Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ingebedde bioprinting van weefselachtige structuren met behulp van κ-carrageen sub-microgelmedium

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66806

⸱

3 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie introduceert een nieuw κ-carrageen sub-microgel suspensiebad, dat opmerkelijke omkeerbare jamming-unjamming overgangseigenschappen vertoont. Deze eigenschappen dragen bij aan de opbouw van biomimetische weefsels en organen in ingebedde 3D-bioprinting. Het succesvol printen van hart-/slokdarmachtige weefsels met hoge resolutie en celgroei demonstreert hoogwaardige bioprinting- en tissue engineering-toepassingen.

Samenvatting

Ingebed driedimensionaal (3D) bioprinten met behulp van een korrelig hydrogel-ondersteunend bad is naar voren gekomen als een cruciale techniek voor het maken van biomimetische steigers. Het ontwikkelen van een geschikt gelsuspensiemedium dat een evenwicht vindt tussen nauwkeurige afzetting van bio-inkt en de levensvatbaarheid en functie van de cel, brengt echter meerdere uitdagingen met zich mee, met name bij het bereiken van de gewenste visco-elastische eigenschappen. Hier wordt een nieuw κ-carrageengel ondersteunend bad vervaardigd door middel van een eenvoudig te bedienen mechanisch maalproces, waarbij homogene deeltjes op submicroschaal worden geproduceerd. Deze sub-microgels vertonen typisch Bingham-stromingsgedrag met een kleine vloeigrens en snelle afschuifverdunnende eigenschappen, die de soepele afzetting van bioinks vergemakkelijken. Bovendien zorgen de omkeerbare gel-sol-overgang en het zelfherstellende vermogen van het κ-carrageen-microgelnetwerk voor de structurele integriteit van geprinte constructies, waardoor complexe, meerlagige weefselstructuren met gedefinieerde architecturale kenmerken kunnen worden gecreëerd. Na het printen kunnen de κ-carrageen sub-microgels gemakkelijk worden verwijderd door een eenvoudige fosfaatgebufferde zoutoplossing. Verdere bioprinting met met cellen beladen bioinks toont aan dat cellen binnen de biomimetische constructen een hoge levensvatbaarheid van 92% hebben en pseudopodia snel uitbreiden, evenals robuuste proliferatie behouden, wat het potentieel van deze bioprintstrategie voor weefsel- en orgaanfabricage aangeeft. Samenvattend komt dit nieuwe κ-carrageen sub-microgel-medium naar voren als een veelbelovende weg voor ingebedde bioprinting van uitzonderlijke kwaliteit, met ingrijpende implicaties voor de in vitro ontwikkeling van gemanipuleerde weefsels en organen.

Inleiding

Weefselmanipulatiesteigers, waaronder elektrogesponnen vezels, poreuze sponzen en polymeerhydrogels, spelen een cruciale rol bij het herstel en de reconstructie van beschadigde weefsels en organen door een structureel kader te bieden dat celgroei, weefselregeneratie en het herstel van de orgaanfunctieondersteunt1,2,3. Traditionele steigers ondervinden echter uitdagingen bij het nauwkeurig repliceren van inheemse weefselstructuren, wat leidt tot een mismatch tussen de gemanipuleerde en natuurlijke weefsels. Deze beperking belemmert de efficiënte genezing van defecte weefsels, wat de dringende noodzaak benadrukt van vooruitgang in het steigerontwerp om een nauwkeurigere biomimicry te bereiken. Driedimensionaal (3D) bioprinten is een innovatieve productietechniek die complexe biologische weefselstructuren laag voor laag nauwkeurig construeert met behulp van biomateriaalinkten en cellen4. Onder de verschillende biomaterialen komen polymeerhydrogels naar voren als ideale bioinks met hun onderscheidende netwerk dat in situ inkapseling van cellen vergemakkelijkt en hun groei cruciaal ondersteunt 5,6. Desalniettemin hebben veel zachte en sterk gehydrateerde hydrogels de neiging om tijdens het printproces vervaging of snelle ineenstorting van geprinte steigerstructuren te veroorzaken wanneer ze als bio-inkten worden gebruikt. Om deze uitdaging aan te gaan, maakt ingebedde 3D-bioprinttechnologie gebruik van een microgelbad als ondersteunend materiaal, waardoor nauwkeurige afzetting van zachte bioinkt mogelijk is. Na gelering van de hydrogel-bioinks worden verfijnde bionische steigers met ingewikkelde structuren verkregen door het microgelbad te verwijderen. Materialen zoals gelatine 7,8, agarose9 en gellangom10,11 zijn gebruikt om microgelbaden te maken voor ingebedde 3D-bioprinten, waardoor de toepassing van zachte hydrogels in weefselmanipulatie aanzienlijk wordt bevorderd. Het micronniveau en de niet-uniforme deeltjesgrootte van deze deeltjesgels hebben echter een nadelige invloed op de resolutie en getrouwheid van 3D-printen 12,13,14. Er is dringend behoefte aan het fabriceren van een gelachtige suspensiedrijver met kleine en gelijkmatig verspreide deeltjes, die voordelen biedt bij het bereiken van high-fidelity bioprinting.

