Beeldvorming en kwantificering van het levervaatstelsel van muizen met behulp van ultrasnelle Doppler-echografie

Samenvatting

Ultrasnelle Doppler-echografie (UFUS) met een hoge ruimtelijke resolutie (100 μm) en gevoeligheid is een geschikte niet-invasieve beeldvormingsmodaliteit voor het verkrijgen van een uitgebreid kwalitatief overzicht van de levervasculatuur. UFUS faciliteert ook kwantitatieve metingen van de microvasculatuur, met als doel ons begrip van vaatziektemechanismen te vergroten.

Samenvatting

Niet-invasieve in vivo beeldvorming van het vaatstelsel is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van ziektemechanismen bij knaagdieren. Om een zeer gevoelige beeldvorming van de microvasculatuur te bereiken met behulp van Doppler-echografiemethoden, wordt de voorkeur gegeven aan beeldvormingsmodaliteiten die gebruik maken van het concept van ultrasnelle beeldvorming. Door de framesnelheid van de ultrasone scanner te verhogen tot duizenden frames per seconde, wordt het mogelijk om de gevoeligheid van de bloedstroom tot 2 mm/s te verbeteren en functionele informatie over de microcirculatie te verkrijgen in vergelijking met een gevoeligheid van ongeveer 1 cm/s in conventionele Doppler-modi. Hoewel ultrasnelle Doppler-echografie (UFUS) beeldvorming is toegepast in de neurowetenschappen, waar het hersenactiviteit kan vastleggen door middel van neurovasculaire koppeling, biedt het grotere uitdagingen bij het in beeld brengen van het vaatstelsel van buikorganen als gevolg van grotere bewegingen die verband houden met ademhaling. De lever, anatomisch onder het middenrif geplaatst, is bijzonder gevoelig voor beweging buiten het vlak en oscillerende ademhalingsbewegingen. Deze artefacten hebben niet alleen een nadelige invloed op de Doppler-beeldvorming, maar bemoeilijken ook de anatomische analyse van vasculaire structuren en de berekening van vasculaire parameters. Hier presenteren we een kwalitatieve en kwantitatieve beeldvormingsanalyse van het levervaatstelsel bij muizen door UFUS. We identificeren de belangrijkste anatomische vasculaire structuren en bieden grafische illustraties van de macroscopische anatomie van de lever, waarbij we deze vergelijken met een diepgaande anatomische beoordeling van het levervasculatuur op basis van Doppler-uitlezingen. Daarnaast hebben we een kwantificeringsprotocol ontwikkeld voor robuuste metingen van het leverbloedvolume van de microvasculatuur in de loop van de tijd. Om verder onderzoek te overwegen, biedt kwalitatieve vasculaire analyse een uitgebreid overzicht en stelt het een gestandaardiseerde terminologie voor voor onderzoekers die werken met muismodellen van leveraandoeningen. Bovendien biedt het de mogelijkheid om echografie toe te passen als een niet-invasieve aanvullende methode om leverdefecten in vivo te inspecteren en functionele microvasculaire veranderingen diep in het orgaan te meten voordat bloedvatafwijkingen op micronschaalniveaus worden ontrafeld met behulp van ex vivo kleuring op weefselsecties.

Inleiding

Preklinische muismodellen worden veel gebruikt om het ontstaan en de progressie van microvasculaire leveraandoeningen te bestuderen ^1,2. Longitudinale follow-up is voordelig, aangezien capillaire veranderingen in het bloed optreden in een vroeg stadium van de ziekte voordat ontsteking en fibrose optreden, wat na verloop van tijd kan leiden tot cirrose¹. Om ziekteprogressie te onderzoeken, zijn krachtige beeldvormingsinstrumenten essentieel voor het visualiseren en meten van de bloedvatfunctie in vivo. Ultrasnelle Doppler-echografie (UFUS) is een geschikte modaliteit vanwege de lage kosten, draagbaarheid, eenvoud en real-time mogelijkheden, maar ook omdat het een niet-invasieve en tijdbesparende procedure is³. In vergelijking met conventionele Doppler-echografie, die een vergelijkbare ruimtelijke resolutie kan bereiken, maar beperkt is tot een grote bloedstroom, maakt UFUS de detectie mogelijk van een langzame bloedstroom tot 2 mm/s vanaf 1 cm/s, waardoor de bijdrage van veel kleinere bloedvaten kan worden onderzocht⁴. UFUS verbetert de gevoeligheid, wat wordt bereikt door middel van vlakke golftransmissies met een groot gezichtsveld in een enkele insonificatie om de framesnelheid en dus het aantal beschikbare ultrasone beelden te verhogen⁵. Het hoge aantal tijdelijke monsters verbetert de annulering van het signaal dat uit het weefsel komt en verbetert de detectie van de echo's die door de bloedverdelers worden gereflecteerd, waardoor de gevoeligheid wordt verhoogd zonder dat contrastmiddelen nodig zijn⁶. Door de energie van de echo's van de bloedverstrooier te schatten via de schatting van de vermogensdoppler, wordt een hoeveelheid verkregen die evenredig is met het bloedvolume in elke pixel, zelfs als de bloedvaten te klein zijn om in de afbeelding⁷ te worden opgelost.

