Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het kweken van een cystische fibrose-relevante polymicrobiële biofilm om fenotypes van de gemeenschap te onderzoeken

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66785

⸱

19 april 2024

 , 
1Département de Biologie, Université de Sherbrooke

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een cystic fibrosis (CF) longrelevant vier-species polymicrobieel biofilmmodel dat kan worden gebruikt om de impact van bacteriële interacties tussen soorten te onderzoeken.

Samenvatting

De meeste in vitro modellen missen de capaciteit om bacteriële fenotypes die voortkomen uit de complexe interacties die in real-life omgevingen worden waargenomen, volledig te onderzoeken. Dit is met name het geval in de context van moeilijk te behandelen, chronische en op polymicrobiële biofilm gebaseerde infecties die worden gedetecteerd in de luchtwegen van personen die leven met cystische fibrose (CF), een genetische ziekte met meerdere organen. Hoewel meerdere microbioomstudies de microbiële samenstellingen hebben gedefinieerd die in de luchtwegen van mensen met CF (pwCF) worden gedetecteerd, hebben tot nu toe geen enkele in vitro-modellen kritieke CF-relevante longkenmerken volledig geïntegreerd. Daarom bestaat er een aanzienlijke kennislacune in de capaciteit om de mechanismen te onderzoeken die de pathogenese van CF-longinfecties van gemengde soorten aansturen. Hier beschrijven we een recent ontwikkeld microbieel gemeenschapsmodel van vier soorten, waaronder Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis en Prevotella melaninogenica gekweekt in CF-achtige omstandigheden. Door het gebruik van dit systeem werden klinisch relevante fenotypes zoals antimicrobiële recalcitrantie van verschillende pathogenen waargenomen en onderzocht op moleculair niveau. Het nut van dit in vitro model ligt in de gestandaardiseerde workflow die de studie van intersoortelijke interacties in de context van chronische CF-longinfecties kan vergemakkelijken.

Inleiding

Strategieën die gericht zijn op het uitroeien van ziekteverwekkende microben, zoals die worden gedetecteerd in de luchtwegen van cystische fibrose (CF), een genetische ziekte met meerdere organen, mislukken vaak. Dat wil zeggen, de aanwezigheid van veerkrachtige biofilmachtige microbiële gemeenschappen die groeien in de slijmrijke CF-longomgeving kan chronische infecties veroorzaken die meerdere decennia beslaan. Bovendien, hoewel het gebruik van eerstelijns antimicrobiële stoffen (Abx) en modulatoren heeft geleid tot verbeterde resultaten bij mensen met CF (pwCF), is de klinische benadering van "één bug, één infectie" die doorgaans wordt gebruikt tegen canonieke CF-pathogenen zoals Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus niet effectief geweest bij het oplossen van moeilijk te behandelen infecties die in de longen van deze personen zijn gedetecteerd 3,4, 5,6,7.

In de afgelopen twee decennia hebben meerdere onderzoeken ons begrip van chronische CF-longziekte veranderd8. Dat wil zeggen, rapporten geven aan dat infecties die in de luchtwegen van pwCF worden gedetecteerd, niet alleen worden veroorzaakt door een enkele ziekteverwekker, maar eerder polymicrobieel van aard zijn8. Bovendien, hoewel de pathogenese van CF-longinfecties van gemengde soorten nog steeds slecht wordt begrepen, toont klinisch bewijs aan dat pwCF die gelijktijdig zijn geïnfecteerd met zowel S. aureus als P. aeruginosa in hun luchtwegen, de longfunctie hebben verslechterd dan individuen die door een van deze twee pathogenen zijn gekoloniseerd.

Er wordt verondersteld dat interacties tussen soorten tussen CF-pathogenen een reden zijn waarom polymicrobiële biofilm-gebaseerde infecties niet gemakkelijk worden uitgeroeid door het gebruik van CF-therapieën, wat uiteindelijk van invloed is opde resultaten voor de patiënt. Ter ondersteuning hiervan hebben in vitro studies aangetoond dat interacties tussen microben zoals P. aeruginosa, S. aureus en anderen van invloed kunnen zijn op klinisch relevante fenotypes zoals Abx-responsiviteit op eerstelijns CF-geneesmiddelen, waaronder vancomycine en tobramycine 6,10,11. Daarom moet de huidige behandelingsstrategieën die gericht zijn op het uitroeien van CF-pathogenen in de context van infecties met gemengde soorten nog worden herzien.