In dit protocol wordt een nieuw opofferingsgranulaat κ-carrageen suspensiebad met een uniform submicronniveau gepresenteerd voor ingebed 3D-printen. Dit innovatieve sub-microgelbadgedrag van snelle overgang van vastlopen naar vastlopen vergemakkelijkt de nauwkeurige fabricage van biomimetische hydrogelsteigers met een hoge structurele getrouwheid15. Met behulp van dit nieuwe suspensiemedium wordt met succes een reeks biomimetische weefsel- en orgaanconstructies met meerlaagse weefselstructuren geprint, waarbij gebruik wordt gemaakt van een samengestelde bioink bestaande uit gelatinemethacrylaat en zijdefibromethacrylaat. In deze studie kozen we de slokdarm als het 3D-bioprintende biomimetische object, voornamelijk omdat de slokdarm niet alleen een meerlagige weefselstructuur heeft, maar ook omdat de spierlaag een interne cirkelvormige en externe longitudinale complexe gelaagdheidsstructuur vertoont. Zorgen voor een goede uitlijning en organisatie van deze lagen is essentieel voor functionele weefselregeneratie. Daarom willen we de meerlagige architectuur van de slokdarm nabootsen. Wat nog belangrijker is, we gebruikten κ-carrageen sub-microgels als het suspensiebad en GelMA/SFMA als de bioink om een biomimetische steiger voor weefselmanipulatie te ontwerpen en te bouwen. De geprinte slokdarm kan gemakkelijk worden losgelaten door herhaaldelijk met fosfaat gebufferde zoutoplossing te wassen. Bovendien is het κ-carrageen sub-microgelbad vrij van cytotoxische stoffen, wat zorgt voor een hoge cytocompatibiliteit15. De gladde spiercellen die in anisotrope steigers zijn geladen, vertonen een opmerkelijke verspreidende activiteit. Dit uniforme sub-microgel suspensiemedium biedt een nieuwe weg voor de fabricage van complexe weefsels en organen door middel van ingebed 3D-bioprinten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van het κ-carrageen sub-microgel suspensiebad

  1. Bereid 500 ml κ-carrageen suspensiebad (0,35% gew./vol) door 1,75 g κ-carrageenpoeder toe te voegen aan 500 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) in een glazen fles van 1.000 ml.
  2. Steek een magnetische roerstaaf van 70 mm in de glazen fles om het waterige mengsel te roeren. Draai de dop van de glazen fles vast en draai deze vervolgens een halve slag los.
  3. Plaats de glazen fles in een waterbad van 70 °C en verwarm deze. Zet de magnetische roerder aan met een snelheid van 300 tpm, plaats de fles en roer tot het polymeer volledig is opgelost.
  4. Neem een andere glazen fles en plaats deze in een autoclaaf voor sterilisatie, draaiend op 121 °C gedurende 30 minuten.
  5. Nadat de hogedruksterilisator is afgekoeld tot 80 °C, haalt u de fles uit de sterilisator en brengt u deze over naar de ultraschone werkbank voor verdere behandeling.
  6. Filtreer de volledig opgeloste κ-carrageenoplossing in de gesteriliseerde glazen fles met behulp van een filter van 0,22 μm.
    OPMERKING: Voer de filtratie snel uit terwijl de oplossing heet is om te voorkomen dat het κ-carrageen afkoelt en het filter verstopt.
  7. Bewaar de κ-carrageenoplossing gedurende 12 uur bij 4 °C om een kation-verknoopte gelering te induceren.
  8. Maal de κ-carrageenhydrogels mechanisch met behulp van een magnetische roerder van 60 mm met een roersnelheid van 1200 tpm bij 25 °C totdat ze met succes zijn omgezet in een vloeibare toestand, wat ongeveer 60 minuten duurt.
    OPMERKING: Bewaar de κ-carrageenhydrogels tussen 25-37 °C om gelering bij lage temperaturen of oplossen bij hoge temperaturen te voorkomen.

