Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie, zuivering en identificatie van bacitracine-producerende Bacillus licheniformis uit verse uitwerpselen van gezonde varkens

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66777

⸱

31 mei 2024

 , 
1College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol geeft een volledige en uitgebreide beschrijving van het gedetailleerde proces voor de isolatie, zuivering en identificatie van bacitracineproducerende Bacillus licheniformis uit gezonde varkensuitwerpselen.

Samenvatting

Bacillus licheniformis en bacitracine hebben een enorme toepassingsmarkt en waarde op het gebied van geneeskunde, chemie, aquacultuur, landbouw en nevenproducten. Daarom is de selectie van B. licheniformis met een hoge productie van bacitracine van groot belang. In dit experimentele protocol werd Bacillus met een hoge opbrengst aan bacitracine geïsoleerd, gezuiverd en geïdentificeerd uit de verse uitwerpselen van gezonde varkens. Het remmende effect van secundaire metabolietbacitracine op Micrococcus luteus werd ook getest. Dunnelaagchromatografie en high-performance vloeistofchromatografie werden gebruikt voor de kwalitatieve en kwantitatieve detectie van bacitracine. De fysiologische en biochemische kenmerken van B. licheniformis werden bepaald door relevante kits. De fylogenetische relaties van B. licheniformis werden bepaald en geconstrueerd met behulp van gensequentiedetectie. Dit protocol beschrijft en introduceert het standaard isolatie-, zuiverings- en identificatieproces van B. licheniformis uit verse dierlijke uitwerpselen vanuit meerdere perspectieven, en biedt een methode voor het grootschalige gebruik van B. licheniformis en bacitracine in fabrieken.

Inleiding

Bacillus licheniformis is een soort Bacillus in de familie Firmicutes, die wijd verspreid is in verschillende omgevingen zoals water, bodem en darmen van dieren1. B. licheniformis heeft een korte en stevige staafvormige structuur en beweegt individueel2. De kolonie is bijna rond en dof, met een centrale uitstulping en nette randen van grijsachtig wit3. Het heeft een sterk groei- en voortplantingsvermogen en kan voedingsstoffen uit verschillende koolstofbronnen, zoals monosachariden, polysachariden, ketose en organische zuren, absorberen en gebruiken4. In het latere stadium van groei en ontwikkeling kan B. licheniformis bestaan in de vorm van slapende sporen en antibacteriële stoffen produceren, zoals bacitracine, lichenysine en oppervlaktefactine. Het is ook bestand tegen voedingstekorten en extreme externe omgevingen5. Er is geen duidelijke codonvoorkeur en het efficiënte secretiesysteem bepaalt de heterologe eiwitsecretie van B. licheniformis, die tweemaal zo groot is als die van Bacillus subtilis6. Het wordt vaak gebruikt om enzympreparaten zoals protease, amylase en cellulase7 te produceren. Vanwege het ontbreken van endogene gifstoffen is het gecertificeerd als een voedselveilige stam en vermeld op de QPS door EFSA8. Daarom zijn er verschillende mogelijke toepassingen, waaronder de productie van bioactieve stoffen, die een breed scala aan toepassingen hebben in de aquacultuur-, landbouw-, voedings-, biomedische en farmaceutische industrie. Ook is B. licheniformis een belangrijk onderdeel van de darmflora van dieren, die dieren kan bevorderen om de productieprestaties te verbeteren, de balans van de darmflora te verbeteren en ziekten te voorkomen. Het hele genoom van B. licheniformis ATCC14580 werd in 2004 geanalyseerd en de achtergrondinformatie over transcriptietranslatie, eiwitvouwing en secretiemechanisme is geleidelijk begrepen9. Deze genetische informatie maakt het bevorderlijk voor genetische modificatie op moleculair niveau en draagt bij aan het vergemakkelijken van de grootschalige productie van B. licheniformis.

