Isolatie, zuivering en identificatie van bacitracine-producerende Bacillus licheniformis uit verse uitwerpselen van gezonde varkens

Samenvatting

Dit protocol geeft een volledige en uitgebreide beschrijving van het gedetailleerde proces voor de isolatie, zuivering en identificatie van bacitracineproducerende Bacillus licheniformis uit gezonde varkensuitwerpselen.

Samenvatting

Bacillus licheniformis en bacitracine hebben een enorme toepassingsmarkt en waarde op het gebied van geneeskunde, chemie, aquacultuur, landbouw en nevenproducten. Daarom is de selectie van B. licheniformis met een hoge productie van bacitracine van groot belang. In dit experimentele protocol werd Bacillus met een hoge opbrengst aan bacitracine geïsoleerd, gezuiverd en geïdentificeerd uit de verse uitwerpselen van gezonde varkens. Het remmende effect van secundaire metabolietbacitracine op Micrococcus luteus werd ook getest. Dunnelaagchromatografie en high-performance vloeistofchromatografie werden gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve detectie van bacitracine. De fysiologische en biochemische kenmerken van B. licheniformis werden bepaald door relevante kits. De fylogenetische relaties van B. licheniformis werden bepaald en geconstrueerd met behulp van gensequentiedetectie. Dit protocol beschrijft en introduceert het standaard isolatie-, zuiverings- en identificatieproces van B. licheniformis uit verse dierlijke uitwerpselen vanuit meerdere perspectieven, en biedt een methode voor het grootschalige gebruik van B. licheniformis en bacitracine in fabrieken.

Inleiding

Bacillus licheniformis is een soort Bacillus in de familie Firmicutes, die wijd verspreid is in verschillende omgevingen zoals water, bodem en darmen van dieren¹. B. licheniformis heeft een korte en stevige staafvormige structuur en beweegt individueel². De kolonie is bijna rond en dof, met een centrale uitstulping en nette randen van grijsachtig wit³. Het heeft een sterk groei- en voortplantingsvermogen en kan voedingsstoffen uit verschillende koolstofbronnen, zoals monosachariden, polysachariden, ketose en organische zuren, absorberen en gebruiken⁴. In het latere stadium van groei en ontwikkeling kan B. licheniformis bestaan in de vorm van slapende sporen en antibacteriële stoffen produceren, zoals bacitracine, lichenysine en oppervlaktefactine. Het is ook bestand tegen voedingstekorten en extreme externe omgevingen⁵. Er is geen duidelijke codonvoorkeur en het efficiënte secretiesysteem bepaalt de heterologe eiwitsecretie van B. licheniformis, die tweemaal zo groot is als die van Bacillus subtilis⁶. Het wordt vaak gebruikt om enzympreparaten zoals protease, amylase en cellulase⁷ te produceren. Vanwege het ontbreken van endogene gifstoffen is het gecertificeerd als een voedselveilige stam en vermeld op de QPS door EFSA⁸. Daarom zijn er verschillende mogelijke toepassingen, waaronder de productie van bioactieve stoffen, die een breed scala aan toepassingen hebben in de aquacultuur-, landbouw-, voedings-, biomedische en farmaceutische industrie. Ook is B. licheniformis een belangrijk onderdeel van de darmflora van dieren, die dieren kan bevorderen om de productieprestaties te verbeteren, de balans van de darmflora te verbeteren en ziekten te voorkomen. Het hele genoom van B. licheniformis ATCC14580 werd in 2004 geanalyseerd en de achtergrondinformatie over transcriptietranslatie, eiwitvouwing en secretiemechanisme is geleidelijk begrepen⁹. Deze genetische informatie maakt het bevorderlijk voor genetische modificatie op moleculair niveau en draagt bij aan het vergemakkelijken van de grootschalige productie van B. licheniformis.

Bacitracine is een dodecacyclisch peptide-antibioticum dat wordt geproduceerd door niet-ribosomaal peptidesynthetase door secundair metabolisme in B. subtilis en B. licheniformis. Bacitracine is een mengsel dat is samengesteld uit verschillende componenten zoals bacitracine A, B en C, waarbij een of twee aminozuren verschillen tussen elke component; Hiervan heeft bacitracine A de sterkste biologische activiteit¹⁰. Bacitracine kan grampositieve bacteriën zoals Staphylococcus en Micrococcus luteus en sommige gramnegatieve bacteriën remmen door de vorming van celwanden te remmen en te interageren met membraanbindende eiwitten¹¹. Ondertussen is bacitracine veilig en stabiel, niet gemakkelijk om resistentie tegen geneesmiddelen te produceren en kan het compatibel zijn met andere antibacteriële geneesmiddelen¹². Daarom wordt bacitracine gebruikt in de medische en veterinaire praktijk. Bovendien kan het vanwege zijn snelle eliminatiesnelheid en lage absorptiesnelheid ook worden gebruikt als additief voor diervoeder¹³.

