Dissociatie van tumorweefselmonsters van mensen en muizen voor eencellige RNA-sequencing

Samenvatting

Dit protocol schetst de procedure voor het snel dissociëren van tumormonsters van mensen en muizen voor sequencing van enkelcellig RNA.

Samenvatting

Menselijke tumormonsters bevatten een overvloed aan informatie over hun micro-omgeving en immuunrepertoire. Effectieve dissociatie van menselijke weefselmonsters in levensvatbare celsuspensies is een vereiste input voor de single-cell RNA sequencing (scRNAseq) pijplijn. In tegenstelling tot bulk-RNA-sequencingbenaderingen, stelt scRNAseq ons in staat om de transcriptionele heterogeniteit in tumormonsters op het niveau van één cel af te leiden. Het integreren van deze benadering in de afgelopen jaren heeft geleid tot veel ontdekkingen, zoals het identificeren van cellulaire immuun- en tumortoestanden en programma's die verband houden met klinische reacties op immunotherapieën en andere soorten behandelingen. Bovendien kunnen eencellige technologieën die worden toegepast op gedissocieerde weefsels worden gebruikt om toegankelijk chromatineregio's, T- en B-celreceptorrepertoire en de expressie van eiwitten te identificeren met behulp van DNA-antilichamen met streepjescodes (CITEseq).

De levensvatbaarheid en kwaliteit van het gedissocieerde monster zijn cruciale variabelen bij het gebruik van deze technologieën, aangezien deze de kruisbesmetting van afzonderlijke cellen met omringend RNA, de kwaliteit van de gegevens en de interpretatie dramatisch kunnen beïnvloeden. Bovendien kunnen lange dissociatieprotocollen leiden tot de eliminatie van gevoelige celpopulaties en de opregulatie van een gensignatuur voor stressrespons. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een snel universeel dissociatieprotocol bedacht, dat is gevalideerd op meerdere soorten tumoren bij mensen en muizen. Het proces begint met mechanische en enzymatische dissociatie, gevolgd door filtratie, rode bloedlysis en verrijking van levende doden, geschikt voor monsters met een lage input van cellen (bijv. biopsieën van naaldkernen). Dit protocol zorgt voor een schone en levensvatbare eencellige suspensie die van het grootste belang is voor het succesvol genereren van Gel Bead-In Emulsions (GEM's), barcodering en sequencing.

Inleiding

Hoewel veel vooruitgang in het kankeronderzoek heeft geleid tot de ontwikkeling en goedkeuring door de FDA van middelen die gericht zijn op remmende receptoren die tot expressie worden gebracht op immuun- en tumorcellen, bekend als checkpointblokkaderemmers, blijven therapieresistentie en het identificeren van mechanismen die de respons van de patiënt stimuleren, een uitdaging¹. De complexe uitdaging om tumorheterogeniteit te karakteriseren op basis van zijn moleculaire diversiteit en het ingewikkelde samenspel tussen tumorcellen en de immuunmicro-omgeving vereist nieuwe benaderingen om dit complexe ecosysteem te ontleden met de resolutie van één cel. Het begrijpen van de moleculaire fijne kneepjes in tumoren en hun micro-omgevingen is cruciaal voor het bevorderen van therapeutische strategieën en het ontcijferen van de complexe biologie die ten grondslag ligt aan kankerprogressie². Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) is steeds populairder geworden omdat het een analyse met hoge resolutie biedt van individuele cellen in complexe tumormonsters ^3,4.

Tumorheterogeniteit, die genetische, epigenetische en fenotypische diversiteiten omvat, vormt een uitdaging bij het blootleggen van de fijne kneepjes van de kankerbiologie⁵. De conventionele methoden van bulk-RNA-sequencing hebben de neiging om de unieke expressieprofielen en fenotypes van heterogene celpopulaties die in tumoren aanwezig zijn, te verdoezelen, aangezien deze methoden signalen gemiddeld nemen over hele celpopulaties⁴. ScRNA-seq daarentegen maakt de dissectie van individuele celtypen mogelijk, waardoor diverse genexpressie, onderdrukkingspatronen en cellulaire toestanden worden onthuld die anders over het hoofd worden gezien ^4,6. Het uitgangspunt van scRNA-seq ligt in het vermogen om de genetische en moleculaire handtekeningen van individuele cellen te decoderen, wat een enorme belofte inhoudt bij het ontdekken van nieuwe kankertherapieën⁷.