Bacitracine is een dodecacyclisch peptide-antibioticum dat wordt geproduceerd door niet-ribosomaal peptidesynthetase door secundair metabolisme in B. subtilis en B. licheniformis. Bacitracine is een mengsel dat is samengesteld uit verschillende componenten zoals bacitracine A, B en C, waarbij een of twee aminozuren verschillen tussen elke component; Hiervan heeft bacitracine A de sterkste biologische activiteit10. Bacitracine kan grampositieve bacteriën zoals Staphylococcus en Micrococcus luteus en sommige gramnegatieve bacteriën remmen door de vorming van celwanden te remmen en te interageren met membraanbindende eiwitten11. Ondertussen is bacitracine veilig en stabiel, niet gemakkelijk om resistentie tegen geneesmiddelen te produceren en kan het compatibel zijn met andere antibacteriële geneesmiddelen12. Daarom wordt bacitracine gebruikt in de medische en veterinaire praktijk. Bovendien kan het vanwege zijn snelle eliminatiesnelheid en lage absorptiesnelheid ook worden gebruikt als additief voor diervoeder13.

B. licheniformis kan de darm koloniseren en de gastro-intestinale micro-omgeving verbeteren. De hechting en het voortplantingsvermogen en de daarmee samenhangende fysiologische functies van Bacillus uit verschillende bronnen in het maagdarmkanaal van verschillende dieren zijn verschillend. Van varkens afgeleide B. licheniformis is meer bevorderlijk voor kolonisatie in de darmen van varkens en ander vee. Er is een nauw verband tussen de relatieve overvloed aan intestinale probiotica en de gezondheidstoestand van gastheer14. Voedingssuppletie met B. licheniformis mix bij gespeende biggen verbetert het darmecosysteem door de samenstelling van de microbiota en de metabolische activiteit te veranderen, en beïnvloedt ook het darmslijmvlies15. Uitwerpselen van dieren kunnen een weerspiegeling zijn van het type en de hoeveelheid darmflora van dieren. Dit protocol beschrijft de isolatie en zuivering van bacitracineproducerende Bacillus spp. uit gezonde varkensuitwerpselen. De uitwerpselen zijn afkomstig van Taihu-zeugen die niet worden gevoed met mengvoer en uitstekende productieprestaties leveren in varkenshouderijen. De isolaten werden geïdentificeerd als B. licheniformis op basis van hun morfologische kenmerken, fysisch-chemische eigenschappen en biochemische identificatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden gedocumenteerd en goedgekeurd door de ethische commissie van de Nanjing Tech University. De uitwerpselen waren afkomstig van Taihu-zeugen van ongeveer 2 jaar oud (zie materiaaltabel), die werden grootgebracht op professionele en standaard varkenshouderijen.

1. Voorbereiding van de media

  1. Luria-Bertani (LB) vloeibaar medium: Voeg 10 g NaCl, 5 g gistextractpoeder en 10 g trypton toe aan een conische fles, voeg gedestilleerd water toe aan 1 L, roer en los op met een glazen staaf. Breng 100 ml medium over naar een conische fles van 500 ml en bind deze stevig vast met ademende afdichtingsfolie. Steriliseer bij 121 °C in een autoclaaf gedurende 20 minuten (zie Materiaaltabel).
  2. LB vast medium: Voeg 10 g NaCl, 5 g gistextractpoeder, 10 g trypton, 20 g agarpoeder toe aan een conische fles, voeg gedestilleerd water toe aan 1 L, los op met een glazen staaf en bind stevig vast met een ademende afdichtingsfilm. Steriliseer bij 121 °C in een autoclaaf gedurende 20 min. Wanneer het medium is afgekoeld tot 50 °C, giet je 20 ml van het medium in petrischaaltjes, laat je ze afkoelen en bewaar je ze ondersteboven.
  3. Fermentatiemedium bacitracine: Voeg 8 g sojaschroot, 4 g oplosbaar zetmeel, 0,1 g (NH4)2SO4, 0,6 g CaCO3 en 100 ml gedestilleerd water toe aan een conische fles van 500 ml, roer met een glazen staaf om goed op te lossen en bind stevig vast met een ademende afdichtingsfilm. Steriliseer bij 121 °C in een autoclaaf gedurende 20 minuten (zie Materiaaltabel).
  4. M. luteus suspensie: Selecteer een ring van M. luteus en inoculeer op een LB-kweekplaat, bereid in stap 1.2 (zie Materiaaltabel). Kweek in een incubator met constante temperatuur bij 37 °C gedurende 16 uur (zie materiaaltabel). Voeg 5 ml normale zoutoplossing toe aan het bord en schud voorzichtig om de kolonies te lueren. Meet de OD600 en verdun de oplossing in een reageerbuis om een suspensie met OD600 van 0,3-0,7 te krijgen. Bewaar de suspensie van M. luteus bij 4 °C voor later gebruik.
  5. Antibacterieel testmedium: Voeg 1 ml M. luteus-suspensie , bereid in stap 1.4, toe aan 100 ml vloeibaar LB vast medium bereid in stap 1.2 en schud lichtjes. Neem onmiddellijk 5 ml van deze oplossing met M. luteus en verdeel het gelijkmatig over de LB-kweekplaat.

