Method Article

Pijplijn voor driedimensionale anatomische studie op meerdere schaal van het menselijk hart

DOI:

10.3791/66817

⸱

June 28th, 2024

 ,  ,  , 
1University of California Los Angeles (UCLA) Cardiac Arrhythmia Center, UCLA Health System, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Neurocardiology Program of Excellence, UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een uitgebreide pijplijn voor het analyseren van monsters die zijn verkregen uit menselijke harten die de microscopische en macroscopische schaal overspannen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gedetailleerde studie van niet-falende menselijke harten die zijn afgestoten voor transplantatie biedt een unieke kans om structurele analyses uit te voeren op microscopische en macroscopische schalen. Deze technieken omvatten weefselopruiming (driedimensionale (3D) beeldvorming met gemodificeerde immunolabeling van met oplosmiddel vrijgemaakte organen) en immunohistochemische kleuring. Mesoscopische onderzoeksprocedures omvatten stereoscopische dissectie en micro-computed tomographic (CT) scanning. Macroscopische onderzoeksprocedures omvatten grove dissectie, fotografie (inclusief anagliefen en fotogrammetrie), CT en 3D-printen van het fysiek of virtueel ontlede of hele hart. Voorafgaand aan macroscopisch onderzoek kan drukperfusiefixatie worden uitgevoerd om de 3D-architectuur en fysiologisch relevante morfologie van het hart te behouden. De toepassing van deze technieken in combinatie om het menselijk hart te bestuderen is uniek en cruciaal voor het begrijpen van de relatie tussen verschillende anatomische kenmerken zoals coronaire vasculatuur en myocardinnervatie in de context van de 3D-architectuur van het hart. Dit protocol beschrijft de methodologieën in detail en bevat representatieve resultaten om de vooruitgang in het onderzoek naar de menselijke cardiale anatomie te illustreren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangezien functie vorm volgt, is het begrijpen van de architectuur van het hart van fundamenteel belang voor de waardering van zijn fysiologie. Hoewel talrijke onderzoeken cardiale anatomie van micro- tot macroschaal 1,2,3 hebben aangetoond, blijven meerdere vragen onopgelost, vooral die met betrekking tot de menselijke cardiale anatomie. Dit komt deels omdat basisstudies die zich richten op functionele anatomie over het algemeen dierlijke harten 4,5,6 gebruikten, die vaak verschillen van menselijke harten 1,7,8. Bovendien heeft elke individuele studie, zelfs die waarbij gebruik wordt gemaakt van menselijke hartmonsters, de neiging zich te concentreren op zeer specifieke structuren, wat het moeilijk maakt om de bevindingen toe te passen in de context van het hele hart. Dit is nog meer het geval als de gefocusseerde structuren zich op micro- of mesoschaal bevinden, zoals de perinexus9 en ganglionated plexussen10.

In deze context biedt systemische structurele studie van het menselijk hart dat is afgewezen voor transplantatie een unieke en zeldzame kans om een uitgebreide atlas te verkrijgen van hartstructuren die in focus zijn op microscopische en macroscopische schalen11. Microscopische onderzoeksprotocollen omvatten weefselopruiming (gemodificeerde driedimensionale (3D) beeldvorming op basis van immunolabeling van met oplosmiddel vrijgemaakte organen, iDISCO+)12,13 en immunohistochemische kleuring. Mesoscopische onderzoeksprotocollen omvatten stereoscopische dissectie, macrofotografie en micro-computertomografisch (CT) scannen. Macroscopische onderzoeksprotocollen omvatten grove dissectie14, fotografie (inclusief anagliefen en fotogrammetrie)15,16,17, CT, virtuele dissectie18 en 3D-printen van het fysiek of virtueel ontleedde of hele hart17. Ter voorbereiding op macroscopisch onderzoek wordt drukperfusiefixatie uitgevoerd om de 3D-architectuur en fysiologisch relevante morfologie van het hart te behouden 14,19,20,21. De gecombineerde toepassing van deze technieken is uniek en cruciaal om verschillende anatomische kenmerken te correleren in de context van de 3D-architectuur van het menselijk hart.

Aangezien de mogelijkheid om een niet-pathologisch menselijk hartmonster te verkrijgen uiterst beperkt is, maximaliseert een hierin beschreven benadering op meerdere schalen het gebruik van het monster. Door verschillende procedures toe te passen die hieronder worden beschreven, zullen representatieve resultaten de lezer illustreren hoe de bevindingen voor meerdere doeleinden kunnen worden gebruikt, waaronder ontdekking in wetenschappelijk onderzoek11 (uitgebreide analyses van cardiale innervatie, distributie van ganglionated plexussen), verbetering van klinische procedures (simulatie voor chirurgische en interventionele benaderingen) en anatomisch onderwijs (echte 3D-demonstratie van cardiale anatomie).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie maakte gebruik van geanonimiseerde weefselmonsters die waren verzameld uit niet-falende menselijke donorharten en werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de University of California, Los Angeles (UCLA). Er werden monsters genomen van niet-falende harten die werden afgewezen voor transplantatie. De harten werden onder druk doorbloed, gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) en in beeld gebracht vóór weefselverwerking volgens de volgende methoden. Figuur 1 geeft een samenvatting van het stroomschema van de volgorde van het onderzoek. De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Onderzoek op microschaal

