Nat afschuinen van micro-injectienaalden met behulp van constante luchtdruk voor feedback over het openen van de naald

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de assemblage van een pneumatisch systeem voor de toevoer van perslucht naar een naald tijdens het proces van naaldafschuining. Het protocol beschrijft verder het afschuiningsproces voor het maken van scherpe micro-injectienaalden en hoe de relatieve openingsgrootte van de naald kan worden gemeten.

Samenvatting

Micro-injectienaalden zijn een cruciaal hulpmiddel bij de toediening van reagentia voor genoommodificatie, CRISPR-componenten (gids-RNA's, Cas9-eiwit en donorsjabloon) en transposonsysteemcomponenten (plasmiden en transposase-mRNA) in zich ontwikkelende insectenembryo's. Scherpe micro-injectienaalden zijn vooral belangrijk tijdens de toediening van deze modificerende middelen, omdat ze de schade aan het te injecteren embryo helpen minimaliseren, waardoor de overleving van deze embryo's wordt verhoogd in vergelijking met injectie met niet-afgeschuinde naalden. Verder produceert het afschuinen van naalden naalden die consistenter zijn van naald tot naald in vergelijking met naalden die worden geopend door de naaldpunt willekeurig te breken door de punt tegen een object te borstelen (zijkant van een dekglaasje, het oppervlak van het te injecteren embryo, enz.). Het proces van nat afschuinen van micro-injectienaalden met lucht onder constante druk die aan de naald wordt geleverd, stelt de persoon die de naald afschuint in staat om te weten wanneer de naald open is (aanwezigheid van luchtbellen) en geeft ook een relatieve indicatie van hoe groot een naaldopening is gemaakt. De relatieve openingsgrootte in de naald kan worden bepaald door de luchtdruk die aan de naald wordt geleverd aan te passen totdat een evenwicht is bereikt en er geen bellen meer uit de punt van de naald stromen. Hoe lager de druk waarbij het evenwicht wordt bereikt, hoe groter de naalddikte; En omgekeerd, hoe hoger de druk, hoe kleiner de naalddikte.

Inleiding

Genetische modificatie van insecten is een proces dat oorspronkelijk in Drosophila is ontwikkeld door Rubin en Spradling, en in de loop der jaren is dit proces gewijzigd om genetische modificaties in andere soorten te creëren¹. Het proces is gebaseerd op de nauwkeurige afgifte van modificatiecomponenten die in embryo's worden micro-geïnjecteerd op een specifiek tijdsbestek en op een specifieke locatie in het zich ontwikkelende embryo ^2,3,4. Scherpe micro-injectienaalden zijn een cruciaal hulpmiddel in het proces van genetische modificatie van sommige insecten, zoals muggen 4,5,6,7,8,9 en zandvliegen¹⁰, terwijl ze niet zo cruciaal zijn voor andere insecten, zoals zijderupsen ¹¹. Scherpe naalden zijn vaak een sleutelfactor tussen succes en mislukking bij het maken van een genetisch gemodificeerd insect ^2,4. Meestal worden microcapillaire glasnaalden getrokken door glas te verhitten tot het punt waarop het glas elastisch wordt, waardoor het capillair in een taps toelopende naald met gesloten punt kan worden getrokken. Voordat de naald kan worden gebruikt, moet deze zo worden geopend dat er een scherpe punt voor injectie ontstaat. Traditioneel worden naalden geopend door de punt van de naald voorzichtig tegen iets te borstelen (de rand van een glaasje/dekglaasje, of het embryo, enz.) waardoor een kleine hoeveelheid glas van de punt afbreekt, waardoor willekeurig een scherpe punt ontstaat ^2,3. Een iets minder willekeurig proces is droog afschuinen, waarbij de naald snel gedurende een korte tijd op een optisch vlakke, draaiende schuurplaat wordt neergelaten, waardoor een kleine hoeveelheid glas van de naaldpunt wordt geschuurd, waardoor een scherpe punt ontstaat. Droog afschuinen is iets minder willekeurig dan de punt van de naald ergens tegenaan borstelen. Het hieronder beschreven protocol gaat nog een stap verder in het afschuinproces door perslucht toe te voeren aan de af te schuinen naald en deze onder een vloeistoflaag af te schuinen zodat er luchtbellen zichtbaar zijn zodra de naald is geopend. Dit protocol beschrijft een methode voor het produceren van betrouwbaar scherpe micro-injectienaalden. Afschuinen onder een vloeibare laag is een verbetering ten opzichte van het willekeurig breken van de naald zoals hierboven beschreven, en droog afschuinen omdat de gebruiker feedback krijgt over het afschuinproces, waardoor de persoon die afschuint weet wanneer de naald open is en relatief hoe groot de naaldopening is. Als u de relatieve openingsgrootte van de naaldpunt kent, kan de persoon die afschuint naalden met verschillende openingsmaten maken. Verschillende naaldopeningsmaten hebben verschillende voordelen; Grotere naaldopeningen zijn bijvoorbeeld geschikt voor injectiemengsels met een hoge viscositeit, terwijl kleinere openingsnaalden minder schade toebrengen aan het embryo dat wordt geïnjecteerd.

