Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66771

⸱

3 mei 2024

 , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Samenvatting

In de afgelopen decennia heeft het verzamelde bewijs over het bestaan van respiratoire supercomplexen (SC's) ons begrip van de organisatie van de mitochondriale elektronentransportketen veranderd, wat aanleiding heeft gegeven tot het voorstel van het 'plasticiteitsmodel'. Dit model veronderstelt het naast elkaar bestaan van verschillende verhoudingen van SC's en complexen, afhankelijk van het weefsel of de cellulaire metabolische status. De dynamische aard van de assemblage in SC's zou cellen in staat stellen het gebruik van beschikbare brandstoffen en de efficiëntie van elektronenoverdracht te optimaliseren, waardoor de productie van reactieve zuurstofsoorten wordt geminimaliseerd en het vermogen van cellen om zich aan te passen aan veranderingen in de omgeving wordt bevorderd.

Meer recentelijk zijn afwijkingen in de SC-assemblage gemeld bij verschillende ziekten, zoals neurodegeneratieve aandoeningen (de ziekte van Alzheimer en Parkinson), het Barth-syndroom, het Leigh-syndroom of kanker. De rol van veranderingen in de SC-assemblage in de progressie van de ziekte moet nog worden bevestigd. Toch is de beschikbaarheid van voldoende hoeveelheden monsters om de SC-assemblagestatus te bepalen vaak een uitdaging. Dit gebeurt met biopsie of weefselmonsters die klein zijn of moeten worden verdeeld voor meerdere analyses, met celculturen die langzaam groeien of afkomstig zijn van microfluïdische apparaten, met sommige primaire culturen of zeldzame cellen, of wanneer het effect van bepaalde dure behandelingen moet worden geanalyseerd (met nanodeeltjes, zeer dure verbindingen, enz.). In deze gevallen is een efficiënte en gemakkelijk toe te passen methode vereist. Dit artikel presenteert een methode die is aangepast om verrijkte mitochondriale fracties te verkrijgen uit kleine hoeveelheden cellen of weefsels om de structuur en functie van mitochondriale SC's te analyseren door middel van natuurlijke elektroforese, gevolgd door in-gel activiteitstesten of western blot.

Inleiding

Supercomplexen (SC's) zijn supramoleculaire associaties tussen individuele respiratoire ketencomplexen 1,2. Sinds de eerste identificatie van SC's en de beschrijving van hun samenstelling door de groep van Schägger 2,3, later bevestigd door andere groepen, werd vastgesteld dat ze respiratoire complexen I, III en IV (respectievelijk Ci, CIII en CIV) bevatten in verschillende stoichiometrieën. Er kunnen twee hoofdpopulaties van SC's worden gedefinieerd, die met CI (en ofwel CIII alleen of CIII en CIV) en met een zeer hoog moleculair gewicht (MW, beginnend met ~1,5 MDa voor de kleinere SC: CI + CIII2) en die met CIII en CIV maar niet met CI, met een veel kleinere omvang (zoals CIII2 + CIV met ~680 kDa). Deze SC's bestaan naast elkaar in het binnenste mitochondriale membraan met vrije complexen, ook in verschillende verhoudingen. Dus, terwijl CI meestal wordt aangetroffen in de geassocieerde vormen (dat wil zeggen, in SC's: ~80% in runderhart en meer dan 90% in veel menselijke celtypen)3, is CIV zeer overvloedig in zijn vrije vorm (meer dan 80% in runderhart), waarbij CIII een meer evenwichtige verdeling vertoont (~40% in zijn meer overvloedige vrije vorm, als een dimeer, in runderhart).

