Dit artikel beschrijft een gedetailleerd experimenteel protocol voor het meten van het koolstofgehalte van luchtwegmacrofagen met als doel de interne blootstellingsdosis te beoordelen op het niveau van individuele blootstelling aan fijnstof.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meting van het koolstofgehalte in luchtwegmacrofagen die zijn blootgesteld aan koolstofhoudende deeltjes
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Pulmonale macrofagen vertonen een dosisafhankelijk patroon in fagocytiserende deeltjes. Na overspoeling worden deze macrofagen vervolgens uitgescheiden met sputum, waardoor macrofagen en deeltjes zichtbaar en kwantificeerbaar worden onder lichtmicroscopie. Met name elementaire koolstof in het lichaam van zoogdieren is uitsluitend afkomstig van externe verontreinigingen. Bijgevolg dient het koolstofgehalte in luchtwegmacrofagen (CCAM) als een geldige blootstellingsbiomarker, die de individuele blootstelling aan koolstofhoudende deeltjes (PM) nauwkeurig schat. Dit artikel schetst een protocol met betrekking tot het verzamelen, conserveren, verwerken, voorbereiden en kleuren van sputum, evenals het verzamelen en analyseren van macrofaagfoto's. Na het verwijderen van de macrofaagkernen werd het aandeel van het cytoplasmagebied dat wordt ingenomen door koolstofdeeltjes (PCOC) berekend om het koolstofgehalte in elke macrofaag te kwantificeren. De resultaten wijzen op een verhoging van de CCAM-niveaus na blootstelling aan koolstofhoudende PM. Samenvattend maakt deze niet-invasieve, precieze, betrouwbare en gestandaardiseerde methode de directe meting van koolstofdeeltjes in doelcellen mogelijk en wordt deze gebruikt voor grootschalige kwantificering van individuele CCAM door middel van geïnduceerd sputum.
Inleiding
Luchtverontreiniging wordt in verband gebracht met sterfgevallen als gevolg van aandoeningen van de luchtwegen en hart- en vaatziekten, wat een ernstige bedreiging vormt voor de menselijke gezondheid 1,2. Epidemiologische gegevens geven aan dat chronische blootstelling aan fijnstof in de omgeving met een diameter van minder dan of gelijk aan 2,5 μm (PM2,5) verantwoordelijk is voor de vroegtijdige dood van tussen de 4 en 9 miljoen mensen wereldwijd. PM2.5 werd gerangschikt als de vijfde belangrijkste risicofactor voor wereldwijde mortaliteit in de Global Burden of Disease, Injuries, and Risk Factors Study (GBD) van 20153,4,5,6. Studies hebben aangetoond dat naleving van de WHO-richtlijnen voor luchtverontreiniging 51,213 sterfgevallen per jaar door blootstelling aan PM2.5 kan voorkomen3. Momenteel ontbreekt de evaluatie van intra-individuele blootstelling in de meeste studies en zijn ze alleen gebaseerd op ruwe evaluaties op grotere regionale monitoringlocaties, die ver verwijderd zijn van individuele blootstellingsniveaus. De beschikbare biomarkers voor inwendige blootstelling, zoals PAK's in de urine en benzo(a)pyreen, weerspiegelen niet de associaties tussen blootstelling aan zwevende deeltjes en gezondheidseffecten 7,8,9. Dit leidt tot het onvermogen om een nauwkeurige relatie met gezondheidseffecten vast te stellen. Daarom is het zoeken naar markers die het niveau van blootstelling aan fijnstof bij een persoon weerspiegelen een van de sleutels tot een nauwkeurige blootstellingsbeoordeling voor individuen.