  1. Weefselopruiming met behulp van gemodificeerd immunolabeling-enabled 3D-beeldvorming van met oplosmiddel vrijgemaakte organen (iDISCO+) protocol.
    1. Ontleed 4% PFA-gefixeerd weefsel met een scalpel zodat het in de kamer van 3 mm × 16 mm × 25 mm past voor confocale microscopie. Om dikkere weefsels in beeld te brengen, kunnen extra kamers en/of afstandhouders op het objectglaasje worden gestapeld.
    2. Dehydrateer monsters met behulp van gesorteerde methanol (MeOH)-reeksen (20%, 40%, 60%, 80% en 100% MeOH in gedeïoniseerd H2O [vol/vol]) gedurende 1 uur elk bij kamertemperatuur (RT) met agitatie.
    3. Wassen met 100% MeOH gedurende 1 uur bij RT en onderdompelen in 66% dichloormethaan/33% MeOH bij RT met agitatie 's nachts.
    4. De volgende dag tweemaal wassen in MeOH (100%) gedurende 1 uur bij RT, afkoelen bij 4 °C en behandelen met 5% H2O2 in MeOH (vol/vol) 's nachts bij 4 °C.
    5. Rehydrateer met graduele MeOH-series (80%, 60%, 40% en 20% MeOH) en was in 0,01 mol/L PBS gedurende 1 uur elk bij RT met agitatie.
    6. Was de tissues tweemaal in 0,01 mol/L PBS met 0,2% Triton X-100 gedurende 1 uur bij RT.
    7. Bereid u voor op immunolabeling door permeabilisatie in 0,01 mol/L PBS, 20% dimethylsulfoxide (DMSO), 0,2% Triton X-100 en 0,3 mol/L glycine gedurende 2 dagen bij 37 °C met roeren.
    8. Blokkeer in 0,01 mol/L PBS met 10% DMSO, 0,2% Triton X-100 en 5% normaal ezelserum gedurende nog 2 dagen bij 37 °C met agitatie.
    9. Etiket met een primair antilichaam dat compatibel is met MeOH geconjugeerd aan fluoroforen verdund in 0,01 mol/L PBS met 10 mg/ml heparine (PTwH), 0,2% Tween-20, 5% DMSO en 3% normaal ezelserum gedurende 3-4 dagen bij 37 °C met agitatie.
    10. Vul de antilichaamoplossing aan en incubeer nog 3-4 dagen bij 37 °C met agitatie.
    11. Na 1 week incubatie in primaire antilichaamoplossing, 4 tot 5 keer 's nachts in PTwH wassen bij RT.
    12. Incubeer met secundair antilichaam geconjugeerd aan fluoroforen verdund in PTwH, 3% normaal ezelserum gedurende 3 dagen bij 37 °C met agitatie.
    13. Vul de secundaire antilichaamoplossing aan, incubeer nog 3 dagen bij 37 °C met agitatie.
    14. Na 6 dagen incubatie in secundaire antilichaamoplossing, 4-5 keer 's nachts in PTwH wassen bij RT.
    15. Dehydrateer met een graduele MeOH-reeks (20%, 40%, 60%, 80%, 100% en 100% MeOH). Het monster kan 's nachts bij RT worden bewaard.
    16. Incubeer in 66% dichloormethaan/33% MeOH gedurende 3 uur bij RT met agitatie.
    17. Was tweemaal in 100% dichloormethaan gedurende 15 minuten bij RT met agitatie.
    18. Incubeer en bewaar monsters in benzylether. Vul de buis om te voorkomen dat de lucht het monster oxideert.
  2. Beeldvorming van weefsel-gewist monster
    1. Bevestig een kamer met lijm op een dia en breng nagellak aan rond de omtrek van de kamer. Voor dikkere weefsels kunnen extra kamers en/of afstandhouders op het objectglaasje worden gestapeld.
    2. Plaats schoon weefsel in de kamer, vul met benzylether en breng een dekglaasje aan.
    3. Breng nagellak aan rond het dekglaasje om een afdichting te creëren.
    4. Verkrijg tegelscan- en Z-stapelafbeeldingen met behulp van een rechtopstaande confocale laserscanmicroscoop met een 5x of 10x lens om beelden te maken op een diepte tot aan de werkafstand van de lens.
    5. Afbeelding met een resolutie van 1024 x 1024 met behulp van laserlijnen die geschikt zijn voor de emissiespectra van de gebruikte fluoroforen. Autofluorescentie van de spieren is zichtbaar met behulp van de laserlijn van 488 nm.
    6. Zorg ervoor dat de stapgrootte van de z-as in overeenstemming is met de Nyquist-bemonstering op basis van de numerieke apertuur van het gespecificeerde objectief11.
    7. Naai afbeeldingen en gebruik software voor 3D-visualisatie.
    8. Maak figuren met behulp van MIP-beelden (Maximum Intensity Projection (MIP) van Z-stapels voor afzonderlijke en samengevoegde kanalen (Afbeelding 2).
