Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Dissociatie van tumorweefselmonsters van mensen en muizen voor eencellige RNA-sequencing

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66766

⸱

16 augustus 2024

 ,  ,  ,  , 
1Krantz Family Center for Cancer Research, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol schetst de procedure voor het snel dissociëren van tumormonsters van mensen en muizen voor sequencing van enkelcellig RNA.

Samenvatting

Menselijke tumormonsters bevatten een overvloed aan informatie over hun micro-omgeving en immuunrepertoire. Effectieve dissociatie van menselijke weefselmonsters in levensvatbare celsuspensies is een vereiste input voor de single-cell RNA sequencing (scRNAseq) pijplijn. In tegenstelling tot bulk-RNA-sequencingbenaderingen, stelt scRNAseq ons in staat om de transcriptionele heterogeniteit in tumormonsters op het niveau van één cel af te leiden. Het integreren van deze benadering in de afgelopen jaren heeft geleid tot veel ontdekkingen, zoals het identificeren van cellulaire immuun- en tumortoestanden en programma's die verband houden met klinische reacties op immunotherapieën en andere soorten behandelingen. Bovendien kunnen eencellige technologieën die worden toegepast op gedissocieerde weefsels worden gebruikt om toegankelijk chromatineregio's, T- en B-celreceptorrepertoire en de expressie van eiwitten te identificeren met behulp van DNA-antilichamen met streepjescodes (CITEseq).

De levensvatbaarheid en kwaliteit van het gedissocieerde monster zijn cruciale variabelen bij het gebruik van deze technologieën, aangezien deze de kruisbesmetting van afzonderlijke cellen met omringend RNA, de kwaliteit van de gegevens en de interpretatie dramatisch kunnen beïnvloeden. Bovendien kunnen lange dissociatieprotocollen leiden tot de eliminatie van gevoelige celpopulaties en de opregulatie van een gensignatuur voor stressrespons. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een snel universeel dissociatieprotocol bedacht, dat is gevalideerd op meerdere soorten tumoren bij mensen en muizen. Het proces begint met mechanische en enzymatische dissociatie, gevolgd door filtratie, rode bloedlysis en verrijking van levende doden, geschikt voor monsters met een lage input van cellen (bijv. biopsieën van naaldkernen). Dit protocol zorgt voor een schone en levensvatbare eencellige suspensie die van het grootste belang is voor het succesvol genereren van Gel Bead-In Emulsions (GEM's), barcodering en sequencing.

Inleiding

Hoewel veel vooruitgang in het kankeronderzoek heeft geleid tot de ontwikkeling en goedkeuring door de FDA van middelen die gericht zijn op remmende receptoren die tot expressie worden gebracht op immuun- en tumorcellen, bekend als checkpointblokkaderemmers, blijven therapieresistentie en het identificeren van mechanismen die de respons van de patiënt stimuleren, een uitdaging1. De complexe uitdaging om tumorheterogeniteit te karakteriseren op basis van zijn moleculaire diversiteit en het ingewikkelde samenspel tussen tumorcellen en de immuunmicro-omgeving vereist nieuwe benaderingen om dit complexe ecosysteem te ontleden met de resolutie van één cel. Het begrijpen van de moleculaire fijne kneepjes in tumoren en hun micro-omgevingen is cruciaal voor het bevorderen van therapeutische strategieën en het ontcijferen van de complexe biologie die ten grondslag ligt aan kankerprogressie2. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) is steeds populairder geworden omdat het een analyse met hoge resolutie biedt van individuele cellen in complexe tumormonsters 3,4.

Tumorheterogeniteit, die genetische, epigenetische en fenotypische diversiteiten omvat, vormt een uitdaging bij het blootleggen van de fijne kneepjes van de kankerbiologie5. De conventionele methoden van bulk-RNA-sequencing hebben de neiging om de unieke expressieprofielen en fenotypes van heterogene celpopulaties die in tumoren aanwezig zijn, te verdoezelen, aangezien deze methoden signalen gemiddeld nemen over hele celpopulaties4. ScRNA-seq daarentegen maakt de dissectie van individuele celtypen mogelijk, waardoor diverse genexpressie, onderdrukkingspatronen en cellulaire toestanden worden onthuld die anders over het hoofd worden gezien 4,6. Het uitgangspunt van scRNA-seq ligt in het vermogen om de genetische en moleculaire handtekeningen van individuele cellen te decoderen, wat een enorme belofte inhoudt bij het ontdekken van nieuwe kankertherapieën7.

