Dit protocol beschrijft de assemblage van een pneumatisch systeem voor de toevoer van perslucht naar een naald tijdens het proces van naaldafschuining. Het protocol beschrijft verder het afschuiningsproces voor het maken van scherpe micro-injectienaalden en hoe de relatieve openingsgrootte van de naald kan worden gemeten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Nat afschuinen van micro-injectienaalden met behulp van constante luchtdruk voor feedback over het openen van de naald
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Micro-injectienaalden zijn een cruciaal hulpmiddel bij de toediening van reagentia voor genoommodificatie, CRISPR-componenten (gids-RNA's, Cas9-eiwit en donorsjabloon) en transposonsysteemcomponenten (plasmiden en transposase-mRNA) in zich ontwikkelende insectenembryo's. Scherpe micro-injectienaalden zijn vooral belangrijk tijdens de toediening van deze modificerende middelen, omdat ze de schade aan het te injecteren embryo helpen minimaliseren, waardoor de overleving van deze embryo's wordt verhoogd in vergelijking met injectie met niet-afgeschuinde naalden. Verder produceert het afschuinen van naalden naalden die consistenter zijn van naald tot naald in vergelijking met naalden die worden geopend door de naaldpunt willekeurig te breken door de punt tegen een object te borstelen (zijkant van een dekglaasje, het oppervlak van het te injecteren embryo, enz.). Het proces van nat afschuinen van micro-injectienaalden met lucht onder constante druk die aan de naald wordt geleverd, stelt de persoon die de naald afschuint in staat om te weten wanneer de naald open is (aanwezigheid van luchtbellen) en geeft ook een relatieve indicatie van hoe groot een naaldopening is gemaakt. De relatieve openingsgrootte in de naald kan worden bepaald door de luchtdruk die aan de naald wordt geleverd aan te passen totdat een evenwicht is bereikt en er geen bellen meer uit de punt van de naald stromen. Hoe lager de druk waarbij het evenwicht wordt bereikt, hoe groter de naalddikte; En omgekeerd, hoe hoger de druk, hoe kleiner de naalddikte.
Inleiding
Genetische modificatie van insecten is een proces dat oorspronkelijk in Drosophila is ontwikkeld door Rubin en Spradling, en in de loop der jaren is dit proces gewijzigd om genetische modificaties in andere soorten te creëren1. Het proces is gebaseerd op de nauwkeurige afgifte van modificatiecomponenten die in embryo's worden micro-geïnjecteerd op een specifiek tijdsbestek en op een specifieke locatie in het zich ontwikkelende embryo 2,3,4. Scherpe micro-injectienaalden zijn een cruciaal hulpmiddel in het proces van genetische modificatie van sommige insecten, zoals muggen 4,5,6,7,8,9 en zandvliegen10, terwijl ze niet zo cruciaal zijn voor andere insecten, zoals zijderupsen 11. Scherpe naalden zijn vaak een sleutelfactor tussen succes en mislukking bij het maken van een genetisch gemodificeerd insect 2,4. Meestal worden microcapillaire glasnaalden getrokken door glas te verhitten tot het punt waarop het glas elastisch wordt, waardoor het capillair in een taps toelopende naald met gesloten punt kan worden getrokken. Voordat de naald kan worden gebruikt, moet deze zo worden geopend dat er een scherpe punt voor injectie ontstaat. Traditioneel worden naalden geopend door de punt van de naald voorzichtig tegen iets te borstelen (de rand van een glaasje/dekglaasje, of het embryo, enz.) waardoor een kleine hoeveelheid glas van de punt afbreekt, waardoor willekeurig een scherpe punt ontstaat 2,3. Een iets minder willekeurig proces is droog afschuinen, waarbij de naald snel gedurende een korte tijd op een optisch vlakke, draaiende schuurplaat wordt neergelaten, waardoor een kleine hoeveelheid glas van de naaldpunt wordt geschuurd, waardoor een scherpe punt ontstaat. Droog afschuinen is iets minder willekeurig dan de punt van de naald ergens tegenaan borstelen. Het hieronder beschreven protocol gaat nog een stap verder in het afschuinproces door perslucht toe te voeren aan de af te schuinen naald en deze onder een vloeistoflaag af te schuinen zodat er luchtbellen zichtbaar zijn zodra de naald is geopend. Dit protocol beschrijft een methode voor het produceren van betrouwbaar scherpe micro-injectienaalden. Afschuinen onder een vloeibare laag is een verbetering ten opzichte van het willekeurig breken van de naald zoals hierboven beschreven, en droog afschuinen omdat de gebruiker feedback krijgt over het afschuinproces, waardoor de persoon die afschuint weet wanneer de naald open is en relatief hoe groot de naaldopening is. Als u de relatieve openingsgrootte van de naaldpunt kent, kan de persoon die afschuint naalden met verschillende openingsmaten maken. Verschillende naaldopeningsmaten hebben verschillende voordelen; Grotere naaldopeningen zijn bijvoorbeeld geschikt voor injectiemengsels met een hoge viscositeit, terwijl kleinere openingsnaalden minder schade toebrengen aan het embryo dat wordt geïnjecteerd.
