Een visuele benadering voor het induceren van dolichoectasia bij muizen om door grote bloedvaten gemedieerde cerebrovasculaire disfunctie te modelleren

Samenvatting

We demonstreren chemisch inducerende grote bloedvatverwijding bij muizen als een model voor het onderzoeken van cerebrovasculaire disfunctie, dat kan worden gebruikt voor modellering van vasculaire dementie en de ziekte van Alzheimer. We demonstreren ook het visualiseren van het vaatstelsel door het injecteren van een siliconenrubbersamenstelling en het bieden van duidelijke visuele richtlijnen voor het meten van veranderingen in de grootte van bloedvaten.

Samenvatting

De bloed-hersenen (BBB) is een cruciaal systeem dat de selectieve hersencirculatie met de periferie reguleert, bijvoorbeeld, waardoor noodzakelijke voedingsstoffen de hersenen kunnen binnenkomen en verdrijven. Om te modelleren hoe de BBB kan worden aangetast bij ziekten zoals vasculaire dementie (VaD) of de ziekte van Alzheimer (AD), ontwikkelden onderzoekers nieuwe methoden om vaatverwijding te modelleren. Een gecompromitteerde BBB in deze ziektetoestanden kan schadelijk zijn en resulteren in de ontregeling van de BBB, wat leidt tot ongewenste en pathologische gevolgen die de hersenfunctie beïnvloeden. We waren in staat om een bestaande techniek aan te passen die ons in staat stelde om rechtstreeks in de Cisterna magna (CM) te injecteren om verwijding van bloedvaten te induceren met behulp van elastase en de tight junctions (TJ) van de BBB te verstoren. Met deze methode waren we in staat om verschillende maatstaven voor succes te zien ten opzichte van eerdere technieken, waaronder consistente bloedvatverwijding, verminderde mortaliteit of verbeterd herstel, en verbetering van het vul-/opacificerende middel, een siliconenrubberverbinding, levering voor het labelen van bloedvaten voor dilatatieanalyse. Deze aangepaste minimaal invasieve methode heeft veelbelovende resultaten opgeleverd, met een toename van 19%-32% in aanhoudende verwijding van grote bloedvaten bij muizen van 2 weken tot 3 maanden na injectie. Deze verbetering staat in contrast met eerdere studies, die pas na 2 weken een verhoogde dilatatie aantoonden. Aanvullende gegevens suggereren een aanhoudende expansie, zelfs na 9,5 maanden. Deze toename werd bevestigd door de diameter van de bloedvaten van de elastase te vergelijken met de groep die met een medium werd geïnjecteerd. Over het algemeen is deze techniek waardevol voor het bestuderen van pathologische aandoeningen die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantasten met behulp van diermodellen.

Inleiding

Microvasculaire endotheelcellen die de haarvaten van de hersenen bekleden, zijn de belangrijkste componenten voor het vormen van de bloed-hersenbarrière (BBB)¹, die een cruciale rol speelt bij het reguleren van wat de hersencirculatie met de periferie binnenkomt of verlaat. Essentiële voedingsstoffen die nodig zijn voor zenuwweefsel mogen de BBB binnenkomen, terwijl sommige essentiële aminozuren zoals glutamaat uit de hersenen worden verdreven, omdat hoge concentraties permanente neuro-excitatoire schade aan hersenweefsel kunnen veroorzaken^. Onder normale fysiologische omstandigheden beperkt de BBB de hoeveelheid plasma-eiwitten zoals albumine ^3,4 en protrombine die de hersenen binnendringen, omdat deze schadelijke effecten kunnen hebben ^5,6,7. Ten slotte beschermt de BBB de hersenen tegen neurotoxines die in de periferie circuleren, zoals xenobiotica uit voedsel of het milieu^. Over het algemeen is schade aan hersenweefsel onomkeerbaar, en veroudering die correleert met lage niveaus van neurogenese⁸ benadrukt het belang van de BBB bij het beschermen en voorkomen dat factoren het neurodegeneratieve proces versnellen.

Bij dolichoectasie (of dilatatie van grote bloedvaten) wordt een afname van de vatelasticiteit waargenomen, wat ertoe leidt dat bloedvaten morfologische veranderingen ondergaan, waardoor ze disfunctioneel worden⁹ en leiden tot een verminderde bloedstroom in de hersenen. Deze vermindering van de bloedstroom vermindert vervolgens de zuurstof- en glucosetoevoer, wat uiteindelijk schade aan de BBB veroorzaakt door de activering van reactieve astrocyten¹⁰. Wanneer de interne elastinelamina van bloedvaten is beschadigd door dolichoectasia¹¹, is herhaalde stimulatie van de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) noodzakelijk voor angiogenese. Dit kan leiden tot de vorming van lekkende bloedvaten en uiteindelijk resulteren in pathologische angiogenese, gekenmerkt door de ontwikkeling van defecte bloedvaten¹². Tijdens pathologische angiogenese, wanneer bloedvaten defect raken, lijkt een compensatiemechanisme de integriteit van de bloedvaten te herstellen door tight junction-eiwitten op te reguleren. Dit proces kan echter onbedoeld de BBB verstoren wanneer de structurele integriteit van een bloedvat verloren gaat¹³. Dit kan gebeuren door de BBB verder te verstoren en de productie van amyloïde plaque^{te bevorderen 14}. Bovendien kan lekkage uit de periferie neuro-inflammatie veroorzaken¹⁵, wat resulteert in neuronale degeneratie en daaropvolgend geheugenverlies.

