de PLL-PEG-ruggengraat een inert substraat vormt dat de niet-specifieke binding van eiwitten en bloedplaatjes voorkomt.
   OPMERKING: De concentratie van PLL-PEG-biotine in de coatingoplossingen bepaalt de uiteindelijke dichtheid van cRGD-liganden.
4. Voeg 100 μL Neutravidin-FITC (25 μg/ml) toe en incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij RT, en was vervolgens drie keer met PBS.
   OPMERKING: Pas de Neutravidin-FITC-concentratie aan naar de PLL-PEG-biotineconcentratie. Verhoog de Neutravidine-FITC-concentratie als hogere PLL-PEG-biotinedichtheden worden gecoat.
5. Voeg 100 μL cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys (Biotine-PEG-PEG)] (cRGD-biotine) (0,1-1 μM) toe, incubeer gedurende 30 minuten bij RT en was driemaal met PBS. Dekglaasjes zijn klaar voor gebruik. Een schema van de coating is weergegeven in figuur 1B.

2. Isolatie van bloedplaatjes bij muizen uit bloed

1. Bereid de gemodificeerde buffer van Tyrode voor, die 136,9 mM NaCl, 12,1 mM NaHCO₃, 2,6 mM KCl, 5,5 mM glucose, 10 mM HEPES bevat, en pas de pH aan op 7,4 en 6,5.
2. Verdoof de muizen (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) door intraperitoneale injectie van 0,5 mg/kg fentanyl, 5 mg/kg midazolam en 0,05 mg/kg medetomidine. Nadat u de diepte van de anesthesie hebt bevestigd door in de teen te knijpen, verwijdert u de thoracale huid met een schaar.
3. Bereid een spuit van 2 ml (naald van 26 g) voor met 150 μl zuurcitraat-dextrose (ACD) als antistollingsmiddel. Steek de naald tussen de tweede en derde rib aan de linkerkant van het borstbeen om bloed uit het hart te halen. Euthanaseer daarna de muis door cervicale dislocatie.
   OPMERKING: (1) ACD-buffersamenstelling: 85 mM natriumcitraat tribasisch dehydraat en 65 mM citroenzuurmonohydraat in 111 mM glucose. (2) Bloedafname moet soepel worden uitgevoerd om stolselvorming te voorkomen. Ongeveer 1 ml bloed kan worden verkregen van muizen van 8-10 weken oud.
4. Meng het bloed met 1 ml Tyrode's buffer (pH 6,5) in een 5 ml FACS-buis (polystyreen ronde bodem) en centrifugeer op 70 x g gedurende 20 minuten bij RT met uitgeschakelde rem.
5. Neem na het centrifugeren het bovenste deel (ongeveer 1 ml) met bloedplaatjesrijk plasma (PRP). Meng met 3 ml Tyrode's buffer (pH 6,5) en voeg 100 ng/ml prostacycline (BGA₂) toe om activering van bloedplaatjes te voorkomen.
6. Centrifugeer bij 1200 x g gedurende 5 minuten bij RT, gooi de supernatant weg, suspendeer de pellet in 500 μL van Tyrode's buffer (pH 6,5) en meet het aantal bloedplaatjes met behulp van een hemocytometer.

3. Migratie van bloedplaatjes bij muizen op biotine-neutravidine-biotine cRGD-coating

1. Vul de gemodificeerde Tyrode's buffer (pH 7,4) aan met 10 x 10³/μL muizenbloedplaatjes, 1 mM CaCl₂, 2 μM U46619 en 4 μM Adenosine 5′-difosfaat natriumzout (ADP), en pipetteer een totaal volume van 240 μL in de kanalen die in stap 1 zijn voorbereid.
2. Registreer live migratie van bloedplaatjes met behulp van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een fase-incubator. U kunt het kanaal ook gedurende 1 uur bij 37 °C in een broedmachine incuberen.
3. Fixeer het monster met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij RT en was vijf keer met PBS.
4. Permeabiliseer bloedplaatjes met Triton-X (0,2% in PBS) gedurende 5 minuten en was ze vijf keer met PBS.
5. Verdun 2,5 μL Alexa Fluor 594 falloidine (40x methanolische aantrek) in 100 μL PBS. Incubeer met bloedplaatjes gedurende 30 minuten in het donker en was vervolgens vijf keer met PBS.
6. Beeld de dia's af onder een fluorescentiemicroscoop.