2. Isolatie en zuivering van Bacillus uit verse uitwerpselen van gezonde varkens

  1. Voeg 9 ml normale zoutoplossing en 1,0 g verse varkensuitwerpselen toe aan een erlenmeyer van 150 ml. Roer met een magnetische roerder (zie Materiaaltabel) bij kamertemperatuur bij 60 tpm/min gedurende 15 min.
  2. Doe het fecale extract gedurende 20 minuten in een waterbad van 80 °C (zie materiaaltabel) om bacteriën die geen sporen produceren te doden.
  3. Voeg de suspensie toe aan 100 ml LB vloeibaar medium in een erlenmeyer van 250 ml en kweek in een schudder (zie materiaaltabel) bij 180 tpm/min bij 37 °C gedurende 8 uur.
  4. Voer seriële verdunning uit van de gekweekte bacteriële oplossing met normale zoutoplossing van 10-1 tot 10-8. Breng 0,1 ml 10-6, 10-7 en 10-8 bacterieel verdunningsmiddel aan op individuele LB-kweekplaten en laat drogen. Plaats de platen na 10 minuten ondersteboven in een incubator met constante temperatuur bij 37 °C gedurende 48 uur.
  5. Gebruik de inoculatiering om de kolonies te kiezen die lijken op B. licheniformis (roomwitte kleur, zachte consistentie, slijmerig uiterlijk, convex en vlakke elevatie en onregelmatige vorm)16en streep ze met behulp van een zigzagpatroon op het antibacteriële activiteitstestmedium dat in stap 1.5 is voorbereid (zie figuur 1).
  6. Plaats de platen gedurende 48 uur bij 37 °C in de broedmachine en observeer of er een remmingszone rond de kolonie is.

3. Screening op remming van de activiteit van M. luteus

  1. Selecteer een enkele kolonie die een remmende zone heeft gegenereerd en voeg toe aan 100 ml LB vloeibaar medium, kweek in de shaker bij 37 °C en 180 tpm/min gedurende 12 uur.
  2. Inoculeer 5 ml van het kweekmedium in het in stap 1.3 bereide bacitracinefermentatiemedium en kweek gedurende 48 uur bij 37 °C.
  3. Vang de fermentatiebouillon op in een centrifugebuis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 13.400 x g bij 4 °C en filtreer vervolgens met behulp van een microporeus filtermembraan van 0,22 μm (zie materiaaltabel).
  4. Voeg een Oxford-beker toe aan een verse mediumplaat met antibacteriële activiteitstest en voeg vervolgens 50 μL filtraat (fermentatiesupernatant) toe aan de Oxford-beker (zie materiaaltabel). Kweken in een broedmachine bij 37 °C gedurende 12 uur. Meet na de incubatie de diameter van de remmende zone met een schuifmaat (zie materiaaltabel).
  5. Selecteer de stammen en het bijbehorende fermentatiesupernatans met een remmende zonediameter van meer dan 15 mm voor latere experimenten.