Deeltjes die in de bronchiën worden ingeademd, kunnen met sputum worden uitgescheiden via ciliaire oscillaties in de bronchiën. Het ontbreken van een gecilieerd slijmstroomtransportsysteem in de longblaasjes betekent dat de primaire klaringsroute voor deeltjes die de longblaasjes binnenkomen via fagocytose en translocatie door macrofagenis 10,11. Op basis van de anatomische structuur van de long is de klaring van onoplosbare vreemde deeltjes traag. Hierdoor kan fijnstof gedurende langere perioden interageren met longcellen en verschillende biologische effecten veroorzaken, waardoor schade aan longweefsel en andere organen ontstaat 12,13. Stimulatie door fijnstof leidt tot activering van macrofagen, waardoor een cascade van ontstekingsfactoren in de longen op gang komt die een systemische ontstekingsreactie kunnen veroorzaken14. Gezien de cruciale rol van macrofaagcytofagie bij het uitlokken van cytokinestormen in de longen, wordt getheoretiseerd dat koolstofdeeltjes van longmacrofagen de biologisch effectieve dosis van blootstelling aan koolstofdeeltjes in de lucht zouden kunnen weerspiegelen15. Bovendien, aangezien er geen aggregatie van elementaire koolstof in zoogdiercellen is en koolstofhoudende deeltjes onder een lichtmicroscoop kunnen worden waargenomen als zwarte deeltjes, kan het verzamelen van alveolaire en bronchiale macrofagen en het meten van het koolstofgehalte daarin dienen als een marker voor het evalueren van de blootstelling aan fijnstof16.
Deze studie identificeerde een methode voor het nauwkeurig beoordelen van individuele blootstellingsniveaus aan deeltjes, bekend als het koolstofgehalte van luchtwegmacrofagen (CCAM). In het bijzonder werden populatiesputummonsters verzameld nadat deelnemers hypertone zoutoplossing hadden ingeademd die werd gegenereerd door een ultrasone vernevelaar. Deze monsters werden vervolgens geconserveerd met behulp van een fixerende oplossing. Luchtwegmacrofagen werden geïsoleerd, gekleurd en gefotografeerd onder een lichtmicroscoop om macrofagen te identificeren die koolstofhoudende deeltjes bevatten, die vervolgens werden gekwantificeerd. Deze methode biedt een biologische marker voor het nauwkeurig beoordelen van individuele blootstellingsniveaus aan fijnstof. Het legt een methodologische basis voor het onderzoeken van de relatie tussen blootstelling aan fijnstof en gezondheidseffecten, en dient als onderzoeksbasis voor het onderzoeken van verbanden tussen blootstelling aan PM en gezondheidsresultaten zoals longziekten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De studie kreeg goedkeuring van de Medische Ethische Commissie van het Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention (NIOHP201604), met schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van alle proefpersonen voorafgaand aan de studie en biologische monsterverzameling. Voor deze studie werden carbon black packers geselecteerd die meer dan 1 jaar in een carbon black-fabriek werkten en werden blootgesteld aan carbon black aerosolen. Werknemers in de waterleiding in een waterleidingfabriek zonder significante beroepsmatige blootstelling aan schadelijke factoren werden gerekruteerd uit de lokale omgeving als controlepopulatie om het onderzoek op te zetten. De volgende in- en exclusiecriteria werden geselecteerd voor de onderzoekspopulatie: Inclusiecriteria voor carbon black packers omvatten direct contact met carbon black tijdens de meeste diensten en een minimum van een jaar werk in het blootstellingsgebied aan carbon black. Werknemers in de waterleiding werden opgenomen als ze geen beroepsmatige blootstelling hadden aan roet of andere verontreinigende stoffen in hun werkomgeving. Uitsluitingscriteria omvatten werknemers met chronische ziekten zoals kanker, degenen die in de afgelopen drie maanden röntgenstraling hadden ondergaan, personen met een voorgeschiedenis van longtuberculose, longchirurgie, virale myocarditis, aangeboren hartafwijking, recente koorts of ontsteking, en werknemers die onlangs antibiotica hadden gebruikt. De reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Conservering van sputum
- Bereid de fixeeroplossing voor door de onderstaande stappen te volgen:
- Smelt 2% polyethyleenglycol (PEG1500) in een waterbad. Neem 20 ml gesmolten PEG1500 in een centrifugebuis. Voeg 20 ml 50% ethanol toe aan de centrifugebuis en schud het mengsel grondig om de moedervloeistof te maken.
- Giet geleidelijk 40 ml van de moedervloeistof in 960 ml 50% ethanol. Schud de oplossing goed om de Saccomanno-fixatieoplossing te vormen. Bewaar de oplossing op een koele, donkere plaats.