Door de genexpressieprofielen van tumorcellen en de omringende stromale en immuuncellen te ontcijferen, kunnen onderzoekers nieuwe therapeutische doelen identificeren en strategieën voor genetische precisiegeneeskunde ontwikkelen die zijn afgestemd op individuele patiënten. Bovendien biedt het ontleden van het immuunrepertoire binnen de micro-omgeving van de tumor cruciale inzichten in de wisselwerking tussen tumorcellen en immuuneffectoren, wat de weg vrijmaakt voor immunotherapeutische interventies3. Ondanks de vooruitgang in het gebruik van scRNAseq op klinische monsters, kunnen verschillende uitdagingen tijdens de verwerkingsstappen de RNA-integriteit, levensvatbaarheid en kwaliteit van de gegenereerde gegevens van de cel schaden. Bovendien kan het verwerken van weefsel met een lage cellevensvatbaarheid de omringende RNA-niveaus verhogen in de druppeltjes die worden gegenereerd tijdens de inkapseling van individuele cellen, wat resulteert in kruisbesmetting en onjuiste annotatie van celtypen, terwijl lange dissociatieprotocollen die bij 37 °C worden uitgevoerd, kunnen leiden tot de opregulatie van een stressrespons-gensignatuur in meerdere celtypen 8,9, 10. okt.

De stapsgewijze procedure (figuur 1A) die in dit protocol wordt beschreven, begint met snelle mechanische en enzymatische dissociatie van tumoren, gevolgd door filtratie en verwijdering van dode cellen, afhankelijk van de levensvatbaarheid van elk tumormonster. Op dit moment is deze procedure geverifieerd in melanoom11, colorectaal12, hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom13, pancreas- en longtumormonsters (niet-gepubliceerde gegevens). Deze technieken zorgen voor het genereren van levensvatbare celsuspensies van hoge kwaliteit die cruciaal zijn voor downstream-analyses14. Met name het verwijderen van rode bloedcellen, verstoken van gesynthetiseerd RNA, wordt noodzakelijk om het monster te zuiveren15. Daaropvolgende evaluatie van het aantal cellen en de eliminatie van dode cellen dienen als voorwaarde voor een succesvolle 10x Genomics Gel bead-in Emulsion (GEM) generatie, barcodering, en verhogen het herstel van transcripten en gesequencede cellen zonder de uitsluiting van gevoelige populaties (bijv. neutrofielen en epitheelcellen) in gevaar te brengen16. Deze stappen zijn van fundamenteel belang bij het ontsluiten van het potentieel van analyse van eencellige resolutie in tumormonsters 9,10, het blootleggen van nieuwe genexpressieprofielen en immuunsignaturen die nodig zijn voor het stimuleren van innovatieve therapeutische interventies en het identificeren van nieuwe tumorkwetsbaarheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie voldeed aan alle institutionele richtlijnen met betrekking tot het bemonsteren van menselijk weefsel. Er werd geïnformeerde toestemming ontvangen van patiënten en identificeerbare voorbeeldgegevens werden geanonimiseerd. Monsters worden verzameld in de operatiekamer, in een oplossing van RPMI, zoutoplossing of PBS geplaatst en via de afdeling pathologie bevestigd als kanker voordat ze in onderzoek worden gebruikt. Alle stappen, behalve wanneer aangegeven, moeten worden uitgevoerd bij 4 °C of op ijs. Werk in een bioveiligheidskap bij het verwerken van menselijk weefsel. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

1. Verkrijgen van de steekproef

  1. Verkrijg een solide tumormonster in een buis met media en plaats het op ijs.
    1. Instrueer het personeel van de operatiekamer om het monster te vervoeren in een buis die voldoende RPMI, zoutoplossing of PBS bevat om het weefsel volledig onder te dompelen om uitdroging van het monster te voorkomen.
      OPMERKING: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het monster niet uitdroogt, omdat dit de levensvatbaarheid vermindert.
  2. Koel alle centrifuges af tot 4 °C en breng de thermische mixer naar 37 °C.
  3. Verwijder de bereide dissociatie-enzymen voor menselijke of muizentumoren (materiaaltabel), ontdooi ze op de thermische mixer van 37 °C en verplaats ze naar ijs zodra ze zijn ontdooid.
  4. Haal een aliquot van 20 ml RPMI op.
  5. Registreer relevante steekproefinformatie (bijv. patiënt-ID, de-identificatie, steekproeftype).
  6. Breng het monster over naar een weefselkweekschaal van 60 mm (geplaatst op ijs) door de buis meerdere keren om te keren en de inhoud in de schaal te gieten om ervoor te zorgen dat al het monstermateriaal wordt overgebracht. Als het monster bij aankomst niet in media is geleverd, voeg dan verse RPMI-media toe aan de schaal.
    1. Als het monster gefragmenteerd is, laat dan de buis met het monster 5 minuten draaien bij 450 × g, 4 °C, gooi het supernatant weg, resuspendeer het monster in 420 μl RPMI en ga naar sectie 2.