2. Bereiding van gelatinemethacrylaat/zijdefibroïnemethacrylaat samengestelde bioinks

  1. Bereid samengestelde bio-inkten door 10% (gew./vol) gelatinemethacrylaat (GelMA) en 6% (gew./vol) zijdefibroïnemethacrylaat (SFMA) te combineren in PBS-oplossing (pH 7,4). Weeg 2,0 g GelMA en 1,2 g SFMA-poeders afzonderlijk af.
  2. Voeg de poeders langzaam toe aan twee centrifugebuisjes van 50 ml. Voeg 10 ml PBS-oplossing apart toe aan de centrifugebuisjes van 50 ml.
  3. Voeg aan elk een magnetische roerder van 10 mm toe en roer en verwarm voortdurend in een waterbad van 45 °C. Laat de GelMA- en SFMA-poeders volledig oplossen en neem ongeveer 30 minuten in beslag.
  4. Meng de GelMA- en SFMA-oplossingen in een gelijk volume onder continu roeren bij 45 °C. Filtreer de composiet bioinkten met behulp van een filter met een poriegrootte van 100 μm.
  5. Steriliseer de composiet GelMA/SFMA-bioinkten door middel van UV-bestraling in een bioveiligheidskast gedurende 12 uur.
    OPMERKING: Bereid de bio-inkten voor en gebruik ze onmiddellijk om voortijdige gelatie van de SFMA door zelfassemblage te voorkomen.

3. Reologische karakterisering van het κ-carrageen sub-microgel suspensiebad

  1. Opstarten en voorbereiden van reologiegerelateerde apparatuur.
    1. Schakel de luchtcompressor 30 minuten in en zorg ervoor dat de druk 30 psi bereikt. Verwijder de lagerklem door de trekstang tegen de klok in te draaien. Bevestig het zwarte deksel eronder en draai de knopas aan de bovenkant van het instrument met de klok mee.
    2. Schakel de reometer in en laat deze initialiseren. Zet de circulatiewaterschakelaar aan en laat de temperatuur oplopen tot 15 °C.
    3. Open de besturingssoftware van de reometer om de online verbinding tot stand te brengen.
  2. Kalibreer de reometer en installeer de parallelle plaatgeometrie.
    1. Voer instrumentkalibratie uit in de besturingssoftware, wat voornamelijk het aanpassen van het traagheidspad van het kalibratie-instrument inhoudt. Monteer een parallelle plaatgeometrie met een diameter van 40 mm op het uiteinde van de trekstang. Houd de vergrendelknop 3 s ingedrukt om de motoras naar de uitgangspositie te verplaatsen voor een consistente plaatsing van de geometrie.
    2. Selecteer de Calibrate Manager in de besturingssoftware en klik vervolgens op de Traagheids-, Wrijvingskalibratie - en Rotatiemapping om de parallelle plaatgeometrie te kalibreren.
  3. Zet de spleethoogte van de reometer op nul door een standaard procedure voor het op nul stellen van de spleet uit te voeren om een nauwkeurige meting te garanderen.
  4. Stel de experimentele stappen in, waaronder een stroomhelling van 0,01 tot 1000 1/s afschuifsnelheid, een amplitude-sweep van 0,1% tot 100% rek bij 10 rad/s, een meerstaps oscillatietijdsweep van 60 s met afwisselende spanningen van 1% en 100% bij 10 rad/s, en een meerstaps Peak Hold-sweep van 120 s met afwisselende afschuifsnelheid van 0,1 1/s en 10 1/s.
  5. Breng 2 ml 0,35% κ-carrageen suspensies aan op de Peltier-plaat van de reometer.
  6. Plaats de geometriespleet op 510 μm en verwijder eventuele overtollige overloop aan de rand van de clamp apparaat. Stel de monsterspleet in op 500 μm om het monster iets voorbij de klemrand te laten uitsteken.
  7. Voer een stromingsexperiment uit door de stroomhelling te selecteren uit de experimentele ontwerpopties.
    1. Kies de Flow Ramp-test in het experimentele ontwerp. Stel de afschuifsnelheden in van 0,001 tot 10 1/s bij een temperatuur van 25 °C.
    2. Voer stap 3.5 en het Flow Ramp-experiment uit op het toegevoegde monster.
  8. Voer een cyclische Peak Hold-test uit om de herstelprestaties van het materiaal te beoordelen.
    1. Kies Peak Hold sweep in het experimentele ontwerp en stel 5 opeenvolgende experimenten in met een tijd van 120 s bij 25 °C.
    2. Stel de afschuifsnelheid in op 0.01 1/s voor de eerste, derde en vijfde stappen en op 10 1/s voor de tweede en vierde stap.
    3. Voeg een nieuw monster van 2 ml toe. Voer stap 3.5 en de cyclische hersteltest uit.
  9. Voer een visco-elasticiteitsanalyse uit om de mogelijke gel-sol-overgang van het κ-carrageen suspensiebad te evalueren.
    1. Kies de Amplitude Sweep-test in experimenteel ontwerp. Stel de oscillatierek in van 0,1% tot 100% bij een temperatuur van 25 °C. Klik op Start om het experiment Amplitude Sweep uit te voeren op het toegevoegde voorbeeld.
  10. Voer een alternatieve rekanalyse uit om de elastische herstelprestaties van het materiaal te beoordelen.
    1. Kies Oscillation Time Sweep in het experimentele ontwerp en stel 5 opeenvolgende experimenten in met een tijd van 60 s bij 25 °C.
    2. Stel de spanning in op 1% voor de eerste, derde en vijfde stap en op 100% voor de tweede en vierde stap.
    3. Voeg een nieuw monster van 2 ml toe. Voer stap 3.5 en de continue cyclische hersteltest uit.
      OPMERKING: Reinig de geometrieplaat en de Peltier-plaat na elke experimenttest en voeg een nieuw monster van 2 ml toe.