Structureel is de bescherming die de BBB biedt door de tight junctions die voorkomen dat xenobiotische middelen uit het bloed de hersenen binnendringen. Wanneer bepaalde stoffen de hersenen binnendringen, doet de BBB dit voornamelijk via twee belangrijke processen, passieve diffusie of specifieke kanalen (zoals ionenkanalen en transporters)¹. Bij AD heeft onderzoek aangetoond dat een disfunctioneel vasculair systeem een belangrijke rol speelt bij de progressie van de aandoening ^12,13. De vorming van amyloïde-bèta (Aβ) plaques en neurodegeneratie kunnen het gevolg zijn van de afbraak van de BBB^12,13 en verstoringen in de cerebrale bloedstroom¹⁶. Een vermindering van de cerebrale doorbloeding is te zien bij ouderen met de diagnose vasculaire dementie en AD ^17,18. Schade aan de bloed-hersenbarrière (BBB) samen met een disfunctionele cerebrale bloedstroom (CBF) kan bijdragen aan de verhoogde productie van Aβ-concentratie in de hersenen, vergezeld van de infiltratie van vreemde materialen uit de perifere circulatie¹⁹.

Om de pathogenese van neurologische aandoeningen zoals AD en vasculaire dementie (VaD) te onderzoeken, worden modellen ontwikkeld om de ziekte na te bootsen. In vitro modellen worden op grote schaal gebruikt, maar missen de biologische omgeving voor uitgebreide ziektemodellering zoals gemengde celpopulatie, waardoor het belang van in vivo modellen noodzakelijk is. Muizen worden vaak gebruikt vanwege hun gemak van genetische manipulatie bij het genereren van mensachtige eigenschappen (bijv. pathologie) bij ziekten. Met de vooruitgang die tot nu toe is geboekt, is er nog steeds een voortdurende behoefte aan verbeterde modellen om ziektefenotypes zoals dilatatie van grote bloedvaten en hun rol bij AD na te bootsen. Daartoe zagen we een kans en pasten we een techniek aan waarbij elastase in de Cisterna magna van muizen werd geïnjecteerd^20,21. Elastase is een enzym waarvan is aangetoond dat het elastine afbreekt in bindweefsel²² en in omliggende tight junctions²³. De Cisterna magna werd gekozen als injectiepunt omdat deze zich direct boven de cirkel van Willis bevindt, het grootste bloedvat in de hersenen. Door elastase in de Cisterna magna te injecteren, kunnen we de BBB en de bloedvaten aantasten door de tight junctions af te breken en verwijding van bloedvaten te induceren (cirkel van Willis)^24,25. Het combineren van deze techniek met het gebruik van een AD-muismodel van pathologie, voor een beter begrip van de pathogenese voor de vasculaire component van AD, kan waardevolle inzichten opleveren in de complexe interacties en invloeden tussen deze twee verschillende pathologieën.

Eerdere studies hebben gevallen aangetoond waarin patiënten zowel de pathologische kenmerken van AD als VaD vertonen, een aandoening die doorgaans wordt aangeduid als gemengde dementie^26,27. Het begrijpen van de onderling verbonden mechanismen tussen beide aandoeningen kan dus een uitgebreider perspectief bieden op de progressie en manifestatie van deze neurodegeneratieve aandoeningen, en ons begrip van de onderliggende mechanismen en mogelijke therapeutische strategieën verbeteren. Hiertoe demonstreren we de toepassing van elastase in een AD-pathologie muismodel (App^NL-F) om vasculaire veranderingen te identificeren.

Protocol

App^NL-Fmuizen (3 maanden oud) die menselijke amyloïde plaque op fysiologisch niveau tot expressie brengen, werden gebruikt voor deze studie, hoewel dit systeem met elk knaagdiermodel kan worden gebruikt. Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Animal Care Committee van CAMH (Protocol #843) en waren in overeenstemming met de ethische normen van de Canadian Council on Animal Care richtlijnen. Muizen werden in eigen huis gefokt en op een 12-uurs licht-donkercyclus gehouden met ad libitum toegang tot voer en water.