UFUS biedt een gunstige combinatie van ruimtelijke en temporele resolutie, waardoor het een geschikt hulpmiddel is voor de kwalitatieve beoordeling van de levervasculaire architectuur. Hoewel het bedienen van een ultrasone scanner relatief eenvoudig is, is een uitgebreid begrip van de leveranatomie vereist om door het levervaatstelsel van de verschillende leverlobben bij muizen te navigeren. Recente studies hebben zich gericht op het beschrijven van de anatomie van de lever van muizen en de levervasculaire boom met behulp van 3D microcomputertomografie (μ-CT)^8,9. Hoewel sommige van de morfologische verschillen tussen de lever van mensen en muizen goed gedocumenteerd zijn¹⁰, neemt onderzoek bij knaagdieren vaak anatomische terminologieën aan die relevant zijn voor mensen, wat leidt tot enige verwarring in de context van viervoetige dieren. Zelfs erkende gestandaardiseerde nomenclatuur, zoals Nomina Anatomica Veterinaria (NVA), mist voldoende informatie over consistente terminologieën voor levervasculaire structuren van knaagdieren¹¹. Naast de uitdaging van slecht gedocumenteerde anatomische structuren bij knaagdieren, doen zich nog grotere problemen voor bij het interpreteren van ultrasone uitlezingen, vooral wanneer een reproduceerbare benadering wordt verwacht.

Het verkrijgen van niet-invasieve functionele informatie over levende organen op verschillende ruimtelijke schalen vormt een uitdaging voor in vivo beeldvorming³. Hoogwaardige leverbeeldvormingsmodaliteiten zoals CT, magnetische resonantiebeeldvorming en angiografie (MRI/MRA), of conventionele Doppler-beeldvorming met behulp van gefocusseerde golven zijn essentieel voor het evalueren van ziekteprogressie, maar ze slagen er niet in om de meeste bloedstroomdynamiek vast te leggen, met uitzondering van fotoakoestische beeldvorming 12,13,14. UFUS heeft een hoge gevoeligheid en kan een langzame bloedstroom detecteren in kleine bloedvaten, die niet beperkt zijn tot een stroom van meer dan een centimeter per seconde ^4,15. Onlangs hebben we een op maat gemaakte beeldvormingsmethode ontwikkeld op basis van anatomische overwegingen met behulp van UFUS, waardoor een betrouwbare meting van het leverbloedvolume in een muismodel met vasculaire expansie¹⁶ mogelijk is.

In dit protocol schetsen we de procedure voor niet-invasieve UFUS-beeldvorming van de lever met behulp van een in de handel verkrijgbaar echografieplatform dat oorspronkelijk is ontwikkeld voor functionele beeldvorming van de hersenen. Om het proces te stroomlijnen en het ophalen van informatie te verbeteren, bieden we een uitgebreide illustratie van de muizenlever met anatomische nomenclatuur en een complete analysemethode. Daarnaast bieden we een gedetailleerde weergave van de verkregen beeldvormingsmetingen als referentie, waarbij we gemeenschappelijke anatomische structuren en oriëntatiepunten aangeven om de operatorafhankelijke vliegtuigselectie te ondersteunen. Verder voegen we een relevante illustratie toe van zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses van het levervaatstelsel.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd onder Europese wetgeving (Richtlijn 2010/63/EU) en Nederlandse overheidsrichtlijnen en goedgekeurd door de Dierethische Commissie van het Leids Universitair Medisch Centrum.

