Een gedetailleerde methodologie voor het opstellen van een minimaal invasief rattenmodel van longembolie met behulp van autologe bloedstolsels wordt beschreven. Er worden ook aanvullende methoden geboden voor het kwantificeren van het infarctgebied en het visualiseren van de pulmonale arteriële boom.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Opstelling van een minimaal invasief rattenmodel van longembolie met behulp van autologe bloedstolsels
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Longembolie (PE) is een van de belangrijkste oorzaken van cardiovasculaire sterfte, wat resulteert in een aanzienlijke sociaaleconomische last. Hoewel de huidige behandelingen zich voornamelijk richten op antistolling en trombolyse, is er dringend behoefte aan een beter begrip van de pathofysiologie en de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën. Diermodellen spelen een cruciale rol bij het begrijpen van PE en het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor de ziekte, waarbij knaagdieren vaak worden gebruikt vanwege ethische en kostenoverwegingen. Bestaande knaagdiermodellen voor PE worden echter beperkt door een gebrek aan gestandaardiseerde procedures, wat de reproduceerbaarheid en vergelijkingen tussen studies belemmert. Deze studie heeft tot doel een minimaal invasief rattenmodel van PE op te stellen met behulp van autologe bloedstolsels. Het model beschikt over een minimaal invasieve bloedafnametechniek, een gestandaardiseerde procedure voor het genereren van trombus en minimaal invasieve adertoegang. Daarnaast worden protocollen verstrekt voor het kwantificeren van infarctgebieden en het visualiseren van de pulmonale arteriële boom. Deze procedures zijn bedoeld om de betrouwbaarheid van knaagdiermodellen voor het bestuderen van PE-progressie te verbeteren en de ontwikkeling van nieuwe behandelingen te vergemakkelijken.
Inleiding
Longembolie (PE) is een belangrijke doodsoorzaak in het ziekenhuis en de derde meest voorkomende doodsoorzaak door hart- en vaatziekten. Ondanks de hoge incidentie blijven preventie en snelle diagnose een uitdaging 1,2. Antistolling- en trombolytische therapieën zijn van cruciaal belang bij de behandeling van PE, maar een beter begrip van ziekteprogressie en nieuwe therapeutische benaderingen is essentieel voor het verbeteren van de ziektebehandeling3.
In modern biomedisch onderzoek spelen diermodellen een cruciale rol bij het ophelderen van de mechanismen van ziekten bij de mens en het ontwikkelen van nieuwe therapieën 4,5. Muizen, ratten, hamsters en konijnen worden vaak gebruikt bij PE-modellering vanwege ethische overwegingen en kosteneffectiviteit 6,7,8,9,10. PE-modelleringsbenaderingen vallen over het algemeen in drie categorieën: in vivo trombusvorming, in vitro injectie van bloedstolsels en de toediening van niet-trombotische deeltjes. De keuze van de diersoort en de modelleringstechniek wordt bepaald door de specifieke onderzoeksdoelstellingen, aangezien geen enkel model geschikt is voor alle doeleinden. Studies die gericht zijn op het verkennen van nieuwe trombolytische therapieën maken bijvoorbeeld vaak gebruik van modellen met autologe bloedstolsels in plaats van niet-trombotische deeltjes.
De huidige methoden voor het modelleren van PE bij knaagdieren staan voor uitdagingen vanwege het gebrek aan gedetailleerde, gestandaardiseerde methodologieën. Dit heeft invloed op belangrijke processen zoals bloedafname, vorming van bloedstolsels en daaropvolgende embolisatie, die allemaal cruciaal zijn voor het garanderen van reproduceerbare resultaten in alle onderzoeken. Bovendien is er een aanzienlijke kloof in het vermogen om het geëmboliseerde gebied te kwantificeren en de verdeling van embolieën na embolisatie nauwkeurig in kaart te brengen. Het aanpakken van deze tekortkomingen is essentieel voor het bevorderen van de betrouwbaarheid en bruikbaarheid van knaagdiermodellen in PE-onderzoek.