Door de genexpressieprofielen van tumorcellen en de omringende stromale en immuuncellen te ontcijferen, kunnen onderzoekers nieuwe therapeutische doelen identificeren en strategieën voor genetische precisiegeneeskunde ontwikkelen die zijn afgestemd op individuele patiënten^. Bovendien biedt het ontleden van het immuunrepertoire binnen de micro-omgeving van de tumor cruciale inzichten in de wisselwerking tussen tumorcellen en immuuneffectoren, wat de weg vrijmaakt voor immunotherapeutische interventies³. Ondanks de vooruitgang in het gebruik van scRNAseq op klinische monsters, kunnen verschillende uitdagingen tijdens de verwerkingsstappen de RNA-integriteit, levensvatbaarheid en kwaliteit van de gegenereerde gegevens van de cel schaden. Bovendien kan het verwerken van weefsel met een lage cellevensvatbaarheid de omringende RNA-niveaus verhogen in de druppeltjes die worden gegenereerd tijdens de inkapseling van individuele cellen, wat resulteert in kruisbesmetting en onjuiste annotatie van celtypen, terwijl lange dissociatieprotocollen die bij 37 °C worden uitgevoerd, kunnen leiden tot de opregulatie van een stressrespons-gensignatuur in meerdere celtypen ^{8,9, 10}. okt.

De stapsgewijze procedure (figuur 1A) die in dit protocol wordt beschreven, begint met snelle mechanische en enzymatische dissociatie van tumoren, gevolgd door filtratie en verwijdering van dode cellen, afhankelijk van de levensvatbaarheid van elk tumormonster. Op dit moment is deze procedure geverifieerd in melanoom¹¹, colorectaal¹², hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom¹³, pancreas- en longtumormonsters (niet-gepubliceerde gegevens). Deze technieken zorgen voor het genereren van levensvatbare celsuspensies van hoge kwaliteit die cruciaal zijn voor downstream-analyses¹⁴. Met name het verwijderen van rode bloedcellen, verstoken van gesynthetiseerd RNA, wordt noodzakelijk om het monster te zuiveren¹⁵. Daaropvolgende evaluatie van het aantal cellen en de eliminatie van dode cellen dienen als voorwaarde voor een succesvolle 10x Genomics Gel bead-in Emulsion (GEM) generatie, barcodering, en verhogen het herstel van transcripten en gesequencede cellen zonder de uitsluiting van gevoelige populaties (bijv. neutrofielen en epitheelcellen) in gevaar te ^brengen16. Deze stappen zijn van fundamenteel belang bij het ontsluiten van het potentieel van analyse van eencellige resolutie in tumormonsters ^9,10, het blootleggen van nieuwe genexpressieprofielen en immuunsignaturen die nodig zijn voor het stimuleren van innovatieve therapeutische interventies en het identificeren van nieuwe tumorkwetsbaarheden.

Protocol

Deze studie voldeed aan alle institutionele richtlijnen met betrekking tot het bemonsteren van menselijk weefsel. Er werd geïnformeerde toestemming ontvangen van patiënten en identificeerbare voorbeeldgegevens werden geanonimiseerd. Monsters worden verzameld in de operatiekamer, in een oplossing van RPMI, zoutoplossing of PBS geplaatst en via de afdeling pathologie bevestigd als kanker voordat ze in onderzoek worden gebruikt. Alle stappen, behalve wanneer aangegeven, moeten worden uitgevoerd bij 4 °C of op ijs. Werk in een bioveiligheidskap bij het verwerken van menselijk weefsel. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