4. Kwantificering

OPMERKING: Bloedplaatjes die filopodia (vingerachtige uitsteeksels) of lamellipodia (bladachtige uitsteeksels) vormen, werden geteld als aanhangende bloedplaatjes⁴. Bloedplaatjes met een migratieafstand van meer dan één van de diameters werden gedefinieerd als migrerende bloedplaatjes.

1. Fractie migrerende bloedplaatjes: Tel de adhesie- of migratienummers van bloedplaatjes met de Multi Point-tool in Fiji. Klik met de rechtermuisknop op het vervolgkeuzemenu van Puntgereedschap in de werkbalk om het Meerpuntsgereedschap te selecteren. Bereken de fractie migrerende bloedplaatjes door het aantal migrerende bloedplaatjes te delen door het aantal zelfklevende bloedplaatjes.
2. Gemiddelde migratieafstand: Extraheer de migratieafstand uit vaste monsters door de lengte van het migratiepad te meten dat is "afgedrukt" in de neutravidine-FITC-coating met behulp van de Free Hand Line Tool. Klik met de rechtermuisknop op het vervolgkeuzemenu van Rechte lijn in de werkbalk om de tool Vrije handlijn te selecteren.
3. Descriptoren in de vorm van bloedplaatjes: Genereer binaire maskers door fluorescerende bloedplaatjes (Alexa594-Phalloidin) te segmenteren met behulp van de functie Drempel . Selecteer Afbeelding > Pas > drempel aan op de werkbalk.
4. Vormdescriptoren zoals oppervlakte, omtrek, circulariteit en beeldverhouding kunnen worden verkregen bij het analyseren van deeltjes. Selecteer vormdescriptoren in Analyseren > Metingen instellen en selecteer vervolgens Resultaten weergeven in Deeltjes analyseren > analyseren.

Resultaten

Geactiveerde bloedplaatjes hechten zich gemakkelijk en verspreiden zich op PLL-PEG-biotine-neutravidine-FITC-biotine-cRGD gecoate objectglaasjes (Figuur 1C en Figuur 2A; 0 min en 5 min) en polariseren vervolgens door een lamellipodium te vormen aan de voorrand (Figuur 2A; 10 min). Tijdens dit proces bewoog de pseudonucleus (donker gebied in het midden van de bloedplaatjes) van het midden naar de achterkant van de bloedplaatjes (Figuur 2A). Gepolariseerde bloedplaatjes beginnen dan te migreren zonder duidelijke directionaliteit (Figuur 2A; 15 min en 20 min en Figuur 2B). We hebben waargenomen dat bloedplaatjes die migreren op PLL-PEG-biotine-neutravidine-FITC-biotine-cRGD-coatings de neutravidine-FITC-biotine-PLL-PEG-binding kunnen verbreken, zoals blijkt uit de vermindering van de fluorescentie-intensiteit langs het migratiepad (Figuur 1C en Figuur 2A,B). Bovendien hoopt het verstoorde neutravidine-FITC-biotine-cRGD-complex zich op op het oppervlak van de bloedplaatjes (Figuur 2A,B). Dit fenomeen is vergelijkbaar met eerdere bevindingen waarbij migrerende bloedplaatjes fibrinogeen uit het substraat verwijderden en het ophoopten in hun open canaliculaire systeem (OCS)⁴.