  3. Immunohistochemie
    OPMERKING: Nadat het weefsel in paraffine is ingebed,22, wordt de volgende procedure gebruikt om objectglaasjes te maken voor immunohistochemisch onderzoek.
    1. Bereiding van brekingsindex-matchingoplossing (RIMS).
      1. Bereid 0,1 mol/L fosfaatbuffer voor door 10,9 g Na2HPO4 (watervrij) en 3,1 g NaH2PO4 (monohydraat) toe te voegen aan gedeïoniseerd H2O tot een totaal volume van 1 L (pH 7,4). Filtreer-steriliseer de oplossing en bewaar deze bij RT.
      2. Verdun de fosfaatbuffer tot 0,02 mol/L.
      3. Los Histodenz op in 30 ml fosfaatbuffer van 0,02 mol/l door de oplossing 10 minuten te roeren met een magnetische roerstaaf in de uiteindelijke opslagfles die kan worden afgesloten om verdamping en verontreiniging tot een minimum te beperken.
      4. Voeg natriumazide toe tot een totale concentratie van 0,01% (m/v) en pas de pH aan naar 7,5 met NaOH.
      5. Pas de RI aan door de uiteindelijke concentratie van Histodenz te variëren.
      6. Bewaar de RIMS maandenlang bij RT. Gooi weg als microbiële besmetting wordt opgemerkt.
        OPMERKING: Autoclaaf GEEN oplossingen die natriumazide bevatten.
    2. Voorbereiding van objectglaasjes voor immunohistochemisch onderzoek
      1. Maak secties van 5 μm dikte met microtoom. Breng het weefselgedeelte aan op geladen objectglaasjes.
      2. Verwijder paraffine door de objectglaasjes gedurende 10 minuten in >75% xyleen te incuberen. Verplaats de glaasjes naar een tweede container met xyleen voor nog eens 10 minuten.
      3. Verwijder xyleen door de objectglaasjes gedurende 10 minuten onder te dompelen in 100% EtOH, vervolgens gedurende 5 minuten in 95% EtOH en 5 minuten in 70% EtOH.
      4. Spoel de objectglaasjes af met gedeïoniseerd H2O gedurende 5 min.
      5. Dompel de objectglaasjes gedurende 25 minuten onder in een buffer voor het ophalen van antigeen bij 90-95°C.
      6. Laat de container 1 uur afkoelen tot RT met roeren.
      7. Dompel de objectglaasjes onder in een weekbuffer (0,01 mol/L PBS + 0,4% Triton X-100) gedurende 30 minuten bij 4°C.
      8. Omcirkel het weefsel met een PAP-pen. Voeg PBS toe aan elk objectglaasje en plaats het in een bevochtigde kamer om uitdroging te voorkomen.
      9. Was de glaasjes met PBS op RT met agitatie gedurende 5 minuten.
      10. Blok met blokkeerbuffer (0,01 mol/L PBS + 10% Donkey Serum + 0,1% TX-100) gedurende 1 uur met agitatie.
      11. Incubeer met een primair antilichaam verdund in de blokkeerbuffer 's nachts bij 4°C.
      12. Laat de dia's de volgende dag 15 minuten opwarmen tot RT.
      13. Was de objectglaasjes 3 keer met 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 gedurende 5 min.
      14. Incubeer met een secundair antilichaam verdund in blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij RT met agitatie.
      15. Was de objectglaasjes 3 keer met 0,01 mol/L PBS + 0,2% TritonX-100 gedurende 5 min.
      16. Was de glaasjes 3 keer met 0,01 mol/L PBS gedurende 5 min.
      17. Doe 1 druppel RIMS met een druppelaar en breng een dekglaasje aan.
      18. Breng nagellak aan rond het dekglaasje om de afdichting te creëren.
      19. Voer als negatieve controle een monster uit zonder het primaire antilichaam om de afwezigheid van specifieke kleuring aan te tonen.
    3. Beeldvorming van immunogekleurde objectglaasjes
      1. Maak de objectglaasjes in beeld met een confocale laserscanmicroscoop met 10x, 20x en 40x objectieflenzen.
      2. Afbeelding met een resolutie van 1024 x 1024 met behulp van laserlijnen die geschikt zijn voor de emissiespectra van de gebruikte secundaire antilichamen.
      3. Maak figuren met behulp van MIP-afbeeldingen (Maximum Intensity Projection (MIP) van Z-stapels voor afzonderlijke en samengevoegde kanalen (Afbeelding 3).