- Voeg 20-30 ml van de bereide fixeeroplossing toe aan een centrifugebuis die ongeveer 2 ml sputum bevat. Meng de inhoud grondig.
NOTITIE: Zorg ervoor dat het totale volume niet groter is dan 40 ml. - Sluit de centrifugebuis af met een afdichtingsfolie. Bewaar het op een koele, donkere plaats. Transporteer de buis naar het laboratorium voor verdere verwerking wanneer deze klaar is.
OPMERKING: Smelt PEG1500 altijd in een waterbad en gebruik volgens de voorgeschreven dosering.
2. Bereiding van celsuspensie in sputum
- Bereid de spijsverteringsoplossing voor door 0,1 g dithiothreitol op te lossen in 100 ml zoutoplossing volgens de werkelijke dosering. Bewaar de bereide oplossing maximaal 48 uur bij 4 °C.
- Centrifugeer de buis met het sputum bij 1.998 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Gooi het bovenstaande weg. Voeg een gelijk volume sputumdigest toe aan het neerslag. Draai en schud het mengsel grondig.
- Plaats de buis in een waterbad van 37 °C tot volledige vloeibaarmaking (10-15 min).
NOTITIE: Schud de buis continu tijdens het vloeibaarmakingsproces.
- Plaats de buis in een waterbad van 37 °C tot volledige vloeibaarmaking (10-15 min).
- Filtreer het vloeibare mengsel met een 70 μm filtermembraan.
- Centrifugeer de gefiltreerde oplossing bij 500 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg, met behoud van het celneerslag.
- Resuspendeer het celprecipitaat in Duchenne-fosfaatbuffer. Centrifugeer de geresuspendeerde oplossing bij 500 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C om een zuiver celneerslag te verkrijgen.
3. Voorbereiding van het celuitstrijkje
- Voeg 200-600 μL fosfaatbuffer toe aan het celsediment. Meng de inhoud grondig; Pas het buffervolume aan op basis van de resultaten van het tellen van cellen (streef naar >1,0 × 105 cellen).
- Neem 20 μL van de celsuspensie en maak een celuitstrijkje met behulp van de hematocrietmethode17.
- Laat het uitstrijkje op natuurlijke wijze aan de lucht drogen (binnen 48 uur). Fixeer het uitstrijkje gedurende 10 s met een in de handel verkrijgbare kleuroplossing.
- Dompel het uitstrijkje 8 s onder in een kleuroplossing. Til tijdens het vlekken de dia voorzichtig op en neer en spoel overtollige vlekken af met stromend water.
- Kleur het uitstrijkje 8 s aan in B-kleuringsoplossing. Til de dia op tijdens het vlekken en spoel overtollige vlekken af onder stromend water.
OPMERKING: Kleuringsoplossingen A en B zijn verkrijgbaar in de in de handel verkrijgbare kleuringsset. - Dompel het glaasje twee keer in watervrije ethanol, telkens gedurende 2-3 s.
- Eenmaal droog, breng een geschikte hoeveelheid neutrale gom aan. Sluit de dia af met dekglaasjes.
4. Kwantitatieve analyse van CCAM
- Gebruik een lichtmicroscoop met een 100x olielensobjectief. Leg afbeeldingen vast van willekeurig geselecteerde, goed gekleurde en morfologisch intacte macrofagen. Maak willekeurig 50 macrofaagfoto's voor elk monster.
- Voer beeldanalyse uit in de Image J-software door de onderstaande stappen te volgen:
- Meet de schaal en bepaal de werkelijke lengte en pixel-naar-pixel conversie (282 pixels = 10 μm). Stel de schaal in Afbeelding J in (Analyseer > Schaal instellen), voer Afstand in pixels, werkelijke lengte, lengte-eenheid (μm) in en vink Globaal aan.
- Gebruik een onregelmatige vorm om de cellen te omlijnen. Verwijder de achtergrond (selecties uit de vrije hand, bewerken > wissen buiten). Meet de totale oppervlakte van de cellen (Analyseer > meting).
- Knip de kern weg (bewerken > knippen). Converteer de grijswaardenafbeelding naar zwart-wit (afbeelding > Type > 8 bit).
