Methodenartikel

Verglazing van het weefsel van de eierstokschors om een glazige staat van aggregatie te bereiken

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66801

⸱

9 augustus 2024

 ,  ,  , 
1Department of Gynecological Endocrinology and Reproductive Medicine, University Hospital of Bonn

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een protocol voor de vitrificatie van eierstokweefsel, als een alternatieve cryopreservatiemethode voor het veelgebruikte langzame invriesprotocol, wordt gepresenteerd.

Samenvatting

Cryopreservatie van eierstokweefsel (OTC) is een belangrijke optie voor het behoud van de vruchtbaarheid. Voor patiënten van wie de gonadotoxische behandelingen niet kunnen worden uitgesteld of voor pre-puberale meisjes is het vaak de enige optie voor vruchtbaarheidsbescherming. Cryopreservatie kan worden uitgevoerd door vitrificatie of door langzaam invriezen. Langzaam invriezen is momenteel de standaardaanpak. Een toenemend aantal onderzoeken geeft aan dat vitrificatie langzaam invriezen in de ultramoderne in-vitrofertilisatielaboratoria (IVF) kan vervangen, waardoor de overlevingskansen bij ontdooien aanzienlijk worden verbeterd en de technische aspecten van cryopreservatie worden vereenvoudigd. Een op metalen rasters gebaseerd, high-throughput protocol voor snelle vitrificatie van ovariumschorsweefsel, geschikt voor klinische routine, wordt beschreven. De sterilisatie van metalen roosters en vloeibare stikstof zorgt voor een hoge kwaliteit en voldoet aan de normen voor goede productiepraktijken (GMP). Vitrificatie werd uitgevoerd om ultrasnelle afkoelsnelheden te garanderen. In plaats van langzaam te ontdooien, werden de monsters snel opgewarmd. Om de levensvatbaarheid van de follicels te beoordelen, werd calceïnekleuring zowel vóór cryopreservatie als na snelle opwarming uitgevoerd. De succesvolle toepassing van vitrificatie en snelle opwarming met behulp van metalen roosters wordt gerapporteerd. Er werden geen significante verschillen in folliculaire levensvatbaarheid waargenomen vóór vitrificatie en na snelle opwarming. Deze resultaten onderbouwen de hoge capaciteit van weefselvitrificatie voor klinische routinetoepassingen als een mogelijke vervanging voor de veelgebruikte slow-freesmethode.

Inleiding

Cryopreservatie van eierstokweefsel is een belangrijke optie voor het behoud van de vruchtbaarheid. Geëxplanteerd weefsel met ovariële follikels, waarin eicellen zijn ingebed, wordt gecryopreserveerd. Na opslag kan het eierstokweefsel worden ontdooid, verwarmd en opnieuw worden geïmplanteerd bij de patiënt. Voor levensvatbare cellen of weefsel zijn twee cryopreservatiemethoden beschikbaar: langzaam invriezen en vitrificatie1.

Vitrificatie wordt gebruikt om biologisch materiaal, zoals embryo's en eicellen, te conserveren met superieure overlevingspercentages in vergelijking met het langzame invriesprotocol 1,2,3,4. Langzaam invriezen heeft beperkingen, zoals de vorming van ijskristallen, die mogelijk cel- en weefselstructuren kunnen beschadigen. Langzaam invriezen is echter een belangrijke cryopreservatiebenadering die de langdurige opslag van biologische monsters vergemakkelijkt, en de functionaliteit van deze methode is algemeen bewezen5. Vitrificatie induceert een glazige toestand van aggregatie, waardoor de vorming van ijskristallen wordt voorkomen 6,7. Op technisch niveau vereenvoudigt vitrificatie de cryopreservatieprocedure aanzienlijk door het onderhoud van de apparatuur te verminderen, de kans op technische fouten te verkleinen en de duur van het cryopreservatieproces te verkorten 8,9. Bij het behoud van vrouwelijke vruchtbaarheid is cryopreservatie van eierstokweefsel een doorslaggevende benadering voorafgaand aan de behandeling van kanker10. Verschillende groepen hebben met succes het concept van cryopreservatie, ontdooiing en transplantatie van weefsel gedemonstreerd op basis van het langzame invriesprotocol 11,12,13,14, dat momenteel wordt beschouwd als de standaardbenadering 15.

Verglazing van eierstokweefsel wordt beschouwd als een veelbelovende alternatieve methode 16,17,18,19,20,21, in termen van hulpbronnenbesparende22, folliculaire overlevingspercentages, DNA-fragmentatieniveaus en evenwichtig angiogeen potentieel 23,24,25,26,27. Dit wordt onderbouwd door succesvolle leveringen in Japan28, de VS29 en Duitsland30.

Het vergelijken van de twee opties voor cryopreservatie van ovariumweefsel (OTC)-vitrificatie versus de standaardprocedure van langzaam invriezen - resultaten zijn gedeeltelijk tegenstrijdig in de huidige meta-analyses16. Verschillende factoren kunnen hieraan hebben bijgedragen, aangezien de huidige vitrificatieprotocollen sterk variëren. Deze verschillen omvatten de keuze van cryoprotectant of combinatie van protectanten, hun concentratie, de samenstelling van de OTC-media, de grootte van weefselfragmenten en het apparaat dat als weefseldrager wordt gebruikt. Dienovereenkomstig is er geen gestandaardiseerd opwarmingsprotocol.