De gouden standaard in de behandeling van microbiële CF-longinfecties is sterk afhankelijk van het gebruik van antimicrobiële gevoeligheidstesten (AST) om klinische interventies te begeleiden12. ASAT wordt echter meestal gedaan met behulp van bacteriële monoculturen die worden gekweekt in rijke en goed gemengde culturen, wat geen afspiegeling is van de microbiële groeiomstandigheden die in de CF-luchtwegen worden gedetecteerd 3,13. Gezien de aanzienlijke discrepantie tussen patiëntresultaten en het succes van de behandeling, pleiten klinische rapporten nu voor de ontwikkeling van nieuwe benaderingen die kritieke kenmerken van de CF-long integreren12,14.

Er zijn maar weinig studies die CF-relevante bacteriële multispecies in vitro systemen hebben ontwikkeld die meer dan twee pathogenenbevatten15,16. Deze modellen (1) weerspiegelen echter niet volledig de polymicrobiële en biofilmachtige aard van de CF-long en (2) maken geen gebruik van voedings- en omgevingsomstandigheden die in de buurt komen van de omstandigheden die in de CF-luchtwegen worden gedetecteerd15,16. Door het ontginnen van grote CF-long-afgeleide 16S rRNA-gendatasets en berekeningen, hebben Jean-Pierre en collega's onlangs een in vitro co-cultuurmodel ontwikkeld dat de bovengenoemde kenmerken integreert10. Dit systeem omvat P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. en Prevotella spp. gekweekt in CF-luchtwegachtige omstandigheden en stabiel gedurende maximaal 14 dagen. De auteurs rapporteerden ook gemeenschapsspecifieke groei van Prevotella spp. en verschillende veranderingen in de Abx-responsiviteit van deze CF-pathogenen via mechanismen die nog moeten worden geïdentificeerd10. Dit traceerbare in vitro systeem bood ook de mogelijkheid om zich te verdiepen in mechanistisch gerichte vragen met betrekking tot Abx-recalcitrantie van een veel voorkomende variant van P. aeruginosa die vaak wordt gedetecteerd in de luchtwegen van pwCF10. Daarom is het doel van dit protocol om de CF-onderzoeksgemeenschap een gestandaardiseerde experimentele workflow te bieden om een in vitro biofilm te kweken die het potentieel heeft om verder te worden uitgebreid om een aantal CF-relevante vragen aan te pakken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De details van alle reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van kunstmatig sputum medium

OPMERKING: In dit protocol wordt kunstmatig sputummedium (ASM) gedefinieerd als het CF-relevante medium dat is gemodificeerd ten opzichte van SCFM2, eerder gepubliceerd door Turner en collega's17. Hieronder vindt u een beschrijving van de stappen om dit medium voor te bereiden. Zie Tabel met materialen om voorraadoplossingen en opslagcondities te maken. Deze versie van ASM verschilt van Turner et al.,17 omdat de buffercapaciteit in de originele versie geen stabiele pH in de loop van de tijd mogelijk maakt. Dat wil zeggen, fermentatie-activiteit uitgevoerd door Streptococcus spp. en anaëroben zoals Prevotella spp. resulteert in de verzuring van het groeimedium (niet-gepubliceerde waarnemingen). Daarom is de concentratie 3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS) aangepast van 10 mM naar 100 mM.

OPMERKING: Het bereiden van een 2x ASM-basis (ASMb) voorraadoplossing vergemakkelijkt de toevoeging van componenten zoals mucine, agar, water, enz., zonder de uiteindelijke concentratie van moleculen in ASM10,18 te beïnvloeden. De 2x ASMb kan van tevoren worden bereid en tot twee weken op een donkere plaats bij 4 °C worden bewaard. Als het medium geel wordt, gooi het dan weg.