4. Identificatie van bacitracine door middel van dunnelaagchromatografie

  1. Voeg 60 mg bacitracine standaard toe en los op in 1% EDTA-2Na (zie materiaaltabel) in een volumetrische fles van 10 ml om een 6,0 mg/ml bacitracineoplossing te maken.
  2. Verdun 1 ml van het fermentatiemiddel tot 10 ml met 1% EDTA-2Na. Spot 5 μl monster en 5 μl standaardbacitracineoplossing op de geactiveerde silicagelplaat met dunne lagen (zie materiaaltabel).
  3. Voeg 100 ml n-butanol-azijnzuur-water-pyridine-ethanol (60:15:10:6:5) toe aan de chromatografische tank (zie materiaaltabel). Plaats de dunne laag silicagel in de chromatografische tank. Dek af en laat het 30 minuten op kamertemperatuur staan.
  4. Verwijder de dunne laagplaat van silicagel, spuit butanol-pyridineoplossing (99:1) met 1% ninhydrine (zie materiaaltabel) en verwarm gedurende 5 minuten bij 105 °C tot er bruinrode vlekken verschijnen. Bereken Rf (Retention Factor Value) voor de standaard en de steekproef volgens de volgende formule:
    Rf = Spot-reisafstand/Oplosmiddel-reisafstand.

5. Detectie van bacitracine door HPLC

  1. Voeg 0,3 ml fermentatiemiddel en 1,2 ml 50% ethanol toe aan een microcentrifugebuis van 2 ml, schud gedurende 5 minuten met de hand en laat 12 uur bij 4 °C staan.
  2. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 13.400 x g en filtreer in een monsterfles met het label S1 met een microporeus filtermembraan van 0,22 μm (zie materiaaltabel).
  3. Bereiding van de moederbacitracineoplossing: Voeg 0,4 g bacitracine standaard (60 E/mg; zie materiaaltabel), 100 ml 40 g/l EDTA-2Na (zie materiaaltabel) toe aan een maatkolf van 100 ml om 240 E/ml moederbacitracine te bereiden.
  4. Voeg 3 ml bacitracine-moederoplossing en 21, 9, 3, 1 en 0 ml ultrapuur water toe aan reageerbuisjes met respectievelijk het label A1, B1, C1, D1 en E1. Na filtratie met een microporeus filtermembraan van 0,22 μm doet u het filtraat in monsterflesjes met het label A2, B2, C2, D2 en E2.
    OPMERKING: De concentraties van de standaardbacitracineoplossing zijn 30, 60, 120, 180 en 240 E/ml.
  5. Plaats A2, B2, C2, D2, E2 en S1 in de testbak van het HPLC-instrument. Plaats 1000 ml 50 mM/L ammoniumformiaat en 1000 ml acetonitril in de mobiele fasebak en stel ze in als mobiele fasen A en B, respectievelijk.
    OPMERKING: De pH van ammoniumformiaat moet met mierenzuur worden ingesteld op 4,0.
  6. Installeer de C18 (5 μm, 4,6 mm x 250 mm) HPLC-kolom in de richting die op de kolom is aangegeven (zie materiaaltabel).
  7. Stel de parameters van de mobiele fase in op 0 min, 77% A en 23% B; 30 min, 70% A en 30% B; 40 min, 60% A en 40% B; 50 min, 60% A en 40% B; 51 min, 77% A en 23% B; 58 min, 77% A en 23% B. Stel de steekproefgrootte in op 100 μL; Debiet, 1,0 ml/min; Kolomtemperatuur: 30 °C.
  8. Klik op de knop Uitvoeren om het programma uit te voeren.