B. licheniformis kan de darm koloniseren en de gastro-intestinale micro-omgeving verbeteren. De hechting en het voortplantingsvermogen en de daarmee samenhangende fysiologische functies van Bacillus uit verschillende bronnen in het maagdarmkanaal van verschillende dieren zijn verschillend. Van varkens afgeleide B. licheniformis is meer bevorderlijk voor kolonisatie in de darmen van varkens en ander vee. Er is een nauw verband tussen de relatieve overvloed aan intestinale probiotica en de gezondheidstoestand van gastheer¹⁴. Voedingssuppletie met B. licheniformis mix bij gespeende biggen verbetert het darmecosysteem door de samenstelling van de microbiota en de metabolische activiteit te veranderen, en beïnvloedt ook het darmslijmvlies¹⁵. Uitwerpselen van dieren kunnen een weerspiegeling zijn van het type en de hoeveelheid darmflora van dieren. Dit protocol beschrijft de isolatie en zuivering van bacitracineproducerende Bacillus spp. uit gezonde varkensuitwerpselen. De uitwerpselen zijn afkomstig van Taihu-zeugen die niet worden gevoed met mengvoer en uitstekende productieprestaties leveren in varkenshouderijen. De isolaten werden geïdentificeerd als B. licheniformis op basis van hun morfologische kenmerken, fysisch-chemische eigenschappen en biochemische identificatie.

Protocol

Alle experimentele procedures werden gedocumenteerd en goedgekeurd door de ethische commissie van de Nanjing Tech University. De uitwerpselen waren afkomstig van Taihu-zeugen van ongeveer 2 jaar oud (zie materiaaltabel), die werden grootgebracht op professionele en standaard varkenshouderijen.

1. Voorbereiding van de media

1. Luria-Bertani (LB) vloeibaar medium: Voeg 10 g NaCl, 5 g gistextractpoeder en 10 g trypton toe aan een conische fles, voeg gedestilleerd water toe aan 1 L, roer en los op met een glazen staaf. Breng 100 ml medium over naar een conische fles van 500 ml en bind deze stevig vast met ademende afdichtingsfolie. Steriliseer bij 121 °C in een autoclaaf gedurende 20 minuten (zie Materiaaltabel).
2. LB vast medium: Voeg 10 g NaCl, 5 g gistextractpoeder, 10 g trypton, 20 g agarpoeder toe aan een conische fles, voeg gedestilleerd water toe aan 1 L, los op met een glazen staaf en bind stevig vast met een ademende afdichtingsfilm. Steriliseer bij 121 °C in een autoclaaf gedurende 20 min. Wanneer het medium is afgekoeld tot 50 °C, giet je 20 ml van het medium in petrischaaltjes, laat je ze afkoelen en bewaar je ze ondersteboven.
3. Fermentatiemedium bacitracine: Voeg 8 g sojaschroot, 4 g oplosbaar zetmeel, 0,1 g (NH₄)₂SO₄, 0,6 g CaCO₃ en 100 ml gedestilleerd water toe aan een conische fles van 500 ml, roer met een glazen staaf om goed op te lossen en bind stevig vast met een ademende afdichtingsfilm. Steriliseer bij 121 °C in een autoclaaf gedurende 20 minuten (zie Materiaaltabel).
4. M. luteus suspensie: Selecteer een ring van M. luteus en inoculeer op een LB-kweekplaat, bereid in stap 1.2 (zie Materiaaltabel). Kweek in een incubator met constante temperatuur bij 37 °C gedurende 16 uur (zie materiaaltabel). Voeg 5 ml normale zoutoplossing toe aan het bord en schud voorzichtig om de kolonies te lueren. Meet de OD600 en verdun de oplossing in een reageerbuis om een suspensie met OD600 van 0,3-0,7 te krijgen. Bewaar de suspensie van M. luteus bij 4 °C voor later gebruik.
5. Antibacterieel testmedium: Voeg 1 ml M. luteus-suspensie , bereid in stap 1.4, toe aan 100 ml vloeibaar LB vast medium bereid in stap 1.2 en schud lichtjes. Neem onmiddellijk 5 ml van deze oplossing met M. luteus en verdeel het gelijkmatig over de LB-kweekplaat.

