Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van Wharton's Jelly mesenchymale stamcellen en hun afgeleide exosomen/kleine extracellulaire blaasjes

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66778

⸱

11 november 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

In dit artikel

Samenvatting

Navelstrengweefsel is een rijke, direct beschikbare, niet-invasieve bron van mesenchymale stamcellen (MSC's). In dit protocol worden gedetailleerde stappen gegeven voor de isolatie en karakterisering van menselijke Wharton's jelly MSC's (WJ-MSC's), gevolgd door een eenvoudig kort protocol voor het isoleren van hun afgeleide exosomen of kleine extracellulaire blaasjes.

Samenvatting

Op het gebied van regeneratieve geneeskunde hebben mesenchymale stamcellen (MSC's) bijzondere aandacht getrokken. MSC's uit het weefsel van de navelstreng (UC), ook wel Wharton's jelly genoemd, zijn bijzonder goed ingeburgerd in een verscheidenheid aan toepassingen. In vergelijking met andere MSC-bronnen bieden Wharton's jelly MSC's (WJ-MSC's) een aantal voordelen en zijn ze geïsoleerd van CU, dat meestal wordt weggegooid als medisch afval. WJ-MSC's roepen daarom geen ethische kwesties op die vergelijkbaar zijn met die met betrekking tot embryonale stamcellen. Een eenvoudige en reproduceerbare explantatietechniek werd gebruikt om WJ-MSC's te isoleren uit CU-weefsel. Binnen vijf tot tien dagen na isolatie komen de WJ-MSC's tevoorschijn als aanhangende cellen met een fibroblastische vorm. Nadat ze zijn geïsoleerd, bereiken de cellen ongeveer 80% confluentie in 14-18 dagen. Daarna, in passage 3, werden de geïsoleerde WJ-MSC's volledig gekarakteriseerd door ze te induceren om te differentiëren langs de adipogene, osteogene en chondrogene mesenchymale lijnen. Daarnaast werd immunofenotypering getest voor negatieve cluster van differentiatie (CD) oppervlaktemarkers, waaronder CD34, CD14 en HLA-DR, evenals onderscheidende MSC-oppervlaktemarkers zoals CD105, CD90, CD73 en CD44. Bovendien werd precipiterend reagens op een eenvoudige manier gebruikt om exosomen/kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) te isoleren uit het geconditioneerde medium van die WJ-MSC's. Nadat ze waren geïsoleerd, werden exosomen/sEV's waargenomen onder een transmissie-elektronenmicroscoop en werd deeltjesgrootteanalyse gebruikt om hun gemiddelde grootte te berekenen. Samenvattend bieden WJ-MSC's een direct beschikbare, niet-invasieve, hernieuwbare voorraad stamcellen die kunnen worden gebruikt als fabrieken om exosomen/sEV's te produceren. Deze WJ-MSC's en hun afgeleide exosomen/sEV's kunnen worden gebruikt in een breed scala aan therapeutische en downstream onderzoekstoepassingen.

Inleiding

Nog maar een paar jaar geleden werd gedacht dat stamcellen de leiding namen in de geneeskunde 1,2. De ethische bezorgdheid van embryonale stamcellen (ESC's) was echter een enorm obstakel dat een snelle vooruitgang op dit gebied in de weg stond. Dit wekte veel belangstelling voor het verkennen van alternatieve hernieuwbare bronnen voor stamcellen, vooral die welke postnataal kunnen worden geïsoleerd uit de navelstreng (UC)4. De CU sluit van nature aan op de placenta en de foetus in een zwangere moeder. De aangeboren rol van de CU is om de groeiende foetus te voeden met een continue en voldoende bloedtoevoer via bloedvaten en om de bescherming van deze bloedvaten te waarborgen door mogelijke torsie, compressie of knikken van de foetus tijdens zijn beweging te vermijden5. Anatomisch gezien bestaat de menselijke CU uit twee slagaders en een ader die zijn ingebed in een mucoïde bindweefsel en ingesloten in een buitenste laag vruchtwaterepitheel6. De UC-matrix, of het mucoïde bindweefsel dat de drie navelstrengvaten omsluit, staat bekend als "Wharton's jelly" (WJ) en is voornamelijk gemaakt van proteoglycanen en collageen7.

Onlangs hebben mesenchymale stamcellen (MSC's) veel aandacht getrokken als een effectieve nieuwe therapeutische modaliteit voor een breed scala aan toepassingen in de regeneratieve geneeskunde 7,8,9,10,11,12. Wat het meest intrigerend is aan MSC's, is hun gemakkelijke isolatie, evenals aangetoonde immunomodulerende activiteiten en multipotentie 13,14,15. Andere superieure voordelen van MSC's in het algemeen en die afgeleid van WJ in het bijzonder zijn dat er geen teratomen zich manifesteren bij transplantatie, in tegenstelling tot ESC's, en het feit dat ze hun stameigenschap behouden, zelfs na verschillende celpassages16,17. Daarom wordt nu aangenomen dat MSC's inderdaad revolutionaire therapeutische interventies kunnen bieden voor verschillende ziekten 8,18,19. Het is belangrijk om erop te wijzen dat de International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) in 2006 specifieke minimumcriteria heeft gedefinieerd voor de juiste karakterisering van MSC's20. Ten eerste worden MSC's, wanneer ze onder standaard teeltomstandigheden worden gekweekt/gekweekt, verondersteld plastic-hechtend te zijn. Ten tweede moeten MSC's een aantal karakteristieke cluster van differentiatie (CD) oppervlaktemarkers tot expressie brengen, zoals CD90, CD105 en CD73, en mogen ze geen expressie vertonen van andere zoals CD14, CD34 en CD45. Ten derde moeten MSC's in vitro differentiëren in osteogene, adipogene en chondrogene lijnen 20. Tot op de dag van vandaag zijn MSC's geïsoleerd uit meerdere bronnen, waaronder volwassen weefsels zoals beenmerg (BM), vetweefsel21, evenals foetale / perinatale bronnen zoals placenta, UC-bloed (UCB) en UC-matrix 22,23. Het is hier opmerkelijk dat bij het vergelijken van het slagingspercentage voor het oogsten van MSC's, is gemeld dat het bijna 100% bereikt van WJ-weefsel, vergeleken met slechts ongeveer 6% van UCB24,25. Dus hoewel UCB inderdaad een rijke bron van hematopoëtische stamcellen is, wordt het ook beschouwd als een goede bron van MSC's, hoewel aanzienlijk lager dan WJ 26,27,28.