2. Onderzoek op mesoschaal

  1. Stereoscopische dissectie
    1. Voer delicate dissecties uit die zich richten op kleine of dunne structuren, zoals een atrioventriculaire knoop, een atrioventriculaire knoopslagader en een hartzenuwplexus (submillimeter tot millimeter in schaal) met een vergrotende bureaulamp met klem, chirurgische telescopen of stereomicroscoop.
  2. Micro-CT-scannen
    OPMERKING: CT-beeldvorming wordt uitgevoerd na drukperfusie en fixatie en in alle stadia van dissectie met behulp van een micropositronemissietomografie (PET)/CT-scanner (Figuur 4).
    1. Warm de CT-röntgenbron 25 minuten op voordat u het monster in beeld brengt.
    2. Plaats het hartmonster op het scannerbed.
    3. Verplaats het scannerbed naar een horizontale positie van 544 mm en een verticale positie van 14 mm om het hart te centreren in het CT-gezichtsveld (FOV).
    4. Verkrijg een CT-beeld van 80 kVp, 150 μA, met 720 projecties gedurende een scantijd van 1 minuut met een ruimtelijke resolutie van 200 μm.
    5. Reconstrueer de CT-gegevens met een gezichtsveld van 12 cm x 12 cm x 10 cm en een matrix van 600 x 600 x 500 voxels en sla ze op als een DICOM-bestand.