2. Isolatie en zuivering van Bacillus uit verse uitwerpselen van gezonde varkens

1. Voeg 9 ml normale zoutoplossing en 1,0 g verse varkensuitwerpselen toe aan een erlenmeyer van 150 ml. Roer met een magnetische roerder (zie Materiaaltabel) bij kamertemperatuur bij 60 tpm/min gedurende 15 min.
2. Doe het fecale extract gedurende 20 minuten in een waterbad van 80 °C (zie materiaaltabel) om bacteriën die geen sporen produceren te doden.
3. Voeg de suspensie toe aan 100 ml LB vloeibaar medium in een erlenmeyer van 250 ml en kweek in een schudder (zie materiaaltabel) bij 180 tpm/min bij 37 °C gedurende 8 uur.
4. Voer seriële verdunning uit van de gekweekte bacteriële oplossing met normale zoutoplossing van ^10-1 tot ^10-8. Breng 0,1 ml 10-6, ^10-7 en ^10-8 bacterieel verdunningsmiddel aan op individuele ^{LB-kweekplaten} en laat drogen. Plaats de platen na 10 minuten ondersteboven in een incubator met constante temperatuur bij 37 °C gedurende 48 uur.
5. Gebruik de inoculatiering om de kolonies te kiezen die lijken op B. licheniformis (roomwitte kleur, zachte consistentie, slijmerig uiterlijk, convex en vlakke elevatie en onregelmatige vorm)¹⁶en streep ze met behulp van een zigzagpatroon op het antibacteriële activiteitstestmedium dat in stap 1.5 is voorbereid (zie figuur 1).
6. Plaats de platen gedurende 48 uur bij 37 °C in de broedmachine en observeer of er een remmingszone rond de kolonie is.

3. Screening op remming van de activiteit van M. luteus

1. Selecteer een enkele kolonie die een remmende zone heeft gegenereerd en voeg toe aan 100 ml LB vloeibaar medium, kweek in de shaker bij 37 °C en 180 tpm/min gedurende 12 uur.
2. Inoculeer 5 ml van het kweekmedium in het in stap 1.3 bereide bacitracinefermentatiemedium en kweek gedurende 48 uur bij 37 °C.
3. Vang de fermentatiebouillon op in een centrifugebuis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 13.400 x g bij 4 °C en filtreer vervolgens met behulp van een microporeus filtermembraan van 0,22 μm (zie materiaaltabel).
4. Voeg een Oxford-beker toe aan een verse mediumplaat met antibacteriële activiteitstest en voeg vervolgens 50 μL filtraat (fermentatiesupernatant) toe aan de Oxford-beker (zie materiaaltabel). Kweken in een broedmachine bij 37 °C gedurende 12 uur. Meet na de incubatie de diameter van de remmende zone met een schuifmaat (zie materiaaltabel).
5. Selecteer de stammen en het bijbehorende fermentatiesupernatans met een remmende zonediameter van meer dan 15 mm voor latere experimenten.

4. Identificatie van bacitracine door middel van dunnelaagchromatografie

1. Voeg 60 mg bacitracine standaard toe en los op in 1% EDTA-2Na (zie materiaaltabel) in een volumetrische fles van 10 ml om een 6,0 mg/ml bacitracineoplossing te maken.
2. Verdun 1 ml van het fermentatiemiddel tot 10 ml met 1% EDTA-2Na. Spot 5 μl monster en 5 μl standaardbacitracineoplossing op de geactiveerde silicagelplaat met dunne lagen (zie materiaaltabel).
3. Voeg 100 ml n-butanol-azijnzuur-water-pyridine-ethanol (60:15:10:6:5) toe aan de chromatografische tank (zie materiaaltabel). Plaats de dunne laag silicagel in de chromatografische tank. Dek af en laat het 30 minuten op kamertemperatuur staan.
4. Verwijder de dunne laagplaat van silicagel, spuit butanol-pyridineoplossing (99:1) met 1% ninhydrine (zie materiaaltabel) en verwarm gedurende 5 minuten bij 105 °C tot er bruinrode vlekken verschijnen. Bereken R_f (Retention Factor Value) voor de standaard en de steekproef volgens de volgende formule:
   R_f = Spot-reisafstand/Oplosmiddel-reisafstand.