6. Morfologische identificatie

  1. Verdun en bestrijk de stam met de hoogste bacitracine-titer op een LB-kweekplaat en kweek in een broedmachine bij 37 °C gedurende 48 uur. Kleur en observeer de morfologie van de kolonie zoals hieronder beschreven.
  2. Voeg een druppel steriel gezuiverd water toe aan de glijbaan, pak een kleine hoeveelheid kolonies op en voeg toe aan de waterdruppel. Smeer gelijkmatig uit, laat de dia op natuurlijke wijze drogen en bevestig hem vervolgens op een vlam.
  3. Voeg kristalviolet gedurende 1 minuut toe om het monster te kleuren en spoel vervolgens af met kraanwater. Voeg jodium toe gedurende 1 minuut om het monster te bevlekken en spoel vervolgens af met gedestilleerd water.
  4. Voeg 95% alcohol toe, schud de dia om te ontkleuren gedurende 1 minuut en spoel vervolgens af met gedestilleerd water.
  5. Voeg saffraan toe gedurende 1 minuut om het monster te kleuren en spoel vervolgens af met gedestilleerd water. Laat het objectglaasje op natuurlijke wijze drogen en observeer de morfologie van de kolonie onder een microscoop met een olie-onderdompeling (zie Materiaaltabel).

7. Fysiologische en biochemische identificatie

  1. Voeg 2 ml steriele zoutoplossing toe aan de reageerbuis en inoculeer een enkele kolonie van de plaat in de steriele zoutoplossing met behulp van een inoculatiering om bacteriële suspensie te verkrijgen.
  2. Voeg 100 μL van de bacteriële suspensie toe aan elk gat voor het meten van V-P, citraat, gelatine, 7% natriumchloride, pH 5,7, nitraatreductie en zetmeelhydrolyse op de biochemische identificatiestrip van Bacillus (zie materiaaltabel).
  3. Gebruik de inoculatiering om een andere kolonie te kiezen en streep ze in het zigzagpatroon op de anaërobe groei biochemische buis van de Bacillus biochemische identificatiestrip.
  4. Gebruik de inoculatiering om de andere kolonies te plukken en prik ze verticaal in de poriën voor identificatie van propionaat, D-xylose, L-arabinose en D-mannitol op de biochemische identificatiestrip van Bacillus .