WJ-MSC's zijn uitzonderlijk in vergelijking met andere soorten MSC's, omdat ze, hoewel ze bonafide (typische) MSC's zijn, die vergelijkbare eigenschappen hebben als hun volwassen tegenhangers, ook de expressie bezitten van verschillende pluripotentie/ESC-markers17,29. Dienovereenkomstig wordt aangenomen dat WJ-MSC's zich ergens tussen volwassen en embryonale stamcellen bevinden17. Interessant is dat is vastgesteld dat WJ-MSC's zowel menselijke MSC's als ESC-markers tot expressie brengen en in staat zijn om stam gedurende verschillende passages te behouden16. Gelukkig vormen ze bij transplantatie geen teratomen17. Dit kan worden verklaard door hun unieke transcriptomische profiel in vergelijking met ESC's, evenals andere MSC's29,30. WJ-MSC's bieden verschillende voordelen ten opzichte van volwassen MSC's, en zelfs ten opzichte van andere soorten stamcellen in het algemeen. Hun isolatiemiddelen zijn direct beschikbaar, via de CU die routinematig bij de geboorte wordt weggegooid en dus als medisch afval wordt beschouwd. Daarom hebben WJ-MSC's, in tegenstelling tot ESC's, geen ethische bezwaren, en in tegenstelling tot BM-MSC's, wordt dat geïsoleerd via een invasieve techniek31. Bovendien missen WJ-MSC's, net als andere MSC-typen, de expressie van humaan leukocytenantigeen-D-gerelateerd (HLA-DR), en is met name gebleken dat ze humaan leukocytenantigeen-G (HLA-G) tot expressie brengen, waardoor ze een extra immuunprivilege krijgen32. Dit suggereert dat WJ-MSC's een immunosuppressieve rol vertonen door te simuleren wat gewoonlijk gebeurt op de foetus-maternale interface in vivo 33,34,35. Ten slotte hebben WJ-MSC's, net als hun analogen geïsoleerd van UCB, een groot potentieel voor bankieren36. Gezien al deze voordelen worden WJ-MSC's daarom bepleit als de nieuwe gouden standaard voor op MSC gebaseerde therapieën30.

Interessant is dat uit veel onderzoek is gebleken dat MSC's hun therapeutische effecten voornamelijk vertonen via paracriene signalering. In veel gevallen is gemeld dat dergelijke effecten optreden als reactie op exosomen/kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) die worden uitgescheiden door MSC's37. Exosomen/sEV's staan bekend als bioactieve blaasjes van nanoformaat die worden verkregen uit het endomembraansysteem van de cel. Ze fungeren als shuttles die specifieke ladingen eiwitten, mRNA en niet-coderende RNA's zoals microRNA's en lang niet-coderend RNA (LncRNA's) overbrengen, als een bericht in een fles38. Als gevolg hiervan kunnen ze de ontvangende cellen herprogrammeren en worden ze aangeduid als "signalosomen" die essentiële cellulaire functies manipuleren39. MSC's afgeleide exosomen/sEV's hebben hun superioriteit ten opzichte van MSC-therapieën aangetoond als een mogelijk celvrij alternatief. Net als hun oorspronkelijke MSC's is gebleken dat exosomen/sEV's therapeutische effecten en cellulaire regeneratie opwekken bij verschillende ziekten. In tegenstelling tot hun oudercellen kunnen ze echter gemakkelijker biologische barrières passeren. Bovendien zijn ze verstoken van kritieke veiligheidsproblemen; Ze brengen geen risico met zich mee voor immuunafstoting of langdurige tumorvorming40. Bovendien kunnen exosomen/sEV's worden gebruikt voor gentherapietoepassingen als middel voor een medicijnafgiftesysteem, omdat ze van nature zijn uitgerust om genetische informatie over te dragen41. Exosomen/sEV's hebben dus inderdaad opwindende nieuwe wegen aangeboord voor nieuwe therapeutische interventies van verschillende ziekten 42,43,44.

In dit protocol wordt een grondig stapsgewijs explantatie-gebaseerd protocol voor de isolatie en karakterisering van WJ-MSC's uit CU-weefsel gepresenteerd. Dit zal worden gevolgd door een beknopt protocol voor de isolatie van exosomen/sEV's uit geconditioneerde media van deze WJ-MSC's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten en procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen en werden goedgekeurd door de ethische commissies van zowel de Faculteit der Farmacie, Ain Shams University, Caïro, Egypte (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220) als de Faculteit der Farmacie, The British University in Egypte, Caïro, Egypte (CL-2309). De CU's werden verkregen na het verkrijgen van ondertekende geïnformeerde toestemming van de ouder(s).

