Methodenartikel

Chirurgische lumbale sympathectomie bij muizen

5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66821

⸱

5 juli 2024

 , 
1Medical Scientist Training Program, Emory University School of Medicine, 2Neuroscience Graduate Program, Laney Graduate School, Emory University, 3Department of Cell Biology, Emory University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript presenteert een protocol voor het chirurgisch verwijderen van de postganglionische lumbale sympathische neuronen van een muis. Deze procedure zal een groot aantal onderzoeken mogelijk maken die gericht zijn op het onderzoeken van de rol van sympathische innervatie in distale weefseldoelen.

Samenvatting

Perifere zenuwletsels komen vaak voor en bij slechts 10% van de patiënten wordt volledig functioneel herstel na letsel bereikt. Het sympathische zenuwstelsel speelt veel cruciale rollen bij het handhaven van lichamelijke homeostase, maar het is zelden bestudeerd in de context van perifere zenuwbeschadiging. De omvang van postganglionische sympathische neuronale functies in distale doelen in de periferie is momenteel onduidelijk. Om de rol van sympathische innervatie van perifere doelen beter te onderzoeken, biedt een chirurgisch "knock-out"-model een alternatieve benadering. Hoewel dit chemisch kan worden bereikt, kan chemische vernietiging van postganglionische sympathische neuronen niet-specifiek en dosisafhankelijk zijn. Het gebruik van een chirurgische lumbale sympathectomie bij muizen, waarvan ooit werd gedacht dat het "vrijwel niet uitvoerbaar" was bij kleine dieren, maakt het mogelijk om specifiek gericht te zijn op postganglionische sympathische neuronen die de achterpoten innerveren. Dit manuscript beschrijft hoe de L2-L5 lumbale sympathische ganglia van een muis operatief kunnen worden verwijderd als een overlevingsoperatie, die de zweetreactie van de achterpoten en het aantal sympathische axonen in de heupzenuw op betrouwbare wijze vermindert.

Inleiding

Perifere zenuwletsels (PNI's) kunnen leiden tot motorische, sensorische en sympathische tekorten in distale weefseldoelen die zelden volledig functioneel herstellen1. PNI-onderzoek heeft zich vaak gericht op de motorische en sensorische regeneratie; Bijna een kwart van de heupzenuw van de rat bestaat echter uit niet-gemyeliniseerde sympathische axonen2. De rol van sympathische innervatie in de perifere weefsels wordt echter niet volledig begrepen3. Het sympathische zenuwstelsel speelt een belangrijke rol bij het handhaven van lichamelijke homeostase en neemt deel aan immuunregulatie, thermoregulatie, vasculaire tonus, mitochondriale biogenese en meer 4,5,6,7,8,9,10,11 . Wanneer sympathische innervatie bij de neuromusculaire junctie verloren gaat, worden aanhoudende spierzwakte en synaptische instabiliteit waargenomen ondanks het behoud van motorneuroninnervatie12. Het is aangetoond dat deze sympathische regulatie van synaptische transmissie op de neuromusculaire overgang afneemt met veroudering13,14, wat bijdraagt aan sarcopenie, gedefinieerd als de leeftijdsafhankelijke vermindering van spiermassa, kracht en kracht15. Een beter begrip van de rol van sympathische innervatie van perifere weefsels is noodzakelijk voor de ontwikkeling van therapieën die de functionele resultaten voor patiënten met PNI's en andere vormen van sympathische disfunctie zullen optimaliseren.

Een sympathectomie is een krachtig experimenteel hulpmiddel dat onderzoek mogelijk maakt naar de rol van sympathische innervatie in distale doelweefsels. In het bijzonder verwijdert verwijdering van de sympathische ganglia op L2-L5-niveau een meerderheid van de sympathische innervatie naar de onderste ledematen, wat vooral nuttig is voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de heupzenuw.