8. Bepaling van de sequentie van het stamgen

  1. Extraheer het DNA van de stam met behulp van een DNA-extractiekit voor bacteriën (zie materiaaltabel): Voeg 2 ml zaadvloeistof toe aan een microcentrifugebuis van 5 ml en centrifugeer gedurende 1 minuut op 11.500 x g. Gooi het supernatant weg en voeg 110 μl buffer (met 20 mM Tris, pH8.0; 2 mM Na 2-EDTA en 1,2% Triton) en 70 μl 50 mg/ml lysozymoplossing toe aan de pellet en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  2. Voeg 4 μL 100 mg/ml RNase A toe gedurende 15 s en laat 5 min op kamertemperatuur staan. Voeg 20 μL proteïnase K-oplossing toe en meng goed.
  3. Voeg 220 μL buffer GB toe, schud gedurende 15 s tot de pellet is gesuspendeerd, plaats gedurende 10 minuten op 70 °C om de oplossing helder te maken en draai kort om de waterdruppels op de buiswand te verwijderen.
  4. Voeg 220 μL watervrije ethanol toe, schok volledig gedurende 15 s, korte scheiding. Breng de oplossing en het vlokneerslag over naar de adsorptiekolom CB3 van de verzamelbuis, centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi het supernatant weg.
  5. Voeg 500 μL buffer GD toe aan de adsorptiekolom, centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi het supernatant weg. Voeg 600 μL PW toe aan de kolom, centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi het supernatant weg.
  6. Plaats de adsorptiekolom terug in de opvangbuis, centrifugeer gedurende 2 minuten bij 13.400 x g en gooi het supernatant weg.
  7. Zet de adsorptiekolom 10 minuten op kamertemperatuur om te drogen. Breng de kolom over naar de centrifugebuis en voeg 100 μL eluatiebuffer TE toe aan het midden van het adsorptiemembraan.
  8. Laat 5 minuten op kamertemperatuur staan om de stroom in de centrifugebuis op te vangen en centrifugeer gedurende 2 minuten op 13.400 x g.
  9. Voeg 25 μL 2x mastermix (zie Materiaaltabel), 2,5 μL DNA-monster verkregen in stap 8.8, 2 μL 27F forward primer, 2 μL 1492R reverse primer en 18,5 μL dubbel gedestilleerde H2O toe aan een PCR-buisje van 0,1 ml.
    OPMERKING: De gensequenties van de primers zijn 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' en 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
  10. Plaats het PCR-buisje in de PCR-machine (zie materiaaltabel) onder de volgende omstandigheden: voordenaturatie bij 95 °C gedurende 10 min, denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s, gloeien bij 55 °C gedurende 30 s, verlenging bij 72 °C gedurende 90 s, verlenging bij 72 °C gedurende 7 min. Voer de denaturatie-, gloei- en verlengingscyclus in drie stappen 32x uit.
  11. Neem 5 μL van het product en voer elektroforese uit met 1% agarosegel bij 120 V gedurende 30 minuten.
    1. Los 500 mg agarose op in 50 ml 1x TAE-buffer. Verwarm de oplossing 1-2 minuten in de magnetron tot de agarose volledig is opgelost. Voeg 5 μL DNA-kleurstof toe, giet het in een geltray en breng de openingsplaat in. Laat 30 minuten op kamertemperatuur staan tot het stolt; doe de gel in de elektroforesetank en voeg 1x TAE-buffer toe om de gel onder te dompelen. Voeg 2 μL 2 kb DNA-ladder (10 mg/μL) toe aan het eerste putje en 5 μL PCR-product gemengd met 1 μL ladende kleurstof aan de resterende putjes in de gel.
  12. Plaats de gel in het gel imaging systeem en maak een foto. Knip de DNA-strips snel af onder ultraviolet licht en weeg.
  13. Voeg de strips toe aan een microcentrifugebuisje en voeg een gelijk volume PN-oplossing toe. Houd de tube in een waterbad bij 50 °C totdat de gel volledig is opgelost.
  14. Voeg 500 μL evenwichtsvloeistof BL toe aan de adsorptiekolom CA2, centrifugeer op 13.400 x g gedurende 1 minuut en gooi het supernatant weg.
  15. Voeg de opgeloste geloplossing toe aan de adsorptiekolom CA2 en plaats deze 2 minuten op kamertemperatuur, centrifugeer deze gedurende 30 s op 13.400 x g en gooi het bovenstaande weg.
  16. Voeg 600 μL PW toe aan de adsorptiekolom CA2, centrifugeer op 13.400 x g gedurende 1 min, gooi het supernatant weg en herhaal 1x.
  17. Plaats de adsorptiekolom CA2 in een opvangbuis, centrifugeer gedurende 2 minuten bij 13.400 x g en gooi het bovenstaande weg.
  18. Plaats de adsorptiekolom CA2 gedurende 10 minuten op kamertemperatuur om goed te drogen en plaats deze vervolgens in een schone centrifugebuis.
  19. Voeg 50 μl eluatiebuffer EB toe aan de adsorptiefilm die gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur is gesuspendeerd en verzamel de DNA-oplossing door centrifugeren bij 13.400 x g gedurende 2 minuten.
    OPMERKING: De bovengenoemde oplossingen of reagentia zijn inbegrepen in de zuiveringskit (zie materiaaltabel).
    1. Stuur de verzamelde DNA-oplossing naar een professioneel sequencingbedrijf (zie Materiaaltabel) voor sequencing. Vergelijk de sequencingresultaten van Blast in de GenBank-database van NCBI. Selecteer volgens de sequentiehomologie verschillende stammen en construeer fylogenetische bomen met behulp van de maximale waarschijnlijkheidsmethode in MEGA-X om de soortrelaties van de stammen te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit experiment werden 48 stammen van Bacillus geïsoleerd uit verse uitwerpselen van gezonde varkens, genummerd van 1001 tot 1048. Onder hen hadden 15 stammen antibacteriële activiteit tegen M. luteus. Van de 15 stammen werden de titers van bacitracine gemeten met behulp van high-performance vloeistofchromatografie, zoals weergegeven in tabel 1. Onder hen had B. licheniformis nr. 1026 de hoogste bacitracine-titer, 456,35 ± 21,75 E/ml, dus nr....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