1. Isolatie van WJ-MSC's van de menselijke navelstreng

  1. Plaats ongeveer 30-40 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een container (afgesloten opvangzak) voor het opvangen van de navelstreng (UC) (ongeveer 15 cm lang) direct na levering. Bewaar de verzamelde CU op ijs en verwerk deze binnen maximaal 4-5 uur na verzameling.
    OPMERKING: Het monster kan na 4-5 uur niet meer worden verwerkt, omdat dit de MSC-opbrengst sterk zal verminderen. Zorg ervoor dat de PBS en de container steriel zijn.
  2. Bereid complete kweekmedia voor WJ-MSC's voor die zijn samengesteld uit Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (LG-DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 0,25 μg/ml amfotericine B.
  3. Plaats 3 ml complete media per putje in platen met 6 putjes en plaats vervolgens die platen met 6 putjes met media in een CO2 -incubator die is ingesteld op 37 °C en 5% CO2 om op te warmen en bereid je voor.
  4. Bereid in de bioveiligheidskast acht celkweekschaaltjes van 10 cm, elk gevuld met 10 ml steriel PBS.
  5. Breng voorzichtig, met behulp van een gesteriliseerde tang, de CU uit de verzegelde plastic zak over in het eerste petrischaaltje met PBS om het bloed uit te spoelen (herhaal deze stap totdat al het bloed uit het monster is weggespoeld).
  6. Spuit 70% ethanol op een steriel wattenstaafje en veeg hiermee de CU 30 s af.
  7. Breng de CU over naar een nieuw petrischaaltje gevuld met steriel PBS om eventuele resterende ethanol te verwijderen.
  8. Breng de CU over in een andere petrischaal die vooraf is gevuld met steriel PBS en knip de CU met een steriele schaar in kleinere stukjes (elk ongeveer 3 cm). Verplaats die stukken van 3 cm lang vervolgens naar een ander petrischaaltje met verse steriele PBS om te voorkomen dat er bloed vrijkomt tijdens het snijproces.
    OPMERKING: Vanaf dit punt moeten de UC-stukken op ijs worden bewaard, evenals alle volgende verwerkingsstappen. Dit is erg belangrijk om het vrijkomen van gelatineus materiaal te voorkomen en het succes van de isolatieprocedure van WJ-MSC's uit het UC-weefsel te garanderen. Het verwerken van de verzamelde CU binnen maximaal 4-5 uur is cruciaal voor het succes van het isolatieproces. Voorheen werd de CU binnen langere perioden na afname verwerkt en helaas leverde de procedure geen succesvolle resultaten op (gegevens niet getoond).
  9. Begin één voor één (op ijs) met het verwerken van de UC-stukjes in een petrischaaltje gevuld met steriel PBS. Gebruik een steriele schaar en tang om bloedvaten weg te snijden en het weefsel van de Wharton's jelly (WJ) te isoleren. Plaats vervolgens de doorzichtige WJ-stukjes in een ander petrischaaltje gevuld met steriel PBS op ijs.
    OPMERKING: Tijdens de isolatie van WJ-weefsel van het UC-stuk, wordt de eerste incisie gemaakt aan de heldere kant van het UC-stuk, weg van de bloedvaten, om te voorkomen dat het vat wordt doorgesneden. Daarna worden bloedvaten afgeklemd, rondgesneden en weggetrokken.
  10. Herhaal de vorige stap op alle CU-stukken om helder WJ-weefsel zonder bloedvaten te verkrijgen.
    OPMERKING: Vervang de PBS-petrischaal, indien nodig, tijdens het verwerken van de CU-stukjes en het verwijderen van de bloedvaten, als de PBS-oplossing bloederig of onduidelijk wordt tijdens WJ-weefselisolatie.
  11. Was de verzamelde WJ-stukjes met PBS door ze over te brengen naar een vers celkweekschaaltje van 10 cm gevuld met steriel PBS.
  12. Gebruik een steriele, scherpe scalpel en een tang om de verzamelde WJ-weefsels in kleine stukjes van 10 mm te snijden.
  13. Breng de WJ-stukken over in de eerder voorbereide platen met 6 putjes in stap 1.3. Plaats 5-6 WJ-stukjes per putje, incubeer vervolgens de 6-putjes platen met WJ-weefselexplantaten in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37 °C in de CO2 -incubator en laat ze 3 dagen ongestoord staan.
  14. Voeg op de 4edag na het plaatsen van de WJ-weefselexplantaten voorzichtig 1 ml media per putje toe en zorg ervoor dat u de explantaten niet stoort.
    NOTITIE: Vermijd het aanraken of krassen van de onderkant van de plaat waar de WJ-stukken aan zijn bevestigd.
  15. Herhaal de vorige stap op de 6edag na het plaatsen van de WJ-weefselexplantaten.
  16. Op de 8edag na het plaatsen van de WJ-weefselexplantaten (d.w.z. bijna 1 week na het plaatsen van de explantatie), begint u om de dag de helft van het medium per putje te vervangen tot de 12e-14edag na het plaatsen van de explant. Vervang de helft van de kweekmedia uit elk putje door ongeveer 2,5 ml uit elk putje te verwijderen en verse 2,5 ml volledige warme media (37 °C) toe te voegen.
    NOTITIE: Trek de media van het oppervlak van de put en vermijd het aanraken of krassen van de bodem van de plaat waar de WJ-stukken aan zijn bevestigd. De WJ-MSC's verschijnen meestal binnen 5-10 dagen na het plaatsen van de explantaten onder en rond de explantaten van het WJ-weefsel.
  17. Observeer de platen met 6 putjes routinematig onder een omgekeerde microscoop (vergroting van 10x), en als de vrijgekomen cellen zich vermenigvuldigen en hun samenvloeiing toeneemt tot 50-60%, ga dan verder met de volgende stap; Zo niet, herhaal dan stap 1.16. opnieuw. De WJ-stukken krimpen in de loop van de tijd aanzienlijk in omvang.
  18. Verwijder voorzichtig de WJ-explantaten die aan de bodem van de putjes zijn bevestigd en verwijder alle media. Het verwijderen van WJ-explantatiestukken gebeurt meestal op de 12e-14edag na het voor het eerst plaatsen ervan.
    NOTITIE: Kantel de platen iets in een hoek van 45° terwijl u de media verwijdert om ervoor te zorgen dat alle media worden verwijderd.
  19. Was ze goed met 2 ml PBS, draai de plaat voorzichtig rond en gooi PBS weg. Herhaal deze wasstap twee keer.
    OPMERKING: Voeg PBS voorzichtig toe aan de wand van de put en vermijd het aanraken van de bodem van de putjes om ervoor te zorgen dat de cellen helemaal niet worden verstoord.
  20. Voeg voorzichtig 2 ml warme complete media per putje toe (media met een exacte samenstelling zoals beschreven in stap 1.2) en incubeer de 6-wells platen onder bevochtigde omstandigheden met 5% CO2 bij 37 °C.
  21. Verander de media om de dag volledig (2 ml volledige media per putje) totdat de cellen ongeveer 80% samenvloeien.
  22. Wanneer cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, passeert u de cellen met behulp van trypsine-EDTA naar T25-celkweekkolven (het totale aantal cellen verkregen uit één plaat met 6 putjes kan worden overgebracht naar één T25-kweekkolf, gebruik 8-9 ml volledige media per T25-kolf). Deze WJ-MSC's worden aangeduid als P1-cellen.
    OPMERKING: Laat cellen niet te lang met Trypsine-EDTA zitten om toxische effecten te voorkomen; Meestal is 3 minuten voldoende voor de loslating van de cellen. Verschillende leveranciers kunnen trypsine-EDTA voorzien van variabele potentie. Hiermee moet dan ook rekening worden gehouden bij het specificeren van de incubatietijd.
  23. Verander de media om de dag. Zodra de cellen ongeveer 80% samenvloeiing hebben bereikt, worden de cellen met behulp van trypsine-EDTA overgebracht naar T75-celcultuurkolven (het totale aantal cellen dat uit één T25-kweekkolf is verkregen, kan naar één T75-kweekkolf worden geleid; gebruik 15-18 ml volledige media per T75-kolf); deze WJ-MSC's worden aangeduid als P2-cellen.
  24. Verander de media om de dag. Zodra de cellen ongeveer 80% samenvloeiing hebben bereikt, maakt u de cellen los met behulp van Trypsine-EDTA en zaait u vervolgens WJ-MSC's met een dichtheid van ongeveer 0,75 x 106-1 x 106 cellen per T75-kolf. Deze WJ-MSC's worden aangeduid als P3-cellen.
    OPMERKING: Gebruik cellen tussen P3-P5 voor toekomstige experimenten die in dit protocol worden beschreven.
  25. Cryopreservatie van de geïsoleerde WJ-MSC's in vloeibare stikstof met behulp van cryopreservatiemedia die zijn samengesteld uit 80% FBS, 10% complete media (zoals beschreven in stap 1.2) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
    OPMERKING: Een schematische weergave van de volledige stappen voor WJ-MSC-isolatie wordt gegeven in figuur 1.