5. Detectie van bacitracine door HPLC

1. Voeg 0,3 ml fermentatiemiddel en 1,2 ml 50% ethanol toe aan een microcentrifugebuis van 2 ml, schud gedurende 5 minuten met de hand en laat 12 uur bij 4 °C staan.
2. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 13.400 x g en filtreer in een monsterfles met het label S1 met een microporeus filtermembraan van 0,22 μm (zie materiaaltabel).
3. Bereiding van de moederbacitracineoplossing: Voeg 0,4 g bacitracine standaard (60 E/mg; zie materiaaltabel), 100 ml 40 g/l EDTA-2Na (zie materiaaltabel) toe aan een maatkolf van 100 ml om 240 E/ml moederbacitracine te bereiden.
4. Voeg 3 ml bacitracine-moederoplossing en 21, 9, 3, 1 en 0 ml ultrapuur water toe aan reageerbuisjes met respectievelijk het label A1, B1, C1, D1 en E1. Na filtratie met een microporeus filtermembraan van 0,22 μm doet u het filtraat in monsterflesjes met het label A2, B2, C2, D2 en E2.
   OPMERKING: De concentraties van de standaardbacitracineoplossing zijn 30, 60, 120, 180 en 240 E/ml.
5. Plaats A2, B2, C2, D2, E2 en S1 in de testbak van het HPLC-instrument. Plaats 1000 ml 50 mM/L ammoniumformiaat en 1000 ml acetonitril in de mobiele fasebak en stel ze in als mobiele fasen A en B, respectievelijk.
   OPMERKING: De pH van ammoniumformiaat moet met mierenzuur worden ingesteld op 4,0.
6. Installeer de C18 (5 μm, 4,6 mm x 250 mm) HPLC-kolom in de richting die op de kolom is aangegeven (zie materiaaltabel).
7. Stel de parameters van de mobiele fase in op 0 min, 77% A en 23% B; 30 min, 70% A en 30% B; 40 min, 60% A en 40% B; 50 min, 60% A en 40% B; 51 min, 77% A en 23% B; 58 min, 77% A en 23% B. Stel de steekproefgrootte in op 100 μL; Debiet, 1,0 ml/min; Kolomtemperatuur: 30 °C.
8. Klik op de knop Uitvoeren om het programma uit te voeren.

6. Morfologische identificatie

1. Verdun en bestrijk de stam met de hoogste bacitracine-titer op een LB-kweekplaat en kweek in een broedmachine bij 37 °C gedurende 48 uur. Kleur en observeer de morfologie van de kolonie zoals hieronder beschreven.
2. Voeg een druppel steriel gezuiverd water toe aan de glijbaan, pak een kleine hoeveelheid kolonies op en voeg toe aan de waterdruppel. Smeer gelijkmatig uit, laat de dia op natuurlijke wijze drogen en bevestig hem vervolgens op een vlam.
3. Voeg kristalviolet gedurende 1 minuut toe om het monster te kleuren en spoel vervolgens af met kraanwater. Voeg jodium toe gedurende 1 minuut om het monster te bevlekken en spoel vervolgens af met gedestilleerd water.
4. Voeg 95% alcohol toe, schud de dia om te ontkleuren gedurende 1 minuut en spoel vervolgens af met gedestilleerd water.
5. Voeg saffraan toe gedurende 1 minuut om het monster te kleuren en spoel vervolgens af met gedestilleerd water. Laat het objectglaasje op natuurlijke wijze drogen en observeer de morfologie van de kolonie onder een microscoop met een olie-onderdompeling (zie Materiaaltabel).

7. Fysiologische en biochemische identificatie

1. Voeg 2 ml steriele zoutoplossing toe aan de reageerbuis en inoculeer een enkele kolonie van de plaat in de steriele zoutoplossing met behulp van een inoculatiering om bacteriële suspensie te verkrijgen.
2. Voeg 100 μL van de bacteriële suspensie toe aan elk gat voor het meten van V-P, citraat, gelatine, 7% natriumchloride, pH 5,7, nitraatreductie en zetmeelhydrolyse op de biochemische identificatiestrip van Bacillus (zie materiaaltabel).
3. Gebruik de inoculatiering om een andere kolonie te kiezen en streep ze in het zigzagpatroon op de anaërobe groei biochemische buis van de Bacillus biochemische identificatiestrip.
4. Gebruik de inoculatiering om de andere kolonies te plukken en prik ze verticaal in de poriën voor identificatie van propionaat, D-xylose, L-arabinose en D-mannitol op de biochemische identificatiestrip van Bacillus .