1. Muisvoorbereiding voor UFUS-beeldvorming (timing ~ 10 min)

1. Voorbereiding van de beeldvorming
   1. Centrifugeer ultrasone transmissiegel in buisjes van 50 ml bij 100 x g gedurende 3-5 minuten om de vorming van luchtbellen te voorkomen.
   2. Zet het verwarmingskussen aan en verwarm tot 35 °C. Vul het 3D-geprinte waterreservoir met gedeïoniseerd water.
      OPMERKING: Waterbelletjes of kleine deeltjes in het water kunnen de Doppler-meting verstoren.
2. Verdoving van het dier
   1. Weeg het dier. Er werden mannelijke en vrouwelijke nestgenoten gebruikt die 8-16 weken oud zijn met een lichaamsgewicht van 19-32 g. Bereid een anesthesiemix van Ketamine met een toedieningsdosis van 100 mg/kg en Xylazine 10 mg/kg in 0,9% NaCl. Bereid het mengsel elke dag steriel en vers, want het mengsel is niet stabiel en kan zijn kracht verliezen.
      OPMERKING: Het voorkeurslichaamsgewicht van het dier ligt tussen 23-30 g.
   2. Desinfecteer de injectieplaats, d.w.z. het kwadrant rechtsonder of linksonder van de buik, met behulp van gaasjes en 70% ethanol. Injecteer 10 μl/g lichaamsgewicht intraperitoneaal (ip) met een naald van 27 g en een wegwerpspuit van 1 ml of een insulinespuit van 30 g.
   3. Plaats het dier terug in een kooi op een verwarmingskussen zonder het deksel van de kooi te sluiten. Timer starten.
      OPMERKING: Diepe anesthesie moet ongeveer 40 minuten aanhouden. Als een langere beeldvormingssessie gewenst is, overweeg dan het gebruik van omkeerbare anesthesie, zoals mengsels van Ketamine 60 mg/kg en Medetomidine 0,4 mg/kg in 0,9% NaCl gevolgd door omkering met subcutane injectie van Atipamezol 1 mg/kg. Injectie-anesthesie heeft de voorkeur boven inhalatie-anesthesie vanwege de beeldvormingsopstelling.
   4. Controleer de effectiviteit van de anesthesie. Bevestig of de verdoving werkt door na ongeveer 5 minuten voorzichtig in de achterpoten te knijpen. Als het dier nog steeds reageert, wacht dan nog 2-3 minuten om volledige verdoving te bereiken.
   5. Breng oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies en oogtrauma te voorkomen wanneer het dier diep in slaap is. Controleer de reflexen opnieuw en begin pas met de procedure als het dier geen reactie op het knijpen vertoont.
3. Voorbereiding van het beeldvormingsgebied (Figuur 1)
   1. Trim de buik van het dier voorzichtig met een dierenartstrimmer terwijl deze op een verwarmingskussen wordt geplaatst. Voer het trimmen heel voorzichtig uit zonder compressie op de borst of buik uit te oefenen.
   2. Breng de ontharingscrème niet langer dan 2 minuten aan.
      LET OP: Verleng de incubatietijd van de ontharingscrème niet, omdat dit huidontsteking kan veroorzaken. Dit heeft niet alleen invloed op de beeldkwaliteit, maar kan ook ongemak veroorzaken voor het dier.
   3. Verwijder de ontharingscrème met wat papieren zakdoekjes en maak voorzichtig schoon met warm water.
4. Plaats het dier en de beeldvormingsopstelling voor Doppler-metingen (Figuur 2A).
   1. Plaats het dier dorsaal op een verwarmingskussen en zet de poten voorzichtig vast met tape. Hydrateer de huid met een kleine hoeveelheid warm water.
   2. Breng de gecentrifugeerde ultrasone transmissiegel rechtstreeks op de geschoren huid aan met behulp van een spuit van 20 ml.
      OPMERKING: Luchtbellen kunnen de Doppler-beeldvorming beïnvloeden en artefacten veroorzaken.
   3. Plaats het 3D-geprinte waterreservoir gevuld met water boven het dier. Zorg ervoor dat de hoogte van het waterreservoir geschikt is voor het dier, ongeveer 1 mm erboven, en dat het dier niet bekneld raakt.
   4. Controleer of er lucht is tussen de ultrasone transmissiegel en de polymethylpenteen thermoplast (PMP) van de watertank.

2. Werking van de sonde en vliegtuigselectie (timing ~ 10 min)

1. Start de software en maak een experimentele sessie op het systeem. Start de scansoftware.
   OPMERKING: Scansoftware is geïntegreerd in het systeem.
2. Centreer de motoren door in het pop-upvenster op Ja te klikken. Een gemotoriseerd systeem wordt gebruikt om de sonde op afstand te bedienen door middel van scansoftware. Door de motoren te centreren, beweegt de sonde automatisch in drie richtingen, dat wil zeggen verticaal, lateraal en geroteerd. Zorg ervoor dat er geen voorwerpen zijn die de baan van de sonde belemmeren om beschadiging van de apparatuur te voorkomen.
   OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de motoren te centreren; Als u dit niet doet, kan dit leiden tot softwaredisfunctie.
3. Maak een nieuwe experimentele sessie door Sessie te selecteren in het menu. Vul de vereiste informatie in het sessievenster in, waaronder Project, Onderwerp, Sessie, Gebruikersnaam, Opmerking en Tag. Klik op Valideren.
   OPMERKING: De sessie moet worden gemaakt voordat beeldgegevens worden verkregen of opgeslagen. Sessie-informatie kan tijdens het experiment worden gewijzigd, maar houd er rekening mee dat dit ook de bestemming voor het opslaan van gegevens wijzigt.
4. Plaats de sonde. De lineaire ultrasone sonde van 15 MHz met 128 elementen is verbonden met het systeem via een gemotoriseerd systeem dat bestaat uit een vierassige motormodule, dat wil zeggen drie translatie- en één roterende bewegingsrichting.
   1. Ga naar het menu Sonde verplaatsen en gebruik het computergestuurde positioneringssysteem om de sonde in het water in het 3D-geprinte waterreservoir te verplaatsen. Gebruik de bedieningsknoppen die in de positie van de sonde worden aangegeven om de motoren te verplaatsen en definieer de stappen in mm voor translatiebeweging (X, Y en Z) of in ° voor roterende beweging (R). Om ongelukken in de Z-richting te voorkomen, definieert u de Z-limiet in Veiligheid.
      NOTITIE: Het is van cruciaal belang dat de elementen van de sonde in contact komen met het water. Vermijd echter het volledig in het water plaatsen van de sonde, omdat dit de apparatuur kan beschadigen. Als de motoren de positie niet kunnen bereiken, wordt de waarschuwing Out of workspace weergegeven.
   2. Sla de coördinaten op als referentiepositie door op Home instellen te klikken. Wijzig vertalingen en rotaties niet tegelijkertijd, omdat R relatief is ten opzichte van X, Y en Z. Klik altijd op Start instellen voordat u R wijzigt.
   3. Definieer beeldvormings- en visualisatieparameters. Ga naar het menu Live weergave en klik op Afspelen om het interessante vliegtuig te selecteren.
      LET OP: Start alleen een liveweergave of een acquisitie wanneer de elementen van de ultrasone sonde zijn omgeven door een medium dat overeenkomt met de akoestische impedantie om de levensduur van de apparatuur te garanderen en oververhitting te voorkomen.
5. Kies beeldvormingsparameters in Preset.
   1. Laad een 10 ms Doppler ultragevoelige ultrasone sequentie met de Load Sequence-knop , bijvoorbeeld 11 samengestelde vlakke golven (hoeken van -10° tot 10°) met een beeldspanning van 25 V en een Doppler-framerate van 10 ms.
      OPMERKING: Het is niet nodig om een snelle Doppler-sequentie (bijv. 10 ms) te gebruiken om de ademhalingsbewegingen van het orgaan tijdens de analyse in beeld te brengen en te filteren.
   2. Definieer de beelddiepte tussen 1 mm en 50 mm, met een maximale beelddiepte van 50 mm. De standaardinstelling is een diepte van 9 mm van 1 mm tot 10 mm, met de aanbevolen diepte tussen 2 mm en 12 mm.
      OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van het dier en het waterreservoir kan de beelddiepte worden aangepast aan specifieke behoeften.
6. Selecteer visualisatieparameters.
   1. Kies Doppler om het vaatstelsel in beeld te brengen.
      OPMERKING: Pixelintensiteit in A.U. vertegenwoordigt het bloedvolume en mag alleen worden vergeleken bij gebruik van dezelfde sonde en sequentie.
   2. Kies Middeling voor het toepassen van temporele middeling om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren.
      OPMERKING: Het tijdelijk gemiddelde van de afbeeldingen verhoogt de beeldkwaliteit, maar verlaagt de framesnelheid. Afhankelijk van het doel moet een passende afweging worden gemaakt.
   3. Kies Beeldcompressie: Logaritmisch (hoog), Vierkantswortel (gemiddeld) of Lineair (laag). U kunt het contrastbereik ook automatisch of handmatig aanpassen met behulp van schuifregelaars voor opties voor hoog en laag contrast.
      OPMERKING: De keuze van beeldcompressie heeft geen invloed op de gegevens; Het heeft alleen invloed op de weergave van de real-time beeldvorming.
   4. Selecteer de schaal Kleurenkaart van zwart naar wit door de optie Grijs aan te vinken of van roodachtig zwart naar geel door Heet aan te vinken.
7. Vliegtuig selectie (Figuur 2B)
   1. Selecteer het beeldvlak op anatomische oriëntatiepunten. Schakel tussen de visualisatie van Doppler en de B-modus om vertrouwd te raken met de anatomie van de leverkwabben en het vaatstelsel.
   2. Stop de liveweergave door op het pictogram Stoppen te klikken.
   3. Ga naar het menu Sonde verplaatsen om door de sonde te navigeren en selecteer een vliegtuig door op Home instellen te klikken om de coördinaten als referentiepositie op te slaan. Zorg ervoor dat de vaatboom goed gedefinieerd en zichtbaar is met zo min mogelijk signalen buiten het vlak.
   4. Ga terug naar het menu Live view en klik op het Stop-pictogram .