Lucht wordt naar de naald gevoerd met behulp van een regelaar en een systeem van urethaanslangen op basis van een gemodificeerd luchtdrukgeregeld injectiesysteem2. Terwijl lucht met een constante druk aan de naald wordt toegevoerd, wordt de naald afgeschuind onder een laag vloeistof. Het afschuinproces bestaat uit een herhaald proces in vijf stappen: 1) het laten zakken van de naald op het schuuroppervlak, 2) het laten afschuinen van de naald voor een korte periode, 3) het optillen van de naald weg van de schuurplaat terwijl deze onder het oppervlak van de vloeistoflaag wordt gehouden, 4) het stoppen van het draaien van de schuurplaat om te controleren op het verschijnen van luchtbellen. Als er geen bubbels aanwezig zijn, worden stap 1 tot en met 4 herhaald totdat er belletjes verschijnen; 5) Zodra er luchtbellen aanwezig zijn, kan de luchtdruk worden aangepast om de relatieve openingsgrootte van de naald te bepalen. Hoe lager de druk die nodig is om de vorming van luchtbellen te stoppen, hoe groter de opening bij de naaldpunt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Het protocol zoals hieronder beschreven maakt gebruik van de Sutter BV-10 microcapillair afgeschuind. Dit protocol kan echter worden aangepast voor gebruik met elk model microcapillair afgeschuind.
1. Montage van regelaar, manometer en luchttoevoerslang
- Snijd een stuk urethaanslang af voor de aansluiting van de luchttoevoer naar de basis van de regelaar (R; Deel 1, figuur 1). De lengte van dit gedeelte is afhankelijk van de afstand van de luchttoevoer tot de regelaar, die zich naast de afschuiner bevindt.
- Schuif een slangklem op de urethaanslang en duw vervolgens een slangconnector in het uiteinde van de slang. Zorg ervoor dat de slangaansluiting volledig is ingestoken door de slangaansluiting tegen een harde ondergrond te plaatsen. Terwijl u de slang dicht bij de slangaansluiting houdt, drukt u de slang stevig in de slang totdat de slangaansluiting volledig is ingestoken. De slangklem en de slangaansluiting vormen samen de verbinding HC (Figuur 1).
- Schuif de slangklem tot aan het uiteinde van de slang waar de slangaansluiting is ingebracht. Draai de slangklem over het ingestoken baarduiteinde zodat het een luchtdichte verbinding vormt.
- Schroef de slangaansluiting met de hand in de basis van de regelaar (R) en draai de verbinding vast met een kleine sleutel. Zorg ervoor dat de verbinding luchtdicht is, maar niet te strak.
- Schroef in de zijpoort van de regelaar met de hand een T-connector (T) vast en gebruik vervolgens een kleine sleutel om het vastdraaien te voltooien.
- Snijd een klein stukje urethaanslang (Figuur 1, sectie 2) van ongeveer 3-5 cm lang. Plaats twee slangklemmen op het stuk slang, steek vervolgens een slangconnector in elk uiteinde van de slang en werk de aansluitingen (HC) af zoals beschreven in stap 1.2-1.4 voor elk uiteinde van de buis.
- Schroef het ene uiteinde van de korte buis in de basis van de manometer en draai ze vast met een sleutel zoals in stap 1.5.
- Schroef het andere uiteinde van de korte buis in een van de poorten op de T-connector (T) die in stap 1.5 op de regelaar is aangesloten.
- Snijd een stuk urethaanslang af (Figuur 1, Sectie 3) voor de verbinding tussen de regelaar en de naaldhouder (NH). De grootte van dit gedeelte is afhankelijk van de afstand van de afschuiner tot de locatie van de regelaar.