1. Procedure voor injectie met Cisterna magna (CM)

1. Chirurgische ingreep
   1. Plaats de muis (APP^NL-F, beide geslachten, 3 maanden) gedurende 1 minuut in een anesthesie-inductiekamer.
      NOTITIE: Spoel de kamer met 5% isofluraan gemengd met 1% zuurstof gedurende ten minste 1 minuut.
   2. Nadat de muis is verdoofd, verwijdert u het dier uit de kamer en plaatst u het op een vers chirurgisch laken en handhaaft u de anesthesie (isofluraan, 2,5%-3%) door een neuskegel over de neus te plaatsen.
      NOTITIE: Controleer de diepte van de anesthesie door in de teen te knijpen om er zeker van te zijn dat er geen reflexen zijn.
   3. Breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen. Injecteer vervolgens subcutaan 0,1 ml bupivacaïne (lokale verdoving; 1-2 mg/kg 0,125%, met een verdunningsverhouding van 1:2) op de incisieplaats en Metacam (pijnstiller; 5 mg/kg, met een verdunningsverhouding van 1:10). Houd het dier gehydrateerd door 0,5 ml zoutoplossing subcutaan te injecteren voordat u de procedure uitvoert om eventueel bloedverlies tijdens de operatie te compenseren.
   4. Voor een duidelijke incisieplaats scheert u de nek aan de basis van het achterhoofdsbeen, veegt u het oppervlak af met steriele PBS en brengt u de proefpersoon over naar het stereotaxische frame in buikligging.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de anesthesie wordt gehandhaafd via de stereotaxische neuskegel.
   5. Plaats de neusbeugel van het stereotaxische frame bovenop de muis om stabiliteit te bieden en ervoor te zorgen dat de boventanden vastzitten.
   6. Plaats de kop van het dier in een hoek van 120° ten opzichte van het lichaam om de nek op te tillen en uit te zetten om het operatiegebied van belang bloot te leggen.
   7. Reinig de operatieplaats met Betadine scrub 3x, 70% ethanol 3x en betadine oplossing 1x met steriel 2 inch x 2 inch gaas.
   8. Vouw de huid voorzichtig met behulp van een pincet en maak een kleine incisie (1 cm) met een chirurgische schaar.
      OPMERKING: Dit zou de middellijn van de nek moeten onthullen.
   9. Ga voorzichtig met de scalpel langs de middellijn om door de spieren te snijden. Scheid vervolgens met een pincet de spieren voorzichtig door ze naar links en rechts uit elkaar te trekken.
      OPMERKING: Dit zou de Cisterna magna (omgekeerde driehoek) moeten onthullen die zich onder de basis van de schedel bevindt (Figuur 1).
2. Bereiding van elastase
   LET OP: Het pakket elastase (poedervorm) dat werd besteld bevatte 250 eenheden (U). De hoeveelheid van de elastase die in elk dier moet worden geïnjecteerd, is 2,5 μl. De hoeveelheid elastase die in de 2,5 μL zou moeten zitten, moet 15 milli-eenheden mU zijn.
   1. Bereken eerst de concentratie van de te injecteren oplossing.
      Concentratie = massa/ volume
      = 15 mU/2,5 μL
      = 6 mU/μL
      Daarom is de benodigde concentratie 6 mU/μL.
   2. De hoeveelheid van de elastase is 250 U en de studie werkt met milli-eenheden, dus reken de eenheden om naar milli-eenheden, wat 250000 mU geeft.
   3. Na een massa van 250000 mU en een concentratie van 6 mU/uL, berekent u het volume (PBS) waarvoor verdunning van de elastase nodig is en een concentratie van 6 mU/uL moet worden aangehouden.
   4. Gebruik dezelfde formule hierboven om het volume op te lossen:
      Volume = massa/Conc.
      = 250000 mU/ 6 mU/μL
      = 41666.67 μL
   5. Omdat het moeilijk is om 41666.67 μL te pipetteren, converteer je het eenvoudig naar milliliter door het te delen door 1000 om 41.66667 ml te krijgen om een 1x-oplossing te verkrijgen.
      1. Om de oplossing geconcentreerder te maken, verhoogt u deze met 10x of 100x.
      2. Creëer een 10x-oplossing omdat het eenvoudiger is om mee te werken (zie hieronder).
         10x oplossing ---------- 4,166667 ml (conc.)
   6. Plaats de 250 U in een aliquot tube van 5 ml en voeg 4.167 ml steriele PBS toe aan de aliquot tube om de 10x voorraadoplossing te maken.
   7. Pipetteer 10 μl bouillonoplossing en doe deze in 100 aliquot buisjes voor 1000 μl van de 4,167 ml bouillonoplossing. Bewaar de tubes bij -20 °C.
   8. Bewaar de rest van de voorraadoplossing in aliquot buisjes bij 100 μl per buisje en bewaar in de vriezer bij -20 °C.
      OPMERKING: De oplossingen zijn stabiel bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden zonder noemenswaardig verlies van activiteit. Daarnaast is het belangrijk op te merken dat overmatig invriezen en ontdooien van de elastase de stabiliteit kan verminderen. Om dat te voorkomen, kan de stockoplossing vóór het invriezen worden verdeeld, zodat slechts één monster tegelijk hoeft te worden ontdooid voor injectie.
   9. Na het ontdooien van een van de aliquot buisjes die 10 μL van een 10x oplossing bevat, voeg je 90 μL steriele PBS toe om een 100 μL 1x oplossing te krijgen.
   10. Als de aliquot-buis die 100 μL van een 10x-oplossing bevat, in plaats daarvan is ontdooid, voeg dan gewoon 900 μL PBS toe om 1000 μL te krijgen, wat een 1x-oplossing is. Bewaar beide oplossingen gedurende 1 week bij 4 °C.
3. Injecteren in de Cisterna magna
   NOTITIE: Reinig de Hamilton-spuit voor het laden met elastase door 5x te laden en op te zuigen met gedestilleerd water, vervolgens 5x met ethanol en ten slotte 5x met gedestilleerd water.
   1. Laad de Hamilton-spuit met 2,5 μL elastase (concentratie van 15 mU) en zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn.
   2. Breng de spuit langzaam met de schuine kant naar boven in het midden van de Cisterna magna.
      OPMERKING: Vermijd het doorboren van bloedvaten die over de Cisterna magna lopen.
   3. Verwijder na de prik de afschuining. Dit vergemakkelijkt de afgifte van een kleine hoeveelheid cerebrospinale vloeistof (CSF). Gebruik een steriel wattenstaafje om het overtollige CSF te absorberen.
   4. Plaats de afschuining terug in de prikplaats, injecteer langzaam elastase of medium gedurende 1 minuut in de Cisterna magna en laat de naald 1 minuut op zijn plaats om lekkage van elastase te voorkomen.
   5. Sluit na het verwijderen van de afschuining de incisieplaats met een niet-resorbeerbare chirurgische hechtdraad (#4-0 met 3/8" naald) en schakel de verdoving uit.
   6. Haal het dier uit het stereotaxische frame en leg het op een warm warmtekussen dat is ingesteld op 37 °C totdat het onderwerp herstelt.
      OPMERKING: Een andere dosis Metacam wordt aanbevolen na de operatie om te helpen bij pijn tijdens het postoperatieve herstel.