Om te onderzoeken hoe liganddichtheid de migratie van bloedplaatjes beïnvloedt, werd de cRGD-dichtheid aangepast door de verhouding van PLL-PEG-biotine tot PLL-PEG in de eerste coatinglaag te variëren. Uit deze gegevens blijkt dat bloedplaatjes van muizen een optimale migratie bereiken bij een concentratie van 2,5% PLL-PEG-biotine. Migratie wordt verminderd bij zowel lagere (1%) als hogere (10%) concentraties PLL-PEG-biotine (Figuur 3A,B). Deze substraatafhankelijke veranderingen in migratiegedrag gaan gepaard met veranderingen in de morfologie van bloedplaatjes (Figuur 3C). Bij lage liganddichtheden (1%) verspreiden bloedplaatjes zich niet voldoende, zoals blijkt uit een laag geprojecteerd bloedplaatjesgebied en omtrek (Figuur 3C). Dit suggereert onvoldoende integrine-activering en outside-in-signalering⁷. Bijgevolg zijn bloedplaatjes niet in staat om krachten uit te oefenen op de cRGD-liganden, slagen ze er niet in om het substraat te hermodelleren en migreren ze niet (Figuur 3A,B).

Bij een intermediaire liganddichtheid (2,5%) is er een significante toename van het bloedplaatjesoppervlak en de omtrek (Figuur 3C). Bloedplaatjes verspreiden zich effectief, verstoren mechanisch de labiele cRGD-liganden en migreren (Figuur 3A,B). Bij hoge liganddichtheden (10%) neemt de spreiding echter toe, maar slagen bloedplaatjes er niet in om te polariseren, wat blijkt uit een verminderde beeldverhouding (Figuur 3C). Onder deze omstandigheden blijven bloedplaatjes aan het kleverige substraat hechten en migreren ze niet omdat ze de labiele cRGD-liganden niet kunnen breken (Figuur 3A,B).

Deze bevindingen tonen aan dat de migratie van bloedplaatjes kritisch afhankelijk is van de hechtingseigenschappen van het substraat. Bloedplaatjes kunnen alleen migreren als ze voldoende in contact komen met adhesieve liganden en tegelijkertijd trekkrachten genereren die sterk genoeg zijn om de spanningstolerantie van het adhesieve substraat^{te overwinnen 4,6,7,8}.