Aangezien de auteurs een methode hebben gevonden die overtuigende resultaten oplevert op het gebied van behandeling, levensvatbaarheid, aanvang van apoptose, vrijlating van angiogene factoren en zelfs een verslag van een geboorte na re-implantatie 9,27, wordt een zeer gedetailleerde beschrijving van het protocol gegeven. De beschreven methode biedt een valide en effectief protocol dat kan bijdragen aan de standaardisatie van vitrificatie van eierstokweefsel.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Ziekenhuis Bonn (007/09). Van elke patiënt werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. De onderzoeksgroep omvatte menselijk eierstokweefsel van 50 patiënten met een gemiddelde leeftijd van 27,4 jaar voorafgaand aan cryopreservatie, zoals aangegeven in figuur 1. De reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de laadinrichtingen

  1. Bereid chirurgische scharen en metalen mazen voor op maatwerk. Snijd de mazen in stroken van 25 mm x 8 mm, zoals aangegeven in figuur 2A.
  2. Plaats de op maat gemaakte metalen mazen in een sterilisatiecontainer en autoclaaf gedurende 2 uur (Figuur 2B). Plaats na het autoclaveren de sterilisatiecontainer en de injectieflacons van 1.8 ml onder de laminaire stromingsbank.
  3. Schakel de ultraviolette (UV) bestraling van de laminaire stroombank gedurende 30 minuten in voor extra sterilisatie op een golflengte van 254 nm.
  4. Open de sterilisatiecontainer, verwijder de metalen roosters en plaats ze in de doppen van de injectieflacons van 1.8 ml, zoals aangegeven in afbeelding 2C. Sluit de injectieflacons van 1,8 ml.
    OPMERKING: Alle hierboven beschreven weefselkweekwerkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap van klasse II. Reinig de laminaire stromingsbank met een oppervlaktedesinfectiemiddel terwijl u wegwerplaboratoriumhandschoenen draagt; Niet-gepoederde handschoenen worden aanbevolen.

2. Bereiding van vitrificatiemedia

  1. Bereid een serologische pipet van 10 ml, een elektronische pipethulpmiddel en drie buisjes van 50 ml voor voor Vitrificatieoplossing 1 (VS1), Vitrificatieoplossing 2 (VS2) en Vitrificatieoplossing 3 (VS3), en voor het registreren van de bereidingsdatum. Schakel de ultraviolette (UV) straling van de laminaire stromingsbank in voor extra sterilisatie.
  2. Voor VS1 (15 ml) pipetteert u 12 ml eicelverwerkingsmedium (door de fabrikant aangevuld met humaan serumalbumine), 1,5 ml SSS (Serum Substitute Supplement) en 1,5 ml ethyleenglycol in een buisje van 50 ml.
  3. Voor VS2 (15 ml) pipetteert u 10,5 ml eicelverwerkingsmedium (door de fabrikant aangevuld met humaan serumalbumine), 3 ml ethyleenglycol en 1,5 ml SSS in een buisje van 50 ml.
  4. Voor VS3 pipette u 8,5 ml eicelverwerkingsmedium (door de fabrikant aangevuld met humaan serumalbumine), 5,25 ml ethyleenglycol en voegt u 2,57 g sucrose en 0,75 g polyvinylpyrrolidon (PVP) toe aan een buisje van 50 ml. Zie figuur 3 voor details. Meng alle oplossingen door te vortexen met 3.000 tpm.
    OPMERKING: Alle hierboven beschreven weefselkweekwerkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap van klasse II. Reinig de laminaire stromingsbank met een ontsmettingsmiddel terwijl u laboratoriumhandschoenen voor eenmalig gebruik draagt; Niet-gepoederde handschoenen worden aanbevolen.

3. Voorbereiding op verglazing

  1. Reinig de laminaire stromingsbank met een oppervlaktedesinfectiemiddel terwijl u wegwerplaboratoriumhandschoenen draagt; Niet-gepoederde handschoenen worden aanbevolen.
  2. Bereid een bord met 6 putjes, een celzeef, een scalpel, een pincet, een biopsiepons van 2 mm en twee schaaltjes met ronde bodem van 90 mm voor. Bereid ook media voor: conserveringsoplossing voor weefseltransplantatie en VS1-3. Pipeteer 5 ml van elke gekoelde oplossing (VS1-3) in aparte putjes en wacht 30 minuten totdat de oplossingen op kamertemperatuur zijn.
  3. Steriliseer vloeibare stikstof met een geautomatiseerd UV-bestralingssysteem; U kunt ook de UV-straling van de laminaire stromingskap gedurende 120 minuten gebruiken.