Hoewel hun bestaan nu algemeen wordt aanvaard, staat hun precieze rol nog ter discussie 4,5,6,7,8,9,10. Volgens het plasticiteitsmodel kunnen er verschillende verhoudingen van SC's en individuele complexen bestaan, afhankelijk van het celtype of de metabole status 1,7,11. Deze dynamische aard van de assemblage zou cellen in staat stellen het gebruik van beschikbare brandstoffen en de efficiëntie van het oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS) te reguleren als reactie op veranderingen in het milieu 4,5,7. SC's kunnen ook bijdragen aan het beheersen van de generatiesnelheid van reactieve zuurstofsoorten en deelnemen aan de stabilisatie en omzet van individuele complexen 4,12,13,14. Veranderingen van de SC-assemblagestatus zijn beschreven in verband met verschillende fysiologische en pathologische situaties15,16 en met het verouderingsproces17.

Zo zijn er veranderingen in de SC-patronen beschreven in gist, afhankelijk van de koolstofbron die wordt gebruikt voor groei2 en in gekweekte zoogdiercellen wanneer glucose wordt vervangen door galactose4. Modificaties zijn ook gemeld in de lever van muizen na vasten8 en in astrocyten wanneer de oxidatie van mitochondriale vetzuren wordt geblokkeerd18. Daarnaast zijn er een afname of veranderingen in SC's en OXPHOS gevonden bij Barth-syndroom19, hartfalen20, verschillende metabole21 en neurologische 22,23,24 aandoeningen en verschillende tumoren 25,26,27,28. Of deze veranderingen in de samenstelling en niveaus van SC een primaire oorzaak zijn of secundaire effecten vertegenwoordigen in deze pathologische situaties, wordt nog onderzocht15,16. Verschillende methodologieën kunnen informatie geven over de samenstelling en functie van SC's; Deze omvatten activiteitsmetingen 8,29, ultrastructurele analyse30,31 en proteomics 32,33. Een bruikbaar alternatief dat steeds vaker wordt gebruikt en het uitgangspunt vormt voor enkele van de eerder genoemde methodologieën, is de directe bepaling van de SC-assemblagestatus door middel van Blue native (BN) elektroforese die voor dit doel is ontwikkeld door Schäggers groep34,35.

Deze aanpak vereist reproduceerbare en efficiënte procedures om mitochondriale membranen te verkrijgen en op te lossen en kan worden aangevuld met andere technieken zoals in-gel activiteitsanalyse (IGA), tweede-dimensie elektroforese en western blot (WB). Een beperking in de studies naar SC-dynamica door BN-elektroforese kan de hoeveelheid startcellen of weefselmonsters zijn. We presenteren een reeks protocollen voor de analyse van de assemblage en functie van SC, aangepast aan de groepsmethoden van Schägger, die kunnen worden toegepast op verse of bevroren cel- of weefselmonsters vanaf slechts 20 mg weefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: De samenstelling van alle kweekmedia en buffers is gespecificeerd in Tabel 1 en details met betrekking tot alle materialen en reagentia die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Isolatie van mitochondriën uit celcultuur

OPMERKING: Het minimale volume van de geteste cellen was ~30-50 μL verpakte cellen (stap 1.4). Dit kan ongeveer overeenkomen met ten minste twee of drie celkweekplaten van 100 mm of met één plaat van 150 mm op 80-90% van de samenvloeiing, afhankelijk van het celtype (tussen 5 × 106 en 107 cellen in van L929 afgeleide cellen of MDA-MB-468). Efficiënte celbreuk is een cruciale stap.