2. Karakterisering van geïsoleerde WJ-MSC's door immunofenotypering met behulp van flowcytometrische analyse voor verschillende CD-oppervlaktemarkers

  1. Maak de cellen los met behulp van trypsine-EDTA bij passage 4. Was de cellen twee keer met PBS en tel hun aantal met behulp van een hemocytometer.
    OPMERKING: Een minimale incubatietijd (gedurende 3 minuten) tijdens trypsinisatie is van cruciaal belang om cellen met succes los te maken zonder enige schade aan te richten. Langdurige incubatie met trypsine-EDTA kan leiden tot beschadiging van celoppervlaktemarkers en een negatieve invloed hebben op de resultaten van de immunofenotyperingstest.
  2. Incubeer ongeveer 100.000 cellen (in donkere omstandigheden) gedurende 20 minuten bij 4 °C met menselijke monoklonale antilichamen gelabeld met fycoerythrine (PE) of fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) als volgt: Anti-CD90 PE, Anti-CD73 PE, Anti-CD105 FITC, Anti-CD44 PE, Anti-CD34 PE, Anti-CD14 PE en Anti-HLA-DR FITC, en gebruik ongekleurde cellen als controles
  3. Spoel de cellen met PBS en suspendeer ze daarna opnieuw in 500 μL FACS-buffer; Analyseer met behulp van flowcytometrie45.