3. Acquisitie van Doppler-scan (timing ~ 20 min)

1. Start een Doppler-acquisitie met een framerate van 10 ms.
   1. Ga naar het fUS 2D-menu om hemodynamische variaties in de loop van de tijd in een specifieke positie weer te geven (Figuur 3). Om het contrast te verhogen, dient u een bolus van 50 μL intraveneus (iv) geïnjecteerde microbellen met een concentratie van 2 x 10^{8 microbelletjes} per ml toe aan de staartader.
   2. Definieer in de tik op Voorinstelling de totale opnameduur in seconden (30 s). Kies een continue modus zonder pauze tussen de beelden door de tijd tussen beelden in te stellen op 0 s.
   3. Druk op de opnameknop om de 2D-acquisitie te starten. De opname kan worden geannuleerd door op de stopknop te drukken. Gegevens kunnen verloren gaan wanneer de acquisitie wordt onderbroken voordat deze is voltooid.
2. Visualiseer en pas de verkregen opname aan.
   1. Wijzig het contrast en de kleurenkaart indien gewenst in tik op Visualisatie. Speel de opname indien nodig opnieuw af door door de frames te scrollen met de schuifregelaar, die is opgenomen in de functie Tijd.
3. Sla de gegevens op.
   1. Geef een naam op voor de verkregen opname om het bestand op te slaan in een scanindeling in de sessiemap. Aan het einde van elke opname wordt automatisch een pop-upvenster voorgesteld om de gegevens op te slaan. Gegevens worden automatisch opgeslagen.
4. Start een nieuwe acquisitie door op het tabblad Voorinstelling te klikken en herhaal dit vanaf stap 3.1.1.
5. Verwijder de beeldvormingsopstelling en verzorg het dier.
   1. Ga naar het menu Sonde verplaatsen om de sonde verticaal omhoog te bewegen buiten het 3D-geprinte waterreservoir. Verwijder de opstelling en ultrasone gel en maak het dier los.
   2. Euthanasie van het dier wanneer de experimentele opzet het eindpunt bereikt; Ga anders verder met de volgende stappen.
   3. Breng wat vochtinbrengende crème aan op de geschoren huid van het dier als lengtemetingen bedoeld zijn.
   4. Plaats het dier terug in de kooi en laat het onder een warmtelamp ontwaken uit de narcose om onderkoeling te voorkomen. Houd het dier in de gaten tijdens het herstel.
   5. Plaats het dier terug in het individueel geventileerde kooirek als het weer normaal loopt. Voltooi de proefdierproeven voordat u de dataset analyseert.