In deze studie worden gedetailleerde protocollen beschreven voor het opstellen van een rattenmodel van PE met behulp van autologe bloedstolsels. Dit model beschikt over een minimaal invasieve bloedafnametechniek, een gestandaardiseerde procedure voor het genereren van trombus en minimaal invasieve adertoegang. Daarnaast worden protocollen verstrekt voor het kwantificeren van infarcten in de longen en het visualiseren van de pulmonale arteriële boom, wat verdere onderzoeksontdekkingen kan vergemakkelijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven zijn uitgevoerd met goedkeuring van het Animal Care and Use Committee van de Chinese Academy of Medical Sciences en Peking Union Medical College (goedkeuringsnummer: IRM/2-1ACUC-2311-015). Mannelijke Sprague-Dawley-ratten, 6 weken oud en ongeveer 250 g wegend, werden in dit onderzoek gebruikt. De dieren werden gehuisvest in een specifieke pathogeenvrije omgeving met ad libitum toegang tot een uitgebalanceerd voedseldieet en water. Ze werden bewaard onder een licht/donkercyclus van 12 uur bij een kamertemperatuur van 22 °C ± 2 °C. De dieren kregen 1 week de tijd om zich aan te passen aan de omgeving voordat ze chirurgische ingrepen ondergingen. De details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Apparatuur en materialen
- Anesthesieapparatuur: Gebruik een gasanesthesieapparaat voor kleine dieren en isofluraan.
- Chirurgische materialen: Bereid wattenstaafjes, jodoforisch ontsmettingsmiddel, een stereomicroscoop, een scheerapparaat, medische tape, een spuit van 1 ml met een naald van 27 g, spuit van 5 ml, spuit van 10 ml, normale zoutoplossing, gaas, 8-0 Nylon draden, 6-0 nylon draad met een hechtnaald, micro hemostatische klemmen, micropincet en fijne schaar.
- Andere materialen: Zorg voor injectienaalden van 19 G en 18 G die compatibel zijn met medische spuiten, een siliconenslang met een binnendiameter van 1,2 mm en een lengte van 10 cm, een infuusslang met een binnendiameter van 3,0 mm en een lengte van 20 cm, een centrifugebuis van 1,5 ml, een pipet en pipetpunten.
- Zelfgemaakte trombusgenerator en bloedstolselinjector (Figuur 1): Sluit de siliconenslang aan op de 19 G-doseernaald die is bevestigd aan een spuit van 1 ml om de trombusgenerator te maken. Sluit het ene uiteinde van de infuusslang aan op de 18 G-doseernaald en bevestig het andere uiteinde aan een spuit van 5 ml om de stolselinjector te maken.
2. Preparaat van autologe bloedstolsels
- Anesthesie
- Plaats het dier in de anesthesie-inductiekamer en dien een mengsel van 4% isofluraan toe met kamerlucht met een debiet van 2 l/min gedurende 2-3 minuten (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
- Plaats het dier in rugligging op het operatieplatform. Handhaaf de anesthesie door toediening van 2,5% isofluraan met een debiet van 0,4 l/min. Test de pedaalreflex om er zeker van te zijn dat er voldoende anesthesie wordt bereikt.
- Strek beide voorpoten horizontaal uit vanaf het lichaam en strek de achterpoten uit om de liesstreek adequaat bloot te leggen. Zet het dier in deze positie vast met behulp van medische tape (Figuur 2A).
- Bloedafname door de craniale vena cava (CVC)
- Verwijder de haren rond de manubrium met behulp van een scheerapparaat en ontharingscrème. Desinfecteer de huid met jodofoor.
- Steek de naald van 27 G die aan de spuit van 1 ml is bevestigd verticaal tot een diepte van 8 mm om de linker of rechter CVC te doorboren, zoals weergegeven in afbeelding 2A.
OPMERKING: De projectie van het lichaamsoppervlak van de CVC is 5 mm lateraal van het manubrium. Beide kanten kunnen worden gebruikt en de keuze heeft geen invloed op de volgende stappen. - Houd de spuit vast en trek de zuiger voorzichtig terug om onderdruk in het vat te creëren. Trek de naald geleidelijk terug totdat er bloed naar binnen stroomt en houd die positie vervolgens vast totdat er 0,3 ml bloed is verzameld (Figuur 2B).
- Preparaat van bloedstolsels
- Duw het verzamelde bloed in een centrifugebuis van 1,5 ml en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
- Zuig het bloed op in het siliconen buisje van de zelfgemaakte trombusgenerator tot de bloedkolom 10 cm lang is.
OPMERKING: Voer deze twee stappen snel uit, aangezien de coagulatie zal beginnen en zich zal voortplanten in de centrifugebuis, waardoor de kwaliteit van de geoogste bloedstolsels afneemt. - Wacht 30 minuten tot het bloed volledig is trombose. Bereid gedurende deze tijd op dezelfde manier bloedkolommen voor andere dieren voor.