3. Onderzoek op macroschaal

  1. Drukperfusie en fixatie
    OPMERKING: De auteurs wijzigen eerder beschreven drukperfusie- en fixatietechnieken en passen deze toe op de niet-falende menselijke harten die zijn afgestoten voor transplantatie 14,19,20,21.
    1. Gebruik pompen met een hoog debiet voor perfusiefixatie. Gebruik 100% ethanol14, 4% PFA of 10% formaline voor het fixeermiddel.
      OPMERKING: Het hart wordt hersteld met de opgaande aorta, longstam en beide vena cavae en longaders die zo distaal mogelijk worden verwijderd en worden afgeleverd in oplossing23 van de Universiteit van Wisconsin.
    2. Gebruik twee chirurgische canules van 20-24 Fr voor perfusie van het rechter- en linkerhart. Voor perfusie van het rechterhart, kanunneert u de vena cava superior en plaatst u een ventilatieopening bij de longstam of longslagader met half gesneden plastic spuiten van 12-30 ml met Luer-Lock-tips die zijn bevestigd aan driewegkranen.
    3. Sluit de inferieure vena cava en de andere longslagader af met touw na het plaatsen van een vergrendelde, half gesneden plastic spuit van de juiste grootte of een centrifugebuis van 1,5-5,0 ml.
      1. Voor antegrade perfusie van het linkerhart, kanunneert u een van de longaders en plaatst u een ventilatieopening aan het distale gesneden uiteinde van de aorta met de half gesneden plastic spuiten van 12-30 ml met Luer-Lock-tips die zijn bevestigd aan driewegkranen.
      2. Voor retrograde perfusie van het linkerhart, kanunnikt u een van de takken van de aortaboog en plaatst u een ventilatieopening bij een andere tak van de aortaboog. Plaats de uiteinden van de canules in beide ventrikels.
    4. Sluit andere vatopeningen af met touw na het inbrengen van een vergrendelde, half afgesneden plastic spuit van de juiste grootte of een microcentrifugebuis van 1,5-5,0 ml. Gebruik een dun gaasje om het inbrenggedeelte van de spuiten/tubes/canules te bedekken om lekken en wegglijden te voorkomen. Repareer grote lekken met behulp van hechten, strepen of klonteren. Kleine lekken zijn toegestaan.
    5. Hang het hart in een plastic bakje.
    6. Sluit 22-24 Fr zachte plastic slang aan op elke canule en steek het andere uiteinde van de slang in de container gevuld met fixeermiddel.
    7. Circuleer fixeermiddel door de rechter- en linkerhartcircuits met behulp van een high-flow pomp die is ingesteld op ongeveer 100-300 ml/min voor het rechterhart en 200-400 ml/min voor het linkerhart om respectievelijk ongeveer 20 mmHg in de rechterventrikel en 80 mmHg in de linkerventrikel te bereiken.
    8. Houd de perfusie gedurende 24 uur op 4 °C.
    9. Was het hart met 0,01 mol/L PBS gedurende 30 minuten met agitatie vier keer.
    10. Bewaar het hart in 0,01 mol/L PBS/0,02% natriumazide bij 4 °C.
      OPMERKING: De drukperfusiefixatie is alleen effectief voor een vers hart, niet voor een hart dat is hersteld van een gebalsemd kadaver.
  2. Grove ontleding
    1. Voer progressieve dissectie uit met fotografische opnames in elk stadium van de dissectie.
    2. Om de klinische relevantie te behouden, moet u speciale aandacht besteden aan het voorkomen, vervormen/vervormen van structuren om de fysiologische morfologie van het hart te behouden.
    3. Beeldstructuren van het doel af met behulp van klinisch relevante oriëntatie, zoals rechter anterieure schuine oriëntatie.
  3. Fotografie
    1. Plaats het drukgeperfuseerde en vaste hart op een statief met een platform gemonteerd met meerdere uitsteeksels en de mogelijkheid om 360o te draaien.
    2. Fotografeer het hart met behulp van een digitale spiegelreflexcamera (Figuur 5)24 met behulp van lichtgevende diode-lichtpanelen op de C-standaards en een breed zwart dekbed op de achtergrond.
    3. Fotografeer met de lens met een lange brandpuntsafstand (200 mm) voor een werkafstand van 4-6 ft om vervorming van het onderwerp te minimaliseren14.
  4. Anagliefen
    1. Om anaglyfische beelden weer te geven, reconstrueert u een paar foto's of op volume gerenderde afbeeldingen uit CT-datasets met een verschil van 10° in de rotatiehoek op het horizontale vlak.
    2. Converteer een set van deze tweedimensionale (2D) afbeeldingen, ook wel een stereogram genoemd, naar anagliefen met behulp van freeware16.
    3. Gebruik een rood/cyaan bril om een anaglyph te bekijken.
  5. Fotogrammetrie
    OPMERKING: Fotogrammetrie is de toegepaste wetenschap van het genereren van een driedimensionale oppervlakte-gerenderde reconstructie van meerdere tweedimensionale foto's die onder verschillende hoeken zijn genomen17.
    1. Hang het monster op C-standaards of plaats het op de rotatietafel om honderden multidirectionele foto's te maken met een smartphone.
    2. Genereer het 3D-model in FBX-formaat met behulp van in de handel verkrijgbare software.
  6. CT-aftasten
    OPMERKING: CT-scan kan worden uitgevoerd na drukperfusie en fixatie en in elk stadium van dissectie.
    1. Hang het hartmonster op aan een staaf die over de bovenkant van de container is geplaatst. Om te voorkomen dat het hart tijdens de scan gaat slingeren, ondersteunt u de basis van het hart met plastic uitsteeksels die op de bodem van de container zijn bevestigd. De lucht zal dus als negatief contrast dienen.
    2. Voer de CT-scan uit met behulp van een in de handel verkrijgbare CT-scanner met meerdere detectoren met de volgende parameters: buisspanning van 120 kV, buisstroom van 800-900 mA en een portaalrotatie van 280 ms. Het product met dosislengte is over het algemeen 500-1200 mGy.cm.
    3. Reconstrueer axiale beeldgegevens met behulp van de volgende parameters: een doorsnededikte, 0,6 mm; een stapsgewijs interval, 0,3 mm; een zo klein mogelijk gezichtsveld (meestal 100-200 mm); en een matrix, 512 × 512.
  7. Virtuele ontleding
    1. Analyseer de CT-scanbeelden met behulp van in de handel verkrijgbare software om virtuele dissectiebeelden te genereren.
      OPMERKING: Virtuele dissectie is een wijziging van het volumeweergaveproces waarbij de focus wordt verlegd naar de wanden van de hartkamers en bloedvaten18. In dit proces wordt de verbeterde kamer met handmatige drempels vrijwel uit de oorspronkelijke datasets verwijderd.
    2. Visualiseer de niet-verbeterde wanden, septa en kleppen met virtuele dissectie om beelden te produceren die vergelijkbaar zijn met grove dissectie. In tegenstelling tot grove dissectie van de hartmonsters, zijn de snijvlakken tijdens virtuele dissectie praktisch onbeperkt. Bijna elke weergave kan worden nagebootst om de interessante structuren indien nodig te visualiseren.
  8. 3D printen
    1. Open het compatibele bestand van het hartmonster in de 3D-printersoftware.
    2. Gebruik het profiel van 0,10 mm Fast DETAIL voor de printinstellingen in de 3D-printer en verlaag de printsnelheid naar 20 mm/s. Schakel Ondersteunend materiaal genereren in.
    3. Gebruik het profiel van TPU filament voor "Filament Settings" in de 3D printer.
    4. Gebruik het profiel van de Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 nozzle voor "Printerinstellingen" in de printer.
    5. Nadat het snijden is voltooid, slaat u het BGCODE-bestand op een USB-stick op voor 3D-printen.
    6. Gebruik het 1,75 mm TPU-filament voor het 3D-printen van het menselijk hartmonster. Droog het TPU-filament voor het 3D-printen 6 uur met behulp van een filamentdroger.
    7. Om de filamentspanning tijdens het 3D-printen te verminderen, plaatst u de filamentspoel op een spoelhouder met een ingebouwd lager om de rotatie van de filamentspoel te vergemakkelijken. Voer 3D-printen uit met behulp van een in de handel verkrijgbare 3D-printer met een getextureerde gepoedercoate staalplaat.
    8. Verwijder voorzichtig het ondersteuningsmateriaal wanneer het 3D-printen is voltooid.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoeken op microschaal
Het toepassen van weefselopruiming maakt het mogelijk om grotere hoeveelheden weefsel in 3D in beeld te brengen met behulp van confocale microscopie. In het hart kunnen ganglia met cardiale neuronen en de neurale patronen van myocardinnervatie worden gevisualiseerd (Figuur 2). Figuur 3 toont een confocaal beeld van het myocardium van de linkerventrikel van de mens dat immuungekleurd is voor zenuwen en gladde spiercellen. Er wordt opgemerkt dat bloedvaten het myocardium doorkruisen en er worden talloze zenuwvezels geïdentificeerd, zowel in verband met als onafhankelijk van bloedvaten.