2. De injectie van de siliconerubbersamenstelling en weefseloogst

1. Verdoof het dier met een overdosis avertin (1 ml, 125-250 mg/kg).
   OPMERKING: Knijp in de teen om ervoor te zorgen dat de reflexen stoppen.
2. Leg het dier op een luier en zet alle ledematen vast met chirurgische tape met de borstholte naar boven gericht
3. Open de borstholte met een pincet en een schaar om het hart bloot te leggen.
4. Steek een stompe naald van 23 G in de linker hartkamer en doordrenk gedurende 4 minuten met PBS doordrenkt met heparine (100 E/ml) om de bloedvaten vrij te maken met behulp van een microperfusiepomp.
5. Vervang de bufferfles door een fles met 4% paraformaldehyde (PFA) (gemaakt in PBS) en laat nog 4 minuten perfuseren.
6. Bereid de oplossing van de siliconenrubbersamenstelling (geel) voor door 5 ml verbinding te combineren met 5 ml verdunningsmiddel in een tube van 50 ml. Meng grondig voor gebruik.
7. Vul een spuit van 10 ml met 10 ml siliconenrubber composiet. Bevestig de spuit aan de slang die is aangesloten op een stompe naald van 23 G en injecteer de oplossing voorzichtig handmatig in het hart.
   OPMERKING: Vanwege de hoge viscositeit van de siliconenrubbersamenstelling is het belangrijk om een spuit met een grotere cilinder te gebruiken, anders is de druk te groot om de zuiger in te drukken.
8. Verwijder de kop van de muis na injectie en bewaar deze een nacht bij 4 °C, zodat de siliconenrubbersamenstelling in de bloedvaten kan uitharden.
9. Verwijder de volgende dag voorzichtig de schedel van de muis (bij voorkeur met een fijn pincet), extraheer de hersenen en incubeer in 4% PFA een nacht bij kamertemperatuur (RT).
10. Na een incubatie van 24 uur in PFA, de hersenen 3x wassen in PBS, in 30% sucrose doen en bewaren bij 4 °C.

3. Kwantitatieve analyse

1. Om hoogwaardige beelden van de cirkel van Willis in de hele hersenen vast te leggen (Figuur 3):
   1. Verwijder de hersenen uit de sucrose-oplossing. Droog de hersenen grondig af met een papieren handdoek om het oppervlaktevocht af te voeren.
   2. Plaats de hersenen in een hersensnijder. Plaats de hersensnijder onder een lichtmicroscoop die is uitgerust met een camera.
   3. Stel de microscoop scherp op een heldere resolutie met hoge resolutie van de Cirkel van Willis.
2. Gebruik beeldanalysesoftware met een liniaalreferentie van 10 cm om ongeveer 1 cm te meten en noteer het aantal pixels. Stel de schaal van 1 cm in op basis van deze meting en meet vervolgens de dikte van de basilaire slagader horizontaal om de diameter te bepalen.
3. Gebruik een standaard pixeldensitometriesoftware om de afbeelding te analyseren. Meet (in centimeters) vijf afzonderlijke metingen van de basilaire slagader met behulp van beeldanalysesoftware en bereken het gemiddelde om een nauwkeurige weergave van de diameter van de basilaire slagader te krijgen.
4. Gebruik een 2-weg variantieanalyse (ANOVA) om de gemiddelde verandering in diameter tussen de elastase en de controlegroep te vergelijken.
   1. Bereken de procentuele verandering in diameter met behulp van de onderstaande formule ²¹:
      