B. licheniformis groeit snel met eenvoudige kweekomstandigheden en snelle suikerconsumptie, en de volwassen fermentatietechnologie is nuttig bij het besparen van industriële productiekosten13. De brede toepassing van B. licheniformis en zijn afscheidingen, bacitracine, heeft de veelbelovende marktwaarde bepaald. In de landbouw wordt B. licheniformis gebruikt als biomeststof om de plantengroei en de opname van voedingsstoffen te verbetere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (nr. 2022YFC2104800) en het Six Talent Peaks-project in de provincie Jiangsu (nr. 2019-NY-058).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2 × Phanta Flash Master MixNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,ChinaP252-01
2kb DNA MarkerBeijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Beijing, ChinaBM121-01
AcetonitrileShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaA104443
Agar poederShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaA800730
AgaroseShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaA104062
Ammoniumsulfaat ((NH4)2SO4)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China10002917
Autoclaaf sterilisatorZealway Instrument Inc., Xiamen, ChinaGI36DWS
Bacillus biochemische identificatiestripQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinaHBIG14
BacitracineShanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaB65740
Bacterie DNA Extractie KitTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaDP209
Ademende afdichtingsfolieBeijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.BS-QM-01A
ButanolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaB433378
C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) HPLC kolomRizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, ChinaC1805-462510
Calciumcarbonaat (CaCO3)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China10005717
CentrifugeNew Brunswick Scientific Co., Inc., UK5452
Chromatografische tankNanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, ChinaP-1
KegelflesSichuan Shubo Co., Ltd., Chengdu, China18012
Incubator met constante temperatuurTaist Instrument Co., Ltd., Tianjin, ChinaGH4500
Dipotashfosfaat (K2HPO4)Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, ChinaXL0015
EDTA-2NaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaE397526
Elektronische weegschaalMettler Toledo International Co., Ltd.FA2104
EthylalcoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaE130059
Gel Midi ZuiveringskitTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaDP302
GlasmaatjeChengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.1294
GlucoseShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaD823520
Gram's kleurstofoplossing kitQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, ChinaHB8278
Hoge prestatie vloeistof chromatograafAgilent Technologies, Inc., California, America1260
Horizontaal elektroforeseapparaatBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Beijing, ChinaDYCP-31DN BIOMATE
InoclatieringShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China3171026
MagneetroerderWiggens GmbH Co., Ltd., GermanyWH220 PLUS
MethylalcoholShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Shanghai, ChinaM116115
MicrocentrifugebuisjeShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China1351171
Micrococcus luteusBena Culture Collection, Suzhou, ChinaBNCC102589
Microporeuze filtermembraanNantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.PES0.22
NinhydrineShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaN105629
Optische microscoopOptical Instrument Factory, Shanghai, ChinaDYS-108
VarkensmestNanjing Quanfu Pig Farm, Nanjing, China
Polymerasekettingreactie (PCR) VersterkerSuzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Suzhou, ChinaETC811
Professioneel sequencing bedrijfGeneral Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
PyridienShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaP111516
SchakelaarTaicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd.,Taicang, ChinaHYL-C
Silica gel GF254 dunne laagplaatYantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, ChinaHPT-HSGF5025023
Natriumchloride (NaCl)Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaS805275
NatriumcitraatSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, ChinaC39197100001
Oplosbare zetmeelShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaS817547
Thermostaat waterbadShanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, ChinaDK-8D
TryptonShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaT139519
Ultra GelRedNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,ChinaGR501-01
Ultra puur water instrumentMerck KGaA Co., Ltd., GermanyMilli Direct-Q8
Ultrasoon reinigingsapparaatJiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, ChinaSB-100DT
SchuifmaatSanfeng Company, JapanN20P
Gist extract poederVicbio Biotechnology Co., Ltd., Beijing, ChinaLP0021