Dit protocol beschrijft de verwijdering van postganglionische sympathische neuronen op L2-L5-niveau uit een muis als een overlevingsoperatie. Deze procedure vereist microchirurgische vaardigheden van knaagdieren en vertrouwdheid met de anatomie van muizen, en veroorzaakt, wanneer effectief uitgevoerd, geen zichtbare fenotypische verschillen. Een chirurgische lumbale sympathectomie is gebruikt in onderzoek bij knaagdieren, meer bij ratten dan bij muizen 16,17,18,19,20,21; Er bestaat momenteel echter geen gedetailleerd protocol waarin het protocol wordt beschreven. Eerdere studies die gebruik maakten van de lumbale sympathectomie hebben zich voornamelijk gericht op de rol van sympathische innervatie in de pijnrespons, die over het algemeen wordt verzwakt door sympathectomie in verschillende modellen voor zenuwbeschadiging. Minder studies hebben deze techniek gebruikt bij muizen22, waarschijnlijk vanwege de kleinere omvang van anatomische oriëntatiepunten, omdat het gebruik van chirurgische sympathectomie werd aangenomen als "vrijwel niet uitvoerbaar" bij kleine dieren23,24. Gelokaliseerde sympathectomieën in de vorm van microsympathectomieën zijn ook gebruikt in knaagdiermodellen, ook meestal in de context van pijngedrag 25,26,27. De microsympathectomie maakt, in tegenstelling tot de totale lumbale sympathectomie, gebruik van een dorsale benadering waarbij een segment van de grijze ramus naar een specifieke ruggenmergzenuw wordt losgekoppeld en verwijderd, waardoor een zeer gerichte sympathectomie mogelijk is die wijdverspreide bijwerkingen zal voorkomen.

Omdat muismodellen van cruciaal belang zijn voor veel onderzoeken die genetische manipulatie vereisen, zal deze procedure ook veelzijdige toepassingen hebben die verder gaan dan de breedte van perifere zenuwbeschadigingen. Met behulp van een transabdominale benadering kunnen de lumbale sympathische ganglia betrouwbaar worden gevisualiseerd en verwijderd van de muis zonder duidelijke nadelige effecten. Hoewel er protocollen beschikbaar zijn voor de chemische vernietiging van postganglionische sympathische neuronen, zoals het gebruik van 6-hydroxydopamine (6-OHDA)23,24, maakt deze chirurgische ingreep anatomisch specifieke targeting van de postganglionische lumbale sympathische ganglia mogelijk. Het gebruik van een chirurgische sympathectomie vermijdt ook de niet-specifieke en dosisafhankelijke zorgen die verband houden met farmacologische methoden28,29.

Het gebruik van chemische sympathectomieën via toediening van 6-OHDA werd in 1967 beschreven als een eenvoudige manier om selectieve vernietiging van adrenerge zenuwuiteinden te bereiken, aangezien chirurgische sympathectomieën bij kleine dieren niet de voorkeur hadden23,24. 6-OHDA is een catecholaminerge neurotoxine dat endogeen wordt gevormd bij patiënten met de ziekte van Parkinson, en de toxiciteit ervan is afgeleid van het vermogen om vrije radicalen te vormen en de elektronentransportketen in mitochondriën te remmen30,31. Door transportmechanismen voor de opname van noradrenaline-1 kan 6-OHDA zich ophopen in noradrenerge neuronen, zoals postganglionische sympathische neuronen28. Uiteindelijk wordt het neuron vernietigd door 6-OHDA; Terminals in het perifere zenuwstelsel regenereren echter wel, met het herstel van de functionele activiteit, zelfs wanneer de aminespiegels nog steeds verlaagd zijn. Er zijn ook verschillende doseringsdrempels aanwezig voor verschillende organen als reactie op 6-OHDA, en van hogere doses 6-OHDA is aangetoond dat ze meer niet-specifieke effecten vertonen, waardoor de neurotoxische gevolgen worden uitgebreid tot niet-catecholamine-bevattende neuronen en zelfs niet-neuronale cellen. Afgezien van noradrenerge neuronen, worden dopaminerge neuronen ook beïnvloed door 6-OHDA29, waardoor de chemische sympathectomie uiteindelijk minder specifiek is voor postganglionische sympathische neuronen dan de chirurgische sympathectomie.