- Pas de grijswaardenwaarde aan die specifiek is voor elke celkleuring voor een nauwkeurige telling van koolstofdeeltjes (afbeelding > > drempel aanpassen > Meting, Toepassen, Analyseren >>).
- Bereken het koolstofgehalte van 50 macrofagen per monster op basis van het gemeten gebied en de beeldanalyse in Image J-software.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het sputum, geconserveerd en verwerkt met de fixatieve oplossing, vertoonde intacte macrofaagmorfologie onder een optische microscoop tijdens morfologisch onderzoek. De macrofagen vertoonden heldere, ronde of niervormige, gemakkelijk te bevlekken celkernen. Na kleuring leken de celkernen blauwachtig paars, terwijl het cytoplasma lichtroze of lichtblauw was. Het microscopische veld vertoonde minimale onzuiverheden, wat een gemakkelijke celidentificatie vergemakkelijkte. In de cellen waren...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie presenteert een gedetailleerd experimenteel protocol voor het gebruik van geïnduceerde sputum-afgeleide CCAM als biologische marker voor interne blootstelling aan atmosferische deeltjes. CCAM kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd door middel van optische microscopie, en dient als een nauwkeurige biomarker voor interne blootstelling die de relatie met gezondheidseffecten weerspiegelt. Daarom is er behoefte aan het vaststellen en optimaliseren van een handige, betrouwbare ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82273669, 82241086, 42207488), het Taishan Scholars Program van de provincie Shandong (nr. tsqn202211121) en het Innovation and Technology Program for the Excellent Youth Scholars of Higher Education van de provincie Shandong (2022KJ295).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3 mL steriele rietjes | Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD | 84202ES03 | |
| 50 mL centrifugebuisje | Thermo Fisher Scientific, USA | 339652 | |
| Absolute ethyl alcohol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD | 64-17-5 | |
| Ceder olie | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD | C805296 | |
| Diff-quick kleuringsoplossing | Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD | 40748ES76 | |
| Dithiothreitol | Solebo Bio Co., LTD | D8220 | |
| Duchenne fosfaat buffer (DPBS) | Thermo Fisher Scientific, USA | 14190144 | |
| Microscoop camera | Olympus Corporation of Japan | DP72 | |
| Neutraal boomgom | Solebo Bio Co., LTD | G8590 | |
| Nylon filtermembraan 70um | BD Falcon Bioscience, USA | 211755 | |
| Optische microscoop | Olympus Corporation of Japan | BX60 | |
| Polyethyleenglycol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD | 25322-68-3 | |
| Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | SL40R | |
| Viscose diapositiva | Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD | 188105 |
Referenties
- Münzel, T., et al. Environmental stressors and cardio-metabolic disease: part I-epidemiologic evidence supporting a role for noise and air pollution and effects of mitigation strategies. Eur Heart J. 38 (8), 550-556 (2017).
- Guarnieri, M., et al. Lung function in rural Guatemalan women before and after a chimney stove intervention to reduce wood smoke exposure: results from the randomized exposure study of pollution indoors and respiratory effects and chronic respiratory effects of early childhood exposure to respirable particulate matter study. Chest. 148 (5), 1184-1192 (2015).
- Khomenko, S., et al. Premature mortality due to air pollution in European cities: a health impact assessment. Lancet Planet Health. 5 (3), e121-e134 (2021).
- Kulkarni, N., Pierse, N., Rushton, L., Grigg, J. Carbon in airway macrophages and lung function in children. N Engl J Med. 355 (1), 21-30 (2006).
- Krzyzanowski, M. WHO air quality guidelines for Europe. J Toxicol Environ Health A. 71 (1), 47-50 (2008).
- Cohen, A. J., et al. Estimates and 25-year trends of the global burden of disease attributable to ambient air pollution: An analysis of data from the Global Burden of Diseases Study 2015. Lancet. 389 (10082), 1907-1918 (2017).
- Hajat, A., et al. The association between long-term air pollution and urinary catecholamines: Evidence from the multi-ethnic study of atherosclerosis. Environ Health Perspect. 127 (5), 57007(2019).