4. Biomimetische hydrogelsteigers printen met behulp van een op maat ontworpen micro-extrusie bioprinter

  1. Ontwerp kubussen in STL-formaat met behulp van grafische 3D-software en download weefselachtige modellen uit de 3D-database (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).
    1. Importeer de modellen in STL-formaat in de Pango-software en voer de afdrukparameters in. Stel de specifieke X-, Y- en Z-coördinaten van het model in de 3D-ruimte in, voer de verwachte schaalgrootte van het model in millimeters (mm) in, pas de grootte en schaalverhouding van het object op de X-, Y- en Z-assen aan en pas de rotatiehoek van het model in de ruimte indien nodig aan.
    2. Voer de geschatte filamentdiameter in (meestal ongeveer 200-500 μm voor de meeste bio-inkten) in het laagdikteveld om de dikte van de Z-as van elke laag te bepalen. Stel de afdruksnelheid in op basis van de verwachte lijndikte (ongeveer 10-90 mm/s) en stel de vuldichtheid in op 30%-80%.
    3. Exporteer de uiteindelijke parameters als G-code naar een SD-kaart.
  2. Laat de bioprinter en de micro-extrusiepomp draaien.
    1. Schakel de micro-extrusiepompcontroller in, selecteer de bijbehorende volumespuit (5 ml) en stel de extrusiesnelheid in op 0,08 ml/min en de duur van de extrusie in coördinatie met de gewenste printtijd die wordt verkregen door het hydrogelvolume te delen door de extrusiesnelheid.
    2. Plaats de spuit met een naald met een binnendiameter van 210 μm in de spuitsleuf van de bioprinter.
    3. Stel de spuitcontroller af om ervoor te zorgen dat de zuiger van de spuit nauw contact maakt met de schroef.
    4. Plaats 3 ml suspensiebad in een celkweekschaaltje van 35 mm. Plaats de schotel op het platform op basis van de code-instellingen en controleer of de printkop zich 1 mm boven de bodem van de schotel bevindt.
      NOTITIE: Voer een pre-test uit om de nauwkeurigheid van de schotelposities op het afdrukplatform tijdens het afdrukken te garanderen.
    5. Plaats de SD-kaart met de code in de 3D-bioprinter, activeer het codebestand, start de bioprinter en klik op de Start-knop op de controller.
  3. Verwerking van de constructies
    1. Stel de geprinte constructie gedurende 1 minuut bloot aan blauw licht van 405 nm om photocrosslinking te starten.
    2. Verwijder de κ-carrageengel met behulp van een pipet van 1 ml, gevolgd door de toevoeging van 3 ml PBS (pH 7,4) voor het wassen en vervolgens verwijderen. Herhaal dit proces voor grondig wassen.
      NOTITIE: Voer het wasproces voorzichtig uit om beschadiging van de geprinte constructies te voorkomen.