  1. Voor de bereiding van 2x ASM-basisbouillon voegt u in een schoon bekerglas met 400 ml diH2O al roerend het volgende toe:
    1. Voeg 6,50 ml van een 0,2 m NaH2PO4 toe. H2O voorraad; 6,25 ml van een voorraad van 0,2 M Na2HPO4 ; 348 μl van een 1 M KNO3 voorraad; 1,084 ml van een 0,25 M K2SO4 bouillon.
    2. Voeg 4,0 g synthetische gistdruppel zonder tryptofaan toe; 3.032 g NaCl; 20,92 g MOPS; 1,116 g KCl en 0,124 g NH4Cl.
    3. Voeg 9,30 ml van een 1 M L-melkzuurbouillon toe; 2,70 ml van een glucosevoorraad van 1,1 M; 1,75 ml van een 1 M CaCl2,2H 2O bouillon; 1,20 ml van een voorraad van 0,25 M N acetylglucosamine en 1,00 ml van een 3,6 mM FeSO4,7H 2O bouillon.
    4. Voeg 660 μL van een 0,1 M tryptofaanbouillon toe; 606 μL van een voorraad van 1 M MgCl2,6H 2O; 0,60 g desoxyribonucleïnezuur uit haringsperma; 400 μL van een 250 mg/ml 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) voorraad.
    5. Zodra alle componenten zijn toegevoegd, stelt u de pH in op 6,80 met een NaOH-kolf van 5 M. Vul aan tot 500 ml met diH2O. Steriliseer met een filter van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.
  2. Voor de bereiding van een 10 mg/ml (2x) mucinebouillon gebruikt u een schone glazen fles met 250 ml diH2O en al roerend:
    1. Voeg 5,0 g mucine uit de varkensmaag toe - Type II. Meng de suspensie gedurende 10 min. Compleet tot 500 ml met diH2O.
    2. Steriliseer door autoclaveren bij 121 °C gedurende 15 min. Houd op 4 °C tot gebruik.
  3. Stel het ASM opnieuw samen.
    OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd op de dag van het experiment.
    1. Meng een 1:1 volumeverhouding van de 2x ASMb-bouillon en de 10 mg/ml mucinebouillon.
    2. Vortex grondig voor gebruik.

2. Bereiding van selectieve media voor polymicrobiële gemeenschap

OPMERKING: Hieronder staan de hoeveelheden die nodig zijn om een volume van 1 L media te bereiden.

  1. Volg de instructies van de fabrikant om Mannitol Salt Agar (MSA) en Pseudomonas Isolation Agar (PIA) te bereiden.
  2. Om Prevotella Selective Agar (PSA) te bereiden, voeg je in een schone glazen fles het volgende toe:
    1. 30,0 g tryptische sojabouillon (TSB). 15,0 g agar. 5,00 g gistextract. 0,50 g L-cysteïnehydrochloride.
    2. 10,0 ml van een 0,5 mg/ml heminbouillon. 100 μL van een 10 mg/ml menadionvoorraad.
    3. Voeg 940 ml diH2O toe en roer. Steriliseer door autoclaveren bij 121 °C gedurende 15 min.
    4. Als de fles is afgekoeld (d.w.z. de fles kan met blote handen worden vastgehouden), voeg dan al roerend toe: 50,0 ml gederibrineerd schapenbloed. 2,00 ml van een kanamycinevoorraad van 50 mg/ml. 150 μL van een vancomycinevoorraad van 50 mg/ml. 500 μL van een 10 mg/ml polymixine B-voorraad.
  3. Voeg het volgende toe om Streptococcus Selective Agar (SSA) in een schone glazen fles te bereiden:
    1. 30,0 g TSB. 15,0 g agar.
    2. Voeg 950 ml diH2O toe en roer. Steriliseer door autoclaveren bij 121 °C gedurende 15 min.
    3. Als de fles is afgekoeld (d.w.z. de fles kan met blote handen worden vastgehouden), voeg dan al roerend toe: 50,0 ml gederibrineerd schapenbloed. 1,00 ml van een 10 mg/ml polymixine B-bouillon. 1,00 ml van een oxolinzuurvoorraad van 10 mg/ml.
      LET OP: Giet in borden en bewaar maximaal 1 maand op 4 °C. Laat de platen voor gebruik tot 24 uur van tevoren bij kamertemperatuur drogen voordat ze worden geënt. PSA is gevalideerd met P. melaninogenica en Prevotella intermedia. SSA is gevalideerd met S. sanguinis en de Streptococcus milleri-groep (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius en Streptococcus anginosus, aangeduid als SMG). Het wordt sterk aanbevolen om deze selectieve media de novo te valideren als nieuwe stammen moeten worden getest.