  1. Kweek aanhangende cellen tot ongeveer 80% samenvloeiing of gesuspendeerde cellen tot een adequate dichtheid.
  2. Oogst cellen door centrifugatie bij 500 × g gedurende 5 minuten (rechtstreeks uit de celsuspensie in het geval van niet-hechtende cellen of na standaard trypsinisatie met een trypsine-EDTA-oplossing van 0,05% trypsine en 0,02% EDTA in 1x PBS, in het geval van aanhangende cellen).
  3. Was de cellen 2x koud 1x PBS en bezink ze door centrifugeren bij 500 × g gedurende 5 min.
    OPMERKING: Vanaf dit punt moeten alle stappen worden uitgevoerd bij 4 °C. Daarom moeten alle reagentia koud zijn en moeten de buisjes met cellen of mitochondriën op ijs worden bewaard.
  4. Gooi na de tweede centrifugatie het supernatant weg, schat het volume van de celpellets (cpv) en vries de cellen in bij -80 °C gedurende ten minste 15 minuten om het breken van het membraan in stap 1.8 te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gestopt en de cellen kunnen wekenlang bij -80 °C worden bewaard. Gewoonlijk zijn maatbuizen van 10 of 15 ml met conische bodem geschikt.
  5. Laat de cellen langzaam ontdooien op ijs.
  6. Resuspendeer de verpakte celpellet in een volume hypotone buffer gelijk aan 7x de cpv (10 mM MOPS, 83 mM sucrose, pH 7,2) (bijv. 100 μL verpakte cellen in 700 μL buffer).
    OPMERKING: Het volume moet voldoende zijn om efficiënte ploffingen te verkrijgen (zie OPMERKING bij stap 1.8).
  7. Breng de celsuspensie over in een Potter-Dounce-homogenisator van de juiste grootte en laat de cellen opzwellen door ze 2 minuten in ijs te incuberen. Voor een volume van 700-800 μL celsuspensie is bijvoorbeeld een homogenisator met een capaciteit van 1 ml voldoende.
  8. Breek de celmembranen door acht tot tien slagen uit te voeren in de homogenisator die is gekoppeld aan een motoraangedreven teflonstamper die met 600 tpm draait.
    OPMERKING: Bij het maken van de streken is het belangrijk om een vacuüm te creëren dat de efficiëntie van de celbreuk verhoogt, samen met de hypotone en bevriezingsacties voor respectievelijk zwelling en fragilisatie van de membranen. Als het goed is gedaan, is er een "plop" -geluid te horen wanneer u de homogenisator met een snelle beweging bij elke beweging naar beneden trekt.
  9. Voeg hetzelfde volume hypertone buffer toe aan de celsuspensie (7x de cpv) (30 mM MOPS, 250 mM sucrose, pH 7,2) om een isotone omgeving te genereren.
  10. Breng het homogenaat over in een buis van 10-15 ml en centrifugeer in een vaste rotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: De originele buis met de ongebroken cellen kan voor dit doel worden gebruikt.
  11. Breng het supernatant, dat de mitochondriale fractie bevat, over in polypropyleen buizen van 1,5 ml.
  12. OPTIONEEL: Om de opbrengst van mitochondriën te verhogen, resuspendeert u de pellet vanaf stap 1.10 in 7x het celpelletvolume van buffer A (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M sucrose, pH 7.4) door op en neer te pipetteren en centrifugeert bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Combineer het nieuwe supernatans met het vorige voordat u doorgaat naar stap 1.13.
  13. Centrifugeer in een microfuge bij 16.000 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C om de mitochondriale ruwe fractie op te vangen.
  14. Gooi het supernatans weg en resuspendeer elke met mitochondriën verrijkte pellet met 0,5 ml buffer A, waarbij de inhoud van twee buisjes wordt gecombineerd tot één, en centrifugeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 1.13. Herhaal hetzelfde proces totdat al het materiaal in slechts één buis zit.
  15. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de uiteindelijke pellet met 300 μL buffer A en kwantificeer de mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Centrifugeer opnieuw zoals eerder en ga verder met sectie 3.

2. Isolatie van mitochondriën uit kleine hoeveelheden dierlijk weefsel

OPMERKING: De minimale hoeveelheid weefsel om dit protocol met een zekere zekerheid toe te passen, hangt af van het celtype en de mitochondriale abundantie, maar kan in de meeste gevallen ~20-30 mg weefsel zijn. De weefselmonsters kunnen vers materiaal of bevroren monsters zijn. In het laatste geval laat u de monsters ontdooien in een homogenisatiebuffer die op ijs is geplaatst voordat u met de procedure begint.