Lucht wordt naar de naald gevoerd met behulp van een regelaar en een systeem van urethaanslangen op basis van een gemodificeerd luchtdrukgeregeld injectiesysteem². Terwijl lucht met een constante druk aan de naald wordt toegevoerd, wordt de naald afgeschuind onder een laag vloeistof. Het afschuinproces bestaat uit een herhaald proces in vijf stappen: 1) het laten zakken van de naald op het schuuroppervlak, 2) het laten afschuinen van de naald voor een korte periode, 3) het optillen van de naald weg van de schuurplaat terwijl deze onder het oppervlak van de vloeistoflaag wordt gehouden, 4) het stoppen van het draaien van de schuurplaat om te controleren op het verschijnen van luchtbellen. Als er geen bubbels aanwezig zijn, worden stap 1 tot en met 4 herhaald totdat er belletjes verschijnen; 5) Zodra er luchtbellen aanwezig zijn, kan de luchtdruk worden aangepast om de relatieve openingsgrootte van de naald te bepalen. Hoe lager de druk die nodig is om de vorming van luchtbellen te stoppen, hoe groter de opening bij de naaldpunt.

Protocol

OPMERKING: Het protocol zoals hieronder beschreven maakt gebruik van de Sutter BV-10 microcapillair afgeschuind. Dit protocol kan echter worden aangepast voor gebruik met elk model microcapillair afgeschuind.

