Deze studie presenteert een orthotopisch model voor niet-kleincellige longkanker (NSCLC) op basis van intrapulmonale inoculatie van meercellige sferoïden van fluorescerende A549-iRFP-cellen. Het model recapituleert klinische NSCLC-stadia en reageert op cisplatine, volgens dynamische in vivo monitoring van fluorescentie met lange golflengten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Constructie van een orthotopisch xenotransplantaatmodel van niet-kleincellige longkanker dat ziekteprogressie nabootst en geneesmiddelactiviteiten voorspelt
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is een zeer dodelijke ziekte met een complexe en heterogene tumormicro-omgeving. Momenteel recapituleren gangbare diermodellen op basis van subcutane inoculatie van suspensies van kankercellen de micro-omgeving van de tumor in NSCLC niet. Hierin beschrijven we een orthotopisch xenotransplantaatmodel voor longkanker bij muizen dat gebruik maakt van de intrapulmonale inoculatie van driedimensionale meercellige sferoïden (MCS). In het bijzonder werden fluorescerende menselijke NSCLC-cellen (A549-iRFP) gedurende 3 weken gekweekt in microplaten met 96 putjes met collageen met een lage hechting om MCS te vormen, die vervolgens intercostaal werden geïnoculeerd in de linkerlong van athymische naaktmuizen om het orthotope longkankermodel vast te stellen.
Vergeleken met de oorspronkelijke A549-cellijn reageerde MCS van de A549-iRFP-cellijn op dezelfde manier op geneesmiddelen tegen kanker. Het fluorescerende signaal met lange golflengte van de A549-iRFP-cellen correleerde sterk met gemeenschappelijke markers van kankercelgroei, waaronder sferoïde volume, cellevensvatbaarheid en cellulair eiwitniveau, waardoor dynamische monitoring van de kankergroei in vivo mogelijk is door fluorescerende beeldvorming. Na inoculatie bij muizen vorderde het A549-iRFP MCS-xenotransplantaat op betrouwbare wijze door fasen die sterk lijken op de klinische stadia van NSCLC, waaronder de uitbreiding van de primaire tumor, het ontstaan van naburige secundaire tumoren en de metastasen van kankercellen naar de contralaterale rechterlong en afgelegen organen. Bovendien reageerde het model op het benchmarkgeneesmiddel tegen longkanker, cisplatine, met de verwachte toxiciteit en langzamere kankerprogressie. Daarom zou dit orthotopische xenotransplantaatmodel van NSCLC bij muizen dienen als een platform om de progressie van de ziekte samen te vatten en de ontwikkeling van potentiële geneesmiddelen tegen kanker te vergemakkelijken.
Inleiding
Van alle oncologische aandoeningen veroorzaakt longkanker niet alleen het hoogste verlies aan levens, maar claimt het ook het op één na hoogste aantal nieuwe patiënten per jaar in de VS1. Deze verwoestende maligniteit vormt een groot obstakel in de moderne gezondheidszorg en dringt aan op een dieper begrip van de ingewikkelde biologie en effectievere therapeutische modaliteiten. Niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is verantwoordelijk voor 85% van de longkanker en heeft de neiging zich te ontwikkelen tot solide tumoren. Een van de belangrijkste uitdagingen bij longkanker is de dynamische en heterogene micro-omgeving van de tumor, die de progressie van de kanker en de reacties op therapeutische interventies diepgaand beïnvloedt 4,5,6. Een beter begrip van de wisselwerking tussen kankercellen en hun micro-omgeving in verschillende stadia van NSCLC vraagt om verfijnde pathologische modellen die de histologische kenmerken van NSCLC-progressie samenvatten.
In dit opzicht komen orthotope diermodellen naar voren als een veelbelovende weg voor NSCLC-onderzoek. In tegenstelling tot algemeen gebruikte subcutane xenotransplantaatmodellen7, bevatten orthotope modellen kankercellen die rechtstreeks in het orgaan van oorsprong worden geïnoculeerd. Voor longkanker betekent dit dat kankercellen rechtstreeks in het longweefsel worden geïmplanteerd 8,9. Bijgevolg bootsen orthotope modellen van longkanker de oorspronkelijke micro-omgeving van de tumor beter na, inclusief de aangrenzende weefsels, bloedvaten en immuuncomponenten, waardoor hun fysiologische en klinische relevantie wordt verbeterd.