1. Verkrijgen van de steekproef

1. Verkrijg een solide tumormonster in een buis met media en plaats het op ijs.
   1. Instrueer het personeel van de operatiekamer om het monster te vervoeren in een buis die voldoende RPMI, zoutoplossing of PBS bevat om het weefsel volledig onder te dompelen om uitdroging van het monster te voorkomen.
      OPMERKING: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het monster niet uitdroogt, omdat dit de levensvatbaarheid vermindert.
2. Koel alle centrifuges af tot 4 °C en breng de thermische mixer naar 37 °C.
3. Verwijder de bereide dissociatie-enzymen voor menselijke of muizentumoren (materiaaltabel), ontdooi ze op de thermische mixer van 37 °C en verplaats ze naar ijs zodra ze zijn ontdooid.
4. Haal een aliquot van 20 ml RPMI op.
5. Registreer relevante steekproefinformatie (bijv. patiënt-ID, de-identificatie, steekproeftype).
6. Breng het monster over naar een weefselkweekschaal van 60 mm (geplaatst op ijs) door de buis meerdere keren om te keren en de inhoud in de schaal te gieten om ervoor te zorgen dat al het monstermateriaal wordt overgebracht. Als het monster bij aankomst niet in media is geleverd, voeg dan verse RPMI-media toe aan de schaal.
   1. Als het monster gefragmenteerd is, laat dan de buis met het monster 5 minuten draaien bij 450 × g, 4 °C, gooi het supernatant weg, resuspendeer het monster in 420 μl RPMI en ga naar sectie 2.

2. Mechanische en enzymatische vertering

1. Pipetteer 420 μl media uit het monsterschaaltje van 60 mm in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Probeer eventuele voorbeeldfragmenten die in de media zijn opgehangen op te nemen.
2. Breng het monsterweefsel met een pincet over van de schaal van 60 mm naar het buisje van 1,5 ml met media. Knip het monster af met een schone schaar in de buis, zodat de stukjes maximaal 2-3 mm in diameter zijn.
3. Voeg spijsverteringsenzymen, bereid volgens de specificaties van de fabrikant (materiaaltabel), toe aan het monster in de volgende volumes: 42 μl enzym H (niet-specifieke proteasen) voor menselijke monsters, enzym D (niet-specifieke proteasen) voor muizenmonsters, 21 μl enzym R (niet-specifieke proteasen) en 5 μl enzym A (nuclease).
4. Voeg nog eens 420 μL media toe uit de schaal of tot de 1 ml-markering op de buis. Niet meer dan 420 μL media gebruiken.
5. Draai de buis gedurende 5 s en plaats deze in een thermische mixer die verticaal op zijn kant staat (Figuur 1B). Incubeer bij 37 °C, 450 rpm, gedurende 15 min.
   OPMERKING: Verwijder tijdens de incubatie alle 10x Genomics-materialen die nodig zijn voor het genereren van GEM, aangezien deze 30 minuten nodig hebben om op kamertemperatuur te komen

3. Filteren van monsters

1. Plaats een celfilter van 50 μm op een nieuwe conische buis van 15 ml en vul het filter door er 1 ml verse RPMI-media doorheen in de buis te leiden.
2. Breng het monster na de spijsvertering over in de buis van 15 ml met behulp van een brede pipetpunt van 1.000 μl met een lage retentie. Was de slang van 1.5 ml met 1 ml vers materiaal en breng het materiaal over naar het filter om ervoor te zorgen dat al het monstermateriaal door het filter wordt geleid.
3. Pak een plastic spuit van 1 ml en haal alleen de zuiger eruit (gooi de rest van de spuit weg). Gebruik de achterkant van de zuiger van de spuit om het monster met een draaiende beweging op het filter te malen en te duwen.
4. Was het filter met 5 ml media en eventuele resterende media van de schaal waarin het monster zich bevond (sectie 1) om eventuele cellen te verzamelen die mogelijk van het weefsel zijn losgekomen.
5. Plaats een celfilter van 30 μm op een nieuwe conische buis van 15 ml, vul het filter met 1 ml media en breng de inhoud van de buis met het gedissocieerde monster door het filter.
   OPMERKING: Met deze stap wordt groot vuil verwijderd dat verstopt kan raken of een bevochtigingsfout kan veroorzaken bij het uitvoeren van het monster met behulp van de 10x Genomics microfluïdische chips.

4. Lysis van rode bloedcellen

1. Centrifugeer het monster bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min. Zuig de media op en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.
2. Resuspendeer in ACK Lysis-buffer om rode bloedcellen (RBC's) te verwijderen en registreer het gebruikte volume. Het volume is afhankelijk van de grootte van de pellet en de mate van RBC's in de pellet.
   OPMERKING: Geresuspendeerde ACK-monsteroplossing moet kleurloos zijn als er voldoende ACK Lysis-buffer is toegevoegd, omdat dit de rode bloedcellen uit het monster zal verwijderen.
3. Centrifugeer de monsterbuisjes bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten en zuig het supernatant op.
4. Herhaal stap 4.2-4.3 indien nodig totdat de monsterpellet na centrifugeren geen zichtbare rode kleur meer heeft (Figuur 2). Noteer eventuele extra volumes ACK Lysis-buffer die in deze stap worden gebruikt.
5. Resuspendeer de monsterpellet in verse media ter voorbereiding op het tellen.