1. Montage van regelaar, manometer en luchttoevoerslang

1. Snijd een stuk urethaanslang af voor de aansluiting van de luchttoevoer naar de basis van de regelaar (R; Deel 1, figuur 1). De lengte van dit gedeelte is afhankelijk van de afstand van de luchttoevoer tot de regelaar, die zich naast de afschuiner bevindt.
2. Schuif een slangklem op de urethaanslang en duw vervolgens een slangconnector in het uiteinde van de slang. Zorg ervoor dat de slangaansluiting volledig is ingestoken door de slangaansluiting tegen een harde ondergrond te plaatsen. Terwijl u de slang dicht bij de slangaansluiting houdt, drukt u de slang stevig in de slang totdat de slangaansluiting volledig is ingestoken. De slangklem en de slangaansluiting vormen samen de verbinding HC (Figuur 1).
3. Schuif de slangklem tot aan het uiteinde van de slang waar de slangaansluiting is ingebracht. Draai de slangklem over het ingestoken baarduiteinde zodat het een luchtdichte verbinding vormt.
4. Schroef de slangaansluiting met de hand in de basis van de regelaar (R) en draai de verbinding vast met een kleine sleutel. Zorg ervoor dat de verbinding luchtdicht is, maar niet te strak.
5. Schroef in de zijpoort van de regelaar met de hand een T-connector (T) vast en gebruik vervolgens een kleine sleutel om het vastdraaien te voltooien.
6. Snijd een klein stukje urethaanslang (Figuur 1, sectie 2) van ongeveer 3-5 cm lang. Plaats twee slangklemmen op het stuk slang, steek vervolgens een slangconnector in elk uiteinde van de slang en werk de aansluitingen (HC) af zoals beschreven in stap 1.2-1.4 voor elk uiteinde van de buis.
7. Schroef het ene uiteinde van de korte buis in de basis van de manometer en draai ze vast met een sleutel zoals in stap 1.5.
8. Schroef het andere uiteinde van de korte buis in een van de poorten op de T-connector (T) die in stap 1.5 op de regelaar is aangesloten.
9. Snijd een stuk urethaanslang af (Figuur 1, Sectie 3) voor de verbinding tussen de regelaar en de naaldhouder (NH). De grootte van dit gedeelte is afhankelijk van de afstand van de afschuiner tot de locatie van de regelaar.
10. Plaats een slangklem op het slanggedeelte en plaats vervolgens een slangaansluiting zoals beschreven in stap 1.2-1.4.
11. Plaats aan de andere kant van dit deel van de slang de vrouwelijke luer-connector (LC) die bij de naaldhouder (NH) wordt geleverd.
12. Verwijder de borgklem en de nylon ring (Figuur 2, f) van de manipulator. De borgklem en ring zijn ontworpen om alleen een glazen microcapillair vast te houden, ze zijn niet ontworpen om het extra gewicht van een microcapillaire houder, draadstang en luchttoevoerslang te dragen.
13. Knip een rechthoekig stuk rubberen verpakkingsvel van 1,5 cm x 2 cm af om de draadstang in de fietsspatbordklem te wikkelen. Dit zal helpen om de draadstang en naaldhouder steviger in de fietsspatbordklem te houden. Open met twee punttangen de clip van het fietsspatbord, vouw het rechthoekige stuk rubberen verpakkingsvel over de draadstang op 3.5 cm van het ene uiteinde van de stang zodat het een U over de stang vormt. Steek de met rubber beklede draadstang in de geopende fietsspatbordklem en gebruik de tang om de klem rond de stang en het rubberen vel te sluiten. Installeer de fietsklem en de draadstang op de manipulatorbout, vervang de bevestigingsklem zonder de nylon ring en draai de bevestigingsklem vast totdat deze de draadstang stevig vasthoudt.
14. Draai de naaldhouder op de draadstang. Zorg ervoor dat de luer-connector eindigt in een positie die de urethaanslang niet bindt wanneer deze is aangesloten (Figuur 2, g).
15. Sluit de vrouwelijke luer-connector aan op de mannelijke luer-connector (Figuur 2, g) van de naaldhouder (Figuur 2, d).
16. Sluit het vrije uiteinde van Figuur 1, sectie 1 buis aan op de luchttoevoer (deze aansluiting is afhankelijk van de gebruikte luchttoevoer). De luchttoevoer moet schone, droge lucht zijn en vrij van olieresten. De luchttoevoer kan afkomstig zijn van een huisluchtbron of een gasfles, perslucht of stikstof.