  1. Weeg of schat de hoeveelheid (mg) weefsel zo nauwkeurig mogelijk.
  2. Knip het weefsel af met een schaar en maak 3-4 wasbeurten in homogenisatiebuffer met behulp van een zeef, waarbij u ervoor zorgt dat de kleinere stukjes niet verloren gaan.
    OPMERKING: Deze stap is belangrijker in weefsels zoals skeletspieren of hart dan in de hersenen of zachtere weefsels waarvan de cellen gemakkelijk direct kunnen worden gedesaggregeerd door de homogenisatiestap.
  3. Voeg vers homogenisatiemedium toe (4 ml per gram lever, 10 ml per gram hart, bruin vetweefsel (BAT) of spier, en 5 ml per gram hersenen of nier; zie de specifieke buffersamenstelling voor elk geval in tabel 1).
  4. Breng de stukjes weefsel met buffer over naar de homogenisator en volg het optimale homogenisatie- en mitochondriënisolatieprotocol, afhankelijk van het geselecteerde weefsel.
  5. Isolatie van mitochondriën uit lever, milt en nieren
    1. Homogeniseer met vier tot zes op- en neergaande slagen in de Elvehjem-Potter met een motoraangedreven teflonstamper op 600 tpm.
    2. Breng het gehomogeniseerde weefsel over in een steriele centrifugebuis. Centrifugeer in een zwenkbare rotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    3. Vul 1,5 ml polypropyleen buisjes met het supernatans dat in de vorige stap is verkregen. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 16.000 × g in een microfuge bij 4 °C en ga hierna te werk zoals eerder beschreven (stappen 1.13 tot en met 1.15)
  6. Isolatie van mitochondriën uit hart- en spiermonsters
    1. Homogeniseer met zes tot acht slagen in de Elvehjem-Potter met een motoraangedreven teflonstamper op 600 tpm. Breng het gehomogeniseerde weefsel over in een steriele centrifugebuis.
    2. Centrifugeer in een zwenkbare rotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Giet het supernatans in schone polypropyleen buizen van 1,5 ml.
      OPMERKING: Een tweede homogenisatie van de pellet verkregen in stap 2.6.2 kan worden uitgevoerd met 4-5 extra slagen en 1/2 volume homogenisatiebuffer om de mitochondriale opbrengst te verhogen. Het nieuwe supernatans (na centrifugeren opnieuw bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C) kan worden gecombineerd met het vorige voordat overgaat tot stap 2.6.3. Een alternatief om de opbrengst van ruwe mitochondriën te verhogen, is het dissociëren van hart- en spierweefselmonsters in trypsineoplossing vóór homogenisatie36,37. In dit geval moet de trypsine efficiënt worden geïnactiveerd/verwijderd voordat de mitochondriale membranen worden opgelost met digitonine (stap 3.2).
    3. Centrifugeer bij 16.000 × g in een microfuge gedurende 2 minuten bij 4 °C om de ruwe mitochondriale fractie te verkrijgen.
    4. Gooi het supernatans weg en resuspendeer elke met mitochondriën verrijkte pellet met 0,5 ml buffer AT, waarbij de inhoud van twee buisjes wordt gecombineerd tot één, en centrifugeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.6.3. Herhaal hetzelfde proces totdat al het materiaal in slechts één buis zit.
    5. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de uiteindelijke pellet met 300 μL buffer A (geen BSA) en kwantificeer de mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Centrifugeer opnieuw zoals eerder en ga verder met sectie 3.
  7. Isolatie van mitochondriën uit de hersenen