3. Bereiding en groeiomstandigheden van bacteriële vloeibare media

  1. Om P. aeruginosa en S. aureus routinematig te laten groeien, gebruikt u een steriel rijk medium (bijv. lysogeniebouillon (LB) of TSB).
    1. Begin 's nachts met vloeibaar door een enkele kolonie te plukken die eerder op een LB/TSB-agarplaat is gekweekt gedurende 20-24 uur bij 37 °C.
    2. Laat de bouillonculturen een nacht bij 37 °C groeien en schud ze 16-18 uur bij 250 tpm.
  2. Om Streptococcus spp. te kweken, gebruik je steriele Todd Hewitt Bouillon aangevuld met 0,5 % gistextract (THB-YE).
    1. Start 's nachts met vloeibare cultuur van een enkele kolonie die eerder is gekweekt op een TSB-agarplaat aangevuld met 5% gedefibrineerd schapenbloed (bloedagarplaat) gedurende 24 uur bij 37 °C + 5% CO2.
    2. Laat de THB-YE-culturen anaeroob of bij 37 °C + 5% CO2 's nachts groeien zonder te schudden gedurende 18-22 uur.
  3. Om Prevotella spp. te laten groeien, bereidt u 1 L Prevotella groeimedium (PGM) voor door het volgende toe te voegen aan een schone fles:
    1. 30,0 g TSB. 5,00 g gistextract. 0,50 g L-cysteïnehydrochloride. 10,0 ml van een 0,5 mg/ml heminbouillon en 100 μl van een 10 mg/ml menadionbouillon.
    2. Voeg 990 ml diH2O toe. Steriliseer door autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 min. Wikkel de fles in aluminiumfolie om hem tegen licht te beschermen.
    3. Kweek kolonies van Prevotella spp. op een bloedagarplaat die anaeroob is geïncubeerd bij 37 °C gedurende 48 uur.
    4. Inoculeer een enkele kolonie in PGM en groei 's nachts zonder te schudden bij 37 °C anaeroob gedurende 24 uur.
      NOTITIE: PGM kan maximaal twee weken bij kamertemperatuur worden bewaard. Het wordt sterk aanbevolen om voor gebruik steriliteitstests uit te voeren op elk groeimedium. Als er geen anaërobe kamer wordt gebruikt, kan het nodig zijn om 's nachts te beginnen met vloeibare Prevotella spp. uit een stukje kolonies.

4. Voorbereiding van het co-cultuurexperiment

OPMERKING: Figuur 1 toont een samengevatte experimentele workflow. Het opzetten van het experiment kan onder oxische omstandigheden worden gedaan als de voorbereidingstijd minder dan 1 uur duurt. Als wordt verwacht dat het langer zal duren, wordt het sterk aanbevolen om het experiment uit te voeren met behulp van een anaërobe kamer (met 10% CO2, 10% H2 en 80% N2 gemengd gas). Anaërobe potten kunnen ook worden gebruikt om de experimentele monsters uit te broeden.