2. Mechanische en enzymatische vertering

  1. Pipetteer 420 μl media uit het monsterschaaltje van 60 mm in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Probeer eventuele voorbeeldfragmenten die in de media zijn opgehangen op te nemen.
  2. Breng het monsterweefsel met een pincet over van de schaal van 60 mm naar het buisje van 1,5 ml met media. Knip het monster af met een schone schaar in de buis, zodat de stukjes maximaal 2-3 mm in diameter zijn.
  3. Voeg spijsverteringsenzymen, bereid volgens de specificaties van de fabrikant (materiaaltabel), toe aan het monster in de volgende volumes: 42 μl enzym H (niet-specifieke proteasen) voor menselijke monsters, enzym D (niet-specifieke proteasen) voor muizenmonsters, 21 μl enzym R (niet-specifieke proteasen) en 5 μl enzym A (nuclease).
  4. Voeg nog eens 420 μL media toe uit de schaal of tot de 1 ml-markering op de buis. Niet meer dan 420 μL media gebruiken.
  5. Draai de buis gedurende 5 s en plaats deze in een thermische mixer die verticaal op zijn kant staat (Figuur 1B). Incubeer bij 37 °C, 450 rpm, gedurende 15 min.
    OPMERKING: Verwijder tijdens de incubatie alle 10x Genomics-materialen die nodig zijn voor het genereren van GEM, aangezien deze 30 minuten nodig hebben om op kamertemperatuur te komen

3. Filteren van monsters

  1. Plaats een celfilter van 50 μm op een nieuwe conische buis van 15 ml en vul het filter door er 1 ml verse RPMI-media doorheen in de buis te leiden.
  2. Breng het monster na de spijsvertering over in de buis van 15 ml met behulp van een brede pipetpunt van 1.000 μl met een lage retentie. Was de slang van 1.5 ml met 1 ml vers materiaal en breng het materiaal over naar het filter om ervoor te zorgen dat al het monstermateriaal door het filter wordt geleid.
  3. Pak een plastic spuit van 1 ml en haal alleen de zuiger eruit (gooi de rest van de spuit weg). Gebruik de achterkant van de zuiger van de spuit om het monster met een draaiende beweging op het filter te malen en te duwen.
  4. Was het filter met 5 ml media en eventuele resterende media van de schaal waarin het monster zich bevond (sectie 1) om eventuele cellen te verzamelen die mogelijk van het weefsel zijn losgekomen.
  5. Plaats een celfilter van 30 μm op een nieuwe conische buis van 15 ml, vul het filter met 1 ml media en breng de inhoud van de buis met het gedissocieerde monster door het filter.
    OPMERKING: Met deze stap wordt groot vuil verwijderd dat verstopt kan raken of een bevochtigingsfout kan veroorzaken bij het uitvoeren van het monster met behulp van de 10x Genomics microfluïdische chips.

4. Lysis van rode bloedcellen

  1. Centrifugeer het monster bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min. Zuig de media op en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.
  2. Resuspendeer in ACK Lysis-buffer om rode bloedcellen (RBC's) te verwijderen en registreer het gebruikte volume. Het volume is afhankelijk van de grootte van de pellet en de mate van RBC's in de pellet.
    OPMERKING: Geresuspendeerde ACK-monsteroplossing moet kleurloos zijn als er voldoende ACK Lysis-buffer is toegevoegd, omdat dit de rode bloedcellen uit het monster zal verwijderen.
  3. Centrifugeer de monsterbuisjes bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten en zuig het supernatant op.
  4. Herhaal stap 4.2-4.3 indien nodig totdat de monsterpellet na centrifugeren geen zichtbare rode kleur meer heeft (Figuur 2). Noteer eventuele extra volumes ACK Lysis-buffer die in deze stap worden gebruikt.
  5. Resuspendeer de monsterpellet in verse media ter voorbereiding op het tellen.