- Plaats een slangklem op het slanggedeelte en plaats vervolgens een slangaansluiting zoals beschreven in stap 1.2-1.4.
- Plaats aan de andere kant van dit deel van de slang de vrouwelijke luer-connector (LC) die bij de naaldhouder (NH) wordt geleverd.
- Verwijder de borgklem en de nylon ring (Figuur 2, f) van de manipulator. De borgklem en ring zijn ontworpen om alleen een glazen microcapillair vast te houden, ze zijn niet ontworpen om het extra gewicht van een microcapillaire houder, draadstang en luchttoevoerslang te dragen.
- Knip een rechthoekig stuk rubberen verpakkingsvel van 1,5 cm x 2 cm af om de draadstang in de fietsspatbordklem te wikkelen. Dit zal helpen om de draadstang en naaldhouder steviger in de fietsspatbordklem te houden. Open met twee punttangen de clip van het fietsspatbord, vouw het rechthoekige stuk rubberen verpakkingsvel over de draadstang op 3.5 cm van het ene uiteinde van de stang zodat het een U over de stang vormt. Steek de met rubber beklede draadstang in de geopende fietsspatbordklem en gebruik de tang om de klem rond de stang en het rubberen vel te sluiten. Installeer de fietsklem en de draadstang op de manipulatorbout, vervang de bevestigingsklem zonder de nylon ring en draai de bevestigingsklem vast totdat deze de draadstang stevig vasthoudt.
- Draai de naaldhouder op de draadstang. Zorg ervoor dat de luer-connector eindigt in een positie die de urethaanslang niet bindt wanneer deze is aangesloten (Figuur 2, g).
- Sluit de vrouwelijke luer-connector aan op de mannelijke luer-connector (Figuur 2, g) van de naaldhouder (Figuur 2, d).
- Sluit het vrije uiteinde van Figuur 1, sectie 1 buis aan op de luchttoevoer (deze aansluiting is afhankelijk van de gebruikte luchttoevoer). De luchttoevoer moet schone, droge lucht zijn en vrij van olieresten. De luchttoevoer kan afkomstig zijn van een huisluchtbron of een gasfles, perslucht of stikstof.
2. Afschuinen van borosilicaatnaalden
- Trek micro-injectienaalden met behulp van microcapillairen van borosilicaatglas met de volgende instellingen op het instrument: Warmte: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, met Loop-tijd van 12.24.
- Monteer het slijpsamenstel volgens de instructies van de fabrikant, bestaande uit de schuurplaat en de borgring met magneten12.
NOTITIE: De schuurplaat moet mogelijk worden omwikkeld met een dunne strook transparante film om voortijdige lekkage van Photo-Flo (bevochtigingsmiddel) van de schuurplaat te voorkomen. Dit is alleen nodig als de bevochtigingsmiddeloplossing voortijdig in de sokkelolie lekt, waardoor de slijpplaat niet meer draait. Het bevochtigingsmiddel vermindert het risico op droogsporen op de glasnaalden na het afschuinen. Het gebruik van een bevochtigingsmiddel is niet cruciaal voor het afschuinproces en kan water worden vervangen. - Plaats 10 druppels sokkelolie op het optisch vlakke oppervlak van de sokkel en plaats de slijpeenheid erop. Start de maaleenheid.
- Zet de lichtbron aan om het oppervlak te verlichten. Zorg ervoor dat de lichtbron achter de afgeschuinde lamp wordt geplaatst en in een hoek van 45° ten opzichte van de schuurplaat en naald schijnt. De verlichtingshoek is nodig zodat een schaduw van de naald goed te zien is. Draai bij een vergroting van 90x de microscoopkop op zijn plaats. Stop het draaien van de schuurplaat kort en richt de microscoop op het oppervlak van de schuurplaat.
- Voeg 1% bevochtigingsmiddel toe aan de lont totdat de lont helemaal nat is. Voeg 1% bevochtigingsmiddel toe aan het oppervlak van de schuurplaat. Zorg ervoor dat het bevochtigingsmiddel het schuuroppervlak bedekt, maar niet op de zwarte borgring lekt.
- Plaats de voorbevochtigde lont op het oppervlak van de schuurplaat terwijl deze draait. Zorg ervoor dat de lont zich aan de linkerkant van de schuurplaat bevindt (als u van boven naar beneden kijkt) en zich uitstrekt van 11 uur tot 6 uur (met de plaat als wijzerplaat). Zorg ervoor dat de lont niet op het zwarte gedeelte van de borgring rijdt.