Driedimensionale meercellige sferoïden (MCS) vertegenwoordigen een andere veelbelovende benadering voor het recapituleren van kenmerken van de tumoromgeving. De meeste kankers worden gekenmerkt door hun complexe tumormicro-omgeving, waaronder de verschillende cel-celinteracties, de extracellulaire matrix en de gradiënten in zuurstof en voedingsstoffen10,11. Traditionele 2D-celculturen missen de ruimtelijke en structurele complexiteit om deze tumorspecifieke kenmerken samen te vatten12. MCS van de juiste grootte daarentegen heeft een heterogene structuur met een hypoxische en necrotische kern, die niet alleen de intratumorale micro-omgeving recapituleert, maar ook de fysiologische barrière tegen het binnendringen van geneesmiddelen, wat een belangrijk mechanisme is van geneesmiddelresistentie bij antikankertherapie 13,14,15.
Door gebruik te maken van zowel de orthotope diermodellen als de MCS-kweektechnieken, is MCS geënt op immuungecompromitteerde muizen om met succes orthotope modellen van borstkanker en prostaatkanker te construeren16,17. Hierin rapporteren we de gedetailleerde methodologie om een orthotopisch xenotransplantaatmodel van longkanker bij muizen te construeren en te karakteriseren. Deze methode maakt gebruik van de intrapulmonale inoculatie van 3D MCS afgeleid van fluorescerende menselijke longkankercellen (A549-iRFP)18. Dit model biedt een uitzonderlijke mogelijkheid om de in vivo progressie van longkanker te observeren in stadia die nauw parallel lopen met de vier klinische stadia van NSCLC. Bovendien reageerde de xenotransplantaatkanker van dit model op het klinisch vastgestelde medicijn tegen longkanker, cisplatine.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De dierstudie werd uitgevoerd met goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of the Pacific (Animal Protocols 19R10 en 22R10). Acht mannelijke athymische naaktmuizen van 5-6 weken oud, met een gewicht van 20-25 g, gefokt met het genoemde knaagdierdieet en gehuisvest onder pathogeenvrije (SPF) omstandigheden, werden gebruikt voor de huidige studie. Kooien, beddengoed en drinkwater werden regelmatig geautoclaveerd en vervangen. Een schema van tumorinoculatie bij muizen is weergegeven in figuur 1. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Oprichting van driedimensionale MCS van A549-iRFP-cellen
- Incubeer A549-iRFP-cellen (humaan longadenocarcinoom) in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37 °C en kweek ze in volledig groeimedium DMEM met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 1 μg/ml puromycine.
- Zaad A549-iRFP-cellen in 96-well ultra-low attachment, sferoïde microplaat met ronde bodem bij een zaaidichtheid van 4.000 cellen/put, met behulp van 100 μL volledig groeimedium aangevuld met 0,3% collageen.
- Centrifugeer de microtiterplaten bij 300 × g gedurende 7 minuten bij 4 °C om de MCS-vorming te vergemakkelijken. Onderzoek de MCS-morfologie onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen na centrifugatie worden samengevoegd.
- Voeg na 48 uur 100 μl volledig groeimedium toe aan elk putje om een totaal volume van 200 μl groeimedium per putje te verkrijgen.
- Vervang om de dag 100 μL groeimedium in elk putje door vers, compleet groeimedium.
2. Karakterisering van A549-iRFP MCS
- Observeer en beeld de MCS-morfologie met behulp van een microscoop en schat het MCS-volume door simulatie met de gerefereerde software van MATLAB op basis van de fasecontrastmicroscoopbeelden.
- Open één MCS-afbeelding in de ImageJ-software.
- Gebruik selecties uit de vrije hand om de rand van het MCS te selecteren en toe te voegen aan ROI Manager.
- Klik op Bewerken | Selectie | Masker maken.
- Klik op Bewerken | Omkeren.
- Klik op Bestand | Opslaan als | Tiff.
- Open de ReViSP-software.
- Open de opgeslagen TIFF-afbeelding door op Bladeren te klikken.
- Klik op Start om de MCS-simulatie te voltooien.
- Meet het iRFP-fluorescerende signaal met behulp van het infraroodbeeldvormingssysteem op het 700 nm-kanaal en kwantificeer het fluorescerende signaal met behulp van software (bijv. Image Studio).
- Open de Image Studio-software.
- Selecteer op het tabblad Kanalen 700 en Intensiteit = 5.
- Selecteer op het tabblad Scanbediening de optie 84 μm, Gemiddeld, 0,0 mm en Afbeelding spiegelen. Houd al het andere als standaard.
- Klik op Start om het scannen te starten.
- Beoordeel en kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de 3D-cellevensvatbaarheidstest volgens het protocol van de leverancier.