Meso- en macroschaal examens
Bij gebruik van absolute ethanol voor 24 uur drukperfusie en fixatie, wordt de natuurlijke kleur van het monster gebleekt, wordt het weefsel gedehydrateerd25 en wordt de elasticiteit aanzienlijk verminderd. Aan de andere kant blijven bij fixatie met PFA en formaline de natuurlijke kleur en elasticiteit opmerkelijk behouden. Om deze redenen wordt PFA of formaline voornamelijk gebruikt als voorkeursfixeermiddel.

Figuur 6 toont representatieve afbeeldingen van de grove dissectie, virtuele dissectie, STL-polygoonmodel en driedimensionaal afdrukken. Figuur 7 toont representatieve afbeeldingen van de anagliefen die zijn gemaakt van zowel grove als virtuele dissectiebeelden. Dieptewaarneming kan worden verkregen met een anaglyfische bril. Het vastgelegde enkelvoudige fotogrammetrische model kan vanuit bijna alle richtingen worden waargenomen met behulp van in de handel verkrijgbare software en vertoont complexe anatomische kenmerken die relevant zijn voor routinematige transkathetercardiale procedures. Door deze technieken toe te passen op het hart dat is voorbereid met drukperfusie en fixatie, kan driedimensionale informatie over het hart bijna eeuwig digitaal of fysiek worden bewaard en grenzeloos worden gedeeld. Figuur 8 toont de 3D-prints op schaal 50% die zijn gerepliceerd van de ontlede harten die zijn afgewezen voor transplantatie.

figure-results-1
Figuur 1: Stroomschema van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Weefselvrij doorsnede van het atrium van de mens. (A) Rechter achterste schuine weergave van een mensenrechts atrium met de rechter atriale ganglionated plexus (RAGP) ontleed voor weefselopruiming. (B) RAPP-monster voor en na het klaren van het weefsel. (C) Projectie van maximale intensiteit van een iDISCO+-geklaard deel van humaan RAGP dat ganglia (pijlpunten) aantoont, immuungekleurd met pan-neuronaal marker-eiwitgenproduct 9.5 (PGP9.5). Schaalbalken zijn 1 cm (A), 5 mm (B) en 500 μm (C). Deze figuur is een bewerking van Hanna et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Immunogekleurde objectglaasjes van de menselijke linker ventrikel. Confocaal beeld van de menselijke linkerventrikel myocardium plak immunogekleurd met pan-neuronale marker eiwit genproduct 9.5 (PGP9.5) en gladde spiercel marker α-gladde spier actine (αSMA). Autofluorescentie van de spieren is zichtbaar met behulp van de laserlijn van 488 nm (groen). De schaalbalk is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Micro-computer-tomografische beeldvorming van hartmonsters. (A) Micro-computertomografie opstelling voor beeldvorming van hartmonsters. (B) Gebruikersinterface voor micro-computertomografiebeeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Fotostudio-instelling in het UCLA Cardiac Arrhythmia Center. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Bruto dissectie (linksboven), virtuele dissectie (rechtsboven), STL-polygoonmodel (linksonder) en driedimensionale afdrukken (rechtsonder) van afbeeldingen van het aorta- en mitralisklepcomplex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Anagliefen van een grove dissectie (links) en virtuele dissectie (rechts) van het aorta- en mitralisklepcomplex. Een anaglyfische bril (rood/cyaan) is nodig om dieptewaarneming te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Afbeelding 8: Driedimensionaal printen van hartmonsters. (A) Driedimensionale (3D) printeropstelling voor het 3D-printen van hartmonsters met een TPU-filament. (B) Representatief hart 3D-prints geproduceerd met behulp van methoden die in deze studie zijn beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie demonstreert de uitgebreide pijplijn voor het analyseren van monsters die zijn verkregen uit hele menselijke harten. Representatieve resultaten tonen anatomische onderzoeken op micro- tot macroschaal die routinematig worden uitgevoerd voor een enkel hart. Aangezien een menselijk hartmonster uiterst kostbaar is, is een benadering op meerdere schalen ideaal en effectief om geen delen van het monster te verspillen door meerdere protocollen toe te passen voor verschillende doeleinden, waaronder ontdekking in wetenschappelijk onderzoek, verbetering van klinische procedures en anatomisch onderwijs met behoud van anatomische correlatie in de context van het hele hart.

Met betrekking tot onderzoek op microschaal kunnen immunokleuring en microscopie worden toegepast om de cytoarchitectuur van menselijke hartmonsters te begrijpen. Hier wordt de toepassing van weefselopruiming en immunohistochemie om cardiale neuroanatomie op cellulaire schaal te bestuderen, gedemonstreerd. Het gebruik van deze technieken is nuttig bij de karakterisering van het cardiale zenuwstelsel en myocardinnervatiepatronen in relatie tot interessante structuren, zoals het hartgeleidingssysteem en de hartkamers. Hoewel een uitstekende ruimtelijke resolutie wordt bereikt, is het gebruik van confocale microscopie, met name voor weefselvrije monsters, tijdrovend. Lightsheet-microscopie kan worden gebruikt om de tijd voor beeldacquisitie te verkorten ten koste van de ruimtelijke resolutie.