- Spoel de trombosebloedkolom in een petrischaaltje met normale zoutoplossing en spoel de trombuskolom driemaal met normale zoutoplossing (Figuur 2C).
- Gebruik een fijne schaar om de trombuskolom in uniforme bloedstolsels te knippen, elk 4 mm lang (Figuur 2D). Zuig 10-20 stolsels op in de zelfgemaakte injector die vooraf is gevuld met 2 ml normale zoutoplossing.
OPMERKING: De lengte van de bloedstolsels mag niet langer zijn dan 1 cm, anders komen ze vast te zitten in de rechterhartkamer.
3. Voorbereiding van adertoegang
- Het blootleggen van de oppervlakkige epigastrische vaten
- Verdoof en fixeer het dier zoals beschreven in stap 2.1.
- Scheer het haar rond de linker liesstreek. Breng ontharingscrème aan op deze gebieden, wacht 1 minuut en veeg de crème vervolgens af met gaas. Desinfecteer de huid met jodofoor.
- Maak een incisie van 5 mm in de huid boven de oorsprong van de oppervlakkige epigastrische vaten in de liesstreek. Meestal kan de oorsprong van de oppervlakkige epigastrische vaten worden getraceerd door een kleine pulsatie in de liesstreek waar te nemen.
- Gebruik een stereomicroscoop met een vergroting van 10x en scheid een dunne laag onderhuids vet om de oppervlakkige epigastrische vaten bloot te leggen (Figuur 3A).
- Isoleren van de oppervlakkige epigastrische ader
- Isoleer de oppervlakkige epigastrische ader voorzichtig van de slagader, zenuw en vetweefsel. Voer dit zowel proximaal uit, tot het punt waar het in de dijbeenader uitmondt, als distaal, tot aan de eerste adervertakking.
- Ligaat de distale zijde met 8-0 Rijg en klem de draad vast met een microklem. Beheers de proximale zijde met een 8-0 draadlus bevestigd aan een andere microklem (Figuur 3B).
- Maak een kleine transversale incisie aan de distale zijde van de geïsoleerde ader. Beheers de proximale zijde om bloedingen te voorkomen. Spoel het resterende bloed in het aderlumen met een normale zoutoplossing. Zodra de ader vrij is, gebruikt u een micropincet om de veneuze incisie te vergroten.
4. Embolisatie
- Cannulatie van de ader
- Steek de naald van de zelfgemaakte injector voorzichtig in de ader via de aderincisie. Zet de naald vast met een derde klem om te voorkomen dat deze uit de ader glijdt.
- Embolisatie procedure
- Druk langzaam op de zuiger om een kleine hoeveelheid normale zoutoplossing toe te dienen. De volheid van de ader zonder weerstand duidt op een onbelemmerde toegang tot de ader (Figuur 3D).
- Blijf op de zuiger drukken om stolsels in de dijbeenader toe te dienen via de oppervlakkige epigastrische adertoegang. Regel de embolisatiesnelheid met 5 embolieën per minuut. Bewaak de ademhaling van het dier; Opkomende en verergerende kortademigheid duidt op succesvolle embolisatie.
- Na het injecteren van de vooraf bepaalde hoeveelheid bloedstolsels, trekt u de naald terug en bindt u de proximale zijde van de oppervlakkige epigastrische ader.
- Hecht de incisie vast en plaats het dier in een warme doos. Breng het dier over naar zijn kooi zodra het wakker is geworden.
5. Kwantificering van het infarctgebied
- Euthanasie en hartperfusie
- Voeg 25.000 E heparine-natrium toe aan 250 ml normale zoutoplossing en meng grondig. Sluit de fles aan op een infuusapparaat en hang de fles ondersteboven op een hoogte van 80 cm. Sluit de klep van het infuusapparaat.
- Euthanaseer de dieren met een overdosis isofluraan (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
- Knip de ribben af met een grote schaar en open de borstkas, waardoor schade aan de longen en grote bloedvaten wordt voorkomen.
- Steek de naald van het infuusapparaat in de linker hartkamer. Open de klep van het infuusapparaat om gehepariniseerde infusie met zoutoplossing mogelijk te maken. Gebruik een schaar om de inferieure vena cava te knippen en het linker aanhangsel om drainage mogelijk te maken. Regel de perfusiesnelheid bij 50 ml/min.