Figuur 1: Coatingprocedure en live beeldvorming van de interactie tussen bloedplaatjes en substraat. (A) Foto van de geassembleerde kamer. (B) Principe van het protocol. Links: Schema van de coating. Met plasma behandelde glazen dekglaasjes werden bedekt met drie lagen. De eerste laag is het mengsel van PLL-PEG en PLL-PEG-biotine (de PLL-PEG-ruggengraat is inert voor cellen en voorkomt niet-specifieke binding). De tweede laag is neutravidine-FITC en de derde laag is biotine-cRGD. Neutravidine-FITC overbrugt PLL-PEG-biotine en biotine-cRGD. Bloedplaatjes binden zich aan de biotine-cRGD via integrinen in het plasmamembraan. Rechts: Illustratie van biotine-avidine die zich ontbindt door integrinen van bloedplaatjes. Bloedplaatjes oefenen krachten uit op het substraat door integrine-cRGD-binding en scheuren ofwel de bovenste cRGD-biotine - neutravidine-FITC - binding of de onderste neutravidine-FITC - PLL-PEG-biotine - binding. Breuk van de onderste binding tussen neutravidine-FITC en biotine-PLL-PEG resulteert in een verminderd fluorescerend signaal, terwijl breuk van de bovenste binding tussen biotine-cRGD en neutravidine-FITC dat niet doet. (C) Tijdreeksen die de migratie van bloedplaatjes en depletie van labiele cRGD-liganden laten zien. Gebieden met verminderde fluorescentie geven de migratiesporen van bloedplaatjes aan (zie ook figuur 2A), en gebieden met verhoogde fluorescentie duiden op accumulatie van FTIC-neutravidine-biotine-cRGD op migrerende bloedplaatjes. Schaalbalk: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Immunofluorescentiebeeldvorming van bloedplaatjesmigratie gecodeerd door het geremodelleerde substraat. (A) Representatieve filmsequentie van enkelvoudige bloedplaatjesmigratie. Links: Fasecontrastbeelden van migrerende bloedplaatjes. Bloedplaatjes polariseren door aan de voorrand een lamellipodium te vormen en migreren vervolgens. Rechts: Neutravidine-FITC werd uit het substraat verwijderd, waardoor de "voetafdruk" van de migratie van bloedplaatjes achterbleef. Gescheurd cRGD-biotine-neutravidine-FITC hoopt zich op in het midden van migrerende bloedplaatjes. (B) Representatieve beelden van bloedplaatjesmigratie op ligandlabiele cRGD-biotine-avidine coatings. Boven: Bloedplaatjes gekleurd met falloïdine (Alexa FluorTM 594) vertoonden grote lamellipodiumvorming en een gepolariseerde vorm die doet denken aan migrerende bloedplaatjes. Migrerende bloedplaatjes verbreken de cRGD-biotine-neutravidine-FITC-binding, waardoor migratiepaden op het substraat worden gegenereerd die worden aangegeven door een verminderd FITC-signaal. Onder: bijgesneden afbeelding met grotere vergroting. (C) Migratiesporen werden in Fiji handmatig getekend met gele lijnen. Schaalbalken: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: De verhouding van PLL-PEG-biotine tot PLL-PEG bepaalt de migratie en vorm van bloedplaatjes. (A) Representatieve beelden van bloedplaatjes op 1%, 2,5% en 10% PLL-PEG-biotinecoatings, schaalbalk: 5 μm. (B) Kwantificering van bloedplaatjeshechting, migratie-efficiëntie en migratieafstand, n = 4 onafhankelijke experimenten; Gemiddelde/SD; Enkele reis ANOVA/Tukey; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001, ns: niet significant (C) Kwantificering van descriptoren in de vorm van bloedplaatjes (oppervlakte, omtrek, circulariteit en beeldverhouding), n = 4 onafhankelijke experimenten; Gemiddelde/min-max; Enkele reis ANOVA/Tukey; **p < 0,01; p < 0,001; P < 0,0001, NS: Niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In dit protocol wordt een drielaagse coatingprocedure gepresenteerd, bestaande uit (1) een PLL-PEG-biotine-backbone en (2) een neutravidine-FITC-linker die de binding van (3) biotine-cRGD (een adhesieve ligand) aan de PLL-PEG-biotine-ruggengraat vergemakkelijkt (zie ook figuur 1B) die een nauwkeurige afstembaarheid van mechanische en adhesieve substraateigenschappen mogelijk maakt door de verhouding van PLL-PEG-biotine tot PLL-PEG te variëren en zorgt voor een gemakkelijke fluorescentie-gebaseerde uitlezing van de migratie van bloedplaatjes. Hoewel dit protocol FITC-geconjugeerd neutravidine en Alexa Fluor 594-geconjugeerd falloidine gebruikt om de migratie en vorm van bloedplaatjes te volgen, kunnen andere fluorofoor-geconjugeerde avidine en falloidine worden gebruikt. Aangezien alle coatingreagentia, waaronder PLL-PEG, PLL-PEG-biotine, neutravidine-FITC en cRGD-biotine, evenals de bloedplaatjesactivatoren in de handel verkrijgbaar zijn, kan dit experiment zonder veel extra inspanning worden uitgevoerd. De kritieke stap is de plasmabehandeling, omdat inefficiënte plasmabehandeling leidt tot onvoldoende binding van PLL-PEG/PLL-PEG-biotine aan het substraat, wat resulteert in het falen van de hechting en migratie van bloedplaatjes. De prestaties van de plasmareiniger zijn belangrijk. Over het algemeen presteren plasmareinigers met 13,6 MHz generatoren beter dan die met 40 KHz of 100 KHz. Bovendien is een zuurstofplasmabron geschikter dan omgevingslucht. Na een succesvolle plasmabehandeling zijn de coatingstappen bijna niet foutgevoelig.