5. Cellen tellen

  1. Doe 10 μL trypan blauw in een buisje van 1,5 ml. Meng de gedissocieerde cellen voorzichtig, neem 10 μL monster en meng (1:1) met het trypanblauw. Laad 10 μL aan elke kant van een hemocytometer en tel de cellen.
  2. Registreer de celconcentratie, het totale aantal live cellen, het levensvatbaarheidspercentage en het uiteindelijke mediavolume na telling.
  3. Zorg ervoor dat het celgetal tussen 700 en 1.200 cellen/μl ligt (7 × 105- 1,2 × 106/ml) voor een optimale 10x Genomics-run.
    1. Als het monster te geconcentreerd is, verdun het dan met media en vertel het opnieuw.
    2. Als het monster te verdund is, centrifugeer het monster dan gedurende 5 minuten bij 450 × g 4 °C en resuspendeer het in een kleinere hoeveelheid media.
    3. Als de levensvatbaarheid van de cellen lager is dan 80%, voer dan een levend-dode procedure uit om dode cellen te verwijderen.
    4. Als er minder dan een miljoen cellen zijn, zie rubriek 6.
    5. Als er meer dan een miljoen cellen zijn en de levensvatbaarheid > 10%, zie rubriek 6.
    6. Als er meer dan een miljoen cellen zijn en de levensvatbaarheid < 10%, zie rubriek 7.
    7. Als de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 80%, bewaar de bewerkte cellen op ijs en ga onmiddellijk verder met het genereren van GEM volgens de instructies van de fabrikant.

6. Verwijdering van dode cellen - Kit 1

OPMERKING: Werk in een bioveiligheidskap wanneer u de reagentia voor het verwijderen van dode cellen gebruikt, omdat deze gemakkelijk besmet kunnen raken.

  1. Centrifugeer het monster bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min.
  2. Bereid isolatiemedia voor in een conische buis van 15 ml en bewaar deze op kamertemperatuur: 9,8 ml PBS, 10 μl CaCl2 en 200 μl warmte-geïnactiveerde FCS (toegevoegd in een bioveiligheidskap).
  3. Na het centrifugeren het medium uit de pellet opzuigen en resuspenderen in 1 ml van het isolatiemedium.
  4. Centrifugeer de tube opnieuw bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min. Zuig het supernatans op en resuspendeer de pellet in 100 μl isolatiemedia.
  5. Breng 100 μL monster in isolatiemedia over in een putje van een PCR-stripbuis van 0,2 ml.
  6. Voeg in een bioveiligheidskap 10 μl Annexin V-cocktail en 10 μL Biotine Selection Cocktail toe aan het putje met 100 μl van het monster in isolatiemedia. Pipetteer de oplossing en laat deze 4 minuten op kamertemperatuur staan.
  7. Draai na 4 minuten de dextran-gecoate magnetische deeltjes gedurende 30 s in een wervel. Voeg 20 μL van de korrels en 60 μL isolatiemedia toe aan het monster (een totaal volume van 200 μL). Als de levensvatbaarheid lager is dan 40%, schaal dan de hoeveelheid korrels op tot 40 μL terwijl u het volume van de isolatiemedia aanpast (tot 40 μL), waarbij u een totaal volume van 200 μL aanhoudt. Pipettemeng en laat de oplossing 3 minuten op kamertemperatuur staan.
  8. Plaats de stripbuis op een 10x Genomics magnetische scheider (op de hoge stand) gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
  9. Breng de vloeistof uit de stripbuis over zonder de korrels te verstoren in een nieuwe 1,5 ml lo-bind microcentrifugebuis. Verwijder de stripbuis niet van de magneet.
  10. Centrifugeer het buisje van 1,5 ml met het monster bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten. Zuig het supernatans op en resuspendeer de pellet in een geschikte hoeveelheid RPMI-media op basis van de cellen voor de grootte en het aantal pellets, zoals beschreven in sectie 5. Herhaal de procedure voor het verwijderen van dode cellen als de levensvatbaarheid onder de 80% blijft (Figuur 3 en Figuur 4).
    OPMERKING: Resuspendeer geen cellen in isolatiemedia voor stroomafwaartse GEM-generatie, aangezien het calciumchloride het inkapselingsproces en de omgekeerde transcriptie (RT) stap zal verstoren.
  11. Bewaar bewerkte cellen op ijs als de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 80% en ga onmiddellijk over tot GEM-generatie volgens de instructies van de fabrikant.

7. Verwijdering van dode cellen - Kit 2

NOTITIE: Werk in een bioveiligheidskap wanneer u de kitreagentia gebruikt.