5. Cellen tellen

1. Doe 10 μL trypan blauw in een buisje van 1,5 ml. Meng de gedissocieerde cellen voorzichtig, neem 10 μL monster en meng (1:1) met het trypanblauw. Laad 10 μL aan elke kant van een hemocytometer en tel de cellen.
2. Registreer de celconcentratie, het totale aantal live cellen, het levensvatbaarheidspercentage en het uiteindelijke mediavolume na telling.
3. Zorg ervoor dat het celgetal tussen 700 en 1.200 cellen/μl ligt (7 × 10⁵- 1,2 × 10⁶/ml) voor een optimale 10x Genomics-run.
   1. Als het monster te geconcentreerd is, verdun het dan met media en vertel het opnieuw.
   2. Als het monster te verdund is, centrifugeer het monster dan gedurende 5 minuten bij 450 × g 4 °C en resuspendeer het in een kleinere hoeveelheid media.
   3. Als de levensvatbaarheid van de cellen lager is dan 80%, voer dan een levend-dode procedure uit om dode cellen te verwijderen.
   4. Als er minder dan een miljoen cellen zijn, zie rubriek 6.
   5. Als er meer dan een miljoen cellen zijn en de levensvatbaarheid > 10%, zie rubriek 6.
   6. Als er meer dan een miljoen cellen zijn en de levensvatbaarheid < 10%, zie rubriek 7.
   7. Als de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 80%, bewaar de bewerkte cellen op ijs en ga onmiddellijk verder met het genereren van GEM volgens de instructies van de fabrikant.

6. Verwijdering van dode cellen - Kit 1

OPMERKING: Werk in een bioveiligheidskap wanneer u de reagentia voor het verwijderen van dode cellen gebruikt, omdat deze gemakkelijk besmet kunnen raken.

1. Centrifugeer het monster bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min.
2. Bereid isolatiemedia voor in een conische buis van 15 ml en bewaar deze op kamertemperatuur: 9,8 ml PBS, 10 μl CaCl₂ en 200 μl warmte-geïnactiveerde FCS (toegevoegd in een bioveiligheidskap).
3. Na het centrifugeren het medium uit de pellet opzuigen en resuspenderen in 1 ml van het isolatiemedium.
4. Centrifugeer de tube opnieuw bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min. Zuig het supernatans op en resuspendeer de pellet in 100 μl isolatiemedia.
5. Breng 100 μL monster in isolatiemedia over in een putje van een PCR-stripbuis van 0,2 ml.
6. Voeg in een bioveiligheidskap 10 μl Annexin V-cocktail en 10 μL Biotine Selection Cocktail toe aan het putje met 100 μl van het monster in isolatiemedia. Pipetteer de oplossing en laat deze 4 minuten op kamertemperatuur staan.
7. Draai na 4 minuten de dextran-gecoate magnetische deeltjes gedurende 30 s in een wervel. Voeg 20 μL van de korrels en 60 μL isolatiemedia toe aan het monster (een totaal volume van 200 μL). Als de levensvatbaarheid lager is dan 40%, schaal dan de hoeveelheid korrels op tot 40 μL terwijl u het volume van de isolatiemedia aanpast (tot 40 μL), waarbij u een totaal volume van 200 μL aanhoudt. Pipettemeng en laat de oplossing 3 minuten op kamertemperatuur staan.
8. Plaats de stripbuis op een 10x Genomics magnetische scheider (op de hoge stand) gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
9. Breng de vloeistof uit de stripbuis over zonder de korrels te verstoren in een nieuwe 1,5 ml lo-bind microcentrifugebuis. Verwijder de stripbuis niet van de magneet.
10. Centrifugeer het buisje van 1,5 ml met het monster bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten. Zuig het supernatans op en resuspendeer de pellet in een geschikte hoeveelheid RPMI-media op basis van de cellen voor de grootte en het aantal pellets, zoals beschreven in sectie 5. Herhaal de procedure voor het verwijderen van dode cellen als de levensvatbaarheid onder de 80% blijft (Figuur 3 en Figuur 4).
    OPMERKING: Resuspendeer geen cellen in isolatiemedia voor stroomafwaartse GEM-generatie, aangezien het calciumchloride het inkapselingsproces en de omgekeerde transcriptie (RT) stap zal verstoren.
11. Bewaar bewerkte cellen op ijs als de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 80% en ga onmiddellijk over tot GEM-generatie volgens de instructies van de fabrikant.