- Beoordeel en kwantificeer cellulair eiwit met behulp van de BCA-test volgens het protocol van de leverancier.
3. MCS-selectie voor tumorinoculatie
OPMERKING: Nadat MCS in sferoïde microplaten is gezaaid en gedurende 2-3 weken is gekweekt met regelmatige uitwisseling van groeimediums, selecteert u MCS met de volgende geschikte kenmerken voor tumorinoculatie.
- Bekijk de MCS-morfologie onder een microscoop en kies MCS met een ronde vorm met over het algemeen gladde randen, maar met 5-10 ruwe knoppen (pijlen in figuur 2F) en een diameter binnen het bereik van 700-800 μm.
- Meet de iRFP-fluorescentie (zie stap 2.2) en selecteer de MCS waarvan de fluorescerende signalen binnen één standaarddeviatie van het gemiddelde liggen.
4. Intrapulmonale MCS-inoculatie
OPMERKING: Gebruik 70% isopropylalcoholspray om het operatiestation en het gereedschap schoon te maken voordat u de dieren aanraakt.
- Verdoof elke muis met een IP-injectie van 80 mg/kg ketamine en 12 mg/kg xylazine; Knijp met een tang in de muisvoeten om volledige anesthesie te garanderen.
- Injecteer 10 μL buprenorfinehydrochloride (0,3 mg/ml) subcutaan om de pijn te verminderen.
- Breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
- Plaats de muis in een dorsale houding en zet de ledematen vast in een strekkende positie met tapes.
- Steriliseer de achterhuid met jodium- en alcoholdoekjes.
- Knip een incisie van 0,5-1 cm af met een chirurgische schaar aan de linkerachterkant (Figuur 1B). Gebruik voorzichtig een pincet om het spier- en vetweefsel te scheiden totdat de borstwand en longbeweging zichtbaar zijn.
- Breng een geselecteerde MCS van een microtiterplaat over in een glazen petrischaal met ijskoude PBS, met behulp van een pipet.
- Bevestig een naald van 20 G op een glazen spuit van 100 μL, koel ze voor op ijs en zuig 20 μL op van een voorgekoeld mengsel van PBS en Matrigel (1:1 v/v).
- Gebruik de spuit om snel één MCS uit de petrischaal op te zuigen in een minimaal volume PBS-Matrigel-mengsel, waarbij het MCS in het metalen deel van de naald blijft.
OPMERKING: Houd de spuit en zuiger stevig vast om te voorkomen dat de MCS uit de naald glijdt. - Steek de naald voorzichtig verticaal tussen twee ribben tot een diepte van ~3 mm en injecteer langzaam al het mengsel van 20 μL PBS en Matrigel dat het MCS bevat.
OPMERKING: Vermijd overmatige kracht tijdens het inbrengen om schade aan de long, het vaatstelsel of het hart te voorkomen. - Verwijder voorzichtig de naald en breng drievoudige antibiotische zalf aan op de wond.
- Sluit de incisie af met chirurgische clips, die na 2 weken moeten worden verwijderd.
OPMERKING: Hecht de incisie niet omdat de hechtlijnen de fluorescentiebeeldvorming kunnen verstoren. De naaktmuizen kunnen na de operatie op natuurlijke wijze genezen. - Leg het dier op een infrarood warmtekussen en bedek het met laboratoriumdoekjes om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Houd het dier minstens 30-60 minuten in de gaten totdat het wakker wordt en goed beweegt.
- Injecteer 10 μL buprenorfinehydrochloride (0,3 mg/ml) subcutaan 3x per dag gedurende de eerste 48 uur om de pijn te verminderen.
5. Postoperatieve monitoring
- Meet elke 3-4 dagen het lichaamsgewicht.
- Meet elke 3-4 dagen het iRFP-fluorescerende signaal van het tumorxenotransplantaat op een beeldvormingssysteem voor kleine dieren op een kanaal van 700 nm in vier houdingen: links, rechts, dorsaal en ventraal, terwijl de muizen onder narcose worden gehouden door inhalatie van isofluraan (stroomsnelheid: 1.5-2 l/min zuurstof met 1.5% isofluraan) gedurende 2-3 minuten.
- Kwantificeer de netto fluorescerende intensiteit van de xenotransplantaatkanker in vivo met behulp van software (bijv. Image Studio).
- Gebruik een vaste rechthoek (A1, 200 x 125 pixels) als bemonsteringsvenster voor het borstgedeelte van de muizen.