      C = relatieve verandering
      X₁ = Beginwaarde (Voertuig)
      X₂ = Eindwaarde (Elastase)
      Beschouw P-waarden kleiner dan 0,05 als statistisch significant. Voer alle statistische analyses uit met behulp van statistische analysesoftware.

4. Verwijdering van siliconenrubbersamenstelling met behulp van alcoholdehydratatie

OPMERKING: Het is belangrijk om de hersenen te dehydrateren om de overtollige siliconenrubbersamenstelling uit het bloedvat te verwijderen, wat mogelijk de kwaliteit van immunokleuring kan verbeteren.

1. Was de hersenen 3x met PBS om de sucrose te verwijderen.
2. Plaats de hersenen in 25%, 50%, 75%, 95% en absolute ethanol gedurende 24 uur in elke concentratie, gedurende een totale tijd van 5 dagen.
3. Plaats het weefsel na uitdroging van het weefsel gedurende 12-24 uur in methylsalicylaat (conc. ≤100%). De ethanol en methylsalicylaat zorgen voor de verwijdering van overtollig siliconen in het weefsel.
4. Was de hersenen 3x in PBS om resterende chemicaliën te verwijderen en laat ze een nacht op een wipstoel bij 4 °C in verse PBS staan.
5. Plaats de hersenen in sucrose en bewaar ze bij 4 °C voordat ze in secties worden gesneden en immunokleuring worden aangebracht.

5. Immunohistochemische kleuring

1. Secties van hersenen
   1. Laat de hersenen zich voorafgaand aan immunosectie nestelen op de bodem van de buis gevuld met sucrose.
   2. Bevries de hersenen op het microtoomplatform met behulp van een optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding omgeven door droogijs. Snijd de hersenen in secties van 40 μm met behulp van het microtoommes.
   3. Breng elke sectie over in een plaat met 96 putjes met cryoprotectant om bevriezing te voorkomen met een penseel met fijne punt.
   4. Sluit de plaat met 96 putjes goed af met plasticfolie. Bewaar de verzegelde plaat in een vriezer van -20 °C.
2. Immunofluorescentiekleuring (met NeuN als voorbeeld)
   1. Leg de secties op een bord met 24 putjes. Voer drie wasbeurten uit met PBS om de cryoprotectant te elimineren.
   2. Om niet-specifieke binding te voorkomen, incubeer gedurende 1 uur bij RT met behulp van een blokkerende oplossing die 2% geitenserum, 0,1% Triton-X 100 en 1% BSA bevat.
   3. Bereid alle componenten voor in PBS.
      OPMERKING: Het primaire antilichaam dat werd gebruikt, omvatte monoklonale anti-NeuN bij muizen met een verdunning van 1:500. Het gebruikte secundaire antilichaam omvatte polyklonaal geitenanti-muis 568 met een verdunning van 1:200.
   4. Verdun de monoklonale muis anti-NeuN in de hierboven genoemde blokkerende oplossing.
   5. Voeg het verdunde antilichaam toe aan elk putje. Incubeer een nacht bij 4 °C, afgeschermd van licht door folie.
   6. Was de secties na de eerste incubatie 3x met PBS. Verdun de polyklonale geit anti-muis 568 in dezelfde blokkerende oplossing.
   7. Voeg het verdunde antilichaam toe aan elk putje. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, afgeschermd van licht door folie.
   8. Was de secties 3x met PBS na de secundaire incubatie.
   9. Bereid de montage voor door secties langzaam over te brengen op dia's met fijne penselen. Laat alle secties drogen.
   10. Breng 125-150 μL anti-fade montagemedia aan zodra de secties zijn gedroogd. Plaats de dekglaasjes voorzichtig.
   11. Laat de glaasjes 24 uur drogen bij RT in het donker en sluit de randen af met nagellak. Leg fluorescerende beelden vast met behulp van beeldvormingssoftware.

Resultaten

We waren erin geslaagd de Cisterna magna onder het occipitale gebied van de schedel te lokaliseren nadat we de muis zorgvuldig op het stereotaxische frame hadden geplaatst en de spieren hadden ontleed. Deze anatomische structuur, die lijkt op een omgekeerde driehoek en geel is gemarkeerd, bevindt zich onder de basis van de schedel (figuur 1). Om precisie te garanderen en schade aan het hersenweefsel te voorkomen, werd 1-2 mm van de afgeschuinde Hamilton-spuit voorzichtig in de Cisterna magna ingebracht.