    1. Homogeniseer de stukjes hersenen met 10-15 slagen met behulp van een Dounce-type glashomogenisator met een handmatig aangedreven glazen stamper. Breng het gehomogeniseerde weefsel over in een steriele centrifugebuis.
    2. Centrifugeer in een zwenkbare rotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    3. Vang het supernatans op in een schone centrifugebuis.
    4. Resuspendeer de pellet die in de vorige centrifugatiestap is verkregen in hetzelfde volume medium AT dat bij de eerste homogenisatie is gebruikt. Homogeniseer de pellet opnieuw door het in stap 2.7.1 beschreven proces te herhalen met behulp van 5-10 gangen en centrifugeer de suspensie in een zwenkrotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    5. Verwijder het supernatans en voeg het toe aan de in stap 2.7.3 voorbereide buis. Centrifugeer bij 10.000 × g in een rotor met vaste hoek gedurende 10 minuten bij 4 °C om de ruwe mitochondriale fractie te verkrijgen.
    6. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 1/2 van het oorspronkelijke homogenisatievolume (stap 2.7.1) van medium AT. Verdeel de mitochondriale suspensie in schone polypropyleen buisjes van 1,5 ml en centrifugeer bij 16.000 × g in een microfuge gedurende 2 minuten bij 4 °C.
    7. Gooi het supernatans weg en resuspendeer elke met mitochondriën verrijkte pellet met 0,5 ml buffer AT, waarbij de inhoud van twee buisjes wordt gecombineerd tot één, en centrifugeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.7.6. Herhaal hetzelfde proces totdat al het materiaal in slechts één buis zit.
    8. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de uiteindelijke pellet met 300 μL buffer A (geen BSA) en kwantificeer de mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Centrifugeer opnieuw zoals eerder en ga verder met sectie 3.
  8. Isolatie van mitochondriën uit BAT
    1. Homogeniseer met acht tot tien op-en-neergaande bewegingen in de Elvehjem-Potter met een motoraangedreven teflonstamper op 600 tpm. Breng het gehomogeniseerde weefsel over in een steriele centrifugebuis.
    2. Centrifugeer in een zwenkbare rotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    3. Vul polypropyleen buisjes van 1,5 ml met het supernatans dat in de vorige stap is verkregen, vermijd de bovenste vetlaag.
      OPMERKING: Een tweede homogenisatie van de pellet verkregen in stap 2.8.2 kan worden uitgevoerd om de mitochondriale opbrengst te verhogen. Het nieuwe supernatans (na centrifugeren opnieuw bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C) kan worden gecombineerd met het vorige voordat overgaat tot stap 2.8.4.
    4. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 16.000 × g gedurende 2 minuten in een microfuge bij 4 °C.
    5. Gooi het supernatans weg en resuspendeer elke met mitochondriën verrijkte pellet met 0,5 ml buffer AT2, waarbij de inhoud van twee buisjes tot één wordt gecombineerd, en centrifugeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.8.4. Herhaal hetzelfde proces totdat al het materiaal in slechts één buis zit.
    6. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de uiteindelijke pellet met 300 μL buffer A (geen BSA) en kwantificeer de mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Centrifugeer opnieuw zoals eerder en ga verder met sectie 3.