4. Verglazing van weefsel

  1. Bereid het weefsel van de eierstokschors voor door de medulla te verwijderen. Omdat de cortex meestal harder is dan de medulla, kunnen ze gemakkelijk worden onderscheiden en gescheiden.
    1. Snijd het weefsel van de ovariumschors in de gewenste vormen (10 mm x 5 mm voor transplantatie; ponsen van 2 mm x 2 mm voor het tellen van levensvatbare follikels voor en na vitrificatie), zoals aangegeven in figuur 4A.
      NOTITIE: Voorkom beschadiging van het weefsel door te hard te drukken en ga er voorzichtig mee om. Weefselmonsters kunnen van patiënt tot patiënt verschillen.
  2. Plaats een celzeef in het eerste putje van de plaat met 6 putjes met VS1. Breng het weefsel van de eierstokschors gedurende 5 minuten in evenwicht in 5 ml VS1 in put 1 van de plaat met 6 putjes met behulp van de celzeef.
    1. Verplaats vervolgens de celzeef met het cortexweefsel naar put 2 met 5 ml VS2 en balanceer gedurende 5 minuten. Evenwicht ten slotte gedurende 6 minuten in 5 ml VS3, zoals aangegeven in figuur 3 en tabel 1.
  3. Open de voorbereide cryovials. Vul de flesjes met gesteriliseerde vloeibare stikstof en plaats ze in het cryo-dewarvat gevuld met vloeibare stikstof. Laad de weefselmonsters binnen 1 minuut op het metalen rooster van het vitrificatieapparaat (Figuur 4B,C).
    1. Steek de weefselmonsters die op het metalen rooster zijn geladen in de vloeibare stikstof in de voorbereide cryovials op basis van het rooster (Figuur 4D).
      OPMERKING: Snelle bevriezing van het weefsel dat op het metalen rooster is geladen, is essentieel voor het succes van deze methode. Alle hierboven beschreven weefselkweekwerkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap van klasse II. Reinig de laminaire stromingsbank met een oppervlaktedesinfectiemiddel terwijl u wegwerplaboratoriumhandschoenen draagt; Niet-gepoederde handschoenen worden aanbevolen.

5. Bereiding van snel opwarmende media

  1. Bereid de oplossingen voor zoals aangegeven in figuur 5 en tabel 2. Weeg de sucrose af voor de snelle opwarmingsoplossing (RWS) en de equilibriatieoplossing (ES) en breng deze over naar de buis. Voeg het eicelverwerkingsmedium toe (door de fabrikant aangevuld met humaan serumalbumine) met behulp van een serologische pipet en een pipetteerhulpmiddel. Voeg SSS en sucrose toe zoals vermeld in Tabel 2.
  2. Sluit de buisjes en laat ze op een rollende shaker schudden tot ze volledig zijn opgelost.
    OPMERKING: Alle hierboven beschreven weefselkweekwerkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap van klasse II. Reinig de laminaire stromingsbank met een oppervlaktedesinfectiemiddel terwijl u wegwerplaboratoriumhandschoenen draagt; Niet-gepoederde handschoenen worden aanbevolen.

6. Voorbereiding voor snelle opwarming

  1. Bereid een dag voor de snelle opwarming de verbruiksartikelen voor en ontsmet ze met UV-licht in de laminaire stromingsbank: Bereid het monsterbekerglas voor op RWS, de 6-wellsplaat voor ES, RS1 en RS2 en het monsterbekertje voor weefseltransport na snelle opwarming. Plaats steriele wegwerppincetten, pipetteerapparatuur en andere verbruiksartikelen in de laminaire flowbank.
  2. Verwarm een verwarmingsplaat voor op 37,2 °C. Incubeer RWS bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur.
  3. Bereid een steriele plaat met 6 putjes voor met 6 ml ES, 6 ml RS voor "RS1" en nog eens 6 ml RS voor "RS2" in de laminaire flowbank. Zie afbeelding 5 voor een schematische weergave van de plaat met 6 putjes. Laat deze 1 uur bij kamertemperatuur incuberen voordat je het weefsel verwarmt.
  4. Breng RWS onder steriele omstandigheden over in een steriel monsterbekertje en plaats het op de verwarmingsplaat. De RWS moet op 37 °C worden gehouden.
    OPMERKING: Snelle opwarming vereist een snelle opwarmingssnelheid. Het is van cruciaal belang om de RWS op 37 °C te houden om het succes van de eerste stap te garanderen.

7. Snelle opwarming van eierstokweefsel

  1. Transporteer de gecryopreserveerde injectieflacons met verglaasd ovariumcorticaal weefsel in vloeibare stikstof naar de laminaire stroombank. Open de injectieflacons terwijl ze gedeeltelijk zijn ondergedompeld in vloeibare stikstof. Dompel het gaas met het verglaasde weefsel snel onder in het RWS en laat het weefsel daar 1 minuut bij 37 °C zitten.
    OPMERKING: Dit is de meest kritieke stap tijdens snelle opwarming en moet zonder enige vertraging worden uitgevoerd.
  2. Breng het weefsel met een steriele pincet over naar de ES en incubeer het gedurende 3 minuten terwijl u het voorzichtig schudt op een schommelende shaker.
  3. Spoel het weefsel elk 10 minuten op kamertemperatuur met RS1 en RS2 op een schommelschudder, zoals aangegeven in afbeelding 5.
  4. Breng het opgewarmde weefsel over in een steriel monsterbekerglas met 5 ml conserveringsoplossing voor weefseltransplantatie, die bij 4 °C moet worden gehouden voor transport naar de transplantatieplaats.
    OPMERKING: Alle hierboven beschreven weefselkweekwerkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap van klasse II. Reinig de laminaire stromingsbank met een oppervlaktedesinfectiemiddel terwijl u wegwerplaboratoriumhandschoenen draagt; Niet-gepoederde handschoenen worden aanbevolen.