3. Beoordeling van het differentiatiepotentieel van geïsoleerde WJ-MSC's naar verschillende mesenchymale lijnen

  1. Adipogene differentiatie
    1. Resuspendeer de cellen in volledige proliferatiemedia (zoals beschreven in stap 1.2). Kweek de cellen daarna met een dichtheid van 3,7 x 104 cellen/putje (0,5 ml medium/putje) in een weefselkweekplaat met 24 putjes. Incubeer vervolgens onder bevochtigde omstandigheden van 5% CO2 bij 37 °C. Vervolgens, Volgende, om de andere dag, verander de media totdat de cellen bijna 100% samenvloeiing bereiken; Dit duurt meestal ongeveer 3-4 dagen.
    2. Verwijder de proliferatiemedia en vervang deze door adipogene differentiatiemedia om adipogenese te induceren. Vul de LG-DMEM-media aan met 100 μg/ml streptomycine, 100 E/ml penicilline, 0,25 μg/ml amfotericine B en het adipogene supplement dat wordt geleverd in de mesenchymale stamcel functionele identificatiekit. Vervang daarna de media voorzichtig (0,5 ml/putje) om de 3 dagen en vermijd de verstoring van de lipidevacuolen.
    3. Na ongeveer 21 dagen kleurt u met behulp van microscopisch onderzoek de lipidevacuolen met olierood om de adipogene differentiatie te beoordelen.
    4. Bereid een verse bouillonoplossing van Oil Red; Los 30 mg olierode vlek op in 10 ml isopropanol en rust minimaal 30 minuten op kamertemperatuur. Bereid vervolgens een werkende oplossing voor door 2 delen dubbel gedestilleerd water (ddH2O) te mengen met 3 delen bouillonoplossing, goed te mengen en 10 minuten op kamertemperatuur te laten rusten. Filtreer daarna met een filter van 0,22 of 0,45 μm.
      OPMERKING: Voor het beste kleurresultaat bereidt u de Oil Red-vlek vers voor.
    5. Voor een succesvolle documentatie van adipogene differentiatie moet u de cellen twee keer wassen met PBS en ze gedurende 15 minuten fixeren met neutraal gebufferde 10% formaline (0,75 ml/putje). Was de cellen daarna twee keer met PBS met 1 ml/putje (voordat u de PBS na elke wasbeurt weggooit, incubert u de cellen ongeveer 5 minuten).
      OPMERKING: Cellen die in proliferatiemedia worden gehouden (beschreven in stap 1.2) worden gebruikt als controlecellen, niet-geïnduceerde cellen. Voeg neutraal gebufferde formaline langzaam toe aan de wanden, niet direct op de cellen, om cellulaire schade te voorkomen. Na de laatste wasbeurt met PBS is volledige aspiratie van PBS cruciaal voordat de Oil Red-vlekwerkoplossing wordt toegevoegd om inefficiënte vlekken te voorkomen.
    6. Kleurt de cellen na de laatste wasbeurt (1 ml/putje) met olierode werkoplossing en incubeer ze gedurende 60 minuten bij 37 °C. Trek vervolgens de vlekoplossing op, gooi deze weg en spoel de cellen voorzichtig twee keer met PBS. Bekijk vervolgens onder de microscoop de gekleurde lipidedruppels.
  2. Osteogene differentiatie
    1. Resuspendeer de cellen in volledige proliferatiemedia (zoals beschreven in stap 1.2). Zaai daarna in een weefselkweekplaat met 24 putjes 7,4 x103 cellen/putje (voeg 0,5 ml medium/putje toe) en incubeer ze gedurende 3 dagen onder vochtige omstandigheden bij 5% CO2 bij 37 °C om bijna 70% samenvloeiing te bereiken.
    2. Vervang bij ongeveer 70% confluentie proliferatiemedia door differentiatie-inductiemedia met het osteogene supplement - geleverd in de mesenchymale stamcel functionele identificatiekit - in LG-DMEM-media aangevuld met 10% FBS, samen met 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 0,25 μg/ml amfotericine B.
    3. Vervang de differentiatiemedia eens in de 3 dagen en ga door met de osteogene inductie gedurende ongeveer 21 dagen.
    4. Bereid een werkende oplossing van Alizarin Red S-kleuring voor; breng 9 ml ddH2O en los er 200 mg Alizarine Red S-kleuring in op, en gebruik vervolgens ammoniumhydroxide en HCl om de pH aan te passen aan 4,1-4,3. Vul vervolgens het volume aan tot 10 ml met ddH2O. Filtreer vervolgens de oplossing met een filter (0,22 of 0,45 μm) om eventuele neerslag te verwijderen.
    5. Spoel de cellen aan het einde van de inductieperiode twee keer met PBS en fixeer ze vervolgens met neutraal gebufferde 10% formaline (0,75 ml/putje) en laat ze 15 minuten rusten. Spoel de cellen vervolgens twee keer met PBS (1 ml/putje) en zorg ervoor dat de cellen bij elke spoeling 5 minuten worden geïncubeerd.
      OPMERKING: Cellen die in proliferatiemedia worden gehouden (beschreven in stap 1.2) worden gebruikt als controlecellen, niet-geïnduceerde cellen.
    6. Voeg de 2% Alizarin-Red S-werkoplossing die in stap 3.2.4 is bereid, toe aan de vaste cellen uit de vorige stap en incubeer ongeveer 45-60 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
    7. Gooi vervolgens de kleuroplossing weg en spoel de cellen twee keer met ddH2O en vervolgens één keer met PBS, en beoordeel vervolgens succesvolle osteogene differentiatie onder de microscoop door de gekleurde calciumrijke extracellulaire matrix te observeren.
  3. Chondrogene differentiatie
    1. Resuspendeer de cellen in volledige proliferatiemedia (zoals beschreven in stap 1.2). Zaai daarna in een weefselkweekplaat met 24 putjes 7,4 x 103 cellen/putje (voeg 0,5 ml medium/putje toe) en incubeer deze onder vochtige omstandigheden bij 5% CO2 bij 37 °C gedurende 3 dagen om bijna 90% samenvloeiing te bereiken.
    2. Begin bij ongeveer 90% confluentie met het induceren van de chondrogene differentiatie met behulp van serumvrije DMEM/F12 aangevuld met insuline-transferrine selenium (ITS) en chondrogenisch supplement - geleverd met de mesenchymale stamcel functionele identificatiekit - samen met 0,25 μg/ml amfotericine B, 100 E/ml penicilline, 2 mM L-glutamine en 100 μg/ml Streptomycine46.
      OPMERKING: Het volledige chondrogene differentiatie-inductiemedium wordt in het donker bij 2-8 °C bewaard.
    3. Ga door met chondrogene differentiatie-inductie gedurende ongeveer 21 dagen; Vervang ondertussen de media elke 3 dagen.
    4. Bereid Alcian Blue vlekwerkoplossing als volgt: Bereid eerst 3% ijsazijn in ddH2O (voeg 3 ml ijsazijn toe en vul tot 100 ml met ddH2O). Bereid vervolgens een Alcian Blue-vlekoplossing voor door 20 mg toe te voegen aan 20 ml 3% ijszuuroplossing, deze ongeveer 30 minuten te laten staan en vervolgens te filteren met een filter van 0.22 μm of 0.45 μm om eventuele neerslag te verwijderen.
    5. Spoel de cellen aan het einde van de inductieperiode twee keer met PBS, fixeer ze vervolgens met 10% neutraal gebufferde formaline (0,75 ml/putje) en laat ze 15 minuten rusten. Was de cellen daarna twee keer met PBS (1 ml/putje). Zorg ervoor dat de cellen elke keer 5 minuten worden geïncubeerd.
      OPMERKING: Cellen die in proliferatiemedia worden gehouden (zoals beschreven in stap 1.2) worden gebruikt als controlecellen, niet-geïnduceerde cellen.
    6. Incubeer de vaste cellen in de 0,1% Alcian blauw bereide werkoplossing gedurende ongeveer 60 minuten bij 37 °C. Spoel de cellen twee keer met ddH2O en één keer met PBS om de resterende vlek te verwijderen. Observeer vervolgens met behulp van microscopisch onderzoek de gekleurde gesulfateerde proteoglycanen.