  1. Plaats de microbeads en de 20x Binding Buffer stock-oplossing in een bioveiligheidskap.
  2. Centrifugeer de monstersuspensie bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min.
  3. Bereid 1x bufferoplossing onder steriele omstandigheden met behulp van 1 ml van de 20x Binding Buffer stock-oplossing die wordt gepipetteerd in 19 ml DNAse-, RNAse-vrij gedestilleerd water.
  4. Zodra het centrifugeren is voltooid, zuigt u het supernatant op, voegt u de microbeads toe, mengt u het monster voorzichtig en incubeert u het gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    1. Wanneer het celgetal 107 of minder is, voeg dan 100 μL van de microbeads toe.
    2. Voor tellingen hoger dan 107 totale cellen, pas de microbeads aan voor een eindconcentratie van 100 μL per 107 levende cellen.
  5. Zorg tijdens de incubatie voor één MACS-positieve selectiekolom, MACS-multistand en de bijbehorende magnetische scheider. Zorg ervoor dat de separator waterpas staat op de multistand en dat er geen ander metaal of magnetisch voorwerp in de buurt van de standaard is, aangezien de magnetische kracht krachtig is en de efficiëntie van het verwijderen van dode cellen kan beïnvloeden. Plaats de kolom stevig in een scheidingshouder met de vleugels naar buiten gericht.
  6. Als het totale resuspensievolume na incubatie minder dan 500 μl is, voeg dan 1x bindingsbuffer toe tot het totale volume 500 μl is.
  7. Plaats een conische buis van 15 ml onder de kolom en vul de kolom met 3 ml 1x Binding Buffer.
  8. Vervang de conische buis door een nieuwe conische buis van 15 ml voor het verzamelen van celmonsters en voeg het monster toe aan de kolom, zodat het volledig door de kolom kan stromen.
  9. Was de kolom 4 x 3 ml 1x Binding Buffer en voeg slechts één wasbeurt per keer toe nadat de vorige wasbeurt volledig door de kolom is gestroomd.
  10. Centrifugeer na de vierde wasbeurt de conische buis met de geïsoleerde cellen gedurende 5 minuten bij 450 × g, 4 °C. Gooi de kolom en de resterende 1x Binding Buffer weg.
  11. Resuspendeer de monsteroplossing in de juiste hoeveelheid RPMI-media op basis van de korrelgrootte en tel de geïsoleerde cellen volgens de methode die is beschreven in sectie 5 (figuur 3 en figuur 5).
    1. Als de levensvatbaarheid onder de 80% blijft en het totale aantal cellen 106 of minder is, herhaal dan rubriek 6.
    2. Als de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 80%, bewaar dan de bewerkte cellen op het ijs en ga onmiddellijk over tot het genereren van GEM volgens de instructies van de fabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een melanoombiopsie gesuspendeerd in RPMI werd verkregen en onmiddellijk op ijs geplaatst. Het monster werd overgebracht in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 420 μl RPMI en spijsverteringsenzymen, met een schaar in kleine stukjes gehakt en vervolgens gedurende 15 minuten enzymatisch verteerd in een verticaal geplaatste thermische mixer van 37 °C (figuur 1). Na de spijsvertering werd het monster gefilterd door een steriel wegwerpfilter van 50 μm en werd het filter gewassen met verse RPMI...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft de dissociatie van tumormonsters van mensen of muizen in een eencellige suspensie voor scRNA-sequencing met behulp van het 10x Genomics microfluïdische systeem. Bij het verwerken van weefsels die vaak afkomstig zijn van zeldzame vormen van kanker of die deel uitmaken van lopende klinische onderzoeken of lange experimenten voor muizentumoren, moet het monster tussen alle stappen optimaal en zorgvuldig worden bewaard. Alle stappen moeten snel worden uitgevoerd op ijs of bij 4 °C om de native cellula...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