Na de elastase-injectie werden de dieren geperfundeerd met PBS en 4% PFA met drie verschillende tijdsintervallen: 2 weken, 1 maand en 3 maanden. Vervolgens werden hun bloedvaten gefixeerd met een siliconenrubbersamenstelling om de visualisatie van bloedvaten te verbeteren, zoals weergegeven in figuur 2. Kwalitatief gezien onthult de door elastase geïnduceerde dilatatie een verhoogde zichtbaarheid van de kleine bloedvaten rond de Cirkel van Willis en een vergrote en kronkelige basilaire slagader, vergeleken met de controlegroep die een injectie met een vehiculum kreeg (Figuur 3).

Kwantitatieve analyse onthulde een significant verschil tussen de elastase- en de controlegroep, waarbij vergroting van de bloedvaten in de elastasegroep werd gezien na 2 weken (32% toename; p-waarde = 0,019), 1 maand (19% toename; p-waarde = 0,020) en 3 maanden (20% toename; p-waarde = 0,020) na injectie (figuur 4). Daaropvolgende uitdroging van de hersenen door een geleidelijke toename van de ethanolconcentratie, gevolgd door onderdompeling in methylsalicylaat, vergemakkelijkte de verwijdering van overtollige siliconenrubbersamenstelling en droeg bij aan een verbeterde kwaliteit van de histologische kleuring (Figuur 5).

Figuur 1: Locatie van de Cisterna magna. Verbeterde visualisatie onthult de Cisterna magna geïsoleerd van aangrenzende nekspieren, en toont zijn positie ten opzichte van de hersenen en schedelstructuur, met name het occipitale bot. De Cisterna magna, gemarkeerd door een gele driehoek, lijkt op een omgekeerde driehoek, wat duidelijkheid biedt in de anatomische weergave. Schaal balken: 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Injectie van gele kleurstof. Transcardiale perfusie werd gebruikt om het weefsel voor te bereiden op histologische kleuring. (A) De perfusie-opstelling voor muizen omvatte het pompen van PBS in het lichaam gedurende 4 minuten om het bloed te verwijderen, gevolgd door PFA gedurende nog eens 4 minuten voor eiwitfixatie. (B) De injectie van kleurstof in de linker hartkamer van een muis na perfusie verbetert de zichtbaarheid van bloedvaten in de hersenen, waardoor gemakkelijke observatie met het blote oog wordt vergemakkelijkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Pictograaf van hersenen geïnjecteerd met elastase en PBS. De visualisatie illustreert de vergroting van de BA en verhoogde kronkeligheid rond de CW na injectie met elastase, in vergelijking met de controlegroep (PBS). CW, cirkel van willis; BA, basilaire slagader. Schaal balken: 3 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Door elastase geïnduceerde en aanhoudende verwijding van bloedvaten gedurende 3 maanden. Vergeleken met de controlegroep die met PBS werd behandeld, zagen we significante bloedvatverwijding na een enkele elastase-injectie in de Cisterna magna van 3 maanden oude muizen, die 3 maanden aanhield. De basilaire slagader werd 2 weken, 1 maand en 3 maanden na injectie met elastase gemeten. Gegevens zijn gemiddeld ± SD; 2-weg Anova, Sidak (post hoc testen); *P < 0,019 (2 weken), *P < 0,020 (1 maand) en *P < 0,020 (3 maanden). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: NeuN-kleuring van gedehydrateerde hersenen na verwijdering van overtollige gele kleurstof. Nadat de hersenen gedurende 24 uur elk 24 uur in toenemende concentraties ethanol en methylsalicylaat waren geplaatst, werden de hersenen doorgesneden met behulp van een microtoom en gekleurd voor de neuronale marker NeuN. In het diagram is het duidelijk dat de (A) niet-gedehydrateerde hersenen grotere zichtbare bloedvaten vertonen in vergelijking met de (B) gedehydrateerde hersenen, zoals aangegeven door de witte pijl. Dit vergemakkelijkt een nauwkeurigere analyse van deze secties, omdat het de achtergrondinterferentie met betrekking tot bloedvaten vermindert. Schaal balken: 3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit artikel demonstreert een verbeterd protocol voor cerebrovasculaire dilatatie, met een nauwkeurige en ongecompliceerde aanpak voor elastase-injectie in de Cisterna magna van muizen. Dit anatomische punt dient als een directe toegangspoort tot het hersenvocht en biedt een waardevolle weg voor het onderzoek naar verschillende neurologische aandoeningen. Een van de belangrijkste voordelen van deze aangepaste techniek is dat het injecteren van een enkele dosis elastase in de Cisterna magna van muizen in staat was om verwijding van grote bloedvaten te veroorzaken en gedurende ten minste 3 maanden vol te houden zonder dat een herhaalbare injectie of implantatie van een canule nodig was. De aanpak van toediening van elastase in een AD-muismodel is een ander opmerkelijk voordeel, met name voor het versnellen van de afzetting van amyloïde plaques in de hersenen. Doorgaans vertoonden^{AD-modellen zoals App NL-F-muizen} (gebruikt in deze studie) plaquevorming op 6 maanden van de leeftijd van²⁸. Dit model is gekozen omdat deze muizen van nature mensachtige amyloïde afzetting vertonen onder normale verouderingsomstandigheden. Het injecteren van elastase in de Cisterna magna op de leeftijd van 3 maanden kan de AD-pathologie verergeren door de cerebrale bloedstroom te verminderen¹⁶ en de verstoringen van de bloed-hersenbarrière te vergroten^12,13.

