Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van de test voor begraven voedsel en het experiment met sociale geurdiscriminatie om de effecten van blootstelling aan ingeademde milieuverontreinigende stoffen op de reukfunctie bij muizen te beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Onderzoek naar de effecten van ingeademde milieuverontreinigende stoffen op de reukfunctie bij muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Reukstoornissen zijn een belangrijk probleem voor de volksgezondheid en voorspellen onafhankelijk het risico op neurodegeneratieve ziekten. Blootstelling aan ingeademde milieuverontreinigende stoffen kan de reukzin aantasten; Daarbij is er dringend behoefte aan methoden om de effecten van blootstelling aan ingeademde milieuverontreinigende stoffen op de reukzin te evalueren. Muizen zijn ideale modellen voor olfactorische experimenten vanwege hun sterk ontwikkelde reuksysteem en gedragskenmerken. Om de effecten van blootstelling aan ingeademde milieuverontreinigende stoffen op de reukfunctie bij muizen te beoordelen, wordt een gedetailleerde test voor begraven voedsel en een experiment met sociale geurdiscriminatie verstrekt, inclusief de voorbereiding van het experiment, de selectie en bouw van experimentele faciliteiten, het testproces en tijdsindexen. Ondertussen worden tijdwaarnemingsapparatuur, operationele details en de experimentele omgeving besproken om het succes van de test te garanderen. Zinksulfaat wordt gebruikt als behandeling om de haalbaarheid van de experimentele aanpak aan te tonen. Het protocol biedt een eenvoudig en duidelijk operationeel proces voor het beoordelen van de effecten van ingeademde milieuverontreinigende stoffen op de olfactorische functie bij muizen.
Inleiding
Olfactorische stoornissen zijn naar voren gekomen als een opmerkelijk probleem voor de volksgezondheid en worden onafhankelijk geassocieerd met een verhoogd risico op neurodegeneratieve ziekten. Deze aandoening kan het algehele welzijn nadelig beïnvloeden, bijdragen aan de ontwikkeling van depressieve symptomen en resulteren in een verminderde kwaliteit van leven. De impact ervan wordt prominent waargenomen in de veranderde perceptie van voedsel, belemmering in sociale communicatie en verhoogde negatieve gevoelens1. Verschillende factoren, waaronder sinonasale aandoeningen, infectie van de bovenste luchtwegen en traumatisch hersenletsel, worden beschouwd als bijdragen aan reukstoornissen bij mensen. Met name inhaleerbare milieuverontreinigende stoffen zoals PM2.5, geschat op 2% tot 16%, komen het lichaam binnen via ingeademde lucht, doorkruisen de neusholte en bereiken specifieke reukgebieden waar ze worden afgezet 3,4,5,6,7. Recente bevindingen geven aan dat inhaleerbare milieuverontreinigende stoffen, waaronder PM2.5 en ammoniak, inderdaad olfactorische sensorische neuronen kunnen beschadigen 8,9,10. Verdere validatie is echter nodig om vast te stellen of dergelijke schade direct leidt tot olfactorische disfunctie. Daarom is een nauwgezette evaluatie van de effecten van inhaleerbare milieuverontreinigende stoffen op de reukfunctie van bijzonder belang.
Momenteel gebruiken tal van onderzoekslaboratoria muizen als een alternatief model voor gewervelde dieren voor gedragsexperimenten die gericht zijn op het begrijpen van veranderingen in de reukfunctie 11,12,13,14. Muizen werden gekozen als het voorkeursmodelsysteem voor het onderzoeken van chemische communicatie van gewervelde dieren, en het vertoont een opmerkelijke olfactorische gevoeligheid die cruciaal is voor foerageren en sociale communicatie15. Bovendien heeft het voortdurend evoluerende scala aan instrumenten voor het observeren en beïnvloeden van het gedrag van muizen deze soort buitengewoon aantrekkelijk gemaakt voor onderzoek naar de reukfunctie16.