8. Bepaling van de folliculaire levensvatbaarheid

  1. Breng dimethylsulfoxide (DMSO) een nacht op kamertemperatuur om een vloeibare toestand te verkrijgen. Pipetteer 100 μL DMSO in een injectieflacon met calceïne en resuspendeer om de calceïne op te lossen. Pipetteer 3 μl van het opgeloste calceïne op de bodem van een buisje van 1,5 ml en bewaar de injectieflacons bij -20 °C.
  2. Doe 0,007 g collagenase in een tube van 1,5 ml en bewaar deze bij -20 °C.
  3. Voeg 997 μL DPBS toe aan de vooraf gealiquoteerde en ingevroren 3 μL calceïne in een buisje van 1,5 ml en resuspendeer om de calceïne op te lossen. Voeg 0,007 g collagenase toe om een werkoplossing van 1000 μl te verkrijgen.
  4. Gebruik 500 μl van de werkoplossing om twee stukjes fragmenten van de ovariumschors van 2 mm gedurende 90 minuten bij 37 °C, afgeschermd van licht, te verteren in een schaaltje met 4 putjes. Na 60 minuten en 70 minuten de oplossing herhaaldelijk resuspenderen. Bepaal ten slotte de folliculaire levensvatbaarheid via fluorescentiemicroscopie, zoals weergegeven in figuur 6.

Resultaten

Dit protocol presenteert de procedures voor de bereiding van vitrificatiemedia, laadinrichtingen, vitrificatie, bereiding van snelopwarmingsmedia, snelle opwarming en bepaling van de folliculaire levensvatbaarheid. Een directe vergelijking van folliculaire levensvatbaarheid en angiogene factoren tussen langzaam invriezen en vitrificatie is gevalideerd en gepubliceerd31,32.

Het algehele succes van het beschreven vitrificatieprotocol werd beoordeeld door het aantal vitale follikels voor en na vitrificatie/snelle opwarming te vergelijken. De experimentele opzet is weergegeven in figuur 1 en de resultaten zijn weergegeven in figuur 6. Bij 50 patiënten werd een gemiddeld aantal van 77,98 vitale follikels waargenomen vóór vitrificatie en 62,99 na vitrificatie/snelle opwarming, wat neerkomt op een overlevingspercentage van 80,8%. Dit was niet significant anders volgens de Wilcoxon-test33.

Metalen roosters worden individueel aangepast met een scherpe schaar tot een afmeting van 25 mm x 8 mm, die past in de doppen van 1,8 ml cryovials, zoals weergegeven in figuur 2A,C. Na sterilisatie met behulp van stoomautoclaveren worden de roosters en doppen van injectieflacons van 1,8 ml gemonteerd onder een laminaire stromingsbank, zoals aangegeven in figuur 2B. Deze opstelling zorgt voor een veilige houvast in de dop zonder dat er extra handelingen nodig zijn en biedt voldoende ruimte voor weefsel van verschillende groottes. Doorgaans worden weefselstukken van 5 mm x 10 mm voor transplantatie en stukjes met een diameter van 2 mm voor het beoordelen van het vitale aantal follikels na snelle ontdooiing gevitrificeerd. Beide maten passen perfect op de metalen roosters.

Equilibratie met vitrificatieoplossingen (VS1, VS2 en VS3) wordt uitgevoerd in een plaat met 6 putjes op een schommelschudder bij kamertemperatuur onder een laminaire stromingsbank, zoals weergegeven in figuur 3. De tijdschema's in het schema zorgen voor de effectieve opname van het cryoprotectieve ethyleenglycol. Het gebruik van een plaat met 6 putjes over enkele vaten wordt aanbevolen, omdat dit een snelle verplaatsing van het weefsel tussen oplossingen vergemakkelijkt en verwisseling helpt voorkomen.

Voor snelle verticale vitrificatie in vloeibare stikstof wordt het weefsel van de eierstokschors in geschikte stukken gesneden (Figuur 4A). Monsters van de ovariumschors worden op laadapparaten geplaatst (Figuur 4B,C) en verticaal ondergedompeld in vloeibare stikstof (Figuur 4D) om door vitrificatie een glasachtige aggregatietoestand te bereiken. De gekozen metalen roosters maken verticale hantering van het weefsel mogelijk, zoals weergegeven in figuur 4D. Bovendien zijn de metalen roosters zeer thermisch geleidend, wat zorgt voor snelle afkoelsnelheden van 22 °C tot -196 °C, wat een uiterst belangrijke stap is in het vitrificatieproces.

Voor snelle opwarming wordt RWS bereid in een steriele beker bij 37 °C. ES, RS1 en RS2 worden bereid in een plaat met 6 putjes op een schommelschudder bij kamertemperatuur, zoals weergegeven in figuur 5. Het grote volume vooropgewarmde RWS voorkomt dat de oplossing overmatig afkoelt bij de toevoeging van het verglaasde weefsel en zorgt voor een constant warme omgeving voor het weefsel tijdens het snelle opwarmproces.