4. Kwantitatieve analyse (Timing ~ 1 uur)

1. Open het analysescript gui_analysis.m dat beschikbaar is in aanvullend bestand 1.
2. Selecteer de scan en stel de kwantitatieve parameters in de instellingen in: 10 interessegebieden (ROI's) met een voxelgrootte van 2 x 2. Kies 40 ms voor elk frame om de Doppler-integratie uit te voeren.
3. Teken de vasculaire periferie van het orgaan; de 10 ROI's worden automatisch voorgepositioneerd tussen duidelijk zichtbare slagaders en kunnen indien nodig handmatig worden aangepast (Figuur 4A). Sluit het zwevende dialoogvenster wanneer u tevreden bent met de positionering. Zorg voor een stabiele acquisitie (Figuur 4B) voor een robuuste berekening van het bloedvolume, waarbij acquisities worden vermeden die worden beïnvloed door sterke bewegingsartefacten (Figuur 4C).
4. Kwantificeer het gemiddelde leverbloedvolume in A.U. van de totale 10 ROI's door automatisch het gemiddelde en de standaarddeviatie van de stille framewaarden binnen de 30 s-registratie te schatten (Figuur 4D).
   OPMERKING: De gegevenstabel met intensiteiten van ROI's kan rechtstreeks naar een spreadsheetbestand worden gekopieerd/geplakt.
5. Herhaal de analyse voor ten minste twee extra vlakken, -0,3 mm en -0,6 mm, in caudale richting. Kwantificeer alle acquisitiegegevens voordat u de statistische analyse uitvoert.
6. Controleer de standaarddeviatie van intensiteiten op het hele beeld en bepaal een cutoff als het algemene gemiddelde (μ) met 2 standaarddeviaties (2σ) om metingen die gevoelig zijn voor bewegingsartefacten objectief uit te sluiten (Figuur 4E).
   OPMERKING: Het gemiddelde en de standaarddeviatie van de geschatte waarden voor stille frames over de hele afbeelding worden weergegeven in de eerste rij van de gegevenstabel.
   LET OP: Bewegingsartefacten verhinderen een robuuste kwantificering en moeten objectief worden geïdentificeerd op basis van analyse van het volledige tijdsbeeld.
7. Neem het gemiddelde van al het gemiddelde leverbloedvolume, gekwantificeerd over 3 verschillende vlakken in 30 ROI's per dier in stap 4.3 (Figuur 4F). Pas de ROUT-test 1% toe in een statistische analysesoftware om uitschieters te identificeren voordat u een gemiddelde ROI's van 30 per dier behaalt. Om de schatting van het bloedvolume te verbeteren, registreert u extra vlakken per dier.
8. Om de mediumbehandeling toe te dienen, desinfecteert u de injectieplaats, d.w.z. het kwadrant rechtsonder of linksonder van de buik, met gaas en 70% ethanol. Injecteer 20 μL zoutoplossing of DMSO ip met een 27G naald en een 1 ml wegwerpspuit of een 30G insulinespuit of dien 100 μL (Hydroxypropyl) methylcellulose toe via een maagsonde met behulp van een herbruikbare voedingsnaald 30G met een ronde punt. Plotgegevens van 3 cohorten die zoutoplossing of DMSO krijgen via ip of orale toediening (po) van cellulose (Figuur 4G). Voer analyses op een blinde manier uit zonder de aandoening en/of de ontvangen behandeling te onthullen.
   OPMERKING: Toediening van het voertuig heeft geen invloed op de metingen van het bloedvolume.

Resultaten

Volgens het protocol wordt beeldvorming van het levervaatstelsel vergemakkelijkt op basis van de standaardisatie van anatomische structuren en bijbehorende terminologie (Figuur 1). Om een gestandaardiseerde nomenclatuur voor te stellen voor onderzoekers die preklinische levermodellen gebruiken, hebben we schematisch de gebruikelijke leverpositionering in de buikholte van muizen weergegeven (Figuur 1A), de structurele rangschikking van de verschillende leverkwabben gegeven (Figuur 1B) en het arteriële vasculaire netwerk gespecificeerd (Figuur 1C). Uitgerust met anatomische expertise, werd in vivo UFUS-beeldvorming uitgevoerd door gebruik te maken van een 3D-geprinte watertank om bewegingsartefacten te verminderen (Figuur 2A). De akoestische impedantie werd gecorrigeerd door de sonde in het water te brengen en ultrasone transmissiegel rechtstreeks op de geschoren huid van het dier aan te brengen. Door deze opstelling aan te nemen, worden de ademhaling en andere bewegingsartefacten verminderd, omdat de sonde niet in direct contact staat met de bewegende borstkas en buik van het dier. Op deze manier hebben we de vasculaire structuur van de rechter- en linkerkwabben gevisualiseerd, die door hun oppervlakkige locatie gemakkelijk toegankelijk zijn voor UFUS (Figuur 2B). Andere leverkwabben, zoals de caudatus en de kwab quadraat, bevinden zich dieper in het lichaam, waardoor het een grotere uitdaging is om het levervasculatuur anatomisch correct te identificeren door UFUS.