Van bloedplaatjes is eerder aangetoond dat ze de mesenchymale migratiewijze gebruiken, die sterk afhankelijk is van substraatverklevingen ^4,17. Analoog aan fibroblasten belemmeren lage liganddichtheden de migratie omdat bloedplaatjes moeite hebben om zich aan het substraat te hechten, terwijl hoge liganddichtheden de migratie belemmeren door te voorkomen dat stevige verklevingen worden losgemaakt¹⁸ (Figuur 3). Bij tussenliggende dichtheden hechten bloedplaatjes zich wel, terwijl myosine IIA-afhankelijke trekkrachten per integrinebinding nog steeds voldoende zijn om verklevingen te verbreken. Het is opmerkelijk dat de hoge affiniteit tussen integrine α_IIbβ₃ en zijn ligand fibrine(ogeen) resulteert in de demontage van verklevingen, niet door het loslaten van de adhesieve ligand, maar eerder door het scheuren of loskomen van het onderliggende substraat, zoals endotheelcellen in vivo of dekglaasjes in vitro ^4,6. De ontbindende kracht die nodig is om fibrinogeen los te maken van het onderliggende substraat wordt sterk beïnvloed door fysische en (bio-)chemische eigenschappen die vaak moeilijk te beheersen zijn, wat kan leiden tot aanzienlijke variabiliteit in migratie-efficiëntie. De hier geïntroduceerde test biedt een reductionistische benadering om dit probleem aan te pakken. De breekkracht van de avidine-biotinebinding is echter vastgesteld op ongeveer 160 pN, dus meer geavanceerde spanningssensoren, zoals die op basis van een dubbelstrengs DNA-ketting, moeten worden gebruikt om de hechting van bloedplaatjes bij lagere krachtregimes te bestuderen¹⁹.

Eerdere studies hebben aangetoond dat bloedplaatjesmigratie betrokken is bij bacteriële infectie en vasculaire ontsteking in vivo. Bijgevolg vertonen bloedplaatjes met migratiedefecten, zoals verminderde myosinecontractiliteit, actinepolymerisatie of integrine outside-in-signalering, een verminderde klaring van bacteriën en vasculaire integriteit ^4,6,7. De hier gepresenteerde test is eenvoudig, stabiel en daarom geschikt voor het screenen van kleine moleculaire remmers en hun effecten op de migratie van bloedplaatjes. Het biedt een nieuw in vitro hulpmiddel om therapeutische doelen bij ontsteking of trombose te onderzoeken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adenosine 5′-diphosphate natriumzout (ADP)	Sigma-Aldrich	A2754
Alexa Fluor 594 phalloidin	Thermofisher	A12381
Bloemteller	Sysmex	XN-1000
Bottomless 6 kanaals kleverige schuif	IBIDI, kleverige schuiven VI0.4	80608
Centrifuge	Eppendorf	5804
Confocal microscoop	Zeiss	LSM880
cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Biotin-PEG-PEG)]	Peptide international	PCI-3697-PI
FACS-buizen	Corning Brand	352052
FITC-conjugaat neutravidine	Thermofisher	A2662
Formaldehyde	Thermofisher	28908
HEPES-oplossing	Sigma-Aldrich	H0887
Phase contrast en epifluorescente microscoop	Olympus	IX83
Plasma cleaner	Diener	116531
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotin(50%)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotin (50%)
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethyleenglycol) co-polymeer	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)
Prostaglandine I2 natriumzout (PGI2)	Abcam	ab120912
Sonicator	BANDELIN	SONNOREX RK514M
Ttriton X-100 20% v/v	Cayman Chemical	600217
U46619	Enzo Life Sciences	BML-PG023-0001)