Het is belangrijk op te merken dat het injecteren van stoffen in de Cisterna magna kan worden belemmerd door CSF-druk. We hebben deze beperking aangepakt door een methode te ontwikkelen die gericht is op het minimaliseren van de impact ervan, in het besef dat we de mogelijke interferentie van cerebrospinale vloeistof (CSF) op de afgifte van elastase aan de hersenen niet kunnen elimineren. Het vermogen van elastase om elastine te verteren resulteert in een vermindering van de arteriële stijfheid, waardoor de slagaders verzwakken en de bloedvaten langer worden en kronkelig worden^29,30, waardoor het een geschikte interventie is voor het veroorzaken van dolichoectasia.

Doorgaans duurt het ongeveer 20 minuten om de chirurgische injectie in de Cisterna magna per muis te voltooien. Tijdens het proces worden de muizen verdoofd met 1,5%-2% isofluraan gebruikt als algemene anesthesie. Het wordt aanbevolen om het gebruik van een stereotaxisch frame met een tandstang en oorbalken te gebruiken om de stabiliteit en stevigheid van het muishoofd te garanderen tijdens de operatie, wat een delicate en cruciale stap is. Onjuiste positionering op het stereotaxische frame kan resulteren in een gekanteld hoofd en onnauwkeurige afgifte, evenals de mogelijkheid om een bloedvat te raken. In plaats van de huid te knippen met een scalpel, wat rommelig kan zijn, knijpen we in de huid met een fijn pincet en maken we een schone snede met een chirurgische schaar om de middellijn van de nek te onthullen. Het scalpel liep vervolgens langs de middellijn om een nette snee te maken, en een fijn pincet werd gebruikt om spieren te scheiden. Over het algemeen minimaliseert dit het bloeden, waardoor de muis veel sneller herstelt.

We kozen voor een dosering van 15 mU elastase op basis van de bevindingen van eerder werk²⁰, waaruit bleek dat er geen verschil was tussen doseringen van 15 mU en 25 mU. Bovendien merkten ze op dat hogere concentraties leidden tot verhoogde sterftecijfers. Hoewel een sterftecijfer van 28% werd gerapporteerd met de dosering van 15 mU²⁰, leverde de methode die in deze studie werd gebruikt geen dodelijke slachtoffers op onder het cohort. We hadden nul sterfte tijdens het gehele chirurgische proces van alle muizen en een sterfte van 5-10% na de operatie tot 3 maanden daarna. De primaire focus van deze studie ligt echter op het begrijpen van dolichoectasia, de verwijding van grote bloedvaten. Deze nadruk bracht ons ertoe ons te concentreren op de basilaire slagader als de primaire referentie voor het meten van dilatatie. Bovendien veroorzaakt het injecteren van elastase in de Cisterna magna van muizen een breed effect, waarbij zowel grote als kleine bloedvaten worden verwijd.

Bij het injecteren in de cisterne magna van een dier, is het van cruciaal belang om rekening te houden met de afstand tussen het hersenweefsel en de Cisterna magna-ruimte om te voorkomen dat de hersenen met de naald worden beschadigd. Omdat muizen een relatief kleine afstand hebben, steken we alleen de afschuining van de spuit in de Cisterna magna. Om het risico op infectie te minimaliseren, moet de procedure worden uitgevoerd met steriele chirurgische apparatuur, waarbij de muis wordt verdoofd. Toediening van bupivacaïne en Metacam vóór de ingreep kan helpen het postoperatieve ongemak te verminderen en een sneller herstel van de dieren te bevorderen. De Cisterna magna, gelegen aan de basis van de schedel, wordt zichtbaar gemaakt door de operatieplaats grondig af te drogen met een steriel wattenstaafje. Voor het huidige onderzoek is het operatiegebied ongeveer 1 cm groot, wat het maximale gebied is dat kan worden gebruikt om een duidelijk zicht op de Cisterna magna te verkrijgen. Bovendien helpt de kleine incisieplaats het dier om sneller te genezen.