Wat betreft onderzoek op meso- tot macroschaal, varieert de ruimtelijke resolutie van micro-CT-scanners in de instelling van de auteurs van 10-200 μm. De steekproefgrootte is beperkt tot 20 mm voor een scan van 10 μm en 120 mm voor een scan van 100-200 μm. Micro-CT-scanners in de instelling van de auteurs kunnen niet het hele hart herbergen. Zo vereist een scan van het hele hart in de instelling van de auteurs het gebruik van een klinische CT-scanner met een ruimtelijke resolutie van 600 μm, hoewel de vooruitgang de ontwikkeling van micro-CT-scanners mogelijk heeft gemaakt die het hele hart kunnen afbeelden2. Technologische ontwikkelingen, zoals CT voor het tellen van fotonen, zullen zeker verdere mogelijkheden vergroten. Verbetering van de ruimtelijke resolutie van het STL-bestand zou de eerste stap moeten zijn om de kwaliteit van 3D-printen verder te verbeteren. De hogere kosten van 3D-printen beperken de toepassing van de techniek tot de routinematige klinische praktijk. Fotogrammetriebeelden die met elke smartphone-applicatie worden gegenereerd, zijn eenvoudig te ontwikkelen en van acceptabele kwaliteit, maar vereisen verdere geavanceerde, maar dure en tijdrovende systemen om de resolutie te verbeteren26. Om in 3D te visualiseren, zijn extended reality met speciale hoofddeksels27,28 en holografische monitoren29 extra hulpmiddelen, maar worden ze ook beperkt door hogere kosten.

Samenvattend, door middel van uitgebreide structurele analyses op microscopische en macroscopische schaal, kan de anatomie op microschaal van elke structuur en zijn functionele bijdrage worden begrepen in de context van het hele hart. Samen met de ontwikkeling van beeldvorming met hoge resolutie wordt de afstand tussen de anatomie op micro- en macroschaal dramatisch groter. Deskundigen in elektronenmicroscopische analyse van cardiomyocyten zijn mogelijk niet bekend met het aantal mitralisblaadjes en vice versa. Om een alomvattend begrip van de hartmorfologie te vergemakkelijken, moeten wetenschappers verdere details van elke boom blijven onderzoeken, terwijl ze het hele bos in vogelvlucht blijven bekijken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de individuen die hun lichaam hebben gedoneerd voor de vooruitgang van onderwijs en onderzoek. We zijn de OneLegacy Foundation dankbaar, die de basis vormde voor het verkrijgen van donorharten voor onderzoek. We zijn ook Anthony A. Smithson en Arvin Roque-Verdeflor van het UCLA Translational Research Imaging Center (Department of Radiology) dankbaar voor hun steun bij het verzamelen van CT-gegevens. Dit project werd ondersteund door het UCLA Amara Yad Project. We zijn Drs. Kalyanam Shivkumar en Olujimi A. Ajijola dankbaar voor het opzetten en onderhouden van een menselijke hartpijplijn voor onderzoek. We waarderen onze Research Operations Manager, Amiksha S. Gandhi, voor haar toewijding om onze projecten te ondersteunen. Dit werk werd mogelijk gemaakt door de steun van NIH-subsidies OT2OD023848 & P01 HL164311 en Leducq-subsidie 23CVD04 aan Kalyanam Shivkumar, de American Heart Association Career Development Award 23CDA1039446 aan PH en het UCLA Amara-Yad Project (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project). De GNEXT microPET/CT-scanner die in deze studie werd gebruikt, werd gefinancierd door een NIH Shared Instrumentation for Animal Research Grant (1 S10 OD026917-01A1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x Phosphate buffered salineSigma-AldrichP3813
3D ViewerMicrosoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgGJackson ImmunoResearch Laboratories713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lensNikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibodySigma-AldrichC6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)Abcamab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)Abcamab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)Abcamab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)Synaptic Systems139 103
Benzyl etherSigma-Aldrich108014
Bovine serum albuminSigma-AldrichA4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mmNinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5VWR48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-165-152
DichloromethaneSigma-Aldrich270997-100ML
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418-500ML
Ethanol, 100%Decon laboratories2701
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosaSigma-AldrichH3149-50KU
HistodenzSigma-AldrichD2158-100G
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH1009-500ML
Imaging softwareZeissZEN (black edition)
Imaging softwareOxford InstrumentsImaris 10
iSpacerSunjin LabsiSpacer 3mm
KIRI EngineKIRI Innovation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic PumpLONGER
Lightview XL Brightech
Methanol (Certified ACS)Fischer ScientificA412-4
Nikon D850Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Original Prusa MK4 3D printerPrusa Research
PAP penAbcamab2601
Paraformaldehyde, 32%Electron Microscopy Sciences15714-S
PolycamPolycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
ScaniverseNiantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface MountantInvitrogenS36936
Sodium azide, 5% (w/v)Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Definition ASSiemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes, Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61OLYMPUS
StereoPhoto MakerFree ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, PrecleanedFisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
XyleneSigma-Aldrich534056-4L
Ziostation2Ziosoft, AMIN