Referenties

  1. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  2. Muras, A., Romero, M., Mayer, C., Otero, A. Biotechnological applications of Bacillus licheniformis. Crit. Rev. Biotechnol. 41 (4), 609-627 (2021).
  3. He, H., et al. Biotechnological and food synthetic biology potential of platform strain: Bacillus licheniformis. Syn Syst Biotechno. 8 (2), 281-291 (2023).
  4. Sun, Y., et al. Enhanced β-mannanase production by Bacillus licheniformis by optimizing carbon source and feeding regimes. Prep Biochem Biotech. 52 (7), 845-853 (2022).
  5. Trunet, C., et al. Suboptimal Bacillus licheniformis and Bacillus weihenstephanensis spore incubation conditions increase heterogeneity of spore outgrowth time. Appl Environ Microb. 86 (6), e02061-e02119 (2020).
  6. Lee, N. K., Kim, W. S., Paik, H. D. Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier. Food Sci Biotechnol. 28 (5), 1297-1305 (2019).
  7. Yi, W., et al. Dietary novel alkaline protease from Bacillus licheniformis improves broiler meat nutritional value and modulates intestinal microbiota and metabolites. Anim Microbiome. 6 (1), 1-16 (2024).
  8. Vasileios, B., et al. Safety and efficacy of Bacillus licheniformis DSM 32457 as a silage additive for all animal species. EFSA Journal. 17 (8), e05787(2019).
  9. Birgit, V., et al. The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential. J Mol Microb Biotech. 7 (4), 204-211 (2004).
  10. Zhu, J., et al. Microbial synthesis of bacitracin: Recent progress, challenges, and prospects. Synth Syst Biotechnol. 8 (2), 314-322 (2023).
  11. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  12. Willdigg, J. R., et al. The Bacillus subtilis cell envelope stress-inducible ytpAB operon modulates membrane properties and contributes to bacitracin resistance. J Bacteriol. 206 (3), e0001524(2024).
  13. Silva, K. G. S., et al. Effects of bacterial direct-fed microbial mixtures offered to beef cattle consuming finishing diets on intake, nutrient digestibility, feeding behavior, and ruminal kinetics/fermentation profile. J Anim Sci. 102, skae003 (2024).
  14. Jia, D., et al. Probiotic Bacillus licheniformis ZW3 alleviates DSS-induced colitis and enhances gut homeostasis. Int J Mol Sci. 25 (1), 561(2024).
  15. Wang, X., et al. Dietary supplementation with Bacillus mixture modifies the intestinal ecosystem of weaned piglets in an overall beneficial way. J Appl Microbiol. 130 (1), 233-246 (2021).
  16. James, N., et al. Unravelling the potential plant growth activity of halotolerant Bacillus licheniformis NJ04 isolated from soil and its possible use as a green bioinoculant on Solanum lycopersicum L. Environ. Res. 216 (2), 114620(2024).
  17. Shen, P., et al. Exploitation of ammonia-inducible promoters for enzyme overexpression in Bacillus licheniformis. J Ind Microbiol Biot. 48 (5-6), kuab037 (2021).
  18. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  19. Fan, B., Chen, T. Y., Zhang, S., Wu, B., He, B. F. Mining of efficient microbial UDP-glycosyltransferases by motif evolution cross plant kingdom for application in biosynthesis of salidroside. Sci Rep. 7 (1), 463(2017).
  20. Hugo, R. O., Bernardo, R. B., Alejandra, C. S. R. Potential application of the probiotic Bacillus licheniformis as an adjuvant in the treatment of diseases in humans and animals: A systematic review. Front Microbiol. 13, 993451(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Bacitracineproductiefecale isolatiemicrobiota van varkenszuivering van bacitracinedunlaagchromatografiehogedrukvloeistofchromatografieinhibitie van Micrococcus luteusfylogenetische analysebiochemische karakterisering

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.