  1. Bereiding van de monoculturen en co-culturen
    NOTITIE: Voer alle centrifugatiestappen uit bij 10.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Voor de co-culturen mengt u de bacteriemonsters net voor het inoculeren van de platen met 96 putjes. Doorgaans wordt een volume van 1 ml voor P. aeruginosa - en S. aureus-stammen verzameld uit de nachtelijke culturen. Voor Streptococcus spp. en Prevotella spp. kunnen de nachtelijke volumes variëren tussen 2-4 ml. Deze volumes kunnen worden aangepast afhankelijk van het aantal te testen omstandigheden.
    1. Voer de volgende stappen uit met behulp van de bacteriële vloeistof uit de nachtculturen:
      1. Voor P. aeruginosa - en S. aureus-stammen , tweemaal wassen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
      2. Voor Streptococcus spp. en Prevotella spp., eenmaal wassen met steriel PBS.
        OPMERKING: Gebruik een pipet om supernatanten voorzichtig weg te gooien, omdat de pellets gemakkelijk verloren kunnen gaan.
      3. Na de wasbeurten elke pellet resuspenderen in 1 ml 1x waterverdunde ASMb.
      4. Maak een verdunning van 1:10 van elk monster in steriel PBS en meet de OD600.
      5. Pas alle culturen aan op een OD600 van 0,2 in ASM.
      6. Verdun met behulp van de OD600 = 0,2 suspensies de bacteriemonsters in ASM tot een uiteindelijke OD600 van 0,01 (voor elke microbe) voor de monoculturen en co-culturen.
      7. Draai grondig gedurende 5 s.
        OPMERKING: Om bijvoorbeeld in totaal 1 ml P. aeruginosa monocultuur ASM-suspensie te bereiden bij OD600 = 0,01, voegt u 50 μl P. aeruginosa bij OD600 = 0,2 toe aan een volume van 950 μl ASM. Neem voor de cocultuur 50 μl van elke suspensie van P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. en Prevotella spp. bij een OD600 = 0,2 en voeg toe aan 800 μL ASM.
      8. Voeg met een pipet 100 μl van de monocultuur- en cocultuursuspensies toe in drie afzonderlijke putjes van een steriele plastic plaat met 96 putjes met platte bodem.
      9. Incubeer de plaat (zonder te schudden) gedurende 24 uur bij 37 °C onder zuurstofloze omstandigheden.
        OPMERKING: Andere zuurstofspanningen (bijv. microxia, normoxie) kunnen hier ook worden gebruikt. Het model is echter ontwikkeld en gevalideerd met zuurstofloze omstandigheden. Bevestig de startinocula door de mono- en co-cultuur bacteriële suspensies serieel te verdunnen, en uitplating op PIA, MSA, SSA en PSA wordt sterk aanbevolen. De beoogde startconcentratie voor elke bacteriesoort is 1 × 107 kve/ml (P. aeruginosa), 3,5 × 106 kve/ml (S. aureus), 1,2 × 106 kve/ml (Streptococcus spp.) en 4,6 × 106 kve/ml (Prevotella spp.). Bacteriële inocula kunnen ook worden gemodificeerd, zoals beschreven door Jean-Pierre en collega's10.
  2. Vervang de media na biofilmvorming.
    1. Verwijder na 24 uur incubatie de losse (planktonische) cellen door aspiratie met behulp van een meerkanaalspipet.
    2. Vul de voorgevormde biofilms aan met 100 μL verse ASM of de gewenste behandeling (bijv. antibiotica, metabolieten, enz.).
    3. Incubeer de plaat nog 24 uur bij 37 °C onder zuurstofloze omstandigheden.
      OPMERKING: Deze stappen kunnen aeroob worden uitgevoerd als ze snel worden uitgevoerd (d.w.z. minder dan 1 minuut). Gebruik anders een anaërobe kamer.

5. Verzamelen en plateren van de monsters

  1. Na de extra 24 uur incubatie zuigt u de niet-aangehechte (planktonische) cellen op met een meerkanaalspipet.
    OPMERKING: De planktonische fractie kan worden bewaard, serieel verdund en op selectieve media worden geplateerd of worden weggegooid.
  2. Was de biofilms twee keer voorzichtig met 125 μL steriele PBS en gooi de volumes weg.
  3. Voeg 50 μL steriele PBS toe en maak de biofilms los door de cellen voorzichtig van de plaat te schrapen met behulp van een 96-pins replicator.
  4. Breng de geresuspendeerde biofilmcellen over naar rij A van een nieuwe steriele plaat met 96 putjes.
    OPMERKING: De plaat met 96 putjes bevat steriele PBS in de rijen B tot en met H.
  5. Voer een 10x seriële verdunning uit van de planktonische (indien nodig) en biofilmfracties.
  6. Plak 3-5 μL van elk verdunningsmonster op PIA, MSA, SSA en PSA.
  7. Laat de inoculatieplekken drogen.