2. Afschuinen van borosilicaatnaalden

1. Trek micro-injectienaalden met behulp van microcapillairen van borosilicaatglas met de volgende instellingen op het instrument: Warmte: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, met Loop-tijd van 12.24.
2. Monteer het slijpsamenstel volgens de instructies van de fabrikant, bestaande uit de schuurplaat en de borgring met magneten¹².
   NOTITIE: De schuurplaat moet mogelijk worden omwikkeld met een dunne strook transparante film om voortijdige lekkage van Photo-Flo (bevochtigingsmiddel) van de schuurplaat te voorkomen. Dit is alleen nodig als de bevochtigingsmiddeloplossing voortijdig in de sokkelolie lekt, waardoor de slijpplaat niet meer draait. Het bevochtigingsmiddel vermindert het risico op droogsporen op de glasnaalden na het afschuinen. Het gebruik van een bevochtigingsmiddel is niet cruciaal voor het afschuinproces en kan water worden vervangen.
3. Plaats 10 druppels sokkelolie op het optisch vlakke oppervlak van de sokkel en plaats de slijpeenheid erop. Start de maaleenheid.
4. Zet de lichtbron aan om het oppervlak te verlichten. Zorg ervoor dat de lichtbron achter de afgeschuinde lamp wordt geplaatst en in een hoek van 45° ten opzichte van de schuurplaat en naald schijnt. De verlichtingshoek is nodig zodat een schaduw van de naald goed te zien is. Draai bij een vergroting van 90x de microscoopkop op zijn plaats. Stop het draaien van de schuurplaat kort en richt de microscoop op het oppervlak van de schuurplaat.
5. Voeg 1% bevochtigingsmiddel toe aan de lont totdat de lont helemaal nat is. Voeg 1% bevochtigingsmiddel toe aan het oppervlak van de schuurplaat. Zorg ervoor dat het bevochtigingsmiddel het schuuroppervlak bedekt, maar niet op de zwarte borgring lekt.
6. Plaats de voorbevochtigde lont op het oppervlak van de schuurplaat terwijl deze draait. Zorg ervoor dat de lont zich aan de linkerkant van de schuurplaat bevindt (als u van boven naar beneden kijkt) en zich uitstrekt van 11 uur tot 6 uur (met de plaat als wijzerplaat). Zorg ervoor dat de lont niet op het zwarte gedeelte van de borgring rijdt.
7. Steek een naald in de naaldhouder (Figuur 2, d) en draai de borgring vast om de naald op zijn plaats te houden. Open de regelaar (Figuur 1, R) en verhoog de druk tot 24 psi.
8. Til de naaldhouder op door aan de koersinstelknop te draaien (Figuur 2, a) Zorg ervoor dat de naald hoog genoeg is opgetild zodat deze hoger is dan het oppervlak van de roterende schuurplaat, draai vervolgens de hele manipulator zodat de naald op zijn plaats zwaait boven de roterende schuurplaat. De af te schuinen naald moet op de roterende schuurplaat worden geplaatst, zo gericht dat de rotatie van de plaat weg beweegt van de punt van de naald (Figuur 3A)
9. Kijk vanaf de zijkant en gebruik de grove instelknop (Figuur 2, a) om de naald in de richting van het oppervlak van de schuurplaat te laten zakken. Stop wanneer de naald bijna het oppervlak van de vloeistof raakt.
10. Gebruik de zoom om de vergroting van de microscoop te verlagen en verplaats de microscoop vervolgens zodat de naald zich in het midden van het gezichtsveld bevindt. Eenmaal in het midden van het beeld, verhoogt u de vergroting en past u de positie van de manipulator aan zodat de naaldpunt in het midden van het zicht blijft. Zodra de maximale vergroting is bereikt, stopt u de slijpplaat en richt u de microscoop op het oppervlak van de schuurplaat, en start u de rotatie van de plaat onmiddellijk opnieuw zodra het oppervlak scherp is. Het is mogelijk dat de naald op dit moment niet in het zicht is.
11. Gebruik de grove instelknop van de manipulator om de naald in de richting van de schuurplaat te laten zakken. In het gezichtsveld zal een afbeelding van de naald en een schaduw(en) van de naald zichtbaar zijn. Wanneer de naald en de schaduw(en) van de naald elkaar bijna raken, schakelt u over naar de fijnafstellingsknop van de manipulator en blijft u de naald laten zakken totdat de naald en zijn schaduw(en) elkaar lijken te raken. Lees nu de schuifmaat af (Figuur 2, c) en noteer de meting. Het oppervlak van de schuurplaat bevindt zich op of onder deze schuifmaat.
    NOTITIE: Het is moeilijk te zien wanneer de naald het oppervlak van de roterende schuurplaat raakt, dus het is mogelijk dat de naald de schuurplaat op dit moment niet echt raakt.
12. Laat de naald 5-10 s op dit niveau van schuifmaat blijven.
13. Til met behulp van de fijnafstellingsknop van de manipulator de naald op en zorg ervoor dat deze onder het oppervlak van het bevochtigingsmiddel blijft. Stop de rotatie van de schuurplaat gedurende enkele seconden en kijk of er luchtbellen uit de naaldpunt ontsnappen. Als er bubbels aanwezig zijn, ga dan verder met stap 2.15. Als er geen bubbels aanwezig zijn, ga dan verder met stap 2.14.
14. Verplaats de naald terug naar de remklauw met behulp van de fijnafstellingsknop van de manipulator, beweeg deze vervolgens iets lager en voer een nieuwe remklauwmeting uit, herhaal vervolgens stap 2.12-2.13.
15. Start de schuurplaat opnieuw om te zien of er luchtbelvorming waarneembaar is terwijl de plaat draait. Als er tijdens het draaien van de plaat bewijs is van luchtbelvorming, is de opening van de naaldpunt waarschijnlijk te groot voor micro-injecties van gevoelige embryo's, zoals injecties met muggenembryo's. Als de vorming van luchtbellen niet zichtbaar is tijdens het draaien van de schuurplaat, is de naaldopening ideaal voor gebruik bij procedures die een scherpe en kleine openingsnaald vereisen.
16. Gebruik de knop voor het aanpassen van het manipulatorverloop om de naald boven de schuurplaat op te tillen naar een positie die hoog genoeg boven de plaat is zodat de naald niets raakt terwijl de hele manipulator wordt gedraaid om de naald weg te bewegen van de schuurplaat en de microscoop.
17. Zodra de naald zich in een positie bevindt waarin deze kan worden verwijderd zonder iets te raken, verlaagt u de luchtdruk tot nul, verwijdert u de naald en plaatst u deze in een naaldopbergdoos (een petrischaal met dubbele plakband of boetseerklei om de afgeschuinde naalden vast te houden) tot gebruik.