- Traffic-related air pollution: A critical review of the literature on emissions, exposure, and health effects. , Available from: https://www.healtheffects.org/publication/traffic-related-air-pollution-critical-review-literature-emissions-exposure-and-health (2010).
- Uccelli, R., et al. Female lung cancer mortality and long-term exposure to particulate matter in Italy. Eur J Public Healt.h. 27 (1), 178-183 (2017).
- Zhang, L., et al. Indoor particulate matter in urban households: sources, pathways, characteristics, health effects, and exposure mitigation. Int J Environ Res Public Health. 18 (21), 11055(2021).
- Wang, K., Zeng, R. Cough and expectoration. Handbook of Clinical Diagnostics. , 27-29 (2020).
- Qi, Y., et al. Passage of exogeneous fine particles from the lung into the brain in humans and animals. PNAS. 119 (26), e2117083119(2022).
- Comunian, S., Dongo, D., Milani, C., Palestini, P. Air pollution and COVID-19: The role of particulate matter in the spread and increase of COVID-19's morbidity and mortality. Int J Environ Res Public Health. 17 (12), 4487(2020).
- Sharma, J., et al. Emerging role of mitochondria in airborne particulate matter-induced immunotoxicity. Environ Pollut. 270, 116242(2021).
- Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
- Kupiainen, K., Klimont, Z. Primary emissions of fine carbonaceous particles in Europe. Atmos Environ. 41 (10), 2156-2170 (2007).
- Tueller, C., et al. Value of smear and PCR in bronchoalveolar lavage fluid in culture positive pulmonary tuberculosis. Eur Respir J. 26 (5), 767-772 (2005).
- Takiguchi, H., et al. Macrophages with reduced expressions of classical M1 and M2 surface markers in human bronchoalveolar lavage fluid exhibit pro-inflammatory gene signatures. Sci Rep. 11 (1), 8282(2021).
- Andelid, K., et al. Lung macrophages drive mucus production and steroid-resistant inflammation in chronic bronchitis. Resp Res. 22 (1), 172(2021).
- Weiszhar, Z., Horvath, I. Induced sputum analysis: Step by step. Eur Respiratory Soc. 9, 300-306 (2013).
- Popov, T., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis. Eur Respir J. 8 (4), 559-565 (1995).
- Sumner, H., et al. Predictors of objective cough frequency in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 187 (9), 943-949 (2013).
- Brugha, R. E., et al. Carbon in airway macrophages from children with asthma. Thorax. 69 (7), 654-659 (2014).
- Simpson, J. L., Timmins, N. L., Fakes, K., Talbot, P. I., Gibson, P. G. Effect of saliva contamination on induced sputum cell counts, IL-8 and eosinophil cationic protein levels. Eur Respir J. 23 (5), 759-762 (2004).
- Risse, E. K., Van't Hof, M. A., Laurini, R. N., Vooijs, P. G. Sputum cytology by the Saccomanno method in diagnosing lung malignancy. Diagn Cytopathol. 1 (4), 286-291 (1985).
- Eells, T. P., Pratt, D. S., Coppolo, D. P., Alpern, H. D., May, J. J. An improved method of cell recovery following bronchial brushing. Chest. 93 (4), 727-729 (1988).
- Bai, Y., et al. Mitochondrial DNA content in blood and carbon load in airway macrophages. A panel study in elderly subjects. Environ Int. 119, 47-53 (2018).
- Jary, H., Rylance, J., Patel, L., Gordon, S. B., Mortimer, K. Comparison of methods for the analysis of airway macrophage particulate load from induced sputum, a potential biomarker of air pollution exposure. BMC Pulm Med. 15, 1-9 (2015).
- Gilbert, D. F., Meinhof, T., Pepperkok, R., Runz, H. DetecTiff: A novel image analysis routine for high-content screening microscopy. J Biomol Screen. 14 (8), 944-955 (2009).
- Dai, Y., et al. Effects of occupational exposure to carbon black on peripheral white blood cell counts and lymphocyte subsets. Environ Mol Mutagen. 57 (8), 615-622 (2016).
- Cheng, W., et al. Carbon content in airway macrophages and genomic instability in Chinese carbon black packers. Arch Toxicol. 94 (3), 761-771 (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