4. Isolatie van exosomen/sEV's uit WJ-MSC's geconditioneerde media

  1. Resuspendeer WJ-MSC's in volledige proliferatiemedia (zoals beschreven in stap 1.2) en zaai weefselkweekplaten met 6 putjes met deze WJ-MSC's met een dichtheid van 150.000 cellen/putje (2 ml media/putje) en incubeer ze bij 37 °C onder vochtige omstandigheden bij 5% CO2.
  2. Bereid serumvrije (SF) exosomenverzamelingsmedia als volgt: Dulbecco's Modified Eagle Medium (LG-DMEM) met lage glucose aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine en 0,25 μg/ml amfotericine B.
    OPMERKING: De exosomenverzamelmedia hebben dezelfde samenstelling als de volledige proliferatiemedia (beschreven in stap 1.2), maar zonder FBS.
  3. Volg de 6-wells platen (voorbereid in stap 4.1) en vervang de media om de dag met behulp van de proliferatiemedia (zoals beschreven in stap 1.2). Bekijk de cellen onder een microscoop totdat ze ongeveer 75-80% samenvloeiing bereiken.
  4. Wanneer 70% samenvloeiing is bereikt, wast u de cellen twee keer met PBS (1 ml/putje), voegt u vervolgens serumvrije (SF) exosomenverzamelmedia toe (1,5 ml/putje) (beschreven in stap 4.2) en incubeert u gedurende 48 uur bij 37 °C onder vochtige omstandigheden bij 5% CO2.
  5. Verzamel na 48 uur de geconditioneerde media van WJ-MSC van de weefselkweekplaten met 6 putjes die in de vorige stap in centrifugatiebuizen van 15 ml zijn geplaatst. Voer vervolgens de volgende opeenvolgende centrifugatie- en filtratiestappen uit om de verzamelde geconditioneerde media47 te verwijderen.
    OPMERKING: Beoordeel met behulp van trypanblauwe uitsluitingskleurstof gevolgd door het tellen van cellen met behulp van de hemocytometer het levensvatbaarheidspercentage van de cellen die oorspronkelijk werden gebruikt om de verzamelde geconditioneerde media af te leiden; De levensvatbare cellen zouden idealiter meer dan 90% moeten zijn. Bewaar de verzamelde celpellet daarna bij -80 °C voor het geval dit nodig is voor toekomstig onderzoek.
    1. Centrifugeer de verzamelde geconditioneerde media bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om eventuele zwevende cellen te verwijderen. Verzamel vervolgens het bovenstaande en voer de volgende centrifugatiestap uit voor dit verzamelde supernatans (geconditioneerde media).
    2. Centrifugeer de geconditioneerde media verkregen in stap 4.5.1 bij 3000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om necrotische cellen en celresten te verwijderen.
      LET OP: De centrifugatiestappen worden bij voorkeur uitgevoerd bij 4 °C, maar kunnen ook bij kamertemperatuur worden uitgevoerd met vergelijkbare resultaten.
    3. Filter het bovenstaande dat uit de vorige stap is verkregen door het door een filter van 0,22 μm in een nieuwe opvangbuis van 50 ml polypropyleen te leiden om eventueel achtergebleven celresten en grote EV's te verwijderen.
      OPMERKING: De gefilterde geconditioneerde media kunnen onmiddellijk worden gebruikt voor volgende stappen om exosomen/sEV's te isoleren, in de koelkast bij 4 °C worden bewaard en niet langer dan 3 dagen worden gebruikt, of worden bewaard bij -80 °C voor langdurige opslag totdat het isoleren van exosomen/sEV's nodig is. De gezuiverde geconditioneerde media die bij -80 °C zijn bewaard, worden bij voorkeur verwerkt binnen een maximale duur van 1-3 maanden; Hoe eerder hoe beter.
  6. Breng 7,5 ml geklaarde geconditioneerde media (verkregen uit stap 4.5) in een centrifugebuis van 15 ml en voeg 1,5 ml reagens toe. Voeg het reagens toe aan de media in een verhouding van 1:5 (d.w.z. 1 ml Exoquick-TC-precipitatiereagens voor elke 5 ml media). Keer daarna de buis op en neer om en tik er meerdere keren op om ervoor te zorgen dat het neerslaande reagens goed met de media wordt gemengd.
    OPMERKING: Het neerslaande reagens is een zwaar, stroperig reagens. Daarbij moet het benodigde volume langzaam en voorzichtig worden teruggetrokken om ervoor te zorgen dat het beoogde volume volledig wordt overgedragen.
  7. Bewaar de buis met de media met het neerslaande reagens 4 °C een nacht rechtop gedurende ongeveer 16 uur (ten minste 12 uur).
  8. Centrifugeer de volgende dag het media/precipitatie-reagensmengsel bij 1500 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Na centrifugatie verschijnt de exosomen/sEVs-pellet als een zeer kleine witte of beige pellet die zich op de bodem van de buis heeft genesteld.
    OPMERKING: Deze centrifugatiestap kan ook bij kamertemperatuur worden uitgevoerd met vergelijkbare resultaten. Als de exosoom/sEVs-pellet aan het einde van deze centrifugatiestap niet zichtbaar is, kan een extra centrifugeertijd bij 3000 x g voor een extra 20-30 minuten bij 4 °C worden toegevoegd. Soms blijft de pellet van exosomen/EV's onzichtbaar, zelfs na de verlengde centrifugatietijd, wat betekent dat er een kleine hoeveelheid exosomen/sEV's is. Ga in dit geval verder met het protocol door de onderste 5-10 μL van de buis te verlaten.
  9. Zuig het supernatant op en centrifugeer het mengsel van restmedia en neerslagreagens bij 1500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig vervolgens heel voorzichtig de resterende sporen van vloeistof op zonder de neergeslagen exosomen/sEVs-pellets te verstoren.
  10. Suspendeer de exosomen/sEVs-pellet in 100-300 μL steriel PBS, afhankelijk van de grootte en zichtbaarheid van de pellets. Daarna kunnen deze exosomen/sEV's onmiddellijk worden gebruikt of in een ultravriezer bij -80 °C worden bewaard voor latere experimenten.
    OPMERKING: In het geval dat u begint met meer dan één centrifugebuis voor dezelfde media (beschreven in stap 4.9) en de exosomen/sEVs-pellets (verkregen in stap 4.10) onzichtbaar zijn, kunnen de exosomen/sEVs-pellets die uit al deze pellets zijn verzameld, worden samengevoegd met behulp van ongeveer 100-300 μL steriel PBS om ze allemaal samengevoegd te suspenderen.
  11. Kwantificeer de verzamelde exosomen/sEV's ten opzichte van hun eiwitgehalte met behulp van een in de handel verkrijgbare bicinchoninezuur (BCA) eiwitkwantificeringskit, zoals aangegeven door de fabrikant.
    OPMERKING: Een schematische weergave van alle isolatiestappen van WJ-MSC's-afgeleide exosomen/sEV's wordt gegeven in figuur 2.