3. Bepaling van de relatieve openingsgrootte van de afgeschuinde naald

OPMERKING: Het bepalen van de relatieve openingsmaten van de afgeschuinde naald gebeurt in stap 2.13. In de onderstaande stappen wordt dit proces verder beschreven.

1. Zodra in stap 2.13 luchtbellen worden waargenomen en de schuurplaat niet draait, verlaagt u langzaam de luchtdruk door aan de instelknop van de regelaar te draaien (Figuur 1, R) totdat er geen luchtbellen meer uit de punt van de naald stromen. Let op de druk waarbij de luchtbellen stoppen met stromen uit de punt.
2. Verhoog de luchtdruk totdat er weer belletjes uit de naaldpunt stromen. Hoe hoger de druk, hoe kleiner de opening van de naald.
3. Ga verder met het verplaatsen van de naald naar een positie waar deze veilig kan worden verwijderd, stappen 2.16-2.17.

Resultaten

De hierboven beschreven procedure produceert consistent scherpe micro-injectienaalden. Scherpe naalden worden gekenmerkt door het kunnen inbrengen in zachte chorion-insectenembryo's, zoals muggenembryo's, met weinig tot geen weerstand van het embryomembraan. Wanneer muggenembryo's worden geïnjecteerd voor genetische modificatie, is het embryomembraan relatief elastisch. Als u een botte naald tegen het embryomembraan duwt, zal deze inspringen (Figuur 4B). Wanneer de naald wordt teruggetrokken, krijgt het membraan zijn vorm terug. Met voldoende druk zal de botte naald uiteindelijk door het membraan scheuren en zal het embryoplasma waarschijnlijk weglekken. Hoe scherper de naald, hoe minder inkeping er optreedt als de naald tegen het embryomembraan wordt gedrukt (Figuur 4E). In plaats van in het membraan te scheuren, zal een scherpe naald door het membraan glippen, waardoor het embryo weinig tot geen schade oploopt. Met een ideale naald zal er bijna geen inkeping van het embryomembraan zijn als de naald in het embryo glijdt.