6. Incubatie van de selectieve platen en telling van de kolonievormende eenheid (KVE)

  1. Voor P. aeruginosa en S. aureus, incuberen bij 37 °C gedurende 18-20 uur.
  2. Voor Streptococcus spp., gedurende 24 uur incuberen bij 37 °C onder zuurstofloze omstandigheden.
  3. Voor Prevotella spp. gedurende 48 uur incuberen bij 37 °C onder zuurstofloze omstandigheden.
  4. Tel na incubatie de kolonies (~10-35 per plek) en bereken de CFU per ml.
  5. Plot de gegevens met behulp van een visualisatietool.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals weergegeven in figuur 2, werden verschillende fenotypes gerapporteerd, waaronder (1) een vermindering van het aantal levensvatbare cellen van P. aeruginosa en S. aureus bij groei in gemengde planktonische gemeenschappen in vergelijking met monocultuur, (2) een toename van polymicrobiële groei van S. sanguinis-cellen en (3) gemengde gemeenschapsgroei van P. melaninogenica zoals eerder gerapporteerd door Jean-Pierre en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het nut van dit klinisch geïnformeerde in vitro co-cultuursysteem ligt in het vermogen om polymicrobieel-specifieke bacteriële functies te detecteren. Dat wil zeggen, door het gebruik van dit model hebben we microbiële fenotypes gerapporteerd, variërend van gemeenschapsspecifieke groei van Prevotella spp. (Figuur 2) tot veranderingen in gevoeligheid voor frontlinie CF Abx van P. aeruginosa, S. aureus en S. sanguinis

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen openbaarmakingen.

Dankbetuigingen

We willen Dr. George A. O'Toole en Dr. Thomas H. Hampton bedanken voor hun belangrijke rol in het ontwerp en de ontwikkeling van het in vitro polymicrobiële gemeenschapsmodel. Wij danken Dr. Sophie Robitaille voor haar behulpzame commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Cystic Fibrosis Foundation JEAN21F0 aan F.J-P. Figuur 1 van het manuscript is gemaakt met behulp van BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)Fisher ScientificNC0387928Bereid een 250 mg/mL stock in chloroform direct in de fles. Bewaar bij -20°C. Eindconcentratie 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS)SigmaM1254Eindconcentratie 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicatorFisher Scientific05-450-9Beschikbare replicators kunnen ook worden gebruikt. Cat #NC1567338.
96-well steriele standaardplaat met dekselFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2,5 L Rechthoekige PotFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500Bereid een 1 M stock in water en filter steriliseer met een 0,22 μm filter. Eindconcentratie 3,5 mM in 2x ASM base.
Defibrinereerd schapenbloedOm groeipitten voor Streptococcus en Prevotella voor te bereiden.
Deoxyribonucleïnezuur uit haringspermaSigmaD7290Eindconcentratie 1,2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O Fisher ScientificAA1449830Bereid een 1 mg/mL stock (3,6 mM) in water en filter steriliseer met een 0,22 μm filter. Bewaar ingepakt in aluminiumfolie. Eindconcentratie 0,0072 mM in 2x ASM base.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucoseFisher ScientificD16-3Bereid als 20% stock (1,1 M) in water en steriliseer door autoclave. Eindconcentratie 6 mM in 2x ASM base.
HeminSigma51280Los 100 mg hemin op in 2 mL 1 M NaOH en breng het volume dan op 200 mL met water. Bewaar in een ambachtelijke fles of een gewone fles ingepakt in aluminiumfolie bij 4 °C.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Bereid een 0,25 M stock in water en filter steriliseer met een 0,22 μm filter. Eindconcentratie 0,54 mM in 2x ASM base.
KanamycineBereid een 50 mg/mL stockoplossing in water. Filter steriliseer met een 0,22 μm filter en bewaar bij 4 °C.
KClFisher ScientificP217-500Eindconcentratie 30,0 mM in 2x ASM base.
KNO3Fisher ScientificP263-500Bereid een 1 M stock in water en filter steriliseer met een 0,22 μm filter. Eindconcentratie 0,70 mM in 2x ASM base.
L-cysteïnehydrochlorideFisher ScientificAAA1038922
L-Melkzuur SigmaL1750Bereid een 1 M stock in water en filter steriliseer met een 0,22 μm filter. pH aanpassen naar 7,0. Eindconcentratie 18,6 mM in 2x ASM base.
L-TryptofaanSigmaT0254Bereid een 0,1 M stock in 0,2 M NaOH en filter steriliseer met een 0,22 μm filter. Bewaar gekoeld bij 4 °C ingepakt in aluminiumfolie. Eindconcentratie 0,132 mM in 2x ASM base.
Mannitol-zout agarFisher ScientificB11407Bereid volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
MenadionSigmaM5625Bereid een 10 mg/mL stockoplossing opgelost in 96-100% ethanol. Bewaar bij 4 °C ingepakt in aluminiumfolie. Voor gebruik kortjes mengen.
MgCl2*6H2O Fisher ScientificAA12288A9Bereid een 1 M stock in water en filter steriliseer met een 0,22 μm filter. Eindconcentratie 1,21 mM in 2x ASM base.
Mucine uit varkensmaag - Type II SigmaM2378Bereid een 10 mg/mL (2x) stock in water; meng grondig voor autoclaving. Bewaar bij 4 °C.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500Bereid een 0,2 M stock in water en filter steriliseer met een 0,22 μm filter. Eindconcentratie 2,5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine SigmaA8625Bereid een 0,25 M stock in water en filter steriliseer met een 0,22 μm filter. Bewaar stock gekoeld bij 4 °C. Eindconcentratie 0,6 mM in 2x ASM base.
NaClFisher ScientificS271-500Eindconcentratie 103,7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500Bereid een 0,2 M stock in water en filter steriliseer met een 0,22 μm filter. Eindconcentratie 2,6 mM in 2x ASM base.
NaOHFisher ScientificS318-500Bereid een 5 M stockoplossing. Gebruik om de pH van 2x ASM base stock aan te passen.
NH4ClFisher ScientificA661-500Eindconcentratie 4,6 mM in 2x ASM base.
OxolinzuurBereid een 10 mg/mL stockoplossing 0,5 M NaOH. Filter sterilise