In deze studie gebruikten we de test voor begraven voedsel en het experiment met sociale geurdiscriminatie om reukstoornissen te beoordelen in een muismodel dat werd blootgesteld aan inhaleerbare milieuverontreinigende stoffen. Om de precisie van de evaluatie te verbeteren, hebben we gekozen voor de meest representatieve methode voor het beoordelen van de olfactorische functie. We hebben deze methode systematisch verfijnd om eenvoud en duidelijkheid te garanderen, waardoor we de mate van olfactorische disfunctie veroorzaakt door inhaleerbare milieuverontreinigende stoffen effectief kunnen meten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
We gebruikten mannelijke C57BL/6J-muizen (leeftijd: 6-8 weken; gewicht: 20-22 g) voor alle gedragstests. De muizen werden blootgesteld aan stabiele omstandigheden (d.w.z. temperatuur, 23 ± 1 °C; vochtigheid, 55% ± 5%, en 12/12 uur licht-donkercyclus met lichten aan om 7:00 uur). Alle gedragstesten werden uitgevoerd tussen 10.00 en 17.00 uur. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Professionele Commissie voor Dierproeven van de Universiteit van Qingdao. Na een acclimatisatieperiode van 1 week werden alle muizen blootgesteld aan inhaleerbare milieuverontreinigende stoffen.
1. Blootstelling aan verontreinigende stoffen
- Intranasale toediening door instillatie
- Los inhaleerbare milieuverontreinigende stoffen op in een 0,9% zoutoplossing. Gebruik eenmaal een oplossing van 5% zinksulfaat, waarvan is aangetoond dat deze reukstoornissen veroorzaakt17. Dien voor controlemuizen 0,9% normale zoutoplossing toe.
- Verdoof de muis door intraperitoneale injectie van 1% natriumpentobarbital18 en beoordeel de diepte van de anesthesie met behulp van de teenknijpreflex. Breng dierenartszalf aan op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen. Plaats de muis op zijn rug op een hellend oppervlak, met het hoofd naar beneden gericht.
- Dien met een pipetteerpistool 10 μl van de oplossing toe in één neusgat van de muis, zodat de oplossing op natuurlijke wijze in de neusholte kan worden ingeademd.
- Om het welzijn van de muis te garanderen en mogelijk ongemak te voorkomen, herhaalt u de inhalatie voor het andere neusgat na een interval van 10 minuten.
- Voer 3 dagen na intranasale toediening door indruppeling bij muizen de test op begraven voedsel uit.
2. Test op begraven voedsel
- Voer 18-24 uur voor de test voedseldeprivatie uit door alle chow-pellets uit de voedseltrechter van de thuiskooi te verwijderen. Verander de bodembedekking voor muizen. Verwijder de waterfles niet.
- Plaats de operatietafel zoals hieronder beschreven.
- Breng 1 uur voor aanvang van de test de kooi met de muizen naar de operatiekamer om uit te rusten.
- Richt de operatiekamer in deze periode in. Gebruik en markeer transparante PVC-standaard muizenkooien als A, omdat deze een vertrouwde omgeving vormen. Gebruik en markeer de testkooi als B, een transparante PVC-standaard eekhoornkooi. Markeer de gemeenschappelijke kooi die werd gebruikt om de muizen na het experiment te plaatsen als kooi C.
- Bedek de kooien A en B met 3 cm strooisel en meet ze af met een liniaal. Plaats de kooien naast elkaar, met een afstand van 0.5 m tussen elke kooi (Figuur 1).
- Definieer het experimentele gebied als een gebied met een straal van 2 m, waarbij het midden het midden van de kooien is. Definieer het gebied buiten het bereik van 2 m als het observatiegebied.
- Houd kooi C en kooien met niet-geteste muizen zo ver mogelijk uit de buurt van het experimenteergebied.
- Noteer de tijd om voedsel te vinden zoals hieronder beschreven.