De University of Maryland Insect Transformation Facility (UM-ITF) is een servicefaciliteit die genetisch gemodificeerde insecten maakt voor klanten in de academische wereld en de industrie. De faciliteit maakt gebruik van afgeschuinde naalden voor de micro-injectie van muggenembryo's. In de periode tussen januari 2023 en december 2023 heeft de UM-ITF 12.795 Aedes-embryo's geïnjecteerd in 56 klantprojecten (tabel 1). Het gebruik van afgeschuinde naalden hielp de UM-ITF om een gemiddeld luik na injectie van 31% te behouden voor alle projecten (tabel 2). Bovendien was de UM-ITF in staat om een injectiesuccespercentage van 96% te behouden, zoals bepaald door follow-up na het project met klanten (tabel 2). Het succes van de injectie is een maat voor de vraag of de injectiematerialen (CRISPR-gidsen, Cas9-eiwit, transposon-vectorplasmiden, enz.) die zijn geïnjecteerd, in de embryo's van het project zijn afgeleverd op een manier waarop deze materialen in staat waren om een genetische modificatie te creëren, in feite was er bewijs van CRISPR Indel-creatie, invoeging van de op transposon gebaseerde vector van de klant of invoeging van een injectiekwaliteitscontrolevector (transposon eindigt met een promotor plus marker). Met andere woorden, waren de injecties goed genoeg om genetische modificatie te produceren, als de geïnjecteerde componenten goed werkten. Er zijn veel factoren die bijdragen aan het succes van een genetisch modificatieproject, en hoogwaardige micro-injecties met scherpe naalden zijn een sleutelfactor voor succes. Het afschuinen van naalden met behulp van de procedure die in het bovenstaande protocol wordt beschreven, stelt de UM-ITF in staat om consequent scherpe micro-injectienaalden van hoge kwaliteit te produceren, waardoor de UM-ITF consistent succesvolle injecties kan geven.