5. Beeldvorming van geïsoleerde exosomen/sEV's met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

  1. Suspendeer vers geïsoleerde exosomen/sEV's in 100-300 μL steriel PBS, afhankelijk van de grootte en zichtbaarheid van de pellets (zoals eerder beschreven in stap 4.11).
    OPMERKING: Het heeft veel de voorkeur om vers geïsoleerde in plaats van ingevroren exosomen/sEV's te gebruiken voor TEM-beeldvorming
  2. Pipetteer 20 μL exosomen/sEV's suspensie op een met koolstof gecoat rooster en laat 10 minuten drogen.
  3. Fixeer de geplaatste exosomen/sEV's met glutaaraldehyde-oplossing (2% in gedestilleerd water) gedurende ongeveer 15 minuten.
  4. Kleur daarna de gefixeerde exosomen/sEV's met 2% uranylacetaat en laat ze ongeveer 3 minuten in het donker staan, en onderzoek ze vervolgens onder een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) (vergroting 20000) met behulp van de standaard TEM-instellingen.

6. Bepaling van de gemiddelde grootte van geïsoleerde exosomen/sEV's met behulp van een deeltjesgrootte-analysator

  1. Verdun vers geïsoleerde exosomen/sEV's met een steriele PBS-pH 7,4 in een verhouding van 1:250.
  2. Meet de gemiddelde deeltjesgrootteverdeling van geïsoleerde exosomen/sEV's met behulp van een deeltjesgrootteanalysator bij 25 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Isolatie en karakterisering van WJ-MSC's

Zoals aangetoond in Figuur 3, verschenen er aanvankelijk kleine fibroblastachtige cellen onder en rond de WJ-explantaatweefsels binnen 5-10 dagen na het zaaien van die explantaten (Figuur 3A). Deze vrijgekomen WJ-MSC's blijven zich vermenigvuldigen en bereiken meestal ongeveer 80...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol konden we gedetailleerde stappen presenteren voor het isoleren van WJ-MSC's uit menselijk CU-weefsel en ook om hun afgeleide exosomen/sEV's te isoleren. CU is een gemakkelijk bereikbare onaangeboorde niet-invasieve bron om MSC's te verkrijgen, en er is geen speciale apparatuur voor verzameling of verwerking nodig 11,15,30,32,48.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle coauteurs verklaren geen belangenconflict in verband met dit werk.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door Ain Shams University - Strategic Plan Research Support Grant (2024/2025), Egypte, en het Nanotechnology Research Center (NTRC) - Access Award (2019/2020), The British University in Egypt (BUE), Caïro, Egypte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, USAA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, USAA5533
Ammonium hydroxideFisher Scientific, Germany1336-21-6
Antibody for human CD-105, FITCR&D systems Inc., MN, USAFAB10971F
Antibody for human CD-14, PEBeckman Coulter, USAIM0650U
Antibody for human CD-34, PEBeckman Coulter, USAIM1420
Antibody for human CD-44, PEBeckman Coulter, USAA32537
Antibody for human CD-73, PER&D systems Inc., MN, USAFAB5795P
Antibody for human CD-90, PER&D systems Inc., MN, USAFAB2067P
Antibody for human HLA-DR, FITCBeckman Coulter, USAIM1638U
Bicinchoninic acid (BCA) protein quantification kitThermofisher23227
Biosafety cabinet, Laminar flow, MSC AdvantageThermo Scientific, USA
CO2 Incubator, Direct FormaThermo Scientific, USA
Cooling CentrifugeSigma, Germany
Cooling CentrifugeEppendorf, Germany
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter, FL, USA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific, GermanyBP231-100
DMEM - Low Glucose 1 g/LLonza, Switzerland12-707F
DMEM/F12 Lonza, Switzerland12-719F
DNAse/RNAse free waterGibco Thermo Fisher, USA10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology gradeSigma-Aldrich, Germany24103
ExoQuick-TCSystem Biosciences (SBI), USAEXOTC50A-1Precipitating agent
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brazil10270-106
Formaldehyde 37%Fisher ScientificBP531-500
Glacial Acetic acidSigma Aldrich, GermanyA38S-500
Glutaraldehyde solution SigmaG7776
Hydrochloric acid (HCl)Fisher Scientific, GermanyA144-212
Inverted microscopeOlympus, Japan
L-GlutamineGibco Thermo Fisher, USA25030-024
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit R&D systems Inc., MN, USASC006
Microplate readerChromate, Awareness Technologies, USA
Oil Red StainSigma-Aldrich, USAO0625
Penicillin-Streptomycin-AmphotericinGibco Thermo Fisher, USA15240062
Phosphate buffered saline, 1x, without Ca/MgLonza, SwitzerlandBE17-516F
Shaking water-bathDaihan Wisebath, Korea
Syringe filter, 0.2 micronCorning, USA431224
Transmission electron microscopeJEM-1200EX II, Jeol, Germany
Trypan blue Gibco Thermo Fisher, USA15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1xLonza, SwitzerlandCC-5012
Uranyl acetate solution (2%)Electron Microsopy Sciences, USA22400-2
UV-Visible spectrophotometerShimadzu, Japan
VortexSciLogex
Zeta-sizer Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, United Kingdom Particle size analyzer