Nadat we het belang van gestandaardiseerde en algemeen aanvaarde anatomische indicaties en interpretaties van vasculaire structuren hadden aangetoond, hebben we meerdere Doppler-scans in verschillende vlakken uitgevoerd om een uitgebreid overzicht te geven van het levervaatstelsel dat in beeld is gebracht door contrastversterkte UFUS bij muizen (Figuur 3). We hebben het arteriële hepatische netwerk van de individuele leverlobben afgebakend, d.w.z. linker laterale (LL), linker mediale (LM), rechter laterale (RL) en rechter mediale (RM) lobben. Bovendien zijn belangrijke slagaders gelabeld, zoals de abdominale aorta (AA), de leverslagader (HA), de linker laterale leverslagader (LLHA) en de rechter mediale leverslagader (RMHA). Het is belangrijk op te merken dat leverlobben iets anders kunnen worden geplaatst, afhankelijk van de plaatsing en peristaltische beweging van de dunne darm (SM), evenals de toestand van de maagvulling (S). Dit contrastversterkte overzicht van het gehele levervaatstelsel van muizen biedt een uitgebreide vasculaire atlas voor in vivo leverbeeldvorming door UFUS.

Een nauwkeurige selectie van anatomische vlakken is cruciaal voor het verkrijgen van een kwantitatieve uitlezing afgeleid van één leverkwab. Robuuste bloedvolumemetingen kunnen worden bereikt door handmatig 10 interessegebieden (ROI) per vliegtuig te selecteren (Figuur 4A). Voor een betrouwbare kwantificering van het bloedvolume van de microcirculatie is een stabiele acquisitie nodig met een lage variatie in gemiddelde beeldintensiteit. Dit wordt bepaald op basis van de gemiddelde beeldwaarde (MIV) van het hele beeld in de loop van de tijd (Figuur 4B), in tegenstelling tot een opname die gevoelig is voor aanzienlijke bewegingsartefacten (Figuur 4C). Om bewegingsartefacten te verwerken, werd de automatische selectie van lage MIV gebruikt voor een betrouwbare kwantificering van metingen van het leverbloedvolume (Figuur 4D) door de standaarddeviatie van alle tijdelijke lage MIV van een heel beeld uit te zetten (Figuur 4E). Dopplerscans van meerdere vlakken per dier tonen acceptabele intra- en intervariabiliteit binnen en tussen muizen uit 3 verschillende cohorten na uitschieterbehandeling op 30 ROI's per dier met ROU-test 1% (Figuur 4F). Om de schatting van het bloedvolume per dier te verbeteren, wordt aanbevolen om extra vlakken te registreren of het aantal geselecteerde ROI's per vlak te verhogen. Bovendien kunnen bloedvolumemetingen worden gebruikt om de medicamenteuze behandeling te controleren, specifiek gericht op microvasculatuur. Door het vehiculum via twee toedieningsroutes toe te dienen, hebben we aangetoond dat er geen effect is op de metingen van het bloedvolume in de lever (Figuur 4G). Deze resultaten geven aan dat gendeletie of toediening van de behandeling niet wordt beïnvloed door toediening van vehiculum, wat zorgt voor een robuust experimenteel ontwerp. Over het algemeen wordt een objectief en reproduceerbaar kwantitatief protocol geboden voor toekomstig onderzoek om levervasculaire defecten in verschillende muismodellen te onderzoeken.