3. Voorbereiding van monsters voor Blue Native-analyse

  1. Resuspendeer de mitochondriale fracties (verkregen uit zoogdiercelculturen of weefsels) in BN-monsterbuffer (50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 5 mM Aminocapronzuur, 4 mM PMSF) om een eiwitconcentratie van ongeveer 10 mg/ml te verkrijgen. Zie tabel 2 voor de verwachte opbrengsten voor de verschillende soorten monsters.
  2. Los mitochondriale membranen op door digitonine (10% stockoplossing) toe te voegen om een verhouding van 4 g digitonine/g mitochondriaal eiwit te verkrijgen (4 μL digitonine, 10% bouillon voor 10 μL van de mitochondriale suspensie bereid in stap 3.1).
    OPMERKING: De detergent-eiwitverhouding (g/g) moet voor elk type monster worden geoptimaliseerd om reproduceerbare resultaten te verkrijgen; 2-8 g digitonine/g mitochondriaal eiwit bleek optimaal te zijn voor de meeste weefsels34,35.
  3. Meng door zachtjes op en neer te pipetteren. Incubeer monsters op ijs gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Na deze stap zou de mitochondriale suspensie helderder moeten worden (verschuiving van ondoorzichtig naar doorschijnend); Anders zou het erop kunnen wijzen dat de hoeveelheid wasmiddel onvoldoende is voor een correcte membraanoplosbaarheid.
  4. Centrifugeer op volle snelheid in een microfuge (ongeveer 20.000 × g ) gedurende 25 minuten bij 4 °C om onoplosbaar materiaal te verwijderen.
  5. Vang het supernatans op in een verse tube. Voeg aan het supernatans een volume van 5% G-250 (Coomassie Blue G-250 5% in 0,75 M aminocapronzuur) toe, overeenkomend met 1/3 van het initiële volume resuspensie (stap 3.1, dit komt overeen met een eindverhouding van 1,6 g Coomassie/g eiwit) en meng door pipetteren.
  6. Bewaar op ijs voordat u de gel laadt of vries aliquots in bij -80 °C.

4. Blauwe inheemse gelelektroforese

OPMERKING: De elektroforese wordt uitgevoerd in de koelcel (4-8 °C). Als er geen koelruimte is, kan een koelblok in de elektroforesetank worden ingebracht. Commerciële 3-13% natuurlijke polyacrylamidegels29 worden gebruikt, maar zelfgemaakte gels met de gewenste gradiëntconcentraties kunnen ook worden gebruikt38,39.

  1. Belast de bovenste en onderste kamers met respectievelijk de koude kathode A en anodebuffers. U kunt de monsters ook in de putjes laden voordat u de bovenste kamer voorzichtig vult met kathodebuffer A.
    OPMERKING: In ons laboratorium worden commerciële elektroforesebuffers gebruikt, maar ze kunnen worden bereid zoals aangegeven in Tabel 1.
  2. Laad tussen 30 en 100 μg mitochondriaal eiwit.
    OPMERKING: Gewoonlijk wordt 30-50 μg eiwit (voor WB) of 40-100 μg eiwit (voor IGA) per putje geladen in een gel van 10 banen (putjes van 0,5 x 0,15 cm). Kathode A-buffer bevat Coomassie Blue G-250 en heeft een intens blauwe kleur waardoor het moeilijk is om de gelputjes te zien voor het laden van monsters. Het is handig om het midden van elk putje te markeren, bijvoorbeeld met een rode stift om te helpen bij het plaatsen van de pipetpunt tijdens deze stap. Native molecuulgewichtmarkers kunnen nuttig zijn bij het opzetten van de BN-PAGE-techniek om te bevestigen dat de gradiëntgels correct zijn gevormd en dat het patroon van de complexen en SC's het juiste is.
  3. Draai op 80-100 V gedurende 25-30 minuten en vervolgens op 160-180 V, beperk de stroom tot 12 mA/gel, totdat de kleurstof de bodem van de gel bereikt (~125-165 min in totaal).
  4. Als in-gel activiteitstesten (IGA's) moeten worden uitgevoerd, vervang dan de kathodebuffer A door kathodebuffer B wanneer het kleurstoffront zich in het midden van de gel bevindt (~1 uur na het begin van de run).
    OPMERKING: Hoewel de gels zonder enige kleuring kunnen worden gedocumenteerd net na de run, aangezien sommige banden zichtbaar zijn (voornamelijk complexe V, die kan worden beschouwd als een "interne" maker met een MW van ~600 kDa) vanwege hun binding aan G-250-kleurstof, zullen SC's en individuele complexen meestal niet zichtbaar zijn zonder kleuring of IGA-tests. De gels die worden gebruikt in IGA-assays of voor WB mogen niet worden gekleurd of gefixeerd.
  5. Haal de gel uit de cassette en ga verder met Coomassie blauwkleuring (sectie 5), IGA-analyse (sectie 6) of WB-immunodetectie (sectie 7).