7. Verwijdering van dode cellen - Kit 2

NOTITIE: Werk in een bioveiligheidskap wanneer u de kitreagentia gebruikt.

1. Plaats de microbeads en de 20x Binding Buffer stock-oplossing in een bioveiligheidskap.
2. Centrifugeer de monstersuspensie bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 min.
3. Bereid 1x bufferoplossing onder steriele omstandigheden met behulp van 1 ml van de 20x Binding Buffer stock-oplossing die wordt gepipetteerd in 19 ml DNAse-, RNAse-vrij gedestilleerd water.
4. Zodra het centrifugeren is voltooid, zuigt u het supernatant op, voegt u de microbeads toe, mengt u het monster voorzichtig en incubeert u het gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   1. Wanneer het celgetal 10⁷ of minder is, voeg dan 100 μL van de microbeads toe.
   2. Voor tellingen hoger dan 10⁷ totale cellen, pas de microbeads aan voor een eindconcentratie van 100 μL per 10⁷ levende cellen.
5. Zorg tijdens de incubatie voor één MACS-positieve selectiekolom, MACS-multistand en de bijbehorende magnetische scheider. Zorg ervoor dat de separator waterpas staat op de multistand en dat er geen ander metaal of magnetisch voorwerp in de buurt van de standaard is, aangezien de magnetische kracht krachtig is en de efficiëntie van het verwijderen van dode cellen kan beïnvloeden. Plaats de kolom stevig in een scheidingshouder met de vleugels naar buiten gericht.
6. Als het totale resuspensievolume na incubatie minder dan 500 μl is, voeg dan 1x bindingsbuffer toe tot het totale volume 500 μl is.
7. Plaats een conische buis van 15 ml onder de kolom en vul de kolom met 3 ml 1x Binding Buffer.
8. Vervang de conische buis door een nieuwe conische buis van 15 ml voor het verzamelen van celmonsters en voeg het monster toe aan de kolom, zodat het volledig door de kolom kan stromen.
9. Was de kolom 4 x 3 ml 1x Binding Buffer en voeg slechts één wasbeurt per keer toe nadat de vorige wasbeurt volledig door de kolom is gestroomd.
10. Centrifugeer na de vierde wasbeurt de conische buis met de geïsoleerde cellen gedurende 5 minuten bij 450 × g, 4 °C. Gooi de kolom en de resterende 1x Binding Buffer weg.
11. Resuspendeer de monsteroplossing in de juiste hoeveelheid RPMI-media op basis van de korrelgrootte en tel de geïsoleerde cellen volgens de methode die is beschreven in sectie 5 (figuur 3 en figuur 5).
    1. Als de levensvatbaarheid onder de 80% blijft en het totale aantal cellen 10⁶ of minder is, herhaal dan rubriek 6.
    2. Als de levensvatbaarheid van de cellen hoger is dan 80%, bewaar dan de bewerkte cellen op het ijs en ga onmiddellijk over tot het genereren van GEM volgens de instructies van de fabrikant.

Resultaten

Een melanoombiopsie gesuspendeerd in RPMI werd verkregen en onmiddellijk op ijs geplaatst. Het monster werd overgebracht in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 420 μl RPMI en spijsverteringsenzymen, met een schaar in kleine stukjes gehakt en vervolgens gedurende 15 minuten enzymatisch verteerd in een verticaal geplaatste thermische mixer van 37 °C (figuur 1). Na de spijsvertering werd het monster gefilterd door een steriel wegwerpfilter van 50 μm en werd het filter gewassen met verse RPMI om de celopbrengst te verhogen (figuur 1). De resterende delen van het weefsel die na de wasbeurten overbleven, werden weggegooid, omdat dit ongewenste biologische materialen zijn (bijv. vetweefsel).