8. Bepaling van de sequentie van het stamgen

1. Extraheer het DNA van de stam met behulp van een DNA-extractiekit voor bacteriën (zie materiaaltabel): Voeg 2 ml zaadvloeistof toe aan een microcentrifugebuis van 5 ml en centrifugeer gedurende 1 minuut op 11.500 x g. Gooi het supernatant weg en voeg 110 μl buffer (met 20 mM Tris, pH8.0; 2 mM Na 2-EDTA en 1,2% Triton) en 70 μl 50 mg/ml lysozymoplossing toe aan de pellet en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
2. Voeg 4 μL 100 mg/ml RNase A toe gedurende 15 s en laat 5 min op kamertemperatuur staan. Voeg 20 μL proteïnase K-oplossing toe en meng goed.
3. Voeg 220 μL buffer GB toe, schud gedurende 15 s tot de pellet is gesuspendeerd, plaats gedurende 10 minuten op 70 °C om de oplossing helder te maken en draai kort om de waterdruppels op de buiswand te verwijderen.
4. Voeg 220 μL watervrije ethanol toe, schok volledig gedurende 15 s, korte scheiding. Breng de oplossing en het vlokneerslag over naar de adsorptiekolom CB3 van de verzamelbuis, centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi het supernatant weg.
5. Voeg 500 μL buffer GD toe aan de adsorptiekolom, centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi het supernatant weg. Voeg 600 μL PW toe aan de kolom, centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi het supernatant weg.
6. Plaats de adsorptiekolom terug in de opvangbuis, centrifugeer gedurende 2 minuten bij 13.400 x g en gooi het supernatant weg.
7. Zet de adsorptiekolom 10 minuten op kamertemperatuur om te drogen. Breng de kolom over naar de centrifugebuis en voeg 100 μL eluatiebuffer TE toe aan het midden van het adsorptiemembraan.
8. Laat 5 minuten op kamertemperatuur staan om de stroom in de centrifugebuis op te vangen en centrifugeer gedurende 2 minuten op 13.400 x g.
9. Voeg 25 μL 2x mastermix (zie Materiaaltabel), 2,5 μL DNA-monster verkregen in stap 8.8, 2 μL 27F forward primer, 2 μL 1492R reverse primer en 18,5 μL dubbel gedestilleerde H₂O toe aan een PCR-buisje van 0,1 ml.
   OPMERKING: De gensequenties van de primers zijn 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' en 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
10. Plaats het PCR-buisje in de PCR-machine (zie materiaaltabel) onder de volgende omstandigheden: voordenaturatie bij 95 °C gedurende 10 min, denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s, gloeien bij 55 °C gedurende 30 s, verlenging bij 72 °C gedurende 90 s, verlenging bij 72 °C gedurende 7 min. Voer de denaturatie-, gloei- en verlengingscyclus in drie stappen 32x uit.
11. Neem 5 μL van het product en voer elektroforese uit met 1% agarosegel bij 120 V gedurende 30 minuten.
    1. Los 500 mg agarose op in 50 ml 1x TAE-buffer. Verwarm de oplossing 1-2 minuten in de magnetron tot de agarose volledig is opgelost. Voeg 5 μL DNA-kleurstof toe, giet het in een geltray en breng de openingsplaat in. Laat 30 minuten op kamertemperatuur staan tot het stolt; doe de gel in de elektroforesetank en voeg 1x TAE-buffer toe om de gel onder te dompelen. Voeg 2 μL 2 kb DNA-ladder (10 mg/μL) toe aan het eerste putje en 5 μL PCR-product gemengd met 1 μL ladende kleurstof aan de resterende putjes in de gel.
12. Plaats de gel in het gel imaging systeem en maak een foto. Knip de DNA-strips snel af onder ultraviolet licht en weeg.
13. Voeg de strips toe aan een microcentrifugebuisje en voeg een gelijk volume PN-oplossing toe. Houd de tube in een waterbad bij 50 °C totdat de gel volledig is opgelost.
14. Voeg 500 μL evenwichtsvloeistof BL toe aan de adsorptiekolom CA2, centrifugeer op 13.400 x g gedurende 1 minuut en gooi het supernatant weg.
15. Voeg de opgeloste geloplossing toe aan de adsorptiekolom CA2 en plaats deze 2 minuten op kamertemperatuur, centrifugeer deze gedurende 30 s op 13.400 x g en gooi het bovenstaande weg.
16. Voeg 600 μL PW toe aan de adsorptiekolom CA2, centrifugeer op 13.400 x g gedurende 1 min, gooi het supernatant weg en herhaal 1x.
17. Plaats de adsorptiekolom CA2 in een opvangbuis, centrifugeer gedurende 2 minuten bij 13.400 x g en gooi het bovenstaande weg.
18. Plaats de adsorptiekolom CA2 gedurende 10 minuten op kamertemperatuur om goed te drogen en plaats deze vervolgens in een schone centrifugebuis.
19. Voeg 50 μl eluatiebuffer EB toe aan de adsorptiefilm die gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur is gesuspendeerd en verzamel de DNA-oplossing door centrifugeren bij 13.400 x g gedurende 2 minuten.
    OPMERKING: De bovengenoemde oplossingen of reagentia zijn inbegrepen in de zuiveringskit (zie materiaaltabel).
    1. Stuur de verzamelde DNA-oplossing naar een professioneel sequencingbedrijf (zie Materiaaltabel) voor sequencing. Vergelijk de sequencingresultaten van Blast in de GenBank-database van NCBI. Selecteer volgens de sequentiehomologie verschillende stammen en construeer fylogenetische bomen met behulp van de maximale waarschijnlijkheidsmethode in MEGA-X om de soortrelaties van de stammen te bepalen.