Daarom maakt een chirurgische lumbale sympathectomie de gerichte ablatie van de sympathische innervatie naar de onderste ledematen mogelijk, die kan worden gecombineerd met een verscheidenheid aan experimentele technieken en genetische manipulaties bij de muis om te bestuderen hoe het sympathische zenuwstelsel bijdraagt aan verschillende letsel- en ziektetoestanden.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Emory University (onder het IACUC-protocolnummer PROTO201700371). In dit onderzoek werden vier volwassen vrouwelijke wildtype C57BL/6J-muizen gebruikt, 14 weken oud en met een gewicht tussen 16-21 g. De details van de reagentia en apparatuur die hier worden gebruikt, staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Preoperatieve voorbereiding

  1. Autoclaaf de chirurgische instrumenten: 1 scherpe schaar, 2 pincetten met fijne punt, 1 naaldschroevendraaier.
  2. Verwarm een verwarmingskussen tot 37 °C en plaats het onder het chirurgische tafelblad.
  3. Spuit het operatiegebied, inclusief de anesthesie-inductiekamer, in met een ontsmettingsmiddel en veeg het grondig af met keukenpapier.
  4. Zorg ervoor dat u zich goed aankleedt en de handen wast voordat u de muis aanraakt.
  5. Voed de muis met meloxicam in een lichaamsgewicht van 5 mg/kg en geef de muis ruim de tijd om het geneesmiddel volledig door te slikken om aspiratie tijdens de inductie te voorkomen.
  6. Induceer de muis onder narcose met 3% isofluraan in 1 l/min zuurstof (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  7. Zodra de muis is verdoofd (geen reactie op teenknijp), plaatst u de muis op het chirurgische tafelblad, liggend, met de neus in een passende neuskegel.
  8. Zodra de muis goed in de neuskegel past, stelt u de isofluraan in op 2% voor behoud van de anesthesie.
  9. Breng ooggel aan op de ogen van de muis om keratoconjunctivitis sicca (droge ogen) te voorkomen.
  10. Zorg ervoor dat de muis goed is vastgezet met chirurgische tape aan het chirurgische tafelblad.
  11. Controleer continu op ademhalingsgemak en voldoende ademhalingsfrequentie.
  12. Scheer de vacht van de buik van de muis vanaf het niveau van de geslachtsdelen tot onder de ribben.
  13. Nadat de vacht is verwijderd, veegt u eerst het operatiegebied af in een cirkelvormige beweging, van centraal naar perifeer, met 70% ethanol. Veeg vervolgens het operatiegebied af met betadine in dezelfde cirkelvormige beweging. Herhaal zowel de stappen van ethanol als betadine in totaal 3 keer.
  14. Drapeer de muis met een steriel chirurgisch laken met een gat van de juiste grootte dat uit het midden is gesneden om het operatieveld te visualiseren. De ruitvormige vorm kan worden gemaakt door het laken dubbel te vouwen en een gelijkbenige driehoek te knippen met een hoogte van ~10 mm en een basis van ~15 mm.

2. Incisies

  1. Maak met een scherpe schaar en een pincet met fijne punt een incisie in de middellijn van ~1 mm boven het niveau van de symfyse van het schaambeen tot ~2 mm onder de ribben.
  2. Identificeer de fascia van de middellijn (linea alba) tussen de bilaterale rectus abdominis-spieren. Til met het pincet de buikspieren weg van de onderliggende organen en snijd langs de linea alba om de buikholte binnen te gaan.
    OPMERKING: De linea alba kan worden geïdentificeerd door de bilaterale rectus abdominus-spieren voorzichtig zijwaarts te trekken om een dunnere fascialijn te onthullen die in de lengterichting langs de middellijn ligt32. Door de incisie door de linea alba te maken, kan de spier gemakkelijker worden gesloten.
  3. Trek de buikspieren en huid met 5-0 hechtingen zijdelings in om de volgende stappen goed te visualiseren.