M.S-F. ontving financiering van Bristol Myers-Squibb, Istari Oncology, en was consultant voor Galvazine Therapeutics.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de Adelson Medical Research Foundation (AMRF), de Melanoma Research Alliance (MRA) en U54CA224068. Figuur 1, Figuur 4 en Figuur 5 zijn gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x PBSCorning21-040-CV
10 mL serologische pipetCorning357551
1000 μL low-retention pipettipsRainin30389213
1000 μL low-retention brede pipettipsRainin30389218
1000 μL pipettipsRainin30389212
10x Magnetic Separator10x Genomics120250
15 mL conische buizenCorning430052
2 mL zuigpipetCorning357558
20 μL low-retention pipettipsRainin30389226
20 μL pipettipsRainin30389225
200 μL low-retention pipettipsRainin30389240
200 μL pipettipsRainin30389239
50 mL Polypropyleen conische buisFalcon352098
60 x 15 mm weefselkweekschaalFalcon353004
ACK Lysing BufferGibcoA10492-1
BD 1 mL spuitBecton, Dickinson and Company3090659
Bright-Line HemocytometerHausser Scientific551660
Calcium Chloride SolutionSigma Aldrich2115-100ML
Cell Ranger 10x GenomicsN/Ahttps://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Celtelling slides voor TC20 celtellerBio-Rad1450015
CellTrics 30μm steriele wegwerpfiltersSysmex04-004-2326
CellTrics 50μm steriele wegwerpfiltersSysmex04-004-2327
Dead Cell removal Kit Miltenyi Biotec130-090-101Bewaar bij -20 °C; kit 2
Dissectiepincet, fijne puntVWR82027-386
DNA LoBind Microcentrifugebuizen, 1.5 mLEppendorf22431021
EasySepTM Dead Cell Removal
(Annexin V) Kit		STEMCELL Technologies17899Bewaar bij 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425REppendorf5406000640
Eppendorf centrifuge 5910REppendorf2231000657
Eppendorf Easypet 3 elektronische pipetcontrollerEppendorfEP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384EppendorfEP5384000012
FBSGibco26140-079Bewaar bij 4 °C, gebruik in een biologische kap
Duitse roestvrijstalen schaarFine Science Tools14568-12
Leica Dmi1 MicroscoopLeica Microsystems454793
LS ColumnMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipet L-1000XLS+Rainin17014382
Pipet-Lite LTS Pipet L-200XLS+Rainin17014391
Pipet-Lite LTS Pipet L-20XLS+Rainin17014392
Quadro MACS MagnetMiltenyi Biotec130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)Gibco21870-076Bewaar bij 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-buisjesstripsUSA Scientific1402-4700
Trypan blauwe kleurstof 0,4%Thermo Fisher ScientificT10282
Tumor Dissociatie Kit, MensMiltenyi Biotec130-095-929Bewaar bij -20 °C, bereid enzymen volgens kitinstructies:
Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym H flacon in 3 mL van RPMI 1640
Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym R flacon in 2,7 mL van RPMI 1640
Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym A flacon in 1 mL van Buffer A geleverd bij de kit.
Tumor Dissociatie Kit, MuisMiltenyi Biotec130-096-730Bewaar bij -20 °C, bereid enzymen volgens kitinstructies:
Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym D flacon in 3 mL van RPMI 1640
Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym R flacon in 2,7 mL van RPMI 1640
Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym A flacon in 1 mL van Buffer A geleverd bij de kit.
UltraPure Gedestilleerde WaterInvitrogen10977-015Bewaar bij 4 °C

Referenties

  1. Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects. Front Immunol. 13, 961805(2022).
  2. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).
  3. Sun, G., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges. Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).
  4. Huang, D., et al. Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research. J Hematol Oncol. 16 (1), 98(2023).
  5. Ottaiano, A., et al. From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies. Biology. 12 (9), 1183(2023).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Erfanian, N., et al. Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis. Biomed Pharmacother. 165, 115077(2023).
  8. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  9. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
  10. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  11. Sade-Feldman, M., et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma. Cell. 176 (1-2), 404(2019).
  12. Pelka, K., et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer. Cell. 184 (18), 4734-4752 (2021).
  13. Bill, R., et al. CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers. Science. 381 (6657), 515-524 (2023).
  14. Al'Khafaji, A. M., et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).
  15. Xing, Y., et al. The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood. Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).
  16. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).
  17. Fan, X. -J., et al. Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking. J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).
  18. LoCoco, P. M., et al. Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research. Pain Rep. 5 (2), e818(2020).
  19. Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  20. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), (2023).
  21. Janssen, P., et al. The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data. Genome Biol. 24 (1), 140(2023).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  23. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Dissociatie van tumorweefselbereiding van cel-suspensiesmenselijke tumorstalenmuis-tumorstalenmechanische dissociatieenzymatische dissociatielyse van rode bloedcellenverrijking van levende en dode cellenceltelling met hemocytometer
Dissociatie van tumorweefselmonsters van mensen en muizen voor eencellige RNA-sequencing
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.