5. Ingebedde 3D-bioprinting van analogen van de slokdarmspierlaag

  1. Kweek konijn slokdarm gladde spiercellen (eSMC's).
    1. Start de kweek in T75-kolven met 2 x 106 cellen met behulp van 15 ml DMEM-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine.
    2. Houd de eSMC's op 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht totdat ze 80% samenvloeiing bereiken.
  2. Bereiding van bioink van de slokdarmspierlaag
    1. Zuig het medium op bij het bereiken van confluentie en was de eSMC's met 5 ml 1x PBS.
    2. Voeg 2 ml 0,2% trypsine-EDTA toe aan de kolf en incubeer gedurende 2 minuten om de cellen te verteren. Tik op de kolf om de cellen los te maken van de wand.
    3. Beëindig de spijsvertering door 2 ml DMEM toe te voegen en de celsuspensie over te brengen in een centrifugebuis van 15 ml. Meet de celdichtheid met behulp van een cellenteller met 10 μL celsuspensie.
    4. Centrifugeer bij 675 x g gedurende 3 minuten, zuig het supernatans voorzichtig op en resuspendeer de celpellet in de samengestelde GelMA/SFMA-bioinkten (zoals bereid in stap 2.1). Pas de uiteindelijke celconcentratie aan om een dichtheid van 10 x 106 cellen/ml in de bioink te bereiken, waardoor de omstandigheden voor latere 3D-bioprinttoepassingen worden geoptimaliseerd.
  3. Voorbereiding van de 3D-bioprinter en bijbehorende materialen
    1. Autoclaaf de essentiële printinstrumenten, waaronder spuitnaalden, een tang, een magnetische roerder en een fles van 1000 ml silicaatglas, onder standaard sterilisatieomstandigheden (121 °C gedurende 30 minuten) om een aseptische omgeving voor het printproces te garanderen.
    2. Plaats de bioprinter in een bioveiligheidskast en steriliseer deze gedurende 30 minuten met ultraviolet (UV) licht om de steriliteit te behouden.
    3. Bereid 50 ml steriel κ-carrageen en 5 ml steriele GelMA/SFMA-composietbioinks, zoals beschreven in respectievelijk stap 1 en stap 2.
    4. Ontwerp het model, stel de gewenste parameters in en bereid de bioprinter voor zoals beschreven in stap 4.1.
  4. Start van het bioprintproces
    1. Voer de procedures uit die worden beschreven in stap 4.2 en 4.3 om de 3D-slokdarmspierlaag te bioprinten, gevolgd door PBS-wassen en -vervanging.
    2. Voer tijdens het printproces celprinten uit met steriele technieken om het risico op celbesmetting in de geprinte structuur te minimaliseren.
  5. Vervanging van het celkweekmedium na het printen
    1. Zuig de PBS voorzichtig op en vervang deze door 3 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine. Zorg ervoor dat de geprinte constructies volledig zijn ondergedompeld om optimale celgroeiomstandigheden te bieden.
    2. Incubeer het celkweekschaaltje met de geprinte constructen in een incubator op 37 °C met 5% CO2 . Vervang het celkweekmedium dagelijks door vers medium, gebruik elke keer 3 ml en controleer de toestand van de cellen in de constructen met behulp van lichtmicroscopie.

6. Evaluatie van de levensvatbaarheid van eSMC's binnen de geprinte constructen via Live/Dead assay-kleuring

  1. Verwijder het celkweekmedium na 5 uur incubatie en was de met cellen beladen constructies met PBS.
  2. Voeg 2 ml van de standaard calceïne-AM/propidiumjodide-oplossing (1:1000) toe aan de geprinte celbeladen constructies en incubeer.
  3. Was de constructen 3x met PBS na een incubatie van 45 minuten en voeg dan vers celkweekmedium toe.
  4. Observeer levende en dode cellen en leg fluorescerende beelden vast met behulp van confocale laserscanmicroscopie (CLSM).