Het is van cruciaal belang om de retentie van geneesmiddelen binnen de Cisterna magna-ruimte te maximaliseren. Eerder onderzoek probeerde lekkage van geneesmiddelen te voorkomen door een wattenstaafje op de injectieplaats te plaatsen na toediening van elastase²¹. We maken ons echter zorgen over de werkzaamheid van deze methode, omdat het absorberende karakter van katoen op de injectieplaats de effectiviteit van elastase in gevaar kan brengen door het na injectie opnieuw te absorberen. Evenzo werd in een ander onderzoek²⁰ de naald snel verwijderd na het injecteren van elastase in de Cisterna magna, wat een andere potentiële uitdaging vormde om ervoor te zorgen dat het geneesmiddel optimaal in de Cisterna magna-ruimte terechtkwam, wat mogelijk leidde tot lekkage van elastase in de hersenvloeistof. Daarom begint de voorgestelde methode hier met het doorboren van de Cisterna magna om cerebrospinale vloeistof (CSF) vrij te maken, gevolgd door het plaatsen van een steriel wattenstaafje op de prikplaats om overtollig CSF te absorberen en de druk in de ruimte te verlichten. Vervolgens wordt het wattenstaafje verwijderd en wordt de naald opnieuw op dezelfde plek ingebracht voor elastase-injectie in de stortbakruimte zonder het wattenstaafje opnieuw aan te brengen. Bovendien hebben we ervoor gekozen om de naald 1-2 minuten na de injectie op zijn plaats te houden, zodat de elastase voldoende door de Cisterna magna kan diffunderen voordat deze voorzichtig wordt teruggetrokken. Er moet echter worden opgemerkt dat deze techniek het uitvoeren van de injectievrije hand en het stabiel verankeren van de naald vereist terwijl de Cisterna magna wordt doorboord en de elastase langzaam wordt geïnjecteerd. Bovendien is het belangrijk om beschadiging van de grote bloedvaten in de Cisterna magna te voorkomen tijdens het injecteren, omdat dit kan leiden tot complicaties zoals cirkelen na de operatie, wat een eindpunt is en euthanasie vereist. Over het algemeen toont de methode een dilatatie aan die tot 3 maanden aanhoudt na een enkele elastase-injectie in de Cisterna magna, waarmee de dilatatie van 2 weken die bij eerdere methoden werd waargenomen wordt overtreft^20,21. Concluderend kan worden gesteld dat deze aanpak de duur van de dilatatie verlengt, maar ook consequent stoffen, zoals elastase, rechtstreeks aan de hersenen afgeeft. Deze methode heeft de voorkeur vanwege de minimaal invasieve benadering van het transporteren van stoffen door de bloed-hersenbarrière, wat een bijkomend voordeel biedt omdat het verder kan worden uitgebreid voor de toediening van geneesmiddelen aan het centrale zenuwstelsel.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
23 G catheter	University Medstore	2546-CABD305145	Nodig voor perfusie  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Absolute ethanol	University Medstore	https://www.uoftmedstore.com/index.sz	Voor het verwijderen van de microfil
Betadine scrub	#	https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrub	Sterilisering
Betadine-oplossing	Amazon	https://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHW	Sterilisering
Bupivacaïne	Verstrekt door dierenfaciliteit	N/A	Analgeticum
Kniptang	BrainTree Scientific Inc	CLP-41590	Verschuiven van vacht
Wattenstaafje	University Medstore	1962	Voor chirurgie (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Elastase	Sigma-aldrich	E7885	Gebruikt voor de dilatatie van bloedvaten
Ethanol	University Medstore	39752-P016-EAAN	Sterilisering (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Geit anti-muis 568	Invitrogen	A11004	Voor het kleuren van volwassen neuronen
Graphpad prism 10	Graphpad prism 10	https://www.graphpad.com/	Statistische analysesoftware
Hamilton-spuit	Sigma-aldrich	28614-U	Injectielastase
Warmtepad	Amazon	https://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZ	Lijchaamstemperatuur handhaven
ImageJ-software	Fiji Imagej-software	imagej.net (USA)	Beeldanalysesoftware
Inductiekamer	Verstrekt door dierenfaciliteit	N/A	Anesthesie-inductie
Metacam	Verstrekt door dierenfaciliteit	N/A	Analgeticum
Methylsalicylaat	Sigma-aldrich	M6752	Voor het verwijderen van de microfil
Microfil	Flow Tech, Carver, Massachusetts	https://www.flowtech-inc.com/order/	Kleurstof (geel)
Muis monoklonaal anti-NeuN	Millipore Sigma	MAB377	Voor het kleuren van volwassen neuronen
Olympus VS200 diascanner en VSI-software.	Olympus Life Science	https://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104	Beeldvormingssoftware
Paraformaldehyde	University Medstore	PAR070.1	Voor eiwitfixatie  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Perfusiepomp	VWR International	https://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumps	Nodig voor perfusie
Schelp	University Medstore	2580-M90-10	Voor chirurgie (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Stereotaxisch	Verstrekt door dierenfaciliteit	N/A	Om het dier vast te zetten voor chirurgie
Chirurgische schaar	University Medstore	22751-A9-240	Voor chirurgie (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Chirurgisch tape	University Medstore	https://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2	Het dier op de luier vastzetten
Hechtdraad	University Medstore	2297-VS881	Voor chirurgie (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
X2 pincetten	University Medstore	7731-A10-612	Voor chirurgie (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)