Resultaten

In dit experiment werden 48 stammen van Bacillus geïsoleerd uit verse uitwerpselen van gezonde varkens, genummerd van 1001 tot 1048. Onder hen hadden 15 stammen antibacteriële activiteit tegen M. luteus. Van de 15 stammen werden de titers van bacitracine gemeten met behulp van high-performance vloeistofchromatografie, zoals weergegeven in tabel 1. Onder hen had B. licheniformis nr. 1026 de hoogste bacitracine-titer, 456,35 ± 21,75 E/ml, dus nr. 1026 werd geselecteerd voor latere experimenten.

De identificatieresultaten door TLC worden weergegeven in figuur 2A. De positie van de belangrijkste vlekken in de fermentatiebouillon van stam nr. 1026 en de standaardoplossing van bacitracine was hetzelfde en de _Rf-waarde was 0,61. Voor HPLC-analyse is de standaardcurvevergelijking van bacitracine y = 50,287x - 250,55 en de correlatiecoëfficiënt R² = 0,9968 (figuur 2B). De piektijd van het fermentatiesupernatant kwam overeen met de bacitracinestandaard (figuur 2C), dus de bacteriostatische stof werd geïdentificeerd als bacitracine en de titer van bacitracine was 456,35 ± 21,75 E/ml.

De kolonie van stam nr. 1026 werd gedurende 12 uur gekweekt op LB-medium, zoals weergegeven in figuur 3A. De kolonie was rond en transparant in de vorm van waterdruppels, met volle uitsteeksels en nette randen. Van 12 uur tot 24 uur gingen de bacteriën de latere groeistadia in. Zoals te zien is in figuur 3B, verspreidden de kolonies zich in een pruimvorm, het gevormde centrum vouwde zich en de kleur verdiepte zich geleidelijk tot melkwit. Het komt overeen met de beschrijving van de koloniemorfologie van B. licheniformis¹⁶. Er was een transparant slijm aan de rand. Na Gram-kleuring werd stam nr. 1026 onder de microscoop waargenomen, zoals weergegeven in figuur 3C. De cellen waren paarse staafjes, wat wijst op Gram-positieve bacteriën.

Zoals te zien is in tabel 2, zou stam nr. 1026 kunnen groeien in een anaërobe omgeving. De stam testte positief op VP-test, citraatgebruik, nitraatreductie en zetmeelhydrolyse. De stam was in staat om de meeste koolstofbronnen te ontbinden en te gebruiken. Het had dezelfde fysiologische en biochemische kenmerken als B. licheniformis.

De 16S rDNA-fragmentgrootte van stam nr. 1026 was ongeveer 1400 bp groot (Figuur 4A). De sequentieresultaten van stam nr. 1026 vertoonden 99,58% gelijkenis met die van B. licheniformis DSM 13 in GenBank. De fylogenetische boom werd vervolgens geconstrueerd, zoals weergegeven in figuur 4B. De evolutionaire taklengte van B. licheniformis DSM 13 is 0.000, wat aangeeft dat het B. licheniformis is.

Op basis van de morfologische, fysiologische en biochemische kenmerken van stam nr. 1026 en de homologieanalyse van de 16S rDNA-gensequentie, werd stam nr. 1026 geïdentificeerd als B. licheniformis.