- Kies een willekeurige positie in kooi B, begraaf het voer 1 cm onder het oppervlak van de bodembedekking en strijk het oppervlak van de bodembedekking glad.
- Zet de muis 4 minuten in kooi A. Breng de muizen aan het einde van de timing over naar kooi B, zet het videoapparaat aan en keer terug naar het observatiegebied.
- Wanneer de muis het voedselblok met zijn voorpoot oppakt, stopt u de video-opname. In sommige gevallen zijn muizen te zien eten met hun hoofd gebogen over het voedsel. Dit gedrag duidt ook op succes van de proef, zelfs als de muis het voedsel niet met zijn voorpoot vasthoudt.
- Gegevens vastleggen. Noteer de tijd vanaf het contact met de mat op de bodem van kooi B tot het moment dat er voedsel is gevonden voor elke muis. Als de muizen na 4 minuten geen voedsel vinden, noteer dan de vindtijd als een vertragingstijd van 240 s.
- Zet de muis na de test in kooi C.
- Haal het voer uit kooi B en doe het in een afgesloten zak. Plaats het voer terug in kooi B en test de volgende muis na het vervangen van het strooisel, zoals hieronder beschreven.
- Voor muizen die in dezelfde kooi zijn gehuisvest, test met dezelfde set strooiselmaterialen in kooi B. Voor muizen in verschillende kooien, maak de kooi schoon met alcohol en vervang de bodembedekking.
- Voeg na het experiment voer en water toe aan muizen. Voer 1 dag later het sociale geurdiscriminatie-experiment uit.
OPMERKING: Maskers moeten tijdens het hele proces worden gedragen en transparante handschoenen moeten worden verwisseld nadat elke muis het experiment heeft voltooid om geurkruising zoveel mogelijk te voorkomen. Houd de amplitude van de bewegingen zo klein mogelijk om stress bij de muis te voorkomen.
3. Experiment met sociale geurdiscriminatie
- Urine opvangen
- Verzamel de urine van geslachtsrijpe mannelijke muizen en vrouwelijke muizen afzonderlijk en aliquot in buisjes in gelijke hoeveelheden19. Verpak in microcentrifugebuisjes van 2 ml met 300 μl urine in elk buisje.
- Bewaar de monsters bij -80 ° C tot gebruik. Schud de buisjes om het monster na het ontdooien gelijkmatig te verdelen. Ontdooi en vries het monster niet herhaaldelijk in.
- Plaats de operatietafel zoals hieronder beschreven.
- Breng 1 uur voor aanvang van de test de kooi met de muizen naar de operatiekamer om uit te rusten.
- Richt de operatiekamer in deze periode in zoals beschreven in de stappen 2.2.2-2.2.5.
- Noteer de tijd om urine te vinden zoals hieronder beschreven.
- Maak een groef met tape rond elk van de twee brede zijden van kooi B die groot genoeg is om de microcentrifugebuis met 300 μL mannelijke en vrouwelijke urine vast te houden. Plaats de buizen en houd de twee buisdeksels voorlopig gesloten.
- Zet de muis in kooi A en stel een countdown in op 4 min. Open de twee buizen van kooi B aan het einde van de timing.
- Breng de muis naar de middelste positie van kooi B, op dezelfde afstand van de twee buizen, zet vervolgens de video-opnameapparatuur aan en trek u voorzichtig en langzaam terug naar het observatiegebied.
- Wanneer de muis aan de wand/mond van de buis of zelfs in de buis snuffelt wordt de buis met succes geroken. Druk op dit moment op de stopwatch en noteer de tijd als de tijd van het ruiken van de buis (M s), en ga dan door met het registreren van de verblijftijd (X s) totdat de muis zich van de buis verwijdert.
- Ga door met het timen van de andere buis en snuffel aan de andere buis. Wanneer de muis aan de wand/mond van de buis of zelfs in de buis snuffelt wordt de buis met succes geroken. Druk op de stopwatch en noteer de tijd die nodig was om de andere buis te ruiken (N s), en ga dan door met het registreren van de verblijftijd (Y s) totdat de muis zich van de buis verwijdert.