Om hoge kwaliteitsnormen te beoordelen en te waarborgen, worden biopsieponsen van 2 mm x 2 mm gekleurd met calceïne voorafgaand aan vitrificatie en na snelle opwarming om de folliculaire levensvatbaarheid te bepalen met behulp van fluorescentiemicroscopie34,35 (Figuur 6). Levensvatbare follikels zenden groene fluorescentie uit bij 495 nm na de intracellulaire opname van calceïne. Als alternatief kan de folliculaire levensvatbaarheid (tabel 3) worden beoordeeld met behulp van neutrale rode kleurstoffen36.

Door de beschreven stappen in dit protocol te volgen, wordt eierstokweefsel getransformeerd in een glazige toestand van aggregatie, wat hoge overlevingskansen na snelle opwarming mogelijk maakt, zoals bevestigd door fluorescentiemicroscopie.

figure-results-1
Figuur 1: Onderzoeksopzet. Ovariumcorticale monsters van 50 patiënten werden voor (vers) en na vitrificatie en snelle opwarming onderzocht op het aantal levensvatbare follikels. Voor elke groep werden twee weefselstukken met een diameter van 2 mm gedurende 24 uur gekweekt voordat het aantal follikels werd beoordeeld. Het weefsel werd verteerd met collagenase en gekleurd met calceïne om de levensvatbaarheid te beoordelen. Het aantal levensvatbare follikels werd bepaald met behulp van een microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Voorbereiding van de laadinrichtingen. Metalen roosters werden op maat gesneden van 8 mm x 25 mm (A). De op maat gemaakte metalen roosters werden gesteriliseerd door middel van autoclaveren (B). De gesteriliseerde metalen roosters werden vervolgens in doppen van injectieflacons van 1,8 ml geplaatst, klaar voor gebruik (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Bereiding van vitrificatieoplossingen. Vitrificatieoplossingen (VS) werden bereid en overgebracht naar een plaat met 6 putjes. De putjes tonen het volume van elke oplossing en de individuele incubatietijden die in het vitrificatieprotocol worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Verwerking en vitrificatie van de ovariumschors. Ovariumschorsweefsel werd bewerkt voor cryopreservatie door de medulla te verwijderen en het weefsel in stukjes van 5 mm x 10 mm te snijden (A). Na incubatie in de vitrificatieoplossingen zoals weergegeven in figuur 3, werd het weefsel op het vitrificatielaadapparaat (B,C) geladen. Voor snelle verticale vitrificatie van monsters van de ovariumschors werden de doppen met het geladen weefsel snel in gesteriliseerde vloeibare stikstof (D) ingebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Voorbereiding van oplossingen voor snelle opwarming. Rapid warming solution (RWS), equilibration solution (ES) en rinsing solutions (RS) 1 en 2 werden bereid en overgebracht naar een plaat met 6 putjes. De vaten en putten tonen het volume van elke oplossing en de bijbehorende incubatietijden. Merk op dat RWS op een verwarmingsplaat op 37,2 °C wordt gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Levensvatbaarheid. Om het aantal levensvatbare follikels te beoordelen, werden weefselstukjes met een diameter van 2 mm verteerd met collagenase en gekleurd met calceïne. De representatieve afbeeldingen tonen (A) calceïnekleuring van 3 herstelde follikels voorafgaand aan vitrificatie. (B) Een herstelde levensvatbare follikel na vitrificatie en snelle opwarming. (C) Een herstelde levensvatbare follikel voorafgaand aan langzame bevriezing. (D) Herstelde levensvatbare follikels na langzaam invriezen en ontdooien. Folliculaire levensvatbaarheid wordt aangegeven door calceïne, een groene fluorescerende kleurstof die groene fluorescentie afgeeft wanneer deze enzymatisch wordt omgezet door levensvatbare cellen bij 495 nm. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

TEGEN 1 (15 ml)Ethyleenglycol10%1,5 ml
SSS10%1,5 ml
G-MOPS+12 ml
VERSUS 2 (15 ml)Ethyleenglycol20%3 ml
SSS10%1,5 ml
G-MOPS+10,5 ml
VS 3 (15 ml)Ethyleenglycol35%5,25 ml
SSS10%1,5 ml
Sacharose0,5 mol/L2,57 gr
PVP5 % (m/v)0,75 gr
G-MOPS+ad 15 ml

Tabel 1: Samenstelling van vitrificatieoplossingen (VS).

RWS (30 ml)Sacharose0,8 mol/L
8,22 gr
SSS10%3 ml
G-MOPS+ad 30 ml
ES (15 ml)Sacharose0,4 mol/L2,05 gr
SSS10%1,5 ml
G-MOPS+ad 15 ml
RS 1&2 (15 ml)SSS10%1,5 ml
G-MOPS+ad 15 ml

Tabel 2: Samenstelling van de oplossing voor snelle opwarming (RWS), de evenwichtsoplossing (ES) en de spoeloplossingen (RS). Deze tabel bevat de componenten en concentraties voor de snelle opwarmingsoplossing (RWS), evenwichtsoplossing (ES) en spoeloplossingen (RS) die worden gebruikt in de verwerking na vitrificatie.