Figuur 1: Schematisch schema van de inoculatie van de stam. De inoculatiering werd gebruikt om de kolonies te plukken en ze in een zigzagpatroon te markeren op het antibacteriële activiteitstestmedium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Identificatie van bacteriostatische stoffen. (A) Dunnelaagchromatografie. (B) HPLC-standaardcurve van bacitracine. (C) HPLC-chromatogram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Morfologische kenmerken en gramkleuring van stam nr. 1026. Koloniemorfologie bij (A) 12 uur en (B) 24 uur. (C) Gramkleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Moleculair biologische identificatie van stam nr. 1026. (A) Genamplificatie van stam nr. 1026 16S rDNA. (B) Fylogenetische boom van stam nr. 1026. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

NEE.	Bacritieter (U/ml)	NEE.	Bacritieter (U/ml)
1003	423.57±18.62 Overige	1021	317.46±13.46 Overige
1004	EUR-Lex - 325.82±13.23 - NL	1026	456.35±21.75 Overige
1009	326.26±14.52 Overige	1027	435.57±19.18
1011	376.65±16.11 Overige	1030	382.48±17.64 Overige
1015	325.27±12.37 Overige	1031	215.37±11.73 Overige
1016	256.56±15.37 Overige	1039	EUR-Lex - 353.67±16.16 - NL
1017	352.47±16.47 Overige	1041	342.36±14.36 Overige
1018	EUR-Lex - 328.73±16.12 - NL

Tabel 1: De bacitracinetiter van antibacteriële activiteitsstammen.

Items	Resultaten	Items	Resultaten
Anaërobe groeitest	+	D-mannitol-test	+
V.P-test	+	Gelatine test	+
Test voor het gebruik van citraat	+	7%NaCl-test	+
Propionaat test	+	pH5.7-test	+
D-xylose test	+	Nitraatreductie test	+
L-arabinose	+	Hydrolysetest voor zetmeel	+

Tabel 2: Fysiologische en biochemische identificatie van stam nr. 1026.

Discussie

B. licheniformis groeit snel met eenvoudige kweekomstandigheden en snelle suikerconsumptie, en de volwassen fermentatietechnologie is nuttig bij het besparen van industriële productiekosten¹³. De brede toepassing van B. licheniformis en zijn afscheidingen, bacitracine, heeft de veelbelovende marktwaarde bepaald. In de landbouw wordt B. licheniformis gebruikt als biomeststof om de plantengroei en de opname van voedingsstoffen te verbeteren door de bodemvruchtbaarheid te verbeteren, de wortelontwikkeling te bevorderen en te helpen bij de afbraak van organisch materiaal¹⁵. Voor de industriële productie van enzymen produceert B. licheniformis een reeks enzymen zoals proteasen, amylasen, cellulasen en lipasen, wat de onvervangbare marktwaarde ervan bepaalt in de voedselverwerking, de productie van wasmiddelen, de leerverwerking en de textielindustrie¹⁶. Gezien de superieure antibacteriële farmacologische werking van B. licheniformis en bacitracine, is het in de medische sector gebruikt voor de behandeling van een verscheidenheid aan infectieziekten veroorzaakt door bacteriën en schimmels¹. Ondertussen, gezien de groei van kruidenplanten en de accumulatie van farmacologisch actieve ingrediënten in planten, is B. licheniformis een potentiële versterker van plantengroei en nuttig voor de productie van verbindingen zoals van Rhodiola afgeleid salidroside^17,18. De bovenstaande voordelen van B. licheniformis en bacitracine maken ze zeer bruikbaar in de industrie, landbouw, aquacultuur, biotechnologie en medische industrie. Daarom is de scheiding en zuivering van B. licheniformis met een hoog gehalte aan bacitracine een doorslaggevende factor om de latere grootschalige productie en toepassing te garanderen.

Hoewel bacitracine kan worden bereid door chemische synthese, zijn de stappen omslachtig en zijn er veel bijproducten. In de industrie wordt bacitracine voornamelijk geproduceerd door het secundaire metabolische proces van maïsmeel en sojameel gefermenteerd door B. licheniformis. In de moderne industriële productie van bacitracine belemmeren hoge kosten en lage opbrengst de verdere toepassing ervan¹⁰. Daarom zijn het screenen van bacitracinestammen met een hoog rendement en het verbeteren van de benuttingsgraad van grondstoffen de sleutel tot het verbeteren van de productie van bacitracine.

Op dit moment vindt het kweken van bacitracinestammen met een hoge opbrengst voornamelijk plaats door middel van natuurlijke veredeling uit de bodem en andere milieus, mutatieveredeling met behulp van bestaande bacitracineproducerende stammen of veredeling op basis van genetische manipulatie. De natuurlijke kweekoperatie is eenvoudig en de gescreende stammen hebben een stabiele productiecapaciteit, maar het proces duurt lang en de werkdruk is groot. Mutatieveredeling heeft een hoge mutatiesnelheid en verkort de broedtijd, maar de mutatie kan mogelijk niet stabiel worden overgeërfd in volgende generaties¹⁶. Veredeling op basis van genetische manipulatie is meer gericht op het verkrijgen van stammen met een hoge opbrengst¹⁰, maar er zijn veiligheidsproblemen veroorzaakt door de introductie van exogene genen. Gezonde uitwerpselen van volwassen dieren bevatten overvloedige probiotische bronnen die het evenwicht van de flora kunnen behouden.