3. Identificatie van de L2-L5 lumbale sympathische ganglia

  1. De lumbale sympathische ganglia liggen posterieur van de abdominale aorta en de inferieure vena cava. Om de aorta te visualiseren, verwijdert u de darmen gedeeltelijk uit de buikholte.
    OPMERKING: De sympathische ganglia van L2-L5-niveau lopen van het niveau van de aortavertakking in de darmvaten naar het niveau van de linker nierslagader21,33.
    1. Leg een steriel katoenen vierkant doordrenkt met steriele zoutoplossing op het laken, superieur en links van de incisie. Duw voorzichtig, met 2 steriele applicators met wattenstaafjes, de dikke darm en dunne darm gedeeltelijk naar buiten op het met zoutoplossing doordrenkte katoenen vierkant.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de blindedarm en de appendix uit de buikholte zijn en dat de dalende dikke darm kan worden gevisualiseerd.
    2. Bedek de blootgestelde darmen met een ander met zout verzadigd katoenen vierkant.
    3. Controleer regelmatig de peristaltiek tijdens de operatie, die kan worden geïdentificeerd door ritmische bewegingen van de darmen.
  2. Identificeer de dalende dikke darm, het deel van de darm dat naar het rectum en de anus reist en zichtbare ontlasting kan bevatten, en buig deze structuur naar links af met een gesloten pincet om de abdominale aorta en inferieure vena cava te onthullen. Deze twee vaten zijn gebonden door bindweefsel en moeten als één geheel bewegen.
    1. Til met een pincet de buikvaten op aan het omringende bindweefsel. Terwijl deze wordt opgetild, plaatst u voorzichtig een 5-0 nylon hechtdraad door het bindweefsel.
      LET OP: Prik NIET met de naald in de buikvaten: dit zal leiden tot snelle decompensatie van de muis en waarschijnlijk tot de dood.
    2. Zodra de hechting door het bindweefsel is ingebracht, buigt u de buikvaten naar links af. Dit geeft een driehoekig venster, waardoor directe visualisatie van de bilaterale psoas-spieren mogelijk is.
      OPMERKING: Vanwege de intieme verbindingen die de ganglia hebben met de buikvaten, zullen de sympathische ganglia, hoewel meestal op de middellijn gelegen, samen met de bloedvaten iets naar links (rechts van de muis) worden afgebogen. Zodra de buikvaten zijn afgebogen, moet men een driehoek visualiseren, waarbij de twee zijden aan de linkerkant bestaan uit de afgebogen buikvaten en de rechterkant wordt gedefinieerd door de middellijn van de muis (tussen de bilaterale psoas-spieren). De sympathische ganglia liggen in het midden van deze driehoek (Figuur 1A). Ze bewegen verticaal naast elkaar en lijken doorschijnend. Ze kunnen een klein bloedvat overlappen dat in de middellijn van de muis duikt en plat op zijn rechter psoas-spier ligt. Gebruik een pincet om eventuele bovenliggende fascia botweg te ontleden om de ganglia te onthullen (Figuur 1B).
  3. Identificeer de linker nierslagader en de linker testiculaire of eierstokslagader.
    OPMERKING: Dit zijn grote vaten die een vierhoek zullen vormen, waarvan de zijkanten voornamelijk bestaan uit de linker nierslagader, de middellijn en de abdominale aorta/inferieure vena cava van het dier lateraal, en de linker testiculaire of eierstokslagader inferieur. De ganglia op L2-niveau zijn groot en liggen binnen deze vierhoek (Figuur 1A). Ontleed voorzichtig stomp om deze vierhoek met een pincet binnen te gaan en identificeer de bilaterale L2-ganglia (Figuur 1B).
  4. Zodra de onderste en bovenste delen van de ganglia zijn geïdentificeerd, pakt u het inferieure aspect van de zichtbare bilaterale ganglia vast met een pincet en trekt u het omhoog. Visualisatie van meer inferieur gelegen ganglia, zoals L4 en L5, kan worden verhoogd door met het tweede pincet voorzichtig op organen te duwen die het zicht inferieur belemmeren.
    OPMERKING: Het visualiseren van het perforatievat in de middellijn zoals vermeld in stap 3.2.2 zorgt voor een completere lumbale sympathectomie. Houd een tweede pincet in de andere hand en trek de fascia en neuronale verbindingen die de ganglia in de buik vasthouden weg terwijl u tegelijkertijd de ganglia zelf omhoog trekt met het eerste pincet. Slechts één pincet mag de ganglia vasthouden, terwijl de andere de fascia en neuronale verbindingen verwijdert. Eenmaal ter hoogte van de linker testiculaire of eierstokslagader kan het nuttig zijn voor L2-identificatie als de onderste keten ganglia nog intact zijn, omdat de L2 ganglia zal bewegen wanneer deze door de onderste keten wordt getrokken. De L3-5 ganglia kan worden gebroken bij de testiculaire of eierstokslagader voordat de L2 ganglia met een pincet uit de vierhoek wordt gehaald. De enige ganglia die in de vierhoek aanwezig zijn, zijn de L2-ganglia.
  5. Deze procedure moet minimaal bloedverlies hebben. Als er een bloeding optreedt, zorg dan voor voldoende hemostase voordat u deze sluit.