7. Observatie van de eSMC's in de geprinte constructen via FITC-Phalloidine/DAPI-kleuring

  1. Kleuring van de geprinte constructies met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) gelabeld falloidine (groen) voor F-actine en 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, blauw) voor nucleair na 5 dagen incubatie.
  2. Voorbereiding van de fixatievloeistof
    1. Combineer 4 ml 1x PBS met 0,16 ml paraformaldehyde (PFA) in een tube van 5 ml polyethyleen (PE) en bereik een eindconcentratie van 4%.
    2. Plaats het kweekschaaltje met de biogeprinte constructies op een schone ondergrond. Verwijder het medium en bedek de constructies voorzichtig met de PFA-oplossing, zorg ervoor dat ze volledig worden ondergedompeld. Laat de fixatie 20 minuten op kamertemperatuur plaatsvinden voordat u de oplossing weggooit.
      OPMERKING: Ga voorzichtig om met vloeistoffen tijdens het toevoeg- en verwijderingsproces om de structurele integriteit van de biogeprinte constructies te behouden.
    3. Breng 2,5 ml 1x PBS in de kweekschaal en dompel de constructies volledig onder om eventuele resterende kleuringsreagentia te verwijderen.
  3. Permeabilisatie van het celmembraan
    1. Formuleer een 0,5% Triton X-100 oplossing door 20 μL Triton X-100 toe te voegen aan 4 ml 1x PBS in een 5 ml PE-buis.
    2. Dien de Triton X-100-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur toe aan de constructies om de celmembranen te doordringen en verwijder vervolgens de oplossing.
    3. Breng 2,5 ml 1x PBS in de kweekschaal en dompel de constructies volledig onder om eventuele resterende kleuringsreagentia te verwijderen.
  4. Niet-specifieke binding blokkeren
    1. Maak een 3% runderserumalbumine (BSA) blokkerende oplossing in een PE-buis van 5 ml door 0,12 ml BSA toe te voegen aan 4 ml 1x PBS.
    2. Introduceer de BSA-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de constructies om niet-specifieke locaties te blokkeren en gooi de oplossing vervolgens weg.
  5. Actine-kleuring met FITC-falloidine
    1. Bereid 0,2% FITC-falloidine-oplossing in een PE-tube van 5 ml met 4 ml 1x PBS en 8 μl kleuringsreagens.
    2. Dompel de constructies 60 minuten onder in deze oplossing bij kamertemperatuur in het donker en gooi de oplossing vervolgens weg.
    3. Voeg 2,5 ml 1x PBS toe aan de kweekschaal en dompel de constructies volledig onder om resterende kleuringsreagentia te verwijderen.
  6. Nucleaire kleuring met DAPI
    1. Breng 4 ml DAPI-kleuringsoplossing aan op de constructies en zorg voor volledige dekking.
    2. Incubeer 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur voordat u de DAPI-oplossing verwijdert.
  7. Eindwas en PBS-onderdompeling: Voeg 2,5 ml 1x PBS toe aan de kweekschaal en dompel de constructies volledig onder om resterende kleuringsreagentia te verwijderen.
    OPMERKING: Bereid kleuroplossingen van tevoren voor en behandel ze voorzichtig. Op geen enkel moment mogen de cellen uitdroging ondergaan in het kweekvat.
  8. Observeer met een confocale microscoop: Inspecteer en beeld de gekleurde constructies met behulp van confocale microscopie om de celgroei te evalueren en zorg voor uitgebreide documentatie van de resultaten.

8. Evaluatie van de proliferatie van eSMC's binnen de geprinte constructen met behulp van de CCK-8-test

  1. Verwijder op dag 7 en 14 het kweekmedium van de constructies. Was de constructies met PBS om het resterende medium en de losgeraakte cellen te verwijderen.
  2. Voeg CCK-8-oplossing toe aan elke constructie volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat het volume van de CCK-8-oplossing voldoende is om elke constructie volledig te bedekken.
  3. Incubeer de constructen met de CCK-8-oplossing bij 37 °C gedurende 2 uur. Breng het supernatans na incubatie voorzichtig over naar een nieuwe plaat met 96 putjes.
  4. Meet de absorptie bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het korrelige κ-carrageengelbad werd gegenereerd door de bulkhydrogels mechanisch af te breken tot een deeltjesvormige gelslurry. De meest recente studie toonde aan dat de κ-carrageendeeltjes een gemiddelde diameter vertoonden van ongeveer 642 ± 65 nm met uniforme morfologieën bij 1000 tpm mechanische menging15, aanzienlijk kleiner dan de afmetingen van microgels die eerder in de literatuur werden gerapporteerd 16,17,18