- Breng de muis aan het einde van het experiment over naar kooi C.
- Vervang de urineslangen en het strooisel van kooi B na elke muizentest. Doe de gebruikte rattenurine in een schone zak volgens geslacht.
- Wissel van handschoenen en test de volgende muis zoals hierboven beschreven.
- Voer het experiment uit in een laboratorium zonder duidelijke geur. Vermijd persoonlijke producten die sterke geuren afgeven. Draag handschoenen en maskers tijdens de procedure om geuroverschrijding zoveel mogelijk te voorkomen. Houd de amplitude van de bewegingen zo klein mogelijk om stress bij de muis te voorkomen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Inhaleerbare milieuverontreinigende stoffen tasten de reukfunctie bij muizen aan. Het is aangetoond dat atmosferisch zink dat wordt uitgestoten door verbrandingsovens en motorvoertuigen een ingeademde verontreinigende stof is die kan leiden tot allergische longontsteking20. Zinksulfaat wordt beschouwd als een van de typische verbindingen die olfactorische disfunctie veroorzaken21. Daarom gebruiken we zinksulfaat als behandeling om muizen bloot te stellen door intranasale in...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel introduceert twee fundamentele protocollen die zijn ontworpen voor de snelle beoordeling van reukstoornissen bij muizen. Gevarieerde inhaleerbare milieuverontreinigende stoffen resulteren in verschillende niveaus van olfactorische disfunctie bij muizen. De test op begraven voedsel wordt gebruikt om het vermogen om vluchtige geuren te detecteren te beoordelen, terwijl het experiment met sociale geurdiscriminatie het vermogen van het dier evalueert om verschillende sociale geuren te onderscheiden en te ondersch...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82204088, 82273669) en de Natural Science Foundation van de provincie Shandong, China (ZR2021QH209).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5-10 μL aanpasbare micropipet | Eppendorf, Duitsland | 3123000225 | Intranasal instillatie |
| 0,9% zoutoplossing | Solarbio | 7647-14-5 | Verontreinigingen oplossen |
| Watervrij zinksulfaat | Macklin | 7733-02-0 | Muizen blootstellen |
| Centrifugebuis (2 mL) | Biosharp Incorporated | BS-20-M | Plaats urine |
| Elektronische weegschaal | Changzhou Ohaus Co. | EX125DZH | Gewicht verdovingsmiddelen en verontreinigingen |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 8.0.1 | Statistische analyse |
| Handbediende stofdetector | TSI Incorporated | DuatTrak  8532 | Muizen die aan inhalatie zijn blootgesteld |
| Video-opnameapparatuur | Apple Inc. | iPhone 6s Plus | De activiteitstijd van muizen werd geregistreerd |
| Vortexmixer | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co. | Vortex-5 | Oplossing mixen |
Referenties
- Schäfer, L., Schriever, V. A., Croy, I. Human olfactory dysfunction: causes and consequences. Cell Tissue Res. 383 (1), 569-579 (2021).
- Keller, A., Malaspina, D. Hidden consequences of olfactory dysfunction: a patient report series. BMC Ear Nose Throat Disord. 13 (1), 8(2013).
- Schroeter, J. D., et al. Application of physiological computational fluid dynamics models to predict interspecies nasal dosimetry of inhaled acrolein. Inhal Toxicol. 20 (3), 227-243 (2008).
- Schroeter, J. D., Garcia, G. J., Kimbell, J. S. A computational fluid dynamics approach to assess interhuman variability in hydrogen sulfide nasal dosimetry. Inhal Toxicol. 22 (4), 277-286 (2010).
- Keyhani, K., Scherer, P. W., Mozell, M. M. Numerical simulation of airflow in the human nasal cavity. J Biomech Eng. 117 (4), 429-441 (1995).