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Das reizleitungssystem des säugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie über das atrioventrikularbündel und die purkinjeschen fäden. Jena: Gustav fischer. , https://wellcomecollection.org/works/gnxjxg9e (1906).">Tawara, S. Das reizleitungssystem des säugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie über das atrioventrikularbündel und die purkinjeschen fäden. Jena: Gustav fischer. , https://wellcomecollection.org/works/gnxjxg9e (1906).
  2. High-resolution 3-dimensional imaging of the human cardiac conduction system from microanatomy to mathematical modeling. Sci Rep. 7 (1), 7188(2017).">Stephenson, R. S., et al. High-resolution 3-dimensional imaging of the human cardiac conduction system from microanatomy to mathematical modeling. Sci Rep. 7 (1), 7188(2017).
  3. First in situ 3D visualization of the human cardiac conduction system and its transformation associated with heart contour and inclination. Sci Rep. 11 (1), 8636(2021).">Kawashima, T., Sato, F. First in situ 3D visualization of the human cardiac conduction system and its transformation associated with heart contour and inclination. Sci Rep. 11 (1), 8636(2021).
  4. Whole-mount demonstration of cholinesterase-containing nerves in the right atrial wall, nodal tissue, and atrioventricular bundle of the pig heart. J Anat. 108, Pt 3 375-386 (1971).">Bojsen-Moller, F., Tranum-Jensen, J. Whole-mount demonstration of cholinesterase-containing nerves in the right atrial wall, nodal tissue, and atrioventricular bundle of the pig heart. J Anat. 108, Pt 3 375-386 (1971).
  5. Ganglionated plexi and ligament of marshall ablation reduces atrial vulnerability and causes stellate ganglion remodeling in ambulatory dogs. Heart Rhythm. 13 (10), 2083-2090 (2016).">Zhao, Y., et al. Ganglionated plexi and ligament of marshall ablation reduces atrial vulnerability and causes stellate ganglion remodeling in ambulatory dogs. Heart Rhythm. 13 (10), 2083-2090 (2016).
  6. Ischemia-induced ventricular proarrhythmia and cardiovascular autonomic dysreflexia after cardioneuroablation. Heart Rhythm. 20 (11), 1534-1545 (2023).">Chung, W. H., et al. Ischemia-induced ventricular proarrhythmia and cardiovascular autonomic dysreflexia after cardioneuroablation. Heart Rhythm. 20 (11), 1534-1545 (2023).
  7. Anatomy of the pig heart: Comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, Pt 1 105-119 (1998).">Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: Comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  8. Comparative gross anatomy of epicardiac ganglionated nerve plexi on the human and sheep cardiac ventricles. Anat Rec (Hoboken). 306 (9), 2302-2312 (2023).">Saburkina, I., Pauziene, N., Solomon, O. I., Rysevaite-Kyguoliene, K., Pauza, D. H. Comparative gross anatomy of epicardiac ganglionated nerve plexi on the human and sheep cardiac ventricles. Anat Rec (Hoboken). 306 (9), 2302-2312 (2023).
  9. The role of the gap junction perinexus in cardiac conduction: Potential as a novel anti-arrhythmic drug target. Prog Biophys Mol Biol. 144, 41-50 (2019).">Hoagland, D. T., Santos, W., Poelzing, S., Gourdie, R. G. The role of the gap junction perinexus in cardiac conduction: Potential as a novel anti-arrhythmic drug target. Prog Biophys Mol Biol. 144, 41-50 (2019).
  10. Intrinsic cardiac autonomic nervous system: What do clinical electrophysiologists need to know about the "heart brain". J Cardiovasc Electrophysiol. 32 (6), 1737-1747 (2021).">Aksu, T., Gopinathannair, R., Gupta, D., Pauza, D. H. Intrinsic cardiac autonomic nervous system: What do clinical electrophysiologists need to know about the "heart brain". J Cardiovasc Electrophysiol. 32 (6), 1737-1747 (2021).
  11. Innervation and neuronal control of the mammalian sinoatrial node a comprehensive atlas. Circ Res. 128 (9), 1279-1296 (2021).">Hanna, P., et al. Innervation and neuronal control of the mammalian sinoatrial node a comprehensive atlas. Circ Res. 128 (9), 1279-1296 (2021).
  12. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10, 1944(2019).">Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10, 1944(2019).
  13. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).">Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment. Springer-verlag. , ISBN 13: 9783540069850 (1975).">Mcalpine, W. Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment. Springer-verlag. , ISBN 13: 9783540069850 (1975).
  15. Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine. Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).">Mori, S., Shivkumar, K. Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine. Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).
  16. Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures. Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).">Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures. Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).
  17. Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy. JACC Case Rep. 21, 101937(2023).">Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy. JACC Case Rep. 21, 101937(2023).
  18. Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy. J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30(2020).">Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy. J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30(2020).
  19. The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation. Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).">Thomas, A. C., Davies, M. J. The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation. Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).
  20. Controlled pressure fixation apparatus for hearts. Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).">Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. Controlled pressure fixation apparatus for hearts. Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).
  21. The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy. Europace. 18, suppl 4 163-172 (2016).">Iaizzo, P. A. The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy. Europace. 18, suppl 4 163-172 (2016).
  22. Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue. J Vis Exp. (201), e65850(2023).">Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue. J Vis Exp. (201), e65850(2023).
  23. Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges. Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).">Tripathy, S., Das, S. K. Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges. Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).
  24. Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1). Cardiotext. , (2022).">Mori, S., Shivkumar, K. Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1). Cardiotext. , (2022).
  25. Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand. Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).">Crosado, B., et al. Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand. Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).
  26. A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry. J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).">Titmus, M., et al. A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry. J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).
  27. Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine. JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).">Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine. JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).
  28. Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education. Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).">Maresky, H. S., et al. Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education. Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).
  29. Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display. Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).">Mori, S., Shivkumar, K. Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display. Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Heart AnatomyThree Dimensional ImagingTissue ClearingConfocal MicroscopyMicro CT ScanningPressure Perfusion FixationImmunohistochemical StainingGross DissectionCardiac Innervation3D Heart Model

Related Articles