ParameterVersIntervalSnel opgewarmd na vitrificatieIntervaln*P-waarde
SDSD
Aantal folliculaire levensvatbaarheid [n]77.980-38662.990.5-349500.130
77.9580.02
*Wilcoxon-test

Tabel 3: Representatieve resultaten van folliculaire levensvatbaarheid. Deze tabel geeft de resultaten weer van de beoordeling van de folliculaire levensvatbaarheid vóór cryopreservatie en na snelle opwarming. Twee weefselstukken met een diameter van 2 mm per patiënt werden gebruikt om het aantal levensvatbare follikels voor en na vitrificatie/snelle opwarming te tellen. Gepaarde weefselmonsters van 50 patiënten werden geanalyseerd met behulp van de Wilcoxon-test.

Discussie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor high-throughput vitrificatie van menselijk ovariumcortexweefsel, geschikt voor klinische routine. Net als bij de vitrificatie van eicellen of embryo's, vereist de succesvolle toepassing van de procedure een gedetailleerde naleving van het protocol met betrekking tot de temperatuur van de vitrificatie- en opwarmingsoplossingen, evenals de evenwichtsperiode. Naleving van de EU-weefselrichtlijnen37 met betrekking tot luchtkwaliteit en steriliteit is ook essentieel.

Het vitrificatieproces resulteert in een niet-kristallijne, amorfe of glasachtige toestand. Over het algemeen is vitrificatie een veelzijdig proces met aanzienlijke implicaties in verschillende wetenschappelijke en technologische domeinen. Het belangrijkste voordeel van vitrificatie is het vermogen om weefsel om te zetten in een glazige toestand, waardoor de vorming van ijskristallen wordt voorkomen 38,39,40, wat een negatieve invloed kan hebben op de weefselintegriteit en de componenten ervan.

Suppletie van cryoprotectieve middelen (CPA's) met polyvinylpyrrolidon (PVP) zorgt voor een verlaging van de CPA-concentratie zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de vitrificatieoplossingen41,42. Bovendien zorgt het gebruik van metalen roosters voor een hoge thermische geleidbaarheid in vergelijking met draagsystemen op basis van plastic. De rasterstructuur vergemakkelijkt ook de hechting aan het oppervlak, waardoor de veilige cryopreservatie van weefselmonsters en kleine cortexponsen voor kwaliteitsmaatregelen wordt gegarandeerd. Als cryovaten van andere fabrikanten worden gebruikt, is het belangrijk om vooraf de grootte van de metalen roosters te testen om stabiliteit en een goede grip in het deksel van het cryovat te garanderen, evenals een goede pasvorm in het vat.

Cruciale stappen om succesvolle vitrificatie te garanderen, zijn onder meer snelle vitrificatie door het weefsel onder te dompelen in gesteriliseerde vloeibare stikstof en zonder vertraging snel op te warmen om nadelige resultaten te voorkomen. In termen van kosteneffectiviteit is weefselvitrificatie minder veeleisend in vergelijking met de langzame invriesprocedure, die van invloed kan zijn op de planning van de inzet van het personeel. Bovendien elimineert vitrificatie de noodzaak om apparatuur aan te schaffen en te onderhouden die nodig is voor langzaam invriezen.

Biologische metingen en meta-analyses hebben de vergelijkbaarheid of zelfs voordelen van vitrificatie ten opzichte van langzaam invriezen aangetoond43. Verschillen in resultaten na vitrificatie kunnen echter worden toegeschreven aan het gebrek aan standaardisatie in zowel het vitrificatieapparaat als het protocol, inclusief de gebruikte oplossingen, die variëren tussen onderzoeken. Toekomstig onderzoek zou het potentieel moeten onderzoeken voor follikelkweek van verglaasd/snel opgewarmd weefsel om de groei in vitro te volgen, zoals met succes aangetoond in eierstokweefsel van muizen door verschillende groepen 44,45,46,47,48,49,50.

Samenvattend is vitrificatie van eierstokweefsel een belangrijk alternatief voor het veelgebruikte langzame invriesprotocol, ondersteund door vijf succesvolle bevallingen gerapporteerd door Suzuki51 (Japan), Silber52 (VS) en Sänger53 (Duitsland). In tegenstelling tot in de handel verkrijgbare vitrificatiemedia en kits voor cellen, zijn er weinig door de FDA/CE goedgekeurde systemen voor eierstokweefsel, wat de toepassing ervan in klinische omgevingen kan beperken. Daarom wordt de ontwikkeling van door de FDA/CE goedgekeurde kits en media voor de vitrificatie en snelle opwarming van eierstokweefsel aanbevolen30.

Dankbetuigingen

We danken Cara Färber voor het proeflezen; Katharina Wollersheim, Martin Mahlberg, Lea Korte en Jasmin Rebholz voor hun technische assistentie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.8 mL vialsVWR International GmbH479-6837
10 mL serologische pipetSarstedt86.1254.001
4 wel plateGynemedGYOOPW-FW04
50 mL TubeSarstedt62.559.001
6 wel platenSarstedt83.3920
Bacillol AFHartmann973385
Calcein AMMerck17783
Collageenase type 1AMerckC2674
Cryosure DMSOWAK ChemieWAK-DMSO-10
CustodiolDr. Franz Köhler Chemie00867288
DPBS CTSGibco Life technologiesA12856-01
ErgoOne pipet hulpmiddelStarlabS7166-0010
EthyleenglycolSigma Aldrich102466
Euronda sterilisatiecontainereuronda282021
G-MOPS+Vitrolife10130
Metalen mazenSigma AldrichS0770
Metzenbaum schaarworld precision instruments501262102
N-Bath SystemNterilizerN-Bath 3.0
Polyvinylpyrrolidon (PVP)SAGEART-4005
Serum vervangingssupplement (SSS)Fujifilm Irvine scientific99193
Steriele bekerSarstedt75.562.105
Steriele pincettenCarl RothKL05.1
SucroseMerckS0389