Figuur 1: Schematisch diagram van de componenten van het luchtsysteem en de aansluiting op het microcapillair. Lucht wordt via een systeem van urethaanbuizen uit een luchttoevoer (huislucht of luchtcilinder) naar de capillaire naald gevoerd. De urethaanslangen zijn verbonden met de regelaar (R) en manometer door middel van slangaansluitingen (HC), die bestaan uit een slangaansluiting en een slangklem. De slangaansluiting wordt in een 10-32 schroefdraad vrouwelijke aansluiting op de basis van de regelaar (R) en de manometer geschroefd. Een T-connector (T) wordt aangesloten op de regelaar (R) om lucht tussen de manometer en de naaldhouder (NH) te morsen. De urethaanslang is verbonden met de naaldhouder door middel van een luer-connector (LC) die bij de naaldhouder wordt geleverd (NH). De aansluiting op de luchttoevoer is afhankelijk van de gebruikte luchttoevoer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Manipulatoronderdelen en luchtopstelling. Manipulatoronderdelen: a. grove afstelknop, b. fijnafstelknop, c. schuifmaat, d. WPI-naaldhouder, e. hoekmeter, f. bevestigingsklem en fietsspatbordclip, g. luer-adapter en luer-slangaansluiting, en h. urethaanslang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 3: Plaatsing van de naald ten opzichte van de rotatie van de schuurplaat. (A) Juiste plaatsing van de naald tijdens het afschuinen. De af te schuinen naald moet op de roterende schuurplaat worden geplaatst, ergens loodrecht op de rotatie en in lijn met de rotatie, waar de rotatie weg beweegt van de punt van de naald. (B) Onjuiste plaatsing van de naald. Door de rotatie van de schuurplaat in deze richting wordt het oppervlak van de schuurplaat op de naaldpunt gedrukt in plaats van onder en voorbij de punt. In deze richting is het mogelijk dat de afschuining niet soepel verloopt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van het inbrengen van de naald door niet-scherpe en scherpe naalden. (A-C) niet-scherpe naald en (D-F) scherpe naald. (A) en (D) werden gevangen voordat de naald contact maakte met het embryo; (B) en (E) bevinden zich op het punt net voordat de naald het embryomembraan doorboort, en (C) en (F) bevinden zich net na de naaldpiercing. De witte pijl in (B) geeft aan dat het embryomembraan inspringt omdat er meer druk moet worden uitgeoefend om een niet-scherpe naald te doorboren. De zwarte pijl in (E) geeft aan dat er geen inkeping is omdat de naald gemakkelijk kan worden doorboord dankzij een scherpe naald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: UM-ITF Aedes-projecten van januari 2023 tot december 2023. Lijst van UM-ITF Aedes-microinjectieprojecten met het aantal geïnjecteerde embryo's voor elk project, het aantal larven dat uit deze geïnjecteerde embryo's is gekomen en het percentage larven dat is uitgekomen per geïnjecteerd embryo in totaal. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: De resultaten van het UM-ITF Aedes-project. De UM-ITF is een servicefaciliteit die micro-injectiediensten levert voor genetische modificatie van insecten. De tabel geeft een overzicht van het aantal Aedes-projecten dat van januari 2023 tot december 2023 door de ITF is geïnjecteerd. Het aantal klanten dat heeft gereageerd op verzoeken om projectopvolging waarbij het antwoord het succes of falen van het injectieproject aangaf. Het aantal succesvolle projecten, waarbij een succesvol project een project was waarbij de injectiematerialen op een tijdstip en op een locatie in het zich ontwikkelende embryo werden geïnjecteerd, zodat de injecties een genetische modificatie konden veroorzaken, en het aantal projecten dat als niet succesvol werd beschouwd vanwege het ontbreken van genetische modificatie. Het gemiddelde uitkomstpercentage voor Aedes-micro-injectieprojecten in de periode januari 2023 tot december 2023. Het slagingspercentage van het project en het responspercentage van de klant. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Genetische modificatie van muggen is gebaseerd op nauwkeurige micro-injectie van de modificatiematerialen (plasmiden, gids-RNA's of eiwitten) in pre-blastoderm-embryo's 3,4,5,6,7,8. Cruciaal voor dit proces zijn scherpe naalden die het embryo gemakkelijk doorboren tijdens de injectie ^2,4. Een scherpe naald kan door het membraan glippen, de modificatiematerialen afleveren en uit het embryo worden teruggetrokken zonder dat er iets van het embryoplasma weglekt op de injectieplaats na de micro-injectie (persoonlijke observatie).

Micro-injectienaalden zijn gesloten wanneer ze voor het eerst worden getrokken en moeten worden geopend vóór injectie². Traditioneel worden naalden voor micro-injectie geopend door de naald voorzichtig tegen iets te borstelen, zoals de rand van het dekglaasje of het glasplaatje dat de embryo's vasthoudt, tegen het embryo zelf of een ander materiaal². Het openen van de naald door deze tegen een object te borstelen, levert echter een inconsistent resultaat op (persoonlijke observatie). Soms breekt de naald op een manier waardoor hij scherp wordt, terwijl andere keren de naald erg bot wordt, wat, zoals eerder vermeld, de embryo's die worden geïnjecteerd kan beschadigen, waardoor ze niet worden gemodificeerd of, in het slechtste geval, het embryo doden. Als alternatief kunnen naalden ook worden geopend door de naald in een embryo te steken. Dit proces kan de naald openbreken, waardoor deze klaar is voor injectie. Het levert echter ook willekeurige resultaten op die af en toe een zeer scherpe naald creëren, maar vaker de naald verstoppen met embryomateriaal voordat deze voor injectie kan worden gebruikt. Hoewel het afschuinen van naalden extra tijd en moeite kost, produceert het proces consistenter scherpe naalden.