OPMERKING: Tijdens deze procedure wordt normaal longweefsel wit, terwijl de geëmboliseerde zone roestig blijft. - Na voltooiing van de perfusie met gehepariniseerde zoutoplossing, doorboort u de longslagaderstam door de rechterventrikel met behulp van een spuit van 10 ml gevuld met een 4% paraformaldehyde-oplossing. Fixeer het longweefsel door 4% paraformaldehydeperfusie door de longen uit te voeren voor een totaal volume van 30 ml.
- Introductie van een index genaamd Infarction Ratio
- Snijd na fixatie de longen, het hart, de luchtpijp, de slokdarm, de thymus en de grote bloedvaten als geheel weg uit de wervelkolom en het middenrif11.
- Verwijder voorzichtig de slokdarm, thymus en het vetweefsel uit de oorspronkelijke massa, zodat alleen het hart, de longen en de grote bloedvaten overblijven.
- Dompel het resterende deel gedurende ten minste 48 uur onder in een voldoende hoeveelheid paraformaldehydeoplossing van 4%.
- Gebruik een analytische balans om de hele longen te wegen. Gebruik een fijne schaar om het infarctgedeelte van de longen te scheiden en weeg het infarctweefsel met dezelfde balans. Bereken de infarctverhouding met behulp van de volgende vergelijking:
i is het gewicht van het infarctweefsel, w is het gewicht van de hele longen, i staat voor de infarctratio. - Na het kwantificeren van het infarctgebied, snijdt u het paraformaldehyde-gefixeerde longweefsel af voor paraffine-inbedding11.
6. Visualisatie van pulmonale arteriële boom
- Gieten van de longslagader
- Euthanaseer het dier en voer hartperfusie uit zoals beschreven in stap 5.1.
- Voeg een gelijke hoeveelheid (in gewicht) verdunningsmiddel toe aan de siliconengietmassa, meng het mengsel en voeg vervolgens 5% (in gewicht of volume) van het verharder toe. Mix het mengsel opnieuw.
- Zuig 1 ml van het mengsel in een spuit van 1 ml, laat de lucht ontsnappen en steek de naald via de rechterventrikel in de longslagader. Bevestig de naald aan de longslagader om slippen en terugstromen te voorkomen.
- Druk voorzichtig op de zuiger zodat het siliconengietmengsel de longslagader kan vullen. De normale longgebieden worden geverfd door het gietmengsel, terwijl de infarcten roestrood blijven.
OPMERKING: Het gieten van de longslagader mag alleen worden aangebracht op intact longweefsel. Meestal is 0,6-0,8 ml van het gietmengsel voldoende om de pulmonale arteriële boom te vullen. Overmatige injectie van het gietmengsel kan leiden tot het gieten van de longader, wat de visualisatie van de pulmonale arteriële boom beïnvloedt. Het gietmengsel moet binnen 20 minuten na het toevoegen van het uithardingsmiddel worden gebruikt, omdat het na deze tijd zal kristalliseren. - Trek de spuit terug na het gieten van perfusie, lig de longslagaderstam en oogst de longen, het hart en de grote bloedvaten zoals beschreven in stap 5.2. Doe de hele massa in een petrischaaltje en bewaar deze een nacht in een koelkast van 4 °C om het gietmengsel te laten kristalliseren.
- Clearing en visualisatie
- Verwijder het hart en de grote bloedvaten uit de longen met een schaar en verwijder vervolgens het restvuil van het uithardingsmengsel van het longoppervlak.
- Dompel de longen achtereenvolgens onder in oplossingen van 25%, 50%, 75%, 95% en 100% ethylalcohol, elk gedurende 24 uur. Deze procedure zal de longen volledig uitdrogen.