- Gebruik de functie uit de vrije hand om de vorm van de muizen binnen de rechthoek (A1) te traceren en meet de fluorescerende intensiteit (F1) in gebied A1.
- Gebruik een andere kleinere rechthoek (A2, 25 x 40 pixels) om de achtergrondfluorescentie (F2) van de muizen in het dijgebied te meten.
- Gebruik vergelijking (1) om de netto fluorescerende intensiteit van de xenotransplantaatkanker in elke muis te berekenen:
(1)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Karakterisering van A549-iRFP MCS
A549-iRFP MCS werden met succes gekweekt in sferoïde microplaten met behulp van collageen en centrifugatie. Wanneer MCS na 1 week een diameter van ongeveer 500 μm bereikte, werden zowel A549 als A549-iRFP MCS gedurende 3 dagen blootgesteld aan een verscheidenheid aan geneesmiddelen en formuleringen tegen kanker en vervolgens gedurende 4 extra dagen in een geneesmiddelvrij groeimedium gehouden. Het A549-iRFP MCS vertoonde een responspatroon dat nauw leek op dat van de ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De constructie van A549-iRFP MCS is een eenvoudige en zeer reproduceerbare laboratoriumprocedure en kan worden vertaald naar MCS-vorming voor meerdere cellijnen. Het MCS dat met behulp van centrifugatie en collageen wordt gegenereerd, vertoont binnen 3-4 dagen een meer integrale en solide-tumorachtige structuur. Deze methode zorgt voor de vorming van robuuste sferoïden die hun integrale structuur gedurende langere perioden behouden, meestal 2-3 weken of zelfs langer totdat kleine knoppen beginnen te verschijnen. Door geb...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door SAAG- en SEED-beurzen van de University of the Pacific. We danken Dr. William Chan voor het verlenen van toegang tot het Odyssey Infrared Imaging 205 System en Dr. John Livesey voor het verlenen van toegang tot de SpectraMax iD3 plaatlezer. Wij danken Dr. Melanie Felmlee voor het technisch advies over de dierprotocollen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100 µL Glass Syringe | Hamilton | Part/REF #80601 | |
| 20 G Needle | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14 826D | |
| 96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate | Corning | 15-100-173 | |
| A549-iRFP | Imanis Life Sciences | CL082-STAN | |
| AIN-93M Mature Rodent Diet | Research Diets, Inc. | D10012M | |
| Athymic Nude Mouse | Charles River Laboratories, Inc. | Strain Code: 490; homozygoot | |
| BCA | Pierce | 23227 | |
| Buprenorfinehydrochloride | Patterson Veterinary | NDC-nummer: 42023-179-05 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | |
| Collageen | Gibco | A1064401 | |
| DMEM | Corning | MT10013CV | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | Cytiva HyClone | SH3039603 | |
| ImageJ | Open source tool (https://imagej.net/ij/) | N/A | |
| Image Studio | LI-COR | Versie 5.2 | |
| Isofluraan | Patterson Veterinary | NDC-nummer: 17033-0091-25 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | NDC-nummer: 50989-0161-06 | |
| Microscoop | Keyence | Modelnummer: BZ-X710 | |
| Matrigel | Corning | CB-40234 | |
| Odyssey Infrared Imaging 205 System | LI-COR | Modelnummer: 9140 | |
| PBS | Corning | MT21040CV | |
| Pearl Trilogy kleindier beeldvormingssysteem | LI-COR | Modelnummer: 9430 | |
| Penicilline-Streptomycine | Corning | MT30002CI | |
| Puromycine | Thermo Fisher Scientific Inc. | AAJ67236XF | |
| ReViSP software van MATLAB | Open source tool op Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/) | N/A | |
| Chirurgische clips--AutoClip systeem | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Xylazin | Patterson Veterinary | NDC-nummer: 61133-6017-01 |
Referenties
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
- Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials. J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).
- Ducote, T. J., et al. Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers. Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).
- Lim, Z. F., Ma, P. C. Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy. J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).
- Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).
- Peterson, J. K., Houghton, P. J. Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development. Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).
- Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).
- Mclemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Zanoni, M., et al. 3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci Rep. 6, 19103(2016).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).
- Huang, B. W., Gao, J. Q. Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research. J Control Release. 270, 246-259 (2018).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
- Sethi, P., et al. 3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation. Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).
- Valta, M. P., et al. Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer. Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).
- Huang, Y., et al. Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer. J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).
- Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. Lung cancer: Biology and treatment options. Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).
- Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. The eighth edition lung cancer stage classification. Chest. 151 (1), 193-203 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