Referenties

  1. Zakrzewski, W., Dobrzyński, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 68(2019).
  2. Humes, H. D. Stem cells: the next therapeutic frontier. Trans Am Clin Climatol Assoc. 116, discussion 183-164 167-184 (2005).
  3. Sugarman, J. Ethical issues in stem cell research and treatment. Cell Res. 18 (1), S176(2008).
  4. Weiss, M., Troyer, D. Stem cells in the umbilical cord. Stem Cell Rev. 2 (2), 155-162 (2006).
  5. Kim, D., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  6. Ellis, H. Anatomy of fetal circulation. Anesth Intensive Care Med. 6 (3), 73(2005).
  7. Cook, H. J. Thomas Wharton's adenographia, first published in London in 1656. Med Hist. 42 (3), 411-412 (1998).
  8. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Handbook of Stem Cell Therapy. , Springer. Singapore. (2022).
  9. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: a meta-analysis study. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 484(2020).
  10. Nabil, M., Kassem, D. H., Ali, A. A., El-Mesallamy, H. O. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells ameliorate cognitive impairment in Alzheimer's disease rat model: emerging role of SIRT1. BioFactors. 49 (6), 1121-1142 (2023).
  11. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  12. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles: a potential game changer for the COVID-19 crisis. Front Cell Dev Biol. 8, 587866(2020).
  13. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), 886(2019).
  14. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. J Cell Biochem. 123 (5), 906-920 (2022).
  15. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: achievements and challenges. Front Cell Dev Biol. 8, 16(2020).
  16. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2009).
  17. Troyer, D., Weiss, M. Concise review: Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  18. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  19. Batsali, A., Kastrinaki, M., Papadaki, H., Pontikoglou, C. Mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly of the umbilical cord: biological properties and emerging clinical applications. Curr Stem Cell Res Ther. 8 (2), 144-155 (2013).
  20. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  21. Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells. JoVE. (186), e63348(2022).
  22. Da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P., Nardi, N. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119 (11), 2204-2213 (2006).
  23. Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21 (2), 216-225 (2014).
  24. Shetty, P., Cooper, K., Viswanathan, C. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potentials of cord matrix, cord blood, and bone marrow mesenchymal stem cells. Asian J Transfus Sci. 4 (1), 14-24 (2010).
  25. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., Mesallamy, H. O. E. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regen Med. 10 (7), 841-855 (2015).
  26. Sibov, T. T., et al. Mesenchymal stem cells from umbilical cord blood: parameters for isolation, characterization and adipogenic differentiation. Cytotechnology. 64 (5), 511-521 (2012).
  27. Arutyunyan, I., Elchaninov, A., Makarov, A., Fatkhudinov, T. Umbilical cord as prospective source for mesenchymal stem cell-based therapy. Stem Cells Int. 2016, 6901286(2016).
  28. Knudtzon, S. In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human cord blood. Blood. 43 (3), 357(1974).
  29. Fong, C., et al. Human Wharton's jelly stem cells have unique transcriptome profiles compared to human embryonic stem cells and other mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 7 (1), 1-16 (2011).
  30. El Omar, R., et al. Umbilical cord mesenchymal stem cells: the new gold standard for mesenchymal stem cell based therapies. Tissue Eng Part B Rev. 20, 523-544 (2014).
  31. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): a comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  32. La Rocca, G., et al. Isolation and characterization of Oct-4+/HLA-G+ mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new markers. Histochem Cell Biol. 131 (2), 267-282 (2009).
  33. Moffett, A., Loke, Y. The immunological paradox of pregnancy: a reappraisal. Placenta. 25 (1), 1-8 (2003).
  34. Chao, K., Chao, K., Fu, Y., Liu, S. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One. 3 (1), e1451(2008).
  35. Tsai, P., et al. Transplantation of insulin-producing cells from umbilical cord mesenchymal stem cells for the treatment of streptozotocin-induced diabetic rats. J Biomed Sci. 19, 47(2012).
  36. Chatzistamatiou, T., et al. Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood. Transfusion. 54 (12), 3108-3120 (2014).
  37. Newton, W. C., Kim, J. W., Luo, J. Z. Q., Luo, L. Stem cell-derived exosomes: a novel vector for tissue repair and diabetic therapy. J Mol Endocrinol. 59 (4), R155-R165 (2017).
  38. Wei, W., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising biological tool in nanomedicine. Front Pharmacol. 11, 590470(2021).
  39. Bjorge, I. M., Kim, S. Y., Mano, J. F., Kalionis, B., Chrzanowski, W. Extracellular vesicles, exosomes and shedding vesicles in regenerative medicine-a new paradigm for tissue repair. Biomater Sci. 6 (1), 60-78 (2018).
  40. Zhang, K., Cheng, K. Stem cell-derived exosome versus stem cell therapy. Nat Rev Bioeng. 1 (9), 608-609 (2023).
  41. Colao, I. L., Corteling, R., Bracewell, D., Wall, I. Manufacturing exosomes: a promising therapeutic platform. Trends Mol Med. 24 (3), 242-256 (2018).
  42. Zheng, W., et al. Identification of scaffold proteins for improved endogenous engineering of extracellular vesicles. Nat Commun. 14 (1), 4734(2023).
  43. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  44. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  45. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of Flow Cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration. , Wiley-Blackwell. (2010).
  46. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 108(2016).
  47. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  48. Xu, Y., et al. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells isolated by a novel explantation technique can differentiate into functional endothelial cells and promote revascularization. Stem Cells Dev. 19 (10), 1511-1522 (2010).
  49. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  50. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  51. Hua, J., et al. Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix: proliferation and multilineage differentiation as compared to mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and bone marrow. Cell Biol Int. 38 (2), 198-210 (2013).
  52. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Curr Protoc Stem Cell Biol. 48 (1), e68(2019).
  53. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplant. 27 (1), 181-193 (2018).
  54. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  55. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell Tissue Res. 372 (1), 91-98 (2018).
  56. Börger, V., et al. Mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles and their potential as novel immunomodulatory therapeutic agents. Int J Mol Sci. 18 (7), 1450(2017).
  57. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  58. Kou, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for immunomodulation and regeneration: a next generation therapeutic tool. Cell Death Dis. 13 (7), 580(2022).
  59. Huang, L., et al. Research advances of engineered exosomes as drug delivery carrier. ACS Omega. 8 (46), 43374-43387 (2023).
  60. Sun, Y., et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes for drug delivery. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 561(2021).
  61. Chopra, N., et al. Biophysical characterization and drug delivery potential of exosomes from human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. ACS Omega. 4 (8), 13143-13152 (2019).
  62. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2023).
  63. Kamei, N., et al. Comparative study of commercial protocols for high recovery of high-purity mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle isolation and their efficient labeling with fluorescent dyes. Nanomedicine. 35, 102396(2021).
  64. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87, 31-45 (2015).
  65. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12184(2022).
  66. Manning, R. R., et al. Analysis of peptides using asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4). J Pharm Sci. 110 (12), 3969-3972 (2021).
  67. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 131(2018).
  68. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells Int. 2020, 8898221(2020).
  69. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  71. Witwer, K. W., et al. Updating MISEV: evolving the minimal requirements for studies of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 10 (14), e12182(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Whartonse gelei MSC sisolatie van exosomennavelstrengweefselexplantaattechniekimmunofenotyperingoppervlaktemarkerstransmissie elektronenmicroscopiepartikelgrootteanalyse
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.