Op basis van de kleur van de resulterende celkorrel was 15 ml ACK-lysisbuffer nodig om de rode bloedcellen te verwijderen (Figuur 2). Na resuspensie in 3 ml RPMI-media bedroeg het totale celgetal 1 × 10⁶/ml, met een levensvatbaarheid van <80% (figuur 3A). Dit gaf aan dat één cyclus van verrijking van levende cellen met behulp van Kit 1 (protocolsectie 6) nodig was voordat werd overgegaan tot 10x Genomics laden (Figuur 4). Als dit monster meer dan 1 miljoen cellen had en een levensvatbaarheid van minder dan 10% had, zou in plaats daarvan de dode celverwijdering - Kit 2 zijn gebruikt (Figuur 5). Het monster werd gewassen met isolatiemedia en 10 μL Annexine V en biotineselectiecocktail werden toegevoegd, gevolgd door 20 μL magnetische bollen en 60 μL isolatiemedia, zoals beschreven in protocolsectie 6 (Figuur 4). Na deze procedure werd het monster opnieuw gesuspendeerd in 500 μl media en opnieuw geteld. Het aantal levende cellen was 4,9 × 10⁵/ml met een levensvatbaarheid van meer dan 90% (figuur 3B), en het monster ging onmiddellijk over tot het genereren van GEM volgens de instructies van de fabrikant.

Figuur 1: Overzicht van de verwerking van tumormonsters. (A) Illustratie van het stapsgewijze proces van het weefseldissociatieprotocol. (B) De vergisting van een monster met behulp van een verticaal geplaatste thermische mixer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Pre-ACK en Post-ACK behandeling van een licht gepigmenteerd melanoommonster. (A) Afbeelding toont een melanoommonster dat na de verteringsstap is gefilterd en gepelleteerd vóór lysis van rode bloedcellen (RBC) met behulp van ACK. (B) Afbeelding toont hetzelfde melanoommonster na verwijdering van RBC met behulp van ACK-buffer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Weergave van cellen op de hemocytometer onder trypanblauw ingezoomd op een vergroting van 200x. (A) Afbeelding van het verschijnen van blauwe cellen vóór levende celverrijking, die dode cellen vertegenwoordigt, met een levensvatbaarheid van minder dan 80%. (B) Afbeelding van het monster na verrijking van levende cellen met behulp van het Kit 1-protocol (protocolstap 6), met een verhoogde levensvatbaarheid van meer dan 90%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Overzicht van de isolatie van levend-dode monstercellen met behulp van Kit 1. Deze stap wordt uitgevoerd wanneer minder dan een miljoen of meer dan een miljoen cellen met een levensvatbaarheid >10% worden gedetecteerd na celtelling (protocolstap 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Overzicht van de isolatie van levende dode cellen met behulp van de microbeads voor het verwijderen van dode cellen in Kit 2. Deze stap wordt uitgevoerd wanneer er meer dan een miljoen cellen zijn en een levensvatbaarheid van <10%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Validatie van eencellige analyse van een niet-gemanipuleerd monster na één cyclus van verrijking van levende cellen met behulp van het gewijzigde protocol van Kit 1. Het bovenste deel toont een UMAP-analyse die consistentie aantoont in celgroepen en -typen voor en na levende celverrijking. Het onderste deel geeft een overzicht van de sequencing-outputs die door Cell Ranger worden gegenereerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft de dissociatie van tumormonsters van mensen of muizen in een eencellige suspensie voor scRNA-sequencing met behulp van het 10x Genomics microfluïdische systeem. Bij het verwerken van weefsels die vaak afkomstig zijn van zeldzame vormen van kanker of die deel uitmaken van lopende klinische onderzoeken of lange experimenten voor muizentumoren, moet het monster tussen alle stappen optimaal en zorgvuldig worden bewaard. Alle stappen moeten snel worden uitgevoerd op ijs of bij 4 °C om de native cellulaire RNA-profielen te behouden en degradatie te voorkomen, aangezien langdurig werken bij kamertemperatuur de transcriptomische kwaliteit zal beïnvloeden ^17,18.