5. Gel kleuring

  1. Kleuring van de gel gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur (RT) met behulp van Coomassie blauwe kleurstofoplossingen (Coomassie kleurstof R-250 op 0,25% in 40% methanol, 10% azijnzuur; kleuring gedurende 10-15 min).
  2. Ontkleuring met meerdere wasbeurten (meestal 4-5 x 15 minuten) in 40% methanol plus 10% azijnzuur bij RT.
  3. Documenteer de gel.

6. In gel-activiteit (IGA) testen

  1. Bereid IGA-oplossingen voor voor de analyse van de verschillende ademhalingscomplexen vóór het einde van de elektroforese en houd ze in het donker (door bijvoorbeeld donkergekleurde plastic dozen te gebruiken of ze af te dekken met aluminiumfolie). De samenstelling van elke buffer is gedetailleerd weergegeven in tabel 1.
  2. Plaats de gel of de te gebruiken banen in een plastic doos die zo klein mogelijk is om er plaats in te bieden.
  3. Voeg voldoende volume van de juiste oplossing toe om de gel te bedekken (meestal 5 of 10 ml voor respectievelijk 5 of 10 gelbanen) en incubeer bij RT met zacht schudden (60-80 tpm) en uit de buurt van licht.
    OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van het te analyseren complex en van de aard en hoeveelheid van het geladen monster; CI en CIV zijn het gemakkelijkst en snelst te geven resultaten. CI-activiteit zal dus meestal na een paar minuten zichtbaar worden, terwijl CII en CIV ~30 minuten nodig hebben om te worden geobserveerd en CV ~1,5-2 uur. De reactie kan in alle gevallen uren duren en de snelheid van signaalintensivering kan worden verminderd door de incubatie te verplaatsen naar een koude ruimte (4-6 °C), bijvoorbeeld voor een nachtelijke (AAN) incubatie. CIII-activiteit werkt alleen voor heldere natuurlijke elektroforese (CN), niet voor BN34.
  4. Wanneer de juiste banden zich hebben ontwikkeld, stop dan de reacties door de analyseoplossingen te verwijderen, 2x te wassen met gedestilleerd water en de gel te fixeren met 40% methanol plus 10% azijnzuur (behalve CV dat alleen met methanol wordt gefixeerd) gedurende 30 minuten.
    1. Om de CIV-activiteit na CI-detectie door IGA te analyseren, wast u de gel 2x met gedestilleerd water, documenteert u de CI-activiteit, incubeert u de gel (zonder hem te fixeren!) met 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,2) 2x gedurende 30 minuten, en vervolgens met de volledige CIV-reactiebuffer totdat de complexe IV-banden verschijnen (meestal door AAN te incuberen bij RT of 4 °C).
  5. Documenteer de gels.
    OPMERKING: Voor ATPase-activiteit, aangezien de ontwikkelde banden wit zijn, plaatst u deze bij het documenteren van de gel op een donkere achtergrond zodat de heldere banden zichtbaar zijn.