In dit artikel, gebaseerd op de kenmerken van B. licheniformis om slapende sporen te produceren in extreme omgevingen¹⁹, werd de verdunning van gezonde varkensuitwerpselen in een omgeving met hoge temperaturen geplaatst om de hittebestendige, niet-sporenproducerende bacteriën en schimmels te doden. Omdat M. luteus gevoelig is voor de productie van bacteriostatische peptiden door B. licheniformis in het late groeistadium en een geel pigment produceert voor gemakkelijke observatie, wordt het gebruikt om de antibacteriële activiteit te screenen op basis van de beoordeling van de remmingszone. Volgens de koloniemorfologie die vergelijkbaar is met de morfologie van B. licheniformis, is de celmorfologie kort staafvormig, Gram-positieve, fysiologische en biochemische kenmerken van B. licheniformis, 16 s RNA is nauw verwant aan B. licheniformis, om te bepalen dat de stam nr. 1026 B. licheniformis is. De bacteriostatische stof werd door TLC en HPLC geïdentificeerd als bacitracine. Zo werd bacitracine-producerende B. licheniformis verkregen. Deze methode heeft ook tekortkomingen, zoals dat het screeningsproces lang duurt en de operatie enige ervaring vereist.

Samenvattend heeft dit experimentele protocol uitgebreid en gedetailleerd het acquisitie- en routinematige laboratoriumidentificatieproces van bacitracineproducerende B. licheniformis geïntroduceerd, dat een breed toepassingsperspectief en een onschatbare marktwaarde heeft²⁰. Deze methoden zijn eenvoudig, haalbaar en gemakkelijk te implementeren en zullen ongetwijfeld een effectieve referentie zijn voor grootschalige productie van B. licheniformis. Dit artikel biedt ook een screeningsidee voor de productie van stammen voor andere antimicrobiële peptiden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2 × Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,China	P252-01
2kb DNA Marker	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	BM121-01
Acetonitrile	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	A104443
Agar poeder	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	A800730
Agarose	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	A104062
Ammoniumsulfaat ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10002917
Autoclaaf sterilisator	Zealway Instrument Inc., Xiamen, China	GI36DWS
Bacillus biochemische identificatiestrip	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HBIG14
Bacitracine	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	B65740
Bacterie DNA Extractie Kit	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, China	DP209
Ademende afdichtingsfolie	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
Butanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	B433378
C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) HPLC kolom	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, China	C1805-462510
Calciumcarbonaat (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10005717
Centrifuge	New Brunswick Scientific Co., Inc., UK	5452
Chromatografische tank	Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, China	P-1
Kegelfles	Sichuan Shubo Co., Ltd., Chengdu, China	18012
Incubator met constante temperatuur	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, China	GH4500
Dipotashfosfaat (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, China	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	E397526
Elektronische weegschaal	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
Ethylalcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	E130059
Gel Midi Zuiveringskit	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, China	DP302
Glasmaatje	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Glucose	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	D823520
Gram's kleurstofoplossing kit	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HB8278
Hoge prestatie vloeistof chromatograaf	Agilent Technologies, Inc., California, America	1260
Horizontaal elektroforeseapparaat	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	DYCP-31DN BIOMATE
Inoclatiering	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	3171026
Magneetroerder	Wiggens GmbH Co., Ltd., Germany	WH220 PLUS
Methylalcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, China	M116115
Microcentrifugebuisje	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection, Suzhou, China	BNCC102589
Microporeuze filtermembraan	Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.	PES0.22
Ninhydrine	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	N105629
Optische microscoop	Optical Instrument Factory, Shanghai, China	DYS-108
Varkensmest	Nanjing Quanfu Pig Farm, Nanjing, China
Polymerasekettingreactie (PCR) Versterker	Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, China	ETC811
Professioneel sequencing bedrijf	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
Pyridien	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	P111516
Schakelaar	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd.,Taicang, China	HYL-C
Silica gel GF254 dunne laagplaat	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, China	HPT-HSGF5025023
Natriumchloride (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S805275
Natriumcitraat	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	C39197100001
Oplosbare zetmeel	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S817547
Thermostaat waterbad	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, China	DK-8D
Trypton	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,China	GR501-01
Ultra puur water instrument	Merck KGaA Co., Ltd., Germany	Milli Direct-Q8
Ultrasoon reinigingsapparaat	Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, China	SB-100DT
Schuifmaat	Sanfeng Company, Japan	N20P
Gist extract poeder	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	LP0021