Er moeten verschillende stappen worden ondernomen om ervoor te zorgen dat het verlies van cellen tijdens de procedure minimaal is, vooral bij het verwerken van biopsieën van kleine^{naaldkernen 17}. Ervoor zorgen dat alle fragmenten van het tumormonster in de spijsvertering worden opgenomen, zal leiden tot het meest succesvolle resultaat, aangezien meer cellen die uit het monster worden geëxtraheerd, de toekomstige 10x Genomics-inkapseling en sequencing zullen verbeteren en het totale aantal cellen en transcripten dat voor analyse wordt teruggewonnen. Als het monster vast komt te zitten in de buis waarin het aankomt, kunnen media worden toegevoegd, de buis worden omgekeerd en naar de schaal worden overgebracht voor verwerking. Als het eerste monster gefragmenteerd is of als de oplossing troebel is, wat wijst op de aanwezigheid van cellen in suspensie, zorg er dan voor dat het hele monster wordt verzameld voor enzymatische vertering door het monster te centrifugeren met de oplossing waarin het is aangekomen en het opnieuw te suspenderen in mediavolume voor vergisting (protocoldeel 1).

Zorg er bij het aanzuigen voor dat de pellet tijdens de procedure niet wordt gestoord. Laat bij het opzuigen extra volume over, dat met een P200-pipet kan worden verwijderd. Als de pellet wordt verstoord, kan het volume terug in de buis worden gedoseerd en opnieuw worden gecentrifugeerd. Na ACK-lysis of na levende dode verwijdering kan het monster in volumes van slechts 25 μl zijn. Het is dus van cruciaal belang om geen supernatans te verliezen dat de cellen bevat. Een goede mechanische vertering is essentieel om ervoor te zorgen dat de cellen van belang worden blootgesteld aan enzymatische vergisting. Langere enzymatische vertering met behulp van de juiste enzymen en thermische mixer kan nodig zijn voor grotere steekproefgroottes ^9,19,20. Hoewel specifieke enzymnamen gepatenteerd zijn, merkt de fabrikant enzym A op als een nuclease en enzymen H, D en R als niet-specifieke proteasen. Het is van vitaal belang om zoveel mogelijk van het tumormonster door het filter te laten gaan om de hoogst mogelijke celopbrengst te garanderen. Succesvol filteren zal ertoe leiden dat er geen of slechts een klein zichtbaar monster in het filter zit. Sommige stukken van het monster kunnen mogelijk niet worden gefilterd als het grote hoeveelheden vet- of bindweefsel bevat. Als er zichtbare stukjes van het monster op de bovenkant van het filter zitten, blijf dan de achterkant van de zuiger van de spuit gebruiken om het monster te malen en door te duwen met behulp van de draaiende beweging, terwijl u ook de bovenkant van het filter met meer media wast.

Het succes van de lysestap van rode bloedcellen wordt bepaald door het monster onder de microscoop te bekijken zodra het monster op de hemocytometer is geladen voor telling en levensvatbaarheid^15,21. Als er voldoende ACK aan het monster wordt toegevoegd om rode bloedcellen te verwijderen, zouden er geen rode bloedcellen of zichtbare roodheid in de pellet zijn. Als er rode bloedcellen in het monster zichtbaar zijn, moet extra ACK worden toegevoegd en moet het monster opnieuw worden gecentrifugeerd bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten. Eenmaal gedaan, moet het supernatans worden opgezogen en kan de celkorrel opnieuw worden gesuspendeerd in RPMI-media voor visualisatie en telling.

Om een optimale 10x Genomics-run te garanderen, moet het celgetal tussen 700 en 1.200 cellen/μL liggen (7 × 10 5-1,2 × 10⁶/ml). Een hoge concentratie verhoogt de doubletsnelheid (twee cellen in één druppel) tijdens druppelvorming. Als het aantal te hoog is, kan een geschikte hoeveelheid media aan het monster worden toegevoegd en opnieuw op een hemocytometer worden geladen voor hertelling. Als de concentratie te laag is, kan het monster opnieuw worden gecentrifugeerd bij 450 × g, 4 °C gedurende 5 minuten, waarbij het supernatans wordt opgezogen en opnieuw wordt gesuspendeerd in een lager volume media voordat het opnieuw wordt geteld. Het monster is klaar om te worden geladen voor 10x Genomics als de levensvatbaarheid van levende cellen hoger is dan 80% (Figuur 3).