- Dompel de gedehydrateerde longen 24 uur onder in methylsalicylaat. Na dit opruimingsproces zal de pulmonale arteriële boom zichtbaar zijn en zijn de embolieën ook te zien, aangezien methylsalicylaat hemoglobine niet opruimt (Figuur 4B,D).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Symptomen en pathologie van het PE-model
Tijdens embolisatie ervoeren de ratten kortademigheid en vertoonde de thorax vergrote fluctuaties. Bijna alle dieren overleefden de longembolie-episode toen minder dan 10 cm bloedstolsels werden toegediend (14 van de 15 gemodelleerde dieren). Nadat ze waren teruggebracht naar hun kooien, krulden de dieren zich op in hoeken en toonden ze verminderde interesse in voedsel en water. Deze symptomen verdwenen echter snel en binnen en...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie werd met succes een minimaal invasief rattenmodel van PE met behulp van autologe bloedstolsels vastgesteld. Eenmaal onder de knie kan deze modelleringsprocedure binnen 30 minuten worden voltooid. Het model legt de belangrijkste kenmerken van klinische PE effectief vast, zoals bevestigd door pathologisch onderzoek. Bijgevolg biedt het een waardevol hulpmiddel voor het ophelderen van de hemodynamische veranderingen en pathogenese van complicaties na PE, het ontwikkelen van n...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Deze studie wordt ondersteund door een subsidie van Wu Jieping Medical Foundation (320.6750.19089-36).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Analytische balans | METTLER TOLEDO | MA55/A | Geen |
| Doseringsnaald | Jinrong elektronica | Geen | 19 G en 18 G |
| Fijne schaar | Steviger | XGJ1300 | Geen |
| Heparine natriumzout | Solarbio | 01-08-9041 | 140U/mg |
| Isofluraan | RWD | R510-22-10 | Geen |
| Methylsalicylaat | Macklin | M813577 | AR, 99% |
| Microklem | JZ | W40160 | Geen |
| Micro pincet | Steviger | XGN1310 | Geen |
| Siliconen gietstof | Flow Tech | MV-130 | Geen |
| Sprague-Dawley ratten | Vital River | SD-IGS | Geen |
| Stereomicroscoop | Murzider | MSD204 | Geen |
Referenties
- Götzinger, F., et al. Interventional therapies for pulmonary embolism. Nat Rev Cardiol. 20 (10), 670-684 (2023).
- Falster, C., et al. Comparison of international guideline recommendations for the diagnosis of pulmonary embolism. Lancet Haematol. 10 (11), e922-e935 (2023).
- Konstantinides, S. V., et al. ESC guidelines for the diagnosis and management of acute pulmonary embolism developed in collaboration with the European Respiratory Society (ERS). Eur Heart J. 41 (4), 543-603 (2020).
- Domínguez-Oliva, A., et al. The importance of animal models in biomedical research: Current insights and applications. Animals (Basel). 13 (7), 1223(2023).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: A review. Lab Anim Res. 38 (1), 18(2022).
- Tang, Z., et al. Gene expression profiling of pulmonary artery in a rabbit model of pulmonary thromboembolism. PLoS One. 11 (10), e0164530(2016).
- Deng, C., et al. Expression of tissue factor and forkhead box transcription factor o-1 in a rat model for chronic thromboembolic pulmonary hypertension. J Thromb Thrombolysis. 42 (4), 520-528 (2016).
- Runyon, M. S., Gellar, M. A., Sanapareddy, N., Kline, J. A., Watts, J. A. Development and comparison of a minimally-invasive model of autologous clot pulmonary embolism in Sprague-Dawley and Copenhagen rats. Thromb J. 8, 3(2010).
- Li, S. Q., et al. Comparative proteomic study of acute pulmonary embolism in a rat model. Proteomics. 7 (13), 2287-2299 (2007).
- Deng, C., et al. Role of FOXO1 and apoptosis in pulmonary vascular remolding in a rat model of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Sci Rep. 7 (1), 2270(2017).
- Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).
- Karpov, A. A., Vaulina, D. D., Smirnov, S. S., Moiseeva, O. M., Galagudza, M. M. Rodent models of pulmonary embolism and chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Heliyon. 8 (3), e09014(2022).
- Picazo, M. G., Benito, P. J., García-Olmo, D. C. Efficiency and safety of a technique for drawing blood from the hamster cranial vena cava. Lab Anim (NY). 38 (6), 211-216 (2009).
- Szabó, K. The cranial venous system in the rat: Anatomical pattern and ontogenetic development. Ii. Dorsal drainage. Ann Anat. 177 (4), 313-322 (1995).
- Li, C. Y., et al. The effects and mechanism of ginsenoside rg1 on myocardial remodeling in an animal model of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Eur J Med Res. 18 (1), 16(2013).
- Sullivan, D. M., Watts, J. A., Kline, J. A. Biventricular cardiac dysfunction after acute massive pulmonary embolism in the rat. J Appl Physiol (1985). 90 (5), 1648-1656 (2001).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