Referenties

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
  2. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373 (9678), 1891-1904 (2009).
  3. Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway. mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).
  4. Martin, C., et al. Longitudinal microbial and molecular dynamics in the cystic fibrosis lung after elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy. Respir Res. 24 (1), 317(2023).
  5. Sosinski, L. M., et al. A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung. J Cystic Fibros. 21 (6), 996(2022).
  6. Orazi, G., O'Toole, G. A. 34;It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  7. Nichols, D. P., et al. Clinical effectiveness of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor in people with cystic fibrosis: A clinical trial. Am J Respir Crit Care Med. 205 (5), 529-539 (2022).
  8. Filkins, L. M., O'Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: Polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS Pathog. 11 (12), e1005258(2015).
  9. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 35 (6), 947-953 (2016).
  10. Jean-Pierre, F., et al. Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system. Elife. 12 (12), e81604(2023).
  11. Toole Orazi, G., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa alters Staphylococcus aureus sensitivity to vancomycin in a biofilm model of cystic fibrosis infection. mBio. 8 (4), e00873-e00917 (2017).
  12. Lipuma, J. J. The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).
  13. Coenye, T. Biofilm antimicrobial susceptibility testing: Where are we and where could we be going. Clin Microbiol Rev. 36 (4), e0002423(2023).
  14. Waters, V. J., et al. Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections. Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).
  15. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  16. Varga, J. J., et al. Antibiotics drive expansion of rare pathogens in a chronic infection microbiome model. mSphere. 7 (5), e0031822(2022).
  17. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  18. Clay, M. E., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).
  19. Hoffman, L. R., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).
  20. Heirali, A., et al. Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin. Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).
  21. Nelson, M. T., et al. Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome. Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).
  22. Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community. Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123(2023).
  23. Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists. Front Mol Biosci. 8, 634479(2021).
  24. Hendricks, M. R., et al. Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).
  25. Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).
  26. Wu, Y., et al. Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model. Matter. 7 (1), 216-236 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Cystische fibrose-biofilmmicrobieel gemeenschapsmodelin vitro-modelPseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureusStreptococcus sanguinisPrevotella melaninogenicaantimicrobiële resistentiemicrobioominteracties
Het kweken van een cystische fibrose-relevante polymicrobiële biofilm om fenotypes van de gemeenschap te onderzoeken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.