- Steek een naald in de naaldhouder (Figuur 2, d) en draai de borgring vast om de naald op zijn plaats te houden. Open de regelaar (Figuur 1, R) en verhoog de druk tot 24 psi.
- Til de naaldhouder op door aan de koersinstelknop te draaien (Figuur 2, a) Zorg ervoor dat de naald hoog genoeg is opgetild zodat deze hoger is dan het oppervlak van de roterende schuurplaat, draai vervolgens de hele manipulator zodat de naald op zijn plaats zwaait boven de roterende schuurplaat. De af te schuinen naald moet op de roterende schuurplaat worden geplaatst, zo gericht dat de rotatie van de plaat weg beweegt van de punt van de naald (Figuur 3A)
- Kijk vanaf de zijkant en gebruik de grove instelknop (Figuur 2, a) om de naald in de richting van het oppervlak van de schuurplaat te laten zakken. Stop wanneer de naald bijna het oppervlak van de vloeistof raakt.
- Gebruik de zoom om de vergroting van de microscoop te verlagen en verplaats de microscoop vervolgens zodat de naald zich in het midden van het gezichtsveld bevindt. Eenmaal in het midden van het beeld, verhoogt u de vergroting en past u de positie van de manipulator aan zodat de naaldpunt in het midden van het zicht blijft. Zodra de maximale vergroting is bereikt, stopt u de slijpplaat en richt u de microscoop op het oppervlak van de schuurplaat, en start u de rotatie van de plaat onmiddellijk opnieuw zodra het oppervlak scherp is. Het is mogelijk dat de naald op dit moment niet in het zicht is.
- Gebruik de grove instelknop van de manipulator om de naald in de richting van de schuurplaat te laten zakken. In het gezichtsveld zal een afbeelding van de naald en een schaduw(en) van de naald zichtbaar zijn. Wanneer de naald en de schaduw(en) van de naald elkaar bijna raken, schakelt u over naar de fijnafstellingsknop van de manipulator en blijft u de naald laten zakken totdat de naald en zijn schaduw(en) elkaar lijken te raken. Lees nu de schuifmaat af (Figuur 2, c) en noteer de meting. Het oppervlak van de schuurplaat bevindt zich op of onder deze schuifmaat.
NOTITIE: Het is moeilijk te zien wanneer de naald het oppervlak van de roterende schuurplaat raakt, dus het is mogelijk dat de naald de schuurplaat op dit moment niet echt raakt. - Laat de naald 5-10 s op dit niveau van schuifmaat blijven.
- Til met behulp van de fijnafstellingsknop van de manipulator de naald op en zorg ervoor dat deze onder het oppervlak van het bevochtigingsmiddel blijft. Stop de rotatie van de schuurplaat gedurende enkele seconden en kijk of er luchtbellen uit de naaldpunt ontsnappen. Als er bubbels aanwezig zijn, ga dan verder met stap 2.15. Als er geen bubbels aanwezig zijn, ga dan verder met stap 2.14.
- Verplaats de naald terug naar de remklauw met behulp van de fijnafstellingsknop van de manipulator, beweeg deze vervolgens iets lager en voer een nieuwe remklauwmeting uit, herhaal vervolgens stap 2.12-2.13.
- Start de schuurplaat opnieuw om te zien of er luchtbelvorming waarneembaar is terwijl de plaat draait. Als er tijdens het draaien van de plaat bewijs is van luchtbelvorming, is de opening van de naaldpunt waarschijnlijk te groot voor micro-injecties van gevoelige embryo's, zoals injecties met muggenembryo's. Als de vorming van luchtbellen niet zichtbaar is tijdens het draaien van de schuurplaat, is de naaldopening ideaal voor gebruik bij procedures die een scherpe en kleine openingsnaald vereisen.
- Gebruik de knop voor het aanpassen van het manipulatorverloop om de naald boven de schuurplaat op te tillen naar een positie die hoog genoeg boven de plaat is zodat de naald niets raakt terwijl de hele manipulator wordt gedraaid om de naald weg te bewegen van de schuurplaat en de microscoop.