- Hahn, I., Scherer, P. W., Mozell, M. M. Velocity profiles measured for airflow through a large-scale model of the human nasal cavity. J Appl Physiol. 75 (5), 2273-2287 (1993).
- Zhang, Z., et al. Exposure to particulate matter air pollution and Anosmia. JAMA Netw Open. 4 (5), e2111606(2021).
- Ekström, I. A., et al. Environmental air pollution and olfactory decline in aging. Environ Health Perspect. 130 (2), 27005(2022).
- Adams, D. R., et al. Nitrogen dioxide pollution exposure is associated with olfactory dysfunction in older U.S. adults. Int Forum Allergy Rhinol. 6 (12), 1245-1252 (2016).
- Prah, J. D., Benignus, V. A. Decrements in olfactory sensitivity due to ozone exposure. Percept Mot Skills. 48 (1), 317-318 (1979).
- Shi, Z., et al. Chronic exposure to environmental pollutant ammonia causes damage to the olfactory system and behavioral abnormalities in mice. Environ Sci Technol. 57 (41), 15412-15421 (2023).
- Hernández-Soto, R., et al. Chronic intermittent hypoxia alters main olfactory bulb activity and olfaction. Exp Neurol. 340, 113653(2021).
- Islam, S., et al. Odor preference and olfactory memory are impaired in Olfaxin-deficient mice. Brain Res. 1688, 81-90 (2018).
- Wang, H., et al. Inducible and conditional activation of ERK5 MAP kinase rescues mice from cadmium-induced olfactory memory deficits. Neurotoxicology. 81, 127-136 (2020).
- Chamero, P., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. From genes to social communication: molecular sensing by the vomeronasal organ. Trends Neurosci. 35 (10), 597-606 (2012).
- Mohrhardt, J., et al. Signal detection and coding in the accessory olfactory system. Chem Senses. 43 (9), 667-695 (2018).
- Liu, X., et al. Type 3 adenylyl cyclase in the MOE is involved in learning and memory in mice. Behav Brain Res. 383, 112533(2020).
- Li, X., et al. Polyhexamethylene guanidine aerosol triggers pulmonary fibrosis concomitant with elevated surface tension via inhibiting pulmonary surfactant. J Hazard Mater. 420, 126642(2021).
- Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8, Unit 8.24 (2009).
- Huang, K. L., et al. Zinc oxide nanoparticles induce eosinophilic airway inflammation in mice. J Hazard Mater. 297, 304-312 (2015).
- Burd, G. D. Morphological study of the effects of intranasal zinc sulfate irrigation on the mouse olfactory epithelium and olfactory bulb. Microsc Res Tech. 24 (3), 195-213 (1993).
- Zou, J., et al. Methods to measure olfactory behavior in mice. Curr Protoc Toxicol. 63, 1-21 (2015).
- Ryalls, J. M. W., et al. Anthropogenic air pollutants reduce insect-mediated pollination services. Environ Pollut. 297, 118847(2022).
- Schiffman, S. S. Livestock odors: implications for human health and well-being. J Anim Sci. 76 (5), 1343-1355 (1998).
- Albrechet-Souza, L., Gilpin, N. W. The predator odor avoidance model of post-traumatic stress disorder in rats. Behav Pharmacol. 30, 2 and 3-Spec Issue 105-114 (2019).
- Davies, D. A., et al. Inactivation of medial prefrontal cortex or acute stress impairs odor span in rats. Learn Mem. 20 (12), 665-669 (2013).
- Landers, M. S., Sullivan, R. M. The development and neurobiology of infant attachment and fear. Dev Neurosci. 34 (2-3), 101-114 (2012).
- Drobyshevsky, A., et al. Antenatal insults modify newborn olfactory function by nitric oxide produced from neuronal nitric oxide synthase. Exp Neurol. 237 (2), 427-434 (2012).
- Arbuckle, E. P., et al. Testing for odor discrimination and habituation in mice. J Vis Exp. (99), e52615(2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