Figuur 1: Anatomie van de muizenlever. (A) Schematisch overzicht van de positionering van de lever in de buikholte onder het middenrif van de muis. (B) Schematische beschrijving van de muizenlever met vier leverlobben, d.w.z. linker-, kwadraat-, caudaat- en rechterkwab, en de portaaltriade bestaande uit de poortader, de leverslagader en de galwegen. (C) Schematische illustratie van het arteriële netwerk van de haptische vasculatuur. Identificatie van leverslagaders (HA) en vertakkingen (ramus) met Latijnse nomenclatuur. Afkorting: HA = Hepatische slagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Ultrasnelle Doppler-echografie (UFUS) beeldvorming van het levervaatstelsel bij muizen. (A) Schematisch overzicht van experimentele opstelling voor niet-invasieve in vivo beeldvorming. (B) Schematische illustraties van de beeldvormingsrichting en bijbehorende vertegenwoordigers van de rechter en linker mediale kwab, evenals de linker laterale kwab, afgebeeld door UFUS. Afkorting: AA = Aorta abdominals, LLL = Linker laterale kwab, LML = Linker mediale kwab, RML = Rechter mediale kwab. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve contrastversterkte ultrasnelle Doppler-echografie (UFUS) van de muizen levervasculatuur. Een overzicht van het gehele levervaatstelsel van een volwassen muis in beeld gebracht in 3 posities, d.w.z. lateraal rechts, mediaal en lateraal links, in 4 vlakken van craniaal naar caudaal. De referentie bevindt zich direct onder het middenrif, afgebeeld in mediaal en 1 cm lateraal aan de rechter- en linkerkant, met dezelfde vlakken in caudale richting. Afkorting: AA = Aorta abdominals, HA = Hepatische slagader, LLL = Linker laterale kwab, LLHA = Linker laterale leverslagader, LML = Linker mediale kwab, RLL = Rechter laterale kwab, RMHA = Rechter mediale leverslagader, RML = Rechter mediale kwab, SI = Dunne darm, S = Maag. Schaalbalk 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Ultrasnelle Doppler-echografie (UFUS) kwantitatieve meting van het leverbloedvolume. (A) Vertegenwoordigers van de mediale kwab (ML) van volwassen C57BL/6 wildtype controlemuizen in vlak 1 geselecteerd onder het middenrif, overeenkomend met 0 mm, vlak 2 op -0,3 mm en vlak 3 op -0,6 mm met een selectie van 10 interessegebieden (ROI's). Schaal staaf 1 mm. Illustratie van Power Doppler van de jaren '30 met (B) stabiele acquisitie (grijs) en (C) weefselbeweging (rood) op basis van gemiddelde beeldwaarden in willekeurige eenheden (A.U.) van het hele beeld voor kwantitatieve beoordeling. (D) Geautomatiseerde herkenning van lage intensiteiten (A.U.) voor kwantitatieve meting van het bloedvolume in de loop van de tijd. (E) Standaarddeviatie (St. Deviation) van lage intensiteiten uitgezet om onstabiele acquisities (rood) te identificeren veroorzaakt door bewegingsartefacten aangegeven door een afkapping van het totale gemiddelde (μ) van het aantal (N) dieren uit 3 cohorten met 2 SD (2σ) beoordeling van standaarddeviatie (SD) van lage intensiteit (A.U.) in fysiologische toestand (grijs) bij volwassen C57BL/6 wildtype controlemuizen. (F) Kwantificering van in vivo gemeten veranderingen in het bloedvolume in de loop van de tijd, gemiddeld over 3 vlakken, d.w.z. 30 ROI in totaal per dier, worden weergegeven als pixelintensiteit (A.U.). Detectie van uitschieters door ROUT-test 1%. (G) Er is geen verschil tussen het type bestelwagen en de wijze van toediening. Cohort 1 (n=6) kreeg een intraperitoneale (ip) injectie met zoutoplossing, cohort 2 (n=3) ip-injectie met DMSO en cohort 3 (n=6) orale toediening (po) van cellulose. Eenrichtingsverkeer ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett, ns P > 0,05. Afkorting: A.U. = Willekeurige eenheden, DMSO = Dimethylsulfoxide, ip = Intraperitoneaal, po = Orale toediening, ROI = Interessegebied, St. Deviatie = Standaarddeviatie, UFUS = Ultrasnelle Doppler-echografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Ultrasnelle Doppler-echografie (UFUS) kwantitatief script van metingen van het leverbloedvolume. Script gui_analysis.m biedt een grafische interface voor de automatische positionering van het interessegebied (ROI) voor bloedvolumemetingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In dit protocol laten we zien hoe niet-invasieve UFUS-beeldvorming van de levervasculatuur van muizen kan worden uitgevoerd. We geven een gedetailleerde beschrijving van de beeldvormingsprocedure, die de omgang met dieren, de werking van de ultrasone scanner en gegevensanalyse voor het berekenen van bloedvolumeveranderingen in vivo omvat. Om de interpretatie van ultrasone gegevens te vergemakkelijken, bieden we een uitgebreid overzicht van de anatomische structuren die duidelijk kunnen worden gevisualiseerd door UFUS. Verder beschrijven we een gestandaardiseerde kwantificeringsprocedure voor robuuste metingen van vasculaire parameters. Het bereiken van een geschikte resolutie is mogelijk zonder het gebruik van een contrastmiddel, waardoor een veilige en ongecompliceerde kwantitatieve beoordeling van het leverbloedvolume van de microcirculatie mogelijk is. We benadrukken het gebruik van gestandaardiseerde anatomische nomenclatuur om verwarring en verkeerde interpretaties te voorkomen, vooral bij het beoordelen van kwantitatieve metingen van microvasculatuur.

UFUS-beeldvorming van het vaatstelsel van muizen is eerder gemeld, voornamelijk op het gebied van neurowetenschappen⁷. Beeldvorming van de hersenen wordt niet nadelig beïnvloed door bewegingsartefacten, in tegenstelling tot de lever, die zeer gevoelig is voor ademhalingsbewegingen. Vanwege de anatomische positie onder het middenrif moet het ontharen in de buikstreek zeer voorzichtig worden uitgevoerd om te voorkomen dat er een onregelmatige ademhaling ontstaat door de fysieke krachten op de borst en de buik te minimaliseren. Bovendien is het bereiken van de juiste mate van anesthesie essentieel om een regelmatige oscillerende ademhaling te garanderen, een factor die relatief gemakkelijk kan worden gecorrigeerd in de nabewerkingsstappen. De gevoeligheid van UFUS is hier verbeterd door een SVD-filter (Singular Value Decomposition) toe te passen om bewegingsartefacten⁶ te verwijderen en door high-motion frames verder te censureren. De Power Doppler-films met hoge framesnelheid worden hier met 10 ms verkregen om ons verder in staat te stellen het effect van ademhalingsbeweging op frames te visualiseren en te meten die hoogwaardige pieken genereerden als gevolg van bewegingsartefacten. De ademhalingsfrequentie kan dan worden geïdentificeerd aan de hand van de piek in de Fast Fourier-transformatie van het gemiddelde beeldsignaal, en de overeenkomstige piekframes die overeenkomen met de hoge beweging van het orgel kunnen worden weggegooid.