- Zodra de naald zich in een positie bevindt waarin deze kan worden verwijderd zonder iets te raken, verlaagt u de luchtdruk tot nul, verwijdert u de naald en plaatst u deze in een naaldopbergdoos (een petrischaal met dubbele plakband of boetseerklei om de afgeschuinde naalden vast te houden) tot gebruik.
3. Bepaling van de relatieve openingsgrootte van de afgeschuinde naald
OPMERKING: Het bepalen van de relatieve openingsmaten van de afgeschuinde naald gebeurt in stap 2.13. In de onderstaande stappen wordt dit proces verder beschreven.
- Zodra in stap 2.13 luchtbellen worden waargenomen en de schuurplaat niet draait, verlaagt u langzaam de luchtdruk door aan de instelknop van de regelaar te draaien (Figuur 1, R) totdat er geen luchtbellen meer uit de punt van de naald stromen. Let op de druk waarbij de luchtbellen stoppen met stromen uit de punt.
- Verhoog de luchtdruk totdat er weer belletjes uit de naaldpunt stromen. Hoe hoger de druk, hoe kleiner de opening van de naald.
- Ga verder met het verplaatsen van de naald naar een positie waar deze veilig kan worden verwijderd, stappen 2.16-2.17.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hierboven beschreven procedure produceert consistent scherpe micro-injectienaalden. Scherpe naalden worden gekenmerkt door het kunnen inbrengen in zachte chorion-insectenembryo's, zoals muggenembryo's, met weinig tot geen weerstand van het embryomembraan. Wanneer muggenembryo's worden geïnjecteerd voor genetische modificatie, is het embryomembraan relatief elastisch. Als u een botte naald tegen het embryomembraan duwt, zal deze inspringen (Figuur 4B). Wan...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Genetische modificatie van muggen is gebaseerd op nauwkeurige micro-injectie van de modificatiematerialen (plasmiden, gids-RNA's of eiwitten) in pre-blastoderm-embryo's 3,4,5,6,7,8. Cruciaal voor dit proces zijn scherpe naalden die het embryo gemakkelijk doorboren tijdens de injectie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteur heeft niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteur wil graag de volgende mensen erkennen. Het personeel van de Insect Transformation Facility van de Universiteit van Maryland: Channa Aluvihare, Robert Alford en Daniel Gay. Zonder hun toegewijde werk zou de Insect Transformation Facility niet bestaan. Vanessa Meldener-Harrell voor het proeflezen van dit manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.0 mm O.D. microcapillaries | World Precision Instruments | ||
| Beveler pedestal oil | Sutter Instruments | 008 | |
| Bicycle fender clip | VeloOrange | R-clip 4-pack | https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack |
| Boom Stand Microscope | AmScope | AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope of gelijkwaardig | |
| BV-10 Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| Diamond abrasive plate | Sutter Instruments | 104F | Diamant slijpplaat - extra fijn (0,2 µ tot 1,0 µ puntgroottes) |
| Gasket, Buna-N | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 11761-2-pkg | Wordt gebruikt om de verbinding te verzegelen op T of L connectoren, indien niet al inbegrepen bij deze onderdelen |
| Hose Clamp | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 5000-2-pkg | |
| Hose connector | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | CT4-pkg | Heeft 5 slangklemmen nodig |
| Microinjection Needle Holder | World Precision Instruments | MPH3-10 | Naaldhouder voor microcapillairen met een buitendiameter van 1 mm |
| P-2000 | Sutter Instruments | Elke naaldtrekker | |
| Photo-Flo 200 Solution | B&H Photo, Video and Audio | BH #KOPF200P MFR #1464510 | bevochtigingsmiddel |
| Pressure Gauge | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | PG-100 | 0-100 psi meter |
| Reference wick | Sutter Instruments | X050300 | |
| Reference wick holder | Sutter Instruments | M100019 | |
| Regulator | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 01-Mar | Heeft #10-32 poorten nodig voor verbindingen |
| Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in | Danco | Model # 59849 | |
| T fitting | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 15002-2-pkg | |
| Threaded Bar | Ofwel een draadstaaf of staaf met draadverbinding. Draden moeten 10-32 zijn. | ||
| Urethane tubing | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | URH1-0804-BLT-050 |
Referenties
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. Transformation systems in insects. Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect Transgenesis: Methods and Applications. , CRC Press. Boca Rato. (2000).
- Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. Cold Spring Harbor Protocols. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).
- Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).
- Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).
- Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient. Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).
- Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution. Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major. mBio. 10 (4), e01941(2019).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).
- BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