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De bereiding van κ-carrageen sub-microgel suspensiebaden voor gebruik bij bioprinting is een zorgvuldig georkestreerd proces dat verschillende kritieke stappen omvat om ervoor te zorgen dat het resulterende medium de gewenste eigenschappen vertoont voor het ondersteunen van bio-inkten. In eerste instantie wordt een κ-carrageenoplossing bereid door het κ-carrageenpoeder op te lossen in gedeïoniseerd water bij verhoogde temperaturen, waardoor een homogeen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen financieel belang bij de producten die in dit manuscript worden beschreven.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door Ningbo Natural Science Foundation (2022J121, 2023J159), Key project of Natural Science Foundation of Ningbo City (2021J256), Open Foundation of the State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers (Fudan University) (K2024-35) en Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotische Diseases van de provincie Zhejiang, China (2022E10026). Bedankt voor de technische ondersteuning door het Core Facilities, Health Science Center van Ningbo University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3D bioprinterOp maat ontworpen
4’,6-Diamidino-2-FenylindoleSolarbio Life ScienceC0065Klaar voor gebruik
405 nm UV lichtEFLXY-WJ01
CeltellerCorningCyto smart 6749
Confocale laserscanningmicroscoopLeicaSTELLARIS 5
DMEM hoge glucoseVivaCellC3113-0500Hoge glucose, met natriumpyruvaat en L-Glutamine
Dynamische rotatie-reometerTA InstrumentDiscovery HR-20
Spiercellen uit slokdarmGeleverd door het Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo UniversityPrimaire cellen uit het konijnenslokdarm
Foetaal runder serumUEF9070L
Fluoresceïne isothiocyanaatphalloïdineSolarbio Life ScienceCA1610300T
Gelatine metacrylateEFLEFL-GM-6060% substitutie
k-carrageenanAladdinC121013-100gReagenskwaliteit
Lithium Fenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) fosfinaatAladdinL157759-1g365~405 nm
Live-Dead kitbeyotimeC2015M
MicroplaatlezerPotenovPT-3502B
ParaformaldehydeSolarbio Life ScienceP1110 4%
Penicilline/streptomycineSolarbio Life ScienceMA0110100 ´
Fosfaat gebufferde zoutoplossingVivaCellC3580-0500pH 7.2-7.4
Zijde fibroïne metacrylateEFLEFL-SilMA-00139% substitutie
Triton X-100Solarbio Life ScienceT8200
Trypsine-EDTAVivaCellC100C10.25%, zonder fenolrood

Referenties

  1. Xu, X., et al. Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration. J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).
  2. Amann, E., et al. A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells. Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692(2021).
  3. Afjoul, H., et al. Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study. Mater Sci Eng C. 113, 110957(2020).
  4. Hasanzadeh, R., et al. Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing. Chem Eng J. 476, 146616(2023).
  5. Fu, L., et al. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).
  6. Bertsch, P., et al. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
  7. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  8. Wang, S., et al. 3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites. Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004(2023).
  9. Sreepadmanabh, M., et al. Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting. Biomed Mater. 18 (4), 045011(2023).
  10. Zeng, J., et al. Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing. Biofabrication. 15 (3), 035013(2023).
  11. Terpstra, M. L., et al. Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs. Biofabrication. 14 (3), 034104(2022).
  12. Compaan, A. M., et al. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  13. Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects. ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).
  14. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573(2020).
  15. Zhang, H., et al. Cation-crosslinked κ-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting. Biofabrication. 16, 025009(2024).
  16. Lee, A., et al. 3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  17. Yao, J., et al. Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Mater Today Bio. 25, 100947(2024).
  18. Senior, J. J., et al. Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting. J Vis Exp. (195), e64458(2023).
  19. Roche, C. D., et al. durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels. Front Bioeng Biotech. 9, 63657(2021).
  20. Wang, D., et al. Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels. Sci Adv. 8 (43), eabq6900 (2022).
  21. Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues. Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Kappa-carrageen microgels3D-bioprintenweefseltechnologiegranulaire hydrogelbadbio-inktdepositiemechanisch malencelbevatte bio-inktenfotochemische crosslinking
Ingebedde bioprinting van weefselachtige structuren met behulp van κ-carrageen sub-microgelmedium
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.