Referenties

  1. Rezazadeh Valojerdi, M., Eftekhari-Yazdi, P., Karimian, L., Hassani, F., Movaghar, B. Vitrification versus slow freezing gives excellent survival, post-warming embryo morphology and pregnancy outcomes for human cleaved embryos. J Assist Reprod Genet. 26 (6), 347-354 (2009).
  2. Levi-Setti, P. E., Patrizio, P., Scaravelli, G. Evolution of human oocyte cryopreservation: Slow freezing versus vitrification. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 2 (6), 445-450 (2016).
  3. Glujovsky, D., et al. Vitrification versus slow freezing for women undergoing oocyte cryopreservation. Cochrane Database Syst Rev. 9, CD010047(2014).
  4. AbdelHafez, F. F., Desai, N., Abou-Setta, A. M., Falcone, T., Goldfarb, J. Slow freezing, vitrification and ultra-rapid freezing of human embryos: A systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online. 20 (2), 209-222 (2010).
  5. Amorim, C. A., Curaba, M., Van Langendonckt, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Vitrification as an alternative means of cryo-preserving ovarian tissue. Reprod Biomed Online. 23, 160-186 (2011).
  6. Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21, 407-426 (1984).
  7. Liebermann, J., et al. Potential importance of vitrification in reproductive medicine. Biol Reprod. 67 (6), 1671-1680 (2002).
  8. Schallmoser, A., et al. Comparison of angiogenic potential in vitrified vs. slow frozen human ovarian tissue. Sci Rep. 13 (1), 12885(2023).
  9. Schallmoser, A., et al. The effect of high-throughput vitrification of human ovarian cortex tissue on follicular viability: A promising alternative to conventional slow freezing. Arch Gynecol Obstet. 307 (2), 591-599 (2023).
  10. Jadoul, P., et al. Efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation: Lessons learned from 545 cases. Hum Reprod. 32 (5), 1046-1054 (2017).
  11. Meirow, D., et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. N Engl J Med. 353, 318-321 (2005).
  12. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106, 467-474 (2016).
  13. Hoekman, E. J., et al. Ovarian tissue cryopreservation: Low usage rates and high live-birth rate after transplantation. Acta Obstet Gynecol Scand. 00, 1-9 (2019).
  14. Rodriguez-Wallberg, K. A., et al. 86 Successful births and 9 ongoing pregnancies worldwide in women transplanted with frozen-thawed ovarian tissue: Focus on birth and perinatal outcome in 40 of these children. J Assist Reprod Genet. 34, 325-336 (2017).
  15. Anderson, R. A., et al. The ESHRE guideline group on female fertility preservation, ESHRE guideline: Female fertility preservation. Hum Reprod Open. 2020 (4), hoaa052(2020).
  16. Shi, Q., Xie, Y., Wang, Y., Li, S. Vitrification versus slow freezing for human ovarian tissue cryopreservation: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 8538(2017).
  17. Keros, V., et al. Vitrification versus controlled rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue. Hum Reprod. 24, 1670-1683 (2009).
  18. Xiao, Z., Wang, Y., Li, L., Luo, S., Li, S. W. Needle immersed vitrification can lower the concentration of cryoprotectant in human ovarian tissue cryopreservation. Fertil Steril. 94, 2323-2328 (2010).
  19. Fabbri, R., et al. Good preservation of stromal cells and no apoptosis in human ovarian tissue after vitrification. Biomed Res Int. 2014, 673537(2014).
  20. Chang, H. J., et al. Optimal condition of vitrification method for cryopreservation of human ovarian cortical tissues. J Obstet Gynaecol Res. 37 (8), 1092-1101 (2011).
  21. Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2020).
  22. Fabbri, R., et al. Morphological, ultrastructural and functional imaging of frozen/thawed and vitrified/warmed human ovarian tissue retrieved from oncological patients. Hum Reprod. 31 (8), 1838-1849 (2023).
  23. Xiao, Z., Wang, Y., Li, L. L., Li, S. W. In vitro culture thawed human ovarian tissue: NIV versus slow freezing method. Cryo Letters. 34 (5), 520-526 (2013).
  24. Locatelli, Y., et al. In vitro survival of follicles in prepubertal ewe ovarian cortex cryopreserved by slow freezing or non-equilibrium vitrification. J Assist Reprod Genet. 36 (9), 1823-1835 (2017).
  25. Nikiforov, D., et al. Innovative multi-protectoral approach increases survival rate after vitrification of ovarian tissue and isolated follicles with improved results in comparison with conventional method. J Ovarian Res. 11 (1), 65(2018).
  26. Wang, T., et al. Human single follicle growth in vitro from cryopreserved ovarian tissue after slow freezing or vitrification. Human Reprod. 31 (4), 763-773 (2016).
  27. Lee, S., et al. Comparison between slow freezing and vitrification for human ovarian tissue cryopreservation and xenotransplantation. Int JMol Sci. 20 (13), 3346(2019).
  28. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  29. Silber, S. J., et al. Cryopreservation and transplantation of ovarian tissue: Results from one center in the USA. J Assist Reprod Genet. 35 (12), 2205-2213 (2018).