Als de levensvatbaarheid van het monster lager is dan 80%, is een levend-dode procedure nodig voordat 10x Genomics¹⁶ wordt geladen. Als een ronde van levende dode verwijdering het levensvatbaarheidspercentage niet boven de 80% heeft gebracht, moet een andere ronde worden uitgevoerd als er in totaal meer dan 1 × 10⁵ cellen zijn. Een hogere levensvatbaarheid voorkomt verstoppingen in het daaropvolgende 10x Genomics-protocol, verhoogt het celherstel en vermindert de aanwezigheid van omringend RNA. Het protocol van Kit 1 is geoptimaliseerd en geminiaturiseerd voor het snel dissociëren van kleinere weefselmonsters met een lager celaantal. Het verminderde volume van reagentia en de verkorte incubatietijden verhogen de celopbrengst en voorkomen een stressrespons-gensignatuur (FOS, JUN en JUNB) op verschillende cellen ^9,22. Alternatieve methoden om levende cellen te verrijken zijn onder meer kleuring en sortering. Dit zou echter resulteren in een verminderde celopbrengst, langdurige incubatie van kleuring, wat de cellulaire toestanden zou kunnen beïnvloeden (bijv. aCD3e-antilichamen zullen T-cellen activeren) en stress veroorzaakt door de druk van de machine op de cellen tijdens het sorteren ^9,22. Het voorbeeld in figuur 6 illustreert een UMAP die is gegenereerd na 10X Genomics Gene Expression (GEX)-sequencing en de conversie van de gegenereerde celbarcodes naar FASTQ-bestanden die vervolgens werden samengevoegd en uitgelijnd via CellRanger. Daaropvolgende sequentieresultaten en vergelijkingen van levend-dode-verwijdering werden uitgezet, waarbij celpopulaties in een monster voor en na verwijdering van levend-doden en verbeterde sequencingkwaliteit werden aangetoond. Het longmonster dat in figuur 6 wordt getoond, duidde op een probleem met de fractie van de metingen, aangezien deze minder dan 70% bedroeg. Deze waarschuwing werd gegenereerd vanwege een hoge omringende RNA in een populatie van gelyseerde of dode cellen. Na het verwijderen van dode cellen was deze fout echter niet meer aanwezig en resulteerde in een hoger percentage fracties in cellen²³.

Single-cell RNA-sequencing is een kostbaar en precair proces dat het gebied van kankerimmunologie en kankeronderzoek drastisch heeft verbeterd. Het maakt verdere ondervraging mogelijk van genen, cellulaire toestanden en programma's die tot expressie komen en onderdrukt worden in specifieke celtypen, waardoor meer wordt onthuld over het gedrag en de heterogeniteit van kankers. Suboptimaal of weinig levensvatbaar weefsel genereert eerder gegevens van lage kwaliteit die artefacten kunnen creëren die de realiteit van de tumorbiologie wegnemen, wat het cruciale belang van een goede tumordissociatie en monstervoorbereiding benadrukt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serologische pipet	Corning	357551
1000 μL low-retention pipettips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention brede pipettips	Rainin	30389218
1000 μL pipettips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conische buizen	Corning	430052
2 mL zuigpipet	Corning	357558
20 μL low-retention pipettips	Rainin	30389226
20 μL pipettips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipettips	Rainin	30389240
200 μL pipettips	Rainin	30389239
50 mL Polypropyleen conische buis	Falcon	352098
60 x 15 mm weefselkweekschaal	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL spuit	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Celtelling slides voor TC20 celteller	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm steriele wegwerpfilters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm steriele wegwerpfilters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Bewaar bij -20 °C; kit 2
Dissectiepincet, fijne punt	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifugebuizen, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Bewaar bij 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 elektronische pipetcontroller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Bewaar bij 4 °C, gebruik in een biologische kap
Duitse roestvrijstalen schaar	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscoop	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipet L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipet L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipet L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Bewaar bij 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-buisjesstrips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blauwe kleurstof 0,4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociatie Kit, Mens	Miltenyi Biotec	130-095-929	Bewaar bij -20 °C, bereid enzymen volgens kitinstructies: Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym H flacon in 3 mL van RPMI 1640 Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym R flacon in 2,7 mL van RPMI 1640 Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym A flacon in 1 mL van Buffer A geleverd bij de kit.
Tumor Dissociatie Kit, Muis	Miltenyi Biotec	130-096-730	Bewaar bij -20 °C, bereid enzymen volgens kitinstructies: Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym D flacon in 3 mL van RPMI 1640 Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym R flacon in 2,7 mL van RPMI 1640 Reconstitueer gelyofiliseerd Enzym A flacon in 1 mL van Buffer A geleverd bij de kit.
UltraPure Gedestilleerde Water	Invitrogen	10977-015	Bewaar bij 4 °C