4. Sluiting van de huid

  1. Nadat voldoende hemostase is bereikt, verwijdert u de hechting die de buikvaten op hun plaats houdt.
  2. Gebruik 2 steriele applicators met wattenstaafje om de omgeleide darmen voorzichtig terug in de buikholte.
  3. Voer met een 5-0 resorbeerbare hechting een rijgsteek uit om de buikspieren te benaderen.
  4. Gebruik bij 5-0 nylon hechtingen eenvoudige onderbroken hechtingen om de huid te sluiten.
  5. Breng een royale laag antibiotische zalf, zoals Neosporin, aan op de incisieplaats.
  6. Plaats de muis in een schone kooi op een verwarmingskussen.
  7. Observeer de muis elke 15 minuten totdat hij wakker en ambulant is. Dit duurt meestal minder dan 30 minuten.

5. Pilocarpine zweettest

OPMERKING: Om te beoordelen of de sympathische functionele activiteit na een lumbale sympathectomie is uitgeput, werd 7 dagen na de lumbale sympathectomie een pilocarpine-zweettest gebruikt.

  1. Bereid een oplossing van 1% pilocarpinehydrochloride in 0,9% NaCl naast een mengsel van 10% aardappelzetmeel in ricinusolie.
  2. Bedek met een penseel het plantaire oppervlak van de voet met betadine. Laat deze laag volledig drogen.
  3. Zodra de betadinelaag droog is, gebruik je een aparte verfkwast om een laag van 10% zetmeel in ricinusolie aan te brengen.
  4. Dien 0,25 μL/g lichaamsgewicht van 1% pilocarpine subcutaan toe met behulp van een spuit in de losse huid over de hals. Start een timer direct na toediening van pilocarpine.
  5. Maak 8 minuten na de injectie foto's van het plantaire oppervlak van de voet.
  6. Tel met behulp van Fiji het aantal donkere vlekken op alle zes (6) voetzolen (Figuur 2A).

6. Immunohistochemie

OPMERKING: Om de degeneratie van sympathische axonen in de perifere zenuwen na lumbale sympathectomie te beoordelen, werden de bilaterale heupzenuwen geoogst op postoperatieve dag 21.

  1. Verdoof de muