Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters

Summary

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Abstract

In de afgelopen decennia heeft het verzamelde bewijs over het bestaan van respiratoire supercomplexen (SC's) ons begrip van de organisatie van de mitochondriale elektronentransportketen veranderd, wat aanleiding heeft gegeven tot het voorstel van het 'plasticiteitsmodel'. Dit model veronderstelt het naast elkaar bestaan van verschillende verhoudingen van SC's en complexen, afhankelijk van het weefsel of de cellulaire metabolische status. De dynamische aard van de assemblage in SC's zou cellen in staat stellen het gebruik van beschikbare brandstoffen en de efficiëntie van elektronenoverdracht te optimaliseren, waardoor de productie van reactieve zuurstofsoorten wordt geminimaliseerd en het vermogen van cellen om zich aan te passen aan veranderingen in de omgeving wordt bevorderd.

Meer recentelijk zijn afwijkingen in de SC-assemblage gemeld bij verschillende ziekten, zoals neurodegeneratieve aandoeningen (de ziekte van Alzheimer en Parkinson), het Barth-syndroom, het Leigh-syndroom of kanker. De rol van veranderingen in de SC-assemblage in de progressie van de ziekte moet nog worden bevestigd. Toch is de beschikbaarheid van voldoende hoeveelheden monsters om de SC-assemblagestatus te bepalen vaak een uitdaging. Dit gebeurt met biopsie of weefselmonsters die klein zijn of moeten worden verdeeld voor meerdere analyses, met celculturen die langzaam groeien of afkomstig zijn van microfluïdische apparaten, met sommige primaire culturen of zeldzame cellen, of wanneer het effect van bepaalde dure behandelingen moet worden geanalyseerd (met nanodeeltjes, zeer dure verbindingen, enz.). In deze gevallen is een efficiënte en gemakkelijk toe te passen methode vereist. Dit artikel presenteert een methode die is aangepast om verrijkte mitochondriale fracties te verkrijgen uit kleine hoeveelheden cellen of weefsels om de structuur en functie van mitochondriale SC's te analyseren door middel van natuurlijke elektroforese, gevolgd door in-gel activiteitstesten of western blot.

Introduction

Supercomplexen (SC's) zijn supramoleculaire associaties tussen individuele respiratoire ketencomplexen ^1,2. Sinds de eerste identificatie van SC's en de beschrijving van hun samenstelling door de groep van Schägger ^2,3, later bevestigd door andere groepen, werd vastgesteld dat ze respiratoire complexen I, III en IV (respectievelijk Ci, CIII en CIV) bevatten in verschillende stoichiometrieën. Er kunnen twee hoofdpopulaties van SC's worden gedefinieerd, die met CI (en ofwel CIII alleen of CIII en CIV) en met een zeer hoog moleculair gewicht (MW, beginnend met ~1,5 MDa voor de kleinere SC: CI + CIII₂) en die met CIII en CIV maar niet met CI, met een veel kleinere omvang (zoals CIII₂ + CIV met ~680 kDa). Deze SC's bestaan naast elkaar in het binnenste mitochondriale membraan met vrije complexen, ook in verschillende verhoudingen. Dus, terwijl CI meestal wordt aangetroffen in de geassocieerde vormen (dat wil zeggen, in SC's: ~80% in runderhart en meer dan 90% in veel menselijke celtypen)³, is CIV zeer overvloedig in zijn vrije vorm (meer dan 80% in runderhart), waarbij CIII een meer evenwichtige verdeling vertoont (~40% in zijn meer overvloedige vrije vorm, als een dimeer, in runderhart).

Hoewel hun bestaan nu algemeen wordt aanvaard, staat hun precieze rol nog ter discussie 4,5,6,7,8,9,10. Volgens het plasticiteitsmodel kunnen er verschillende verhoudingen van SC's en individuele complexen bestaan, afhankelijk van het celtype of de metabole status ^1,7,11. Deze dynamische aard van de assemblage zou cellen in staat stellen het gebruik van beschikbare brandstoffen en de efficiëntie van het oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS) te reguleren als reactie op veranderingen in het milieu ^4,5,7. SC's kunnen ook bijdragen aan het beheersen van de generatiesnelheid van reactieve zuurstofsoorten en deelnemen aan de stabilisatie en omzet van individuele complexen 4,12,13,14. Veranderingen van de SC-assemblagestatus zijn beschreven in verband met verschillende fysiologische en pathologische situaties^15,16 en met het verouderingsproces¹⁷.

Zo zijn er veranderingen in de SC-patronen beschreven in gist, afhankelijk van de koolstofbron die wordt gebruikt voor groei² en in gekweekte zoogdiercellen wanneer glucose wordt vervangen door galactose⁴. Modificaties zijn ook gemeld in de lever van muizen na vasten⁸ en in astrocyten wanneer de oxidatie van mitochondriale vetzuren wordt geblokkeerd¹⁸. Daarnaast zijn er een afname of veranderingen in SC's en OXPHOS gevonden bij Barth-syndroom¹⁹, hartfalen²⁰, verschillende metabole²¹ en neurologische 22,23,24 aandoeningen en verschillende tumoren 25,26,27,28. Of deze veranderingen in de samenstelling en niveaus van SC een primaire oorzaak zijn of secundaire effecten vertegenwoordigen in deze pathologische situaties, wordt nog onderzocht^15,16. Verschillende methodologieën kunnen informatie geven over de samenstelling en functie van SC's; Deze omvatten activiteitsmetingen ^8,29, ultrastructurele analyse^30,31 en proteomics ^32,33. Een bruikbaar alternatief dat steeds vaker wordt gebruikt en het uitgangspunt vormt voor enkele van de eerder genoemde methodologieën, is de directe bepaling van de SC-assemblagestatus door middel van Blue native (BN) elektroforese die voor dit doel is ontwikkeld door Schäggers groep^34,35.

Deze aanpak vereist reproduceerbare en efficiënte procedures om mitochondriale membranen te verkrijgen en op te lossen en kan worden aangevuld met andere technieken zoals in-gel activiteitsanalyse (IGA), tweede-dimensie elektroforese en western blot (WB). Een beperking in de studies naar SC-dynamica door BN-elektroforese kan de hoeveelheid startcellen of weefselmonsters zijn. We presenteren een reeks protocollen voor de analyse van de assemblage en functie van SC, aangepast aan de groepsmethoden van Schägger, die kunnen worden toegepast op verse of bevroren cel- of weefselmonsters vanaf slechts 20 mg weefsel.

Protocol

OPMERKING: De samenstelling van alle kweekmedia en buffers is gespecificeerd in Tabel 1 en details met betrekking tot alle materialen en reagentia die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Isolatie van mitochondriën uit celcultuur

OPMERKING: Het minimale volume van de geteste cellen was ~30-50 μL verpakte cellen (stap 1.4). Dit kan ongeveer overeenkomen met ten minste twee of drie celkweekplaten van 100 mm of met één plaat van 150 mm op 80-90% van de samenvloeiing, afhankelijk van het celtype (tussen 5 × 10⁶ en 10⁷ cellen in van L929 afgeleide cellen of MDA-MB-468). Efficiënte celbreuk is een cruciale stap.

1. Kweek aanhangende cellen tot ongeveer 80% samenvloeiing of gesuspendeerde cellen tot een adequate dichtheid.
2. Oogst cellen door centrifugatie bij 500 × g gedurende 5 minuten (rechtstreeks uit de celsuspensie in het geval van niet-hechtende cellen of na standaard trypsinisatie met een trypsine-EDTA-oplossing van 0,05% trypsine en 0,02% EDTA in 1x PBS, in het geval van aanhangende cellen).
3. Was de cellen 2x koud 1x PBS en bezink ze door centrifugeren bij 500 × g gedurende 5 min.
   OPMERKING: Vanaf dit punt moeten alle stappen worden uitgevoerd bij 4 °C. Daarom moeten alle reagentia koud zijn en moeten de buisjes met cellen of mitochondriën op ijs worden bewaard.
4. Gooi na de tweede centrifugatie het supernatant weg, schat het volume van de celpellets (cpv) en vries de cellen in bij -80 °C gedurende ten minste 15 minuten om het breken van het membraan in stap 1.8 te vergemakkelijken.
   OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gestopt en de cellen kunnen wekenlang bij -80 °C worden bewaard. Gewoonlijk zijn maatbuizen van 10 of 15 ml met conische bodem geschikt.
5. Laat de cellen langzaam ontdooien op ijs.
6. Resuspendeer de verpakte celpellet in een volume hypotone buffer gelijk aan 7x de cpv (10 mM MOPS, 83 mM sucrose, pH 7,2) (bijv. 100 μL verpakte cellen in 700 μL buffer).
   OPMERKING: Het volume moet voldoende zijn om efficiënte ploffingen te verkrijgen (zie OPMERKING bij stap 1.8).
7. Breng de celsuspensie over in een Potter-Dounce-homogenisator van de juiste grootte en laat de cellen opzwellen door ze 2 minuten in ijs te incuberen. Voor een volume van 700-800 μL celsuspensie is bijvoorbeeld een homogenisator met een capaciteit van 1 ml voldoende.
8. Breek de celmembranen door acht tot tien slagen uit te voeren in de homogenisator die is gekoppeld aan een motoraangedreven teflonstamper die met 600 tpm draait.
   OPMERKING: Bij het maken van de streken is het belangrijk om een vacuüm te creëren dat de efficiëntie van de celbreuk verhoogt, samen met de hypotone en bevriezingsacties voor respectievelijk zwelling en fragilisatie van de membranen. Als het goed is gedaan, is er een "plop" -geluid te horen wanneer u de homogenisator met een snelle beweging bij elke beweging naar beneden trekt.
9. Voeg hetzelfde volume hypertone buffer toe aan de celsuspensie (7x de cpv) (30 mM MOPS, 250 mM sucrose, pH 7,2) om een isotone omgeving te genereren.
10. Breng het homogenaat over in een buis van 10-15 ml en centrifugeer in een vaste rotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: De originele buis met de ongebroken cellen kan voor dit doel worden gebruikt.
11. Breng het supernatant, dat de mitochondriale fractie bevat, over in polypropyleen buizen van 1,5 ml.
12. OPTIONEEL: Om de opbrengst van mitochondriën te verhogen, resuspendeert u de pellet vanaf stap 1.10 in 7x het celpelletvolume van buffer A (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M sucrose, pH 7.4) door op en neer te pipetteren en centrifugeert bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Combineer het nieuwe supernatans met het vorige voordat u doorgaat naar stap 1.13.
13. Centrifugeer in een microfuge bij 16.000 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C om de mitochondriale ruwe fractie op te vangen.
14. Gooi het supernatans weg en resuspendeer elke met mitochondriën verrijkte pellet met 0,5 ml buffer A, waarbij de inhoud van twee buisjes wordt gecombineerd tot één, en centrifugeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 1.13. Herhaal hetzelfde proces totdat al het materiaal in slechts één buis zit.
15. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de uiteindelijke pellet met 300 μL buffer A en kwantificeer de mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Centrifugeer opnieuw zoals eerder en ga verder met sectie 3.

2. Isolatie van mitochondriën uit kleine hoeveelheden dierlijk weefsel

OPMERKING: De minimale hoeveelheid weefsel om dit protocol met een zekere zekerheid toe te passen, hangt af van het celtype en de mitochondriale abundantie, maar kan in de meeste gevallen ~20-30 mg weefsel zijn. De weefselmonsters kunnen vers materiaal of bevroren monsters zijn. In het laatste geval laat u de monsters ontdooien in een homogenisatiebuffer die op ijs is geplaatst voordat u met de procedure begint.

1. Weeg of schat de hoeveelheid (mg) weefsel zo nauwkeurig mogelijk.
2. Knip het weefsel af met een schaar en maak 3-4 wasbeurten in homogenisatiebuffer met behulp van een zeef, waarbij u ervoor zorgt dat de kleinere stukjes niet verloren gaan.
   OPMERKING: Deze stap is belangrijker in weefsels zoals skeletspieren of hart dan in de hersenen of zachtere weefsels waarvan de cellen gemakkelijk direct kunnen worden gedesaggregeerd door de homogenisatiestap.
3. Voeg vers homogenisatiemedium toe (4 ml per gram lever, 10 ml per gram hart, bruin vetweefsel (BAT) of spier, en 5 ml per gram hersenen of nier; zie de specifieke buffersamenstelling voor elk geval in tabel 1).
4. Breng de stukjes weefsel met buffer over naar de homogenisator en volg het optimale homogenisatie- en mitochondriënisolatieprotocol, afhankelijk van het geselecteerde weefsel.
5. Isolatie van mitochondriën uit lever, milt en nieren
   1. Homogeniseer met vier tot zes op- en neergaande slagen in de Elvehjem-Potter met een motoraangedreven teflonstamper op 600 tpm.
   2. Breng het gehomogeniseerde weefsel over in een steriele centrifugebuis. Centrifugeer in een zwenkbare rotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   3. Vul 1,5 ml polypropyleen buisjes met het supernatans dat in de vorige stap is verkregen. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 16.000 × g in een microfuge bij 4 °C en ga hierna te werk zoals eerder beschreven (stappen 1.13 tot en met 1.15)
6. Isolatie van mitochondriën uit hart- en spiermonsters
   1. Homogeniseer met zes tot acht slagen in de Elvehjem-Potter met een motoraangedreven teflonstamper op 600 tpm. Breng het gehomogeniseerde weefsel over in een steriele centrifugebuis.
   2. Centrifugeer in een zwenkbare rotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Giet het supernatans in schone polypropyleen buizen van 1,5 ml.
      OPMERKING: Een tweede homogenisatie van de pellet verkregen in stap 2.6.2 kan worden uitgevoerd met 4-5 extra slagen en 1/2 volume homogenisatiebuffer om de mitochondriale opbrengst te verhogen. Het nieuwe supernatans (na centrifugeren opnieuw bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C) kan worden gecombineerd met het vorige voordat overgaat tot stap 2.6.3. Een alternatief om de opbrengst van ruwe mitochondriën te verhogen, is het dissociëren van hart- en spierweefselmonsters in trypsineoplossing vóór homogenisatie^36,37. In dit geval moet de trypsine efficiënt worden geïnactiveerd/verwijderd voordat de mitochondriale membranen worden opgelost met digitonine (stap 3.2).
   3. Centrifugeer bij 16.000 × g in een microfuge gedurende 2 minuten bij 4 °C om de ruwe mitochondriale fractie te verkrijgen.
   4. Gooi het supernatans weg en resuspendeer elke met mitochondriën verrijkte pellet met 0,5 ml buffer AT, waarbij de inhoud van twee buisjes wordt gecombineerd tot één, en centrifugeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.6.3. Herhaal hetzelfde proces totdat al het materiaal in slechts één buis zit.
   5. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de uiteindelijke pellet met 300 μL buffer A (geen BSA) en kwantificeer de mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Centrifugeer opnieuw zoals eerder en ga verder met sectie 3.
7. Isolatie van mitochondriën uit de hersenen
   1. Homogeniseer de stukjes hersenen met 10-15 slagen met behulp van een Dounce-type glashomogenisator met een handmatig aangedreven glazen stamper. Breng het gehomogeniseerde weefsel over in een steriele centrifugebuis.
   2. Centrifugeer in een zwenkbare rotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   3. Vang het supernatans op in een schone centrifugebuis.
   4. Resuspendeer de pellet die in de vorige centrifugatiestap is verkregen in hetzelfde volume medium AT dat bij de eerste homogenisatie is gebruikt. Homogeniseer de pellet opnieuw door het in stap 2.7.1 beschreven proces te herhalen met behulp van 5-10 gangen en centrifugeer de suspensie in een zwenkrotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   5. Verwijder het supernatans en voeg het toe aan de in stap 2.7.3 voorbereide buis. Centrifugeer bij 10.000 × g in een rotor met vaste hoek gedurende 10 minuten bij 4 °C om de ruwe mitochondriale fractie te verkrijgen.
   6. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet in 1/2 van het oorspronkelijke homogenisatievolume (stap 2.7.1) van medium AT. Verdeel de mitochondriale suspensie in schone polypropyleen buisjes van 1,5 ml en centrifugeer bij 16.000 × g in een microfuge gedurende 2 minuten bij 4 °C.
   7. Gooi het supernatans weg en resuspendeer elke met mitochondriën verrijkte pellet met 0,5 ml buffer AT, waarbij de inhoud van twee buisjes wordt gecombineerd tot één, en centrifugeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.7.6. Herhaal hetzelfde proces totdat al het materiaal in slechts één buis zit.
   8. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de uiteindelijke pellet met 300 μL buffer A (geen BSA) en kwantificeer de mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Centrifugeer opnieuw zoals eerder en ga verder met sectie 3.
8. Isolatie van mitochondriën uit BAT
   1. Homogeniseer met acht tot tien op-en-neergaande bewegingen in de Elvehjem-Potter met een motoraangedreven teflonstamper op 600 tpm. Breng het gehomogeniseerde weefsel over in een steriele centrifugebuis.
   2. Centrifugeer in een zwenkbare rotor bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   3. Vul polypropyleen buisjes van 1,5 ml met het supernatans dat in de vorige stap is verkregen, vermijd de bovenste vetlaag.
      OPMERKING: Een tweede homogenisatie van de pellet verkregen in stap 2.8.2 kan worden uitgevoerd om de mitochondriale opbrengst te verhogen. Het nieuwe supernatans (na centrifugeren opnieuw bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C) kan worden gecombineerd met het vorige voordat overgaat tot stap 2.8.4.
   4. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 16.000 × g gedurende 2 minuten in een microfuge bij 4 °C.
   5. Gooi het supernatans weg en resuspendeer elke met mitochondriën verrijkte pellet met 0,5 ml buffer AT2, waarbij de inhoud van twee buisjes tot één wordt gecombineerd, en centrifugeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.8.4. Herhaal hetzelfde proces totdat al het materiaal in slechts één buis zit.
   6. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de uiteindelijke pellet met 300 μL buffer A (geen BSA) en kwantificeer de mitochondriale eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Centrifugeer opnieuw zoals eerder en ga verder met sectie 3.

3. Voorbereiding van monsters voor Blue Native-analyse

1. Resuspendeer de mitochondriale fracties (verkregen uit zoogdiercelculturen of weefsels) in BN-monsterbuffer (50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 5 mM Aminocapronzuur, 4 mM PMSF) om een eiwitconcentratie van ongeveer 10 mg/ml te verkrijgen. Zie tabel 2 voor de verwachte opbrengsten voor de verschillende soorten monsters.
2. Los mitochondriale membranen op door digitonine (10% stockoplossing) toe te voegen om een verhouding van 4 g digitonine/g mitochondriaal eiwit te verkrijgen (4 μL digitonine, 10% bouillon voor 10 μL van de mitochondriale suspensie bereid in stap 3.1).
   OPMERKING: De detergent-eiwitverhouding (g/g) moet voor elk type monster worden geoptimaliseerd om reproduceerbare resultaten te verkrijgen; 2-8 g digitonine/g mitochondriaal eiwit bleek optimaal te zijn voor de meeste weefsels^34,35.
3. Meng door zachtjes op en neer te pipetteren. Incubeer monsters op ijs gedurende 5 minuten.
   OPMERKING: Na deze stap zou de mitochondriale suspensie helderder moeten worden (verschuiving van ondoorzichtig naar doorschijnend); Anders zou het erop kunnen wijzen dat de hoeveelheid wasmiddel onvoldoende is voor een correcte membraanoplosbaarheid.
4. Centrifugeer op volle snelheid in een microfuge (ongeveer 20.000 × g ) gedurende 25 minuten bij 4 °C om onoplosbaar materiaal te verwijderen.
5. Vang het supernatans op in een verse tube. Voeg aan het supernatans een volume van 5% G-250 (Coomassie Blue G-250 5% in 0,75 M aminocapronzuur) toe, overeenkomend met 1/3 van het initiële volume resuspensie (stap 3.1, dit komt overeen met een eindverhouding van 1,6 g Coomassie/g eiwit) en meng door pipetteren.
6. Bewaar op ijs voordat u de gel laadt of vries aliquots in bij -80 °C.

4. Blauwe inheemse gelelektroforese

OPMERKING: De elektroforese wordt uitgevoerd in de koelcel (4-8 °C). Als er geen koelruimte is, kan een koelblok in de elektroforesetank worden ingebracht. Commerciële 3-13% natuurlijke polyacrylamidegels²⁹ worden gebruikt, maar zelfgemaakte gels met de gewenste gradiëntconcentraties kunnen ook worden gebruikt^38,39.

1. Belast de bovenste en onderste kamers met respectievelijk de koude kathode A en anodebuffers. U kunt de monsters ook in de putjes laden voordat u de bovenste kamer voorzichtig vult met kathodebuffer A.
   OPMERKING: In ons laboratorium worden commerciële elektroforesebuffers gebruikt, maar ze kunnen worden bereid zoals aangegeven in Tabel 1.
2. Laad tussen 30 en 100 μg mitochondriaal eiwit.
   OPMERKING: Gewoonlijk wordt 30-50 μg eiwit (voor WB) of 40-100 μg eiwit (voor IGA) per putje geladen in een gel van 10 banen (putjes van 0,5 x 0,15 cm). Kathode A-buffer bevat Coomassie Blue G-250 en heeft een intens blauwe kleur waardoor het moeilijk is om de gelputjes te zien voor het laden van monsters. Het is handig om het midden van elk putje te markeren, bijvoorbeeld met een rode stift om te helpen bij het plaatsen van de pipetpunt tijdens deze stap. Native molecuulgewichtmarkers kunnen nuttig zijn bij het opzetten van de BN-PAGE-techniek om te bevestigen dat de gradiëntgels correct zijn gevormd en dat het patroon van de complexen en SC's het juiste is.
3. Draai op 80-100 V gedurende 25-30 minuten en vervolgens op 160-180 V, beperk de stroom tot 12 mA/gel, totdat de kleurstof de bodem van de gel bereikt (~125-165 min in totaal).
4. Als in-gel activiteitstesten (IGA's) moeten worden uitgevoerd, vervang dan de kathodebuffer A door kathodebuffer B wanneer het kleurstoffront zich in het midden van de gel bevindt (~1 uur na het begin van de run).
   OPMERKING: Hoewel de gels zonder enige kleuring kunnen worden gedocumenteerd net na de run, aangezien sommige banden zichtbaar zijn (voornamelijk complexe V, die kan worden beschouwd als een "interne" maker met een MW van ~600 kDa) vanwege hun binding aan G-250-kleurstof, zullen SC's en individuele complexen meestal niet zichtbaar zijn zonder kleuring of IGA-tests. De gels die worden gebruikt in IGA-assays of voor WB mogen niet worden gekleurd of gefixeerd.
5. Haal de gel uit de cassette en ga verder met Coomassie blauwkleuring (sectie 5), IGA-analyse (sectie 6) of WB-immunodetectie (sectie 7).

5. Gel kleuring

1. Kleuring van de gel gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur (RT) met behulp van Coomassie blauwe kleurstofoplossingen (Coomassie kleurstof R-250 op 0,25% in 40% methanol, 10% azijnzuur; kleuring gedurende 10-15 min).
2. Ontkleuring met meerdere wasbeurten (meestal 4-5 x 15 minuten) in 40% methanol plus 10% azijnzuur bij RT.
3. Documenteer de gel.

6. In gel-activiteit (IGA) testen

1. Bereid IGA-oplossingen voor voor de analyse van de verschillende ademhalingscomplexen vóór het einde van de elektroforese en houd ze in het donker (door bijvoorbeeld donkergekleurde plastic dozen te gebruiken of ze af te dekken met aluminiumfolie). De samenstelling van elke buffer is gedetailleerd weergegeven in tabel 1.
2. Plaats de gel of de te gebruiken banen in een plastic doos die zo klein mogelijk is om er plaats in te bieden.
3. Voeg voldoende volume van de juiste oplossing toe om de gel te bedekken (meestal 5 of 10 ml voor respectievelijk 5 of 10 gelbanen) en incubeer bij RT met zacht schudden (60-80 tpm) en uit de buurt van licht.
   OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van het te analyseren complex en van de aard en hoeveelheid van het geladen monster; CI en CIV zijn het gemakkelijkst en snelst te geven resultaten. CI-activiteit zal dus meestal na een paar minuten zichtbaar worden, terwijl CII en CIV ~30 minuten nodig hebben om te worden geobserveerd en CV ~1,5-2 uur. De reactie kan in alle gevallen uren duren en de snelheid van signaalintensivering kan worden verminderd door de incubatie te verplaatsen naar een koude ruimte (4-6 °C), bijvoorbeeld voor een nachtelijke (AAN) incubatie. CIII-activiteit werkt alleen voor heldere natuurlijke elektroforese (CN), niet voor BN³⁴.
4. Wanneer de juiste banden zich hebben ontwikkeld, stop dan de reacties door de analyseoplossingen te verwijderen, 2x te wassen met gedestilleerd water en de gel te fixeren met 40% methanol plus 10% azijnzuur (behalve CV dat alleen met methanol wordt gefixeerd) gedurende 30 minuten.
   1. Om de CIV-activiteit na CI-detectie door IGA te analyseren, wast u de gel 2x met gedestilleerd water, documenteert u de CI-activiteit, incubeert u de gel (zonder hem te fixeren!) met 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,2) 2x gedurende 30 minuten, en vervolgens met de volledige CIV-reactiebuffer totdat de complexe IV-banden verschijnen (meestal door AAN te incuberen bij RT of 4 °C).
5. Documenteer de gels.
   OPMERKING: Voor ATPase-activiteit, aangezien de ontwikkelde banden wit zijn, plaatst u deze bij het documenteren van de gel op een donkere achtergrond zodat de heldere banden zichtbaar zijn.

7. Analyse van de westerse blot

1. Bereid de transferbuffer voor volgens tabel 1 en houd deze op 4 °C tot het einde van de elektroforese.
2. Doe de gel in een bakje en voeg de transferbuffer toe. Incubeer bij RT gedurende 10-15 minuten.
3. Snijd een stuk PVDF-membraan van dezelfde grootte als de gel en activeer het in methanol gedurende 10 s onder roeren. Was meerdere keren met gedestilleerd water en voeg transferbuffer toe. Incubeer bij RT gedurende 10-15 minuten met zacht schudden.
4. Bereid de transfersandwich van onder naar boven voor, vermijd luchtbellen tussen de gel en het membraan, in de volgende volgorde: zwarte kant van cassette-spons-blotting paper-gel-membraan-blotting paper- spons-doorzichtige kant van de cassette.
5. Sluit en vergrendel de cassette en plaats de sandwich in de transfertank in de juiste richting voor overdracht (zwarte kant naar de minpool).
6. Vul de transfertank met transferbuffer, voeg een magnetische roerder toe om de buffer te roeren en sluit de voeding aan op 80 V gedurende 2 uur of op 100 V gedurende 1 uur. Voer de overdracht uit tussen 4 en 8 °C (bijvoorbeeld in de koelcel) en met een koelblok in het overdrachtssysteem.
7. Haal het membraan op en ga verder met een standaard western blot-protocol, met behulp van specifieke antilichamen voor de verschillende te detecteren ademhalingscomplexen²⁹.

Results

De opbrengsten van mitochondriën verkregen volgens de hierboven beschreven protocollen variëren afhankelijk van verschillende factoren, zoals de cellijn of het weefseltype, de aard van de monsters (d.w.z. of verse of bevroren weefsels worden gebruikt) of de efficiëntie van het homogenisatieproces. Verwachte opbrengsten van mitochondriën uit verschillende cellijnen en weefsels zijn verzameld in Tabel 2. Zodra de mitochondriale fracties zijn verkregen, is de volgende stap de analyse van het respiratoire SCs-patroon, die wordt uitgevoerd na de ruwe mitochondriale monstersolubilisatie en elektroforetische scheiding door BN-PAGE, gevolgd door IGA-analyse of WB-immunodetectie. Figuur 1 toont het aspect van ongekleurde gelbanen net na de run en het patroon van banden na standaard Coomassie kleuring van een gekweekte cellijn en een mitochondriaal levermonster van muizen.

In figuur 2A,B zijn duidelijke verschillen waarneembaar tussen de SC-assemblagepatronen in menselijke en muiscellen na gebruik van IGA-assays. Zo wordt vrij complex I waargenomen in muizencellen, terwijl het niet detecteerbaar is in menselijke mitochondriën. Het complexe IV-IGA-patroon lijkt sterk op elkaar in beide menselijke cellijnen (Figuur 2B), terwijl het verschillen vertoont tussen de twee muiscellijnen die in Figuur 2A zijn geanalyseerd. Deze verschillen zijn te wijten aan het feit dat BL6-cellen een mutante variant van SCAF1⁸ tot expressie brengen.

De SC-patronen, verkregen met het hier beschreven protocol voor mitochondriale isolatie om met kleine monsters te werken, worden gehandhaafd ten opzichte van de "conventionele" protocollen die worden gebruikt voor grotere monsters. Dit is te zien in figuur 2C, door banen 1 en 6 (verkregen na mitochondriale isolatie met behulp van een conventioneel protocol van 3 g lever en 1,1 g BBT) te vergelijken met respectievelijk banen 2 en 5 (verkregen met behulp van de hier gepresenteerde protocollen van ongeveer 0,1 g van beide weefsels). Zoals voorgesteld in het plasticiteitsmodel, varieert het relatieve aandeel van respiratoire complexen en SC's afhankelijk van het celtype en de metabolische toestand. Zoals te zien is in figuur 2C,D, vertonen de verschillende weefsels verschillende SC-assemblagepatronen. Zo vertonen mitochondriën in de hersenen zeer lage niveaus van vrij complex I en een hoger aandeel SC's in vergelijking met de andere weefsels, en BAT wordt gekenmerkt door zijn lage niveaus van CV (Figuur 2A) en hoge hoeveelheden SC III + IV (Figuur 2D). Hartmitochondriën vertonen hoge niveaus van SC's en CV. CV-assemblagepatronen zijn zeer vergelijkbaar tussen de gekweekte cellijn en een mitochondriaal monster van een muizenlever (Figuur 2E).

SC-assemblage kan ook worden geanalyseerd door WB, zoals weergegeven in figuur 3 voor twee monsters die zijn verkregen uit miltcontrole en tumorcellen. In dit geval is 30-50 μg mitochondriaal eiwit meestal voldoende om de verschillende complexen en SC's met de specifieke antilichamen te detecteren. Figuur 4 toont enkele van de belangrijkste valkuilen die zich kunnen voordoen tijdens de toepassing van deze protocollen. Verkeerde gelgradiënten kunnen abnormale en ongewenste migratiepatronen veroorzaken, zoals in figuur 4A, baan 1, waarbij de SC's dicht bij de put in het bovenste deel van de baan blijven vanwege een hoger dan normale acrylamideconcentratie in de gel. Incubatie van de monsters, zelfs voor relatief korte tijden, bij hoge temperaturen (hier 37 °C en 40 °C gedurende 10 minuten) veroorzaakt degradatie van SC's en CI (figuur 4A , banen 2-4). Evenzo is de verhouding tussen wasmiddel en eiwit van cruciaal belang voor goede resultaten en een adequate gelresolutie. Onder een verhouding van 2 g digitonine/g eiwit wordt de bandresolutie geleidelijk verminderd en bij de lagere concentratie (0,5 g/g) is alleen een uitstrijkje zichtbaar in het gebied dat overeenkomt met SC's (figuur 4B).

Figuur 1: Patroon van mitochondriale complexen en supercomplexen na BNGE-scheiding van digitonine-permeabiliseerde mitochondriën uit een kweekcellijn (L929^Balbc) en muizenlever. De rijstroken aan de linkerkant (1 en 2) vertegenwoordigen het aspect van de ongekleurde gel net na de run, waar alleen CV detecteerbaar is, terwijl de banen aan de rechterkant (3 en 4) het patroon van banden na Coomassie kleuring vertonen. Afkortingen: BNGE = Blue Native gel elektroforese; CV = complex V; SC's = supercomplexen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: IGA-analyse van mitochondriën geïsoleerd uit verschillende cellijnen en muizenweefsels. (A,B) In-gel activiteit van de geïndiceerde complexen in mitochondriën geïsoleerd uit (A) muizen of (B) menselijke cellijnen. L929^Balbc is een transmitochondriale cellijn die in ons laboratorium wordt gegenereerd door mitochondriën over te brengen van Balb/cJ-muisbloedplaatjes naar ρ°L929neo-cellen, zoals eerder beschreven^40,41. BL6-fibroblasten zijn een onsterfelijke cellijn die in ons laboratorium is gegenereerd uit een oorbiopsie van een BL6-muis. (C) CI-IGA-patronen uit mitochondriën van muizen geïsoleerd met behulp van een conventionele methode die begint met 3 g lever (baan 1) en met 1,1 g BAT (baan 6) of het hier gepresenteerde protocol en begint met ongeveer 0,1 g weefsel in alle gevallen (baan 2, lever; baan 3, hart; baan 4, hersenen en baan 5 BAT). (D) CIV-IGA-patronen (uitgevoerd na CI-IGA getoond in panel 2C, banen 2-5) in de lever, het hart, de hersenen en de BAT-mitochondriën van muizen. (E) CV-IGA-activiteit geanalyseerd in gekweekte cellen van muizen en lever. Ongeveer 60-75 μg mitochondriaal eiwit per baan werd geladen. Afkortingen: IGA = in-gel activiteit; SC's = supercomplexen; BI = complex I; BAT = bruin vetweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: WB immunodetectie van de verschillende mitochondriale complexen en supercomplexen in miltmonsters. Na Blue Native PAGE-scheiding van mitochondriale complexen en SC's verkregen uit miltcontrole- (Milt M9) en tumormonsters (Tumor M9), werden ze overgebracht naar een PVDF-membraan en achtereenvolgens gehybridiseerd met antilichamen die de aangegeven CI-, CIII-, CIV- en CII-subeenheden herkennen (respectievelijk panelen AD). Per baan werd ongeveer 50 μg mitochondriaal eiwit geladen. Sterretjes geven het signaal aan dat overblijft van een eerdere westelijke vlek. Afkortingen: SC = supercomplex; BI = complex I; CIII = complex III; CIV = complex IV; CII = complex II. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Valkuilen in SC analyse door Blue-Native PAGE. CI IGA-analyse van mitochondriën geïsoleerd uit (A) verse muizenlever en (B) bevroren rattenlever onder verschillende oplosbaarheidsomstandigheden. (A) Baan 1, verkeerde gelgradiëntconcentratie (8-13% in plaats van de normale 3-13%). Banen 2-4, monsters die gedurende 10 minuten op ijs of bij respectievelijk 37 °C en 40 °C zijn geïncubeerd voordat ze worden geladen. (B) Patroon na IGA voor CI van mitochondriën verkregen uit bevroren rattenlever met behulp van verschillende digitonine/eiwitverhoudingen voor oplosbaarheid. Afkortingen: SC = supercomplex; PAGE = elektroforese van polyacrylamidegel; BI = complex I; IGA = in-gel activiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gemiddeld	Compositie
Hypotone buffer	10 mM MOPS, 83 mM sucrose, pH 7,2
Hypertone buffer	30 mM MOPS, 250 mM sucrose, pH 7,2
Homogenisatie Buffer A	10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sucrose, pH 7,4
Homogenisatie Buffer AT	225 mM mannitol, 1 mM EGTA, 75 mM sucrose, 0,01% BSA pH 7,4
Homogenisatie Buffer AT2	225 mM mannitol, 1 mM EGTA, 75 mM sucrose, 0,02% BSA pH 7,4
BN monster buffer	50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 2 mM Aminocapronzuur, 1 mM EDTA pH 7,0
Digitonin-oplossing	10% digitonine in 50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 5 mM Aminocapronic, 4 mM PMSF
BN laadbuffer	5% Coomassie Blue G in 0,75 M aminocapronzuur
BN kathodebuffer A	50 mM tricine, 15 mM Bis-Tris pH =7,0 (4 °C), 0,02% G-250 (Coomassie briljant blauw G-250)
BN kathodebuffer B	50 mM tricine, 15 mM Bis-Tris pH=7,0 (4 °C), 0,002% G-250
BN anode buffer	50 mM Bis-Tris, pH=7.0
Complex I IGA-substraat	5 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/ml NADH, 2,5 mg/ml Nitroblauw Tetrazolium (NBT)
Complex II IGA-substraat	50 mM Kaliumfosfaatbuffer pH 7,4, 20 mM natriumsuccinaat, 0,2 mM fenazinemethosulfaat (PMS), 2,5 mg/ml NBT
Complex III IGA-substraat	50 mM Kaliumfosfaatbuffer pH 7,2, 0,05% diaminobenzidine (DAB)
Complex IV IGA-substraat	Zelfde oplossing als CIII plus 50 μM cytochroom c
Complex V IGA-substraat	35 mM Tris, 270 mM glycine pH 8,3, 14 mM MgSO4, 0,2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP
Kleuring oplossing	Coomassie kleurstof R-250 op 0,25% in 40% methanol en 10% azijnzuur
Ontkleurings-/fixeeroplossing	40% methanol, 10% azijnzuur
Buffer overdragen	48 mM Tris, 39 mM Glycine, 20% methanol

Tabel 1: Buffers en mediasamenstelling.

Celtype/weefsel	Startbedrag	Verwachte opbrengst (μg mitochondriaal eiwit)	Aantal rijstroken (50-60 μg/baan)
Gekweekte cellen
MDA-MB-468	100 μL vpc	300-400 μg	6-9
143B-afgeleid	100 μL vpc	200-350 μg	4-7
Fibroblasten van muizen	100 μL vpc	150-200 μg	3-5
Hart	100 mg	400-500 μg	10-12*
Skeletspier	100 mg	300-400 μg	8-10*
Lever	100 mg	400-500 μg	8-10
Milt	50 mg	150-250 μg	3-5
VLEERMUIS	100 mg	200-300 μg	4-6
Hersenen	100 mg	250-300 μg	5-8

Tabel 2: Verwachte opbrengsten van mitochondriën van verschillende celtypen en muizenweefsels. De mitochondriale fracties die uit het hart of de skeletspieren worden verkregen, zijn zuiverder dan die uit andere weefsels. Zo kunnen kleinere hoeveelheden in de gels worden geladen (*).

Discussion

De methodologische aanpassingen die in de hier beschreven protocollen zijn geïntroduceerd, zijn bedoeld om verliezen te voorkomen en de opbrengst te verhogen met behoud van mitochondriale complexe activiteiten (wat cruciaal is wanneer de beschikbaarheid van voldoende hoeveelheden monsters in het gedrang komt) en om het verwachte patroon van SC's van het weefsel of de cellijn te reproduceren (zie figuur 2C). Met dit doel en aangezien een hoge mitochondriale zuiverheid niet vereist is om de SC's goed te detecteren, is het aantal stappen, tijden en volumes verminderd wanneer dit mogelijk was.

Dus, na homogenisatie en verwijdering van kernen en ongebroken cellen door centrifugatie met lage snelheid, worden de supernatanten die de mitochondriën bevatten, overgebracht naar polypropyleenbuizen van 1,5 ml, en de daaropvolgende centrifugaties om de ruwe mitochondriale fracties te verkrijgen, worden uitgevoerd in een microfuge door de snelheid te verhogen en de tijden en volumes te verminderen ten opzichte van conventionele protocollen. Dit maakt de verwerking van meerdere monsters in een relatief korte tijd mogelijk: een nauwkeurige schatting is dat 10 monsters kunnen worden verwerkt in ~2-2,5 uur (vanaf het begin van de homogenisatie (protocolstap 1.6. of equivalent voor weefsels) tot het verkrijgen van de SCs-fractie die klaar is om in een gel te worden geladen (protocolstap 3.7) en minimaliseert de verliezen tijdens het behouden van activiteiten. Een andere verandering ten opzichte van de oorspronkelijke protocollen van de Schägger-groep is om, na membraansolubilisatie voor het verkrijgen van de SCs-fractie, een ultracentrifugatiestap te vervangen door een eenvoudige microfuge-centrifugatie (protocolstap 3.4).

Er zijn enkele cruciale stappen in de procedure. Ten eerste de efficiëntie van celbreuk, vooral in het geval van gekweekte cellen (zie opmerking na protocolstap 1.8) en in het bijzonder in het geval van kleine cellen. Weefsels en cellijnen vertonen een variabele moeilijkheidsgraad bij celbreuk: in het hart en de spieren is deze stap bijvoorbeeld meestal minder efficiënt dan in de lever of milt, maar het wordt gecompenseerd in opbrengst omdat de eerste een hoger mitochondriaal gehalte hebben. Een alternatief om de mitochondriale opbrengst te verbeteren wanneer geïsoleerd uit spier of hart, is de behandeling van monsters met trypsine vóór homogenisatie. De hersenen zijn een ander weefsel dat een lage efficiëntie vertoont bij celbreuk vanwege de handmatige homogenisatie, die milder en minder efficiënt is en waarschijnlijk ook vanwege de hogere variatie in celtypen in dit weefsel, zoals eerder is gemeld ⁴². Dit kan gedeeltelijk worden gecompenseerd door een tweede homogenisatiestap zoals voorgesteld in ons protocol (stap 2.7.4). Aan de andere kant, als de celbreuk buitensporig is, kan het uiteindelijke monster dat SC's bevat, besmet zijn met nucleaire DNA-fragmenten die de elektroforetische werking kunnen verstoren. Dit probleem wordt getoond als een toename van de viscositeit van het monster wanneer digitonine wordt toegevoegd om de mitochondriale membranen op te lossen en kan worden opgelost door behandeling met DNAse I.

Ten tweede, als de verhouding tussen detergent en eiwit te laag is, zou dat resulteren in een minder efficiënte membraanoplosbaarheid en de mogelijkheid van aggregaatvorming. Dit kan in de gels tot uiting komen in een slechte resolutie in SC's met een hoog molecuulgewicht (zie figuur 4) of in CIV die meerdere banden geeft die overeenkomen met oligomeren⁴³. Als de verhouding te hoog is, kan dit leiden tot uitsplitsing van SC's (voornamelijk CI-SC's). Ten derde is het belangrijk om het verhitten van monsters tijdens de hele procedure te vermijden (zie figuur 4) en herhaalde cycli van invriezen en ontdooien te vermijden, aangezien deze de SC-assemblagestatus kunnen beïnvloeden.

In tabel 2 wordt een overzicht gegeven van de verwachte opbrengsten voor verschillende celtypen en weefselmonsters. De waarden zijn bij benadering en zijn afhankelijk van de efficiëntie van de celbreuk en de aard van de bron. In het geval van weefsels heeft het uitgangsmateriaal de neiging om een hogere opbrengst te geven dan bij verse monsters. Er wordt een schatting gegeven van het aantal banen (uitgaande van een belasting tussen 50 en 60 μg mitochondriaal eiwit per baan) dat kan worden belast.

De hier gepresenteerde protocollen hebben betrekking op een verscheidenheid aan weefsels en celtypen met kleine variaties, ze kunnen worden gebruikt met verse of bevroren monsters en vereisen eenvoudige apparatuur en relatief lage kosten, waarbij geen dure zuiveringskits of gradiënten worden gebruikt. Ze kunnen echter enkele aanpassingen nodig hebben om te worden gebruikt met bepaalde celtypen of monsters, evenals wanneer specifieke mitochondriale populaties, zoals synaptische mitochondriën in de hersenen of subsarcolemmale mitochondriën van spieren, bijvoorbeeld het object van analyse zijn.

Aangezien de precieze fysiologische rollen en de mogelijke betrokkenheid van SC's bij pathologische situaties nog moeten worden gedefinieerd, is een analyse nodig van hun dynamiek en de factoren die van invloed zijn op hun assemblage, stabiliteit en functie. Onze protocollen kunnen waardevolle hulpmiddelen zijn die het mogelijk maken om reproduceerbare resultaten te verkrijgen op de SCs-patronen met kleine steekproefgroottes en van een verscheidenheid aan celtypen en weefsels, vooral wanneer meerdere experimentele omstandigheden moeten worden vergeleken²⁹.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Azijnzuur	PanReac	131008
Aminocapronzuur	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blauw G-250	Serva	17524
Coomassie Blauw R-250	Merck	1125530025
Cytochroom c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  benzeen (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonine	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Vrije vetzuren BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogenisator Teflon stamper	Deltalab	196102
Imidazool	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Methanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Monoklonaal Antilichaam	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 tot 12% Mini Eiwit Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Kathode Buffer Additief (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Loop Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Monoklonaal Antilichaam	Invitrogen	459100
Nitroblauw tetrazoliümzout (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
PDVF Membraan	Amersham	10600023
Fenazine methazulfaat (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substraat	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Monoklonaal Antilichaam	Invitrogen	459200
Natriumsuccinaat	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycine/penicilline	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Monoklonaal Antilichaam	Invitrogen	459140
XCell  SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001