  30. Sänger, N., John, J., Einenkel, R., Schallmoser, A. First report on successful delivery after retransplantation of vitrified, rapid warmed ovarian tissue in Europe. Reprod Biomed Online. 49 (1), 103940(2024).
  31. Sugishita, Y., et al. Quantification of residual cryoprotectants and cytotoxicity in thawed bovine ovarian tissues after slow freezing or vitrification. Hum Reprod. 37 (3), 522-533 (2022).
  32. Abir, R., et al. Attempts to improve human ovarian transplantation outcomes of needle-immersed vitrification and slow-freezing by host and graft treatments. J Assist Reprod Genet. 34 (5), 633-644 (2017).
  33. Sänger, N., John, J., Einenkel, R., Schallmoser, A. First report on successful delivery after retransplantation of vitrified, rapid warmed ovarian tissue in Europe. Reprod Biomed. 49 (1), 103940(2024).
  34. Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Arch Gynecol Obstet. 306 (4), 1299-1311 (2022).
  35. Kristensen, S. G., et al. A simple method to quantify follicle survival in cryopreserved human ovarian tissue. Hum Reprod. 33 (12), 2276-2284 (2018).
  36. Mortimer, D. A critical assessment of the impact of the European Union Tissues and Cells Directive (2004) on laboratory practices in assisted conception. Reprod Biomed. 11 (2), 162-176 (2005).
  37. Amorim, C. A., Curaba, M., Van Langendonckt, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Vitrification as an alternative means of cryopreserving ovarian tissue. Reprod Biomed. 23 (2), 160-186 (2011).
  38. Fahy, G. M. Vitrification: A new approach to organ cryopreservation. Transplantation: Approaches to Graft Rejection. Meryman, H. T. , Alan R. Liss. New York, USA. 305-335 (1986).
  39. Kattera, S., Chen, C. Cryopreservation of embryos by vitrification: Current development. Int Surg. 91 (5 Suppl), S55-S62 (2006).
  40. Fuller, B., Paynter, S. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reprod Biomed. 9, 680-691 (2004).
  41. Liebermann, J., et al. Potential importance of vitrification in reproductive medicine. Biol Reprod. 67, 1671-1680 (2002).
  42. Shi, Q., Xie, Y., Wang, Y., Li, S. Vitrification versus slow freezing for human ovarian tissue cryopreservation: a systematic review and meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 8538(2017).
  43. Hasegawa, A., Hamada, Y., Mehandjiev, T., Koyama, K. In vitro growth and maturation as well as fertilization of mouse preantral oocytes from vitrified ovaries. Fertil Steril. 81 (Suppl 1), 824-830 (2004).
  44. Segino, M., et al. In vitro culture of mouse GV oocytes and preantral follicles isolated from ovarian tissues cryopreserved by vitrification. Hum Cell. 16 (3), 109-116 (2003).
  45. Kagawa, N., et al. Production of the first offspring from oocytes derived from fresh and cryopreserved pre-antral follicles of adult mice. Reprod Biomed. 14 (6), 693-699 (2007).
  46. Haidari, K., et al. The effects of different concentrations of leukemia inhibitory factor on the development of isolated preantral follicles from fresh and vitrified mouse ovaries. Iran Biomed J. 10, 4(2006).
  47. Haidari, K., Salehnia, M., Rezazadeh Valojerdi, M. The effect of leukemia inhibitory factor and coculture on the in vitro maturation and ultrastructure of vitrified and nonvitrified isolated mouse preantral follicles. Fertil Steril. 90 (6), 2389-2397 (2008).
  48. Lin, T. C., et al. Comparison of the developmental potential of 2-week-old preantral follicles derived from vitrified ovarian tissue slices, vitrified whole ovaries and vitrified/transplanted newborn mouse ovaries using the metal surface method. BMC Biotechnol. 8, 38(2008).
  49. Wang, X., Catt, S., Pangestu, M., Temple-Smith, P. Live offspring from vitrified blastocysts derived from fresh and cryopreserved ovarian tissue grafts of adult mice. Reproduction. 138 (3), 527-535 (2009).
  50. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  51. Silber, S. J., et al. Cryopreservation and transplantation of ovarian tissue: Results from one center in the USA. J Assist Reprodu Genet. 35 (12), 2205-2213 (2018).
  52. Sänger, N., John, J., Einenkel, R., Schallmoser, A. First report on successful delivery after retransplantation of vitrified, rapid warmed ovarian tissue in Europe. Reprod Biomed. 49 (1), 103940(2024).
  53. Parmegiani, L., et al. Testing the efficacy and efficiency of a single "universal warming protocol" for vitrified human embryos: prospective randomized controlled trial and retrospective longitudinal cohort study. J Assist Reprod Gen. 35 (10), 1887-1895 (2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vitrificatie van eiersteweefselbehoud van fertiliteitcryopreservatieprotocolsnelle opwarmingvitrificatie met metalen roosterfolliculaire levensvatbaarheidcalce nekleuringfluorescentiemicroscopielangzame invriezing

Gerelateerde artikelen