7. Analyse van de westerse blot

  1. Bereid de transferbuffer voor volgens tabel 1 en houd deze op 4 °C tot het einde van de elektroforese.
  2. Doe de gel in een bakje en voeg de transferbuffer toe. Incubeer bij RT gedurende 10-15 minuten.
  3. Snijd een stuk PVDF-membraan van dezelfde grootte als de gel en activeer het in methanol gedurende 10 s onder roeren. Was meerdere keren met gedestilleerd water en voeg transferbuffer toe. Incubeer bij RT gedurende 10-15 minuten met zacht schudden.
  4. Bereid de transfersandwich van onder naar boven voor, vermijd luchtbellen tussen de gel en het membraan, in de volgende volgorde: zwarte kant van cassette-spons-blotting paper-gel-membraan-blotting paper- spons-doorzichtige kant van de cassette.
  5. Sluit en vergrendel de cassette en plaats de sandwich in de transfertank in de juiste richting voor overdracht (zwarte kant naar de minpool).
  6. Vul de transfertank met transferbuffer, voeg een magnetische roerder toe om de buffer te roeren en sluit de voeding aan op 80 V gedurende 2 uur of op 100 V gedurende 1 uur. Voer de overdracht uit tussen 4 en 8 °C (bijvoorbeeld in de koelcel) en met een koelblok in het overdrachtssysteem.
  7. Haal het membraan op en ga verder met een standaard western blot-protocol, met behulp van specifieke antilichamen voor de verschillende te detecteren ademhalingscomplexen29.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De opbrengsten van mitochondriën verkregen volgens de hierboven beschreven protocollen variëren afhankelijk van verschillende factoren, zoals de cellijn of het weefseltype, de aard van de monsters (d.w.z. of verse of bevroren weefsels worden gebruikt) of de efficiëntie van het homogenisatieproces. Verwachte opbrengsten van mitochondriën uit verschillende cellijnen en weefsels zijn verzameld in Tabel 2. Zodra de mitochondriale fracties zijn verkregen, is de volgende stap de analyse van het respiratoire SC...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De methodologische aanpassingen die in de hier beschreven protocollen zijn geïntroduceerd, zijn bedoeld om verliezen te voorkomen en de opbrengst te verhogen met behoud van mitochondriale complexe activiteiten (wat cruciaal is wanneer de beschikbaarheid van voldoende hoeveelheden monsters in het gedrang komt) en om het verwachte patroon van SC's van het weefsel of de cellijn te reproduceren (zie figuur 2C). Met dit doel en aangezien een hoge mitochondriale zuiverheid niet vereist is om de SC...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidienummer "PGC2018-095795-B-I00" van het Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) en door subsidies "Grupo de Referencia: E35_17R" en subsidienummer "LMP220_21" van Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) aan PF-S en RM-L.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AzijnzuurPanReac131008
AminocapronzuurFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Organics327721000
Bradford assayBiorad5000002
Coomassie Blauw G-250Serva17524
Coomassie Blauw R-250Merck1125530025
Cytochroom cSigma-AldrichC2506
Diamino  benzeen (DAB)Sigma-AldrichD5637
DigitonineSigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
Vrije vetzuren BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
Homogenisator Teflon stamperDeltalab196102
ImidazoolSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitolSigma-AldrichM4125
MethanolLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 Monoklonaal AntilichaamInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 tot 12% Mini Eiwit GelsInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Kathode Buffer Additief (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Loop Buffer (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 Monoklonaal AntilichaamInvitrogen459100
Nitroblauw tetrazoliümzout (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF MembraanAmersham10600023
Fenazine methazulfaat (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL SubstraatThermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA Monoklonaal AntilichaamInvitrogen459200
NatriumsuccinaatSigma-AldrichS2378
Streptomycine/penicillinePAN biotechP06-07100
SucroseSigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 Monoklonaal AntilichaamInvitrogen459140
XCell  SureLock Mini-CellInvitrogen EI0001

Referenties

  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  3. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  4. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  5. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  6. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  7. Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).
  10. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  11. Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. Clinical Bioenergetics. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).
  12. Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
  13. Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
  14. Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
  15. Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
  16. Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242(2021).
  17. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
  18. Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
  19. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
  20. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  21. Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).
  22. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  23. Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).
  24. Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
  25. Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).
  26. Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).
  27. Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).
  28. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).
  29. Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
  30. Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
  31. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  32. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  33. Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
  35. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  36. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452(2011).
  37. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  38. Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
  41. Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
  42. Celis, J. E. Cell Biology (Third Edition). , Academic Press. 69-77 (2006).
  43. Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Isolatie van mitochondriënmitochondriale supercomplexenblue native elektroforesekleine weefselmonstersmitochondriën uit celculturenassemblage van supercomplexenin-gel activiteitsmetingkwantificering van mitochondriale eiwittenelektronentransportketenrespiratoire supercomplexen
Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.