Reproduceerbare ultrasone Doppler-beeldvorming binnen een enkel dier in de loop van de tijd, evenals tussen dieren met verschillende lichaamsgewichten, kan nog steeds verschillende beperkingen ondervinden. Ten eerste kan de positionering van de lever worden beïnvloed door factoren zoals een sterk gevulde maag en peristaltische beweging van de darm. Deze invloed is vooral uitgesproken bij het selecteren van de linker laterale leverkwab als referentie. Daarom raden we aan om alleen bij grotere dieren de linker zijkwab te kiezen en bij kleinere dieren de voorkeur te geven aan de rechter of linker middenkwab. Ten tweede kunnen zware niet-oscillerende ademhalingsbewegingen optreden bij dieren in nood, wat resulteert in bewegingsartefacten die moeilijk te corrigeren zijn en daarom niet kunnen worden gebruikt voor de berekening van het bloedvolume. Een passende keuze voor anesthesie, samen met een dosering die is afgestemd op het lichaamsgewicht, is dus cruciaal. Ten slotte beperkt de resolutielimiet de visualisatie van de levermicrovasculatuur, d.w.z. bloedvaten kunnen worden gevisualiseerd met diameters tot 100 mm³.

Het gebruik van contrastmiddelen werd onlangs voorgesteld om een gedetailleerd beeld van het vaatstelsel van de muis te verkrijgen door microbellen te volgen. Een dergelijke benadering kan een hoge ruimtelijke resolutie bereiken en kwantitatieve bloedsnelheidsmetingen opleveren¹⁷. Het volgen van microbellen blijft echter een grote uitdaging voor het bewegen van inwendige organen, vooral wanneer ze in 2D worden verkregen.

Hier toonden we aan dat stabiele metingen van het leverbloedvolume, verkregen door ultrasnelle Doppler, konden worden verkregen bij controlemuizen uit drie cohorten die verschillende vehikels kregen die werden toegediend via ip-injecties of orale sonde. Onlangs werden dergelijke bloedvolumemetingen met succes gebruikt in een muismodel met leverziekte¹⁶. Ter verduidelijking werd vasculaire expansie gedetecteerd op een elektronenmicroscopisch niveau en bevestigd door kwantitatieve metingen met behulp van UFUS. Deze studie benadrukte de gevoeligheid van in vivo beoordeling om vasculaire defecten op functioneel en kwantitatief niveau te onderzoeken, zelfs met een geconserveerde hepatische angioarchitectuur, wat veelbelovend is voor klinische diagnose en monitoring.

Samenvattend dient dit protocol als leidraad voor niet-invasieve kwalitatieve en kwantitatieve studies van het levervaatstelsel bij muizen. Het kan ook worden gebruikt voor longitudinale follow-up vanwege de niet-invasieve en eenvoudige procedure. Bovendien heeft het het potentieel om functionele beoordelingen van bloedvaten te geven.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(Hydroxypropyl)methyl cellulose HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	0.5% HPMC
Centrifuge ZentriMix 380 R	Hettich	3200
Centrifuge Tubes 50 mL conical Sterile Polypropylene	CELLSTAR tubes	227 261
Katoenen tips	Meditip Clean	G80215
De-ioniserd water	in house
Depilatoire crème	bij de apotheek
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650-5X5ML	steriele
Ethanol absoluut	FRESENIUS KABI	010-0622-1
Voedingsnaald, herbruikbaar	FST Fine Science Tools	18064-20
Pincet met fijne punt Dumont #5 pincet	FST Fine Science Tools	11252-00
Gaasjes 5 x 5 cm	Klinipress	175 004
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	Versie 9
GUI analyse script	Inserm	gui_analysis.m	heeft een 10 ms Doppler-scan nodig
Verwarmingskussen 17 x 17 cm, 6 W	ThermoLux Acculux	461265
Insuline-spuiten 30G 0.30 x 8 mm, 0.3 mL en 0.5 mL	BD Microfine + Demi	25636
Ketamine Anesketin	Dechra	REG NL 111764	100 mg/mL
Kimwipes KIMTECH laag-vellen	ULINE	S-8115
Lab tape 19 mm x 50 m x 0.125 mm	Stokvis	M451
MATLAB software	MathWorks	Versie R2022b
Vochtinbrengende crème	bij de apotheek
Naald geel 30G 0.3 x 13 mm	BD Microlance	304000
Oftalmische zalf Oculentum Simplex	Added Pharma	220201
Papier zakdoeken	in house
Permanente labmarker	VWR	52877-310
Fysiologische zoutoplossing (NaCl 0.9%)	FRESENIUS KABI	B102986	steriele
Sharps wegwerpcontainer Medical Dispo 2.5 L	APmedical	UN3291
Steriele safe-lock 1.5 mL buisjes	Eppendorf	0030 120.086
Spuit 1 mL	BD Plastipak	303172
Spuit 20 mL Luer-Lok	BD Plastipak	300629
Timer	West Bend	40053
Trimmer	Exacta Aesculap	GT416
Ultrasnelle echografieplatform	Iconeus & INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART	Iconeus One prototype	met een 10 ms sequentie
Echografie-transmissiegel Aquasonic 100	Parker Laboratories INC.	BT-025-0037N
Watertank 3D geprint 10 x 10 x 1.5 cm polymethylpenteen (PMP) 0.125 mm	GoodFellow Cambridge limited	ME311100/2	CAD-bestand op aanvraag
Xylazin Sedamun	Dechra	REG NL 10084	20 mg/mL