Genetische modificatie van muggen is ook een tijdsafhankelijk proces waarbij de embryo's moeten worden gemicro-injecteerd voordat het zich ontwikkelende embryo cellulariseert 4,5,6,7,8. Bij het openen van naalden door de naald ergens tegenaan te borstelen of door de naald in een embryo te steken, wordt de tijd die nodig is om een scherpe naald te openen en te vinden, genomen wanneer de embryo's al klaar zijn voor injectie en zich verder ontwikkelen. In het beste geval duurt het proces van het openen van een naald en het produceren van een scherpe naald slechts een minuut of twee, maar andere keren kan het lang genoeg duren dat de eieren die voor die injectieronde zijn opgesteld, te oud zijn tegen de tijd dat een goede naald wordt gemaakt. Het voordeel van afschuinen is dat het van tevoren wordt gedaan en dat de naalden klaar zijn voor gebruik zodra de embryo's klaar zijn voor injectie, zodat de embryo's zich in de perfecte ontwikkelingsfase voor injectie bevinden.

Hoewel het bovenstaande protocol is ontwikkeld voor en gebruik maakt van de Sutter BV-10 afschuiner, kan het protocol worden aangepast voor gebruik met elke afschuiner. De belangrijkste factor is dat het afschuinoppervlak een kleine hoeveelheid vloeistof moet kunnen bevatten waaronder de naald wordt afgeschuind.

Het afschuinen van naalden met micro-injectie terwijl een luchtbron perslucht naar de achterkant van de naald voert, heeft twee voordelen. Ten eerste helpt de luchtdruk om consistente naalden te produceren. Consistent scherpe naalden worden geproduceerd wanneer het afschuinproces wordt gestart bij dezelfde toegevoerde luchtdruk, en het afschuinen wordt gestopt wanneer er voor het eerst luchtbellen verschijnen. Het is van cruciaal belang dat om de eerste vorming van bellen te observeren, de schuurplaat tijdelijk moet worden gestopt, zodat het draaien van de schuurplaat de initiële luchtbelvorming niet maskeert. Als er alleen luchtbellen zichtbaar zijn als de schuurplaat in beweging is, kan de opening van de naald te groot zijn. Het is van cruciaal belang dat de druk van de toegevoerde lucht elke keer dat het afschuinen wordt gestart hetzelfde is, dat het afschuinen wordt gestopt zodra er luchtbellen beginnen te ontsnappen (gevisualiseerd wanneer de plaat niet in beweging is) en dat er geen luchtbellen zichtbaar zijn wanneer de plaat in beweging is. De openingsgrootte kan relatief worden gemeten door de druk van de toegevoerde lucht te verlagen totdat er geen luchtbellen meer uit de naaldpunt ontsnappen. Door de druk op te merken waarbij de bellen stoppen met stromen uit de punt, kan een relatieve openingsgrootte worden afgeleid. Hoe lager de druk waarbij de bellen stoppen met stromen, hoe groter de opening in de naaldpunt, en hoe hoger de druk, hoe kleiner de opening van de punt. Het kennen van de relatieve openingsgrootte kan nuttig zijn bij het gebruik van een injectiemix die stroperiger is en daarom meer kans heeft om de injectienaald te verstoppen. Door gebruik te maken van deze meting van de relatieve openingsgrootte kunnen naalden worden gemaakt die injectiemengsels met een hogere viscositeit kunnen leveren. Natuurlijk zijn er enkele compromissen gemaakt bij het gebruik van naalden met grotere openingsmaten. In het bijzonder is de kans groter dat geïnjecteerde embryo's na injectie lekken en kunnen de overlevingskansen voor geïnjecteerde embryo's lager zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope of gelijkwaardig
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamant slijpplaat - extra fijn (0,2 µ tot 1,0 µ puntgroottes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Wordt gebruikt om de verbinding te verzegelen op T  of L connectoren, indien niet al inbegrepen bij deze onderdelen
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Heeft 5 slangklemmen nodig
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Naaldhouder voor microcapillairen met een buitendiameter van 1 mm
P-2000	Sutter Instruments		Elke naaldtrekker
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	bevochtigingsmiddel
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi meter
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Heeft #10-32 poorten nodig voor verbindingen
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Ofwel een draadstaaf of staaf met draadverbinding. Draden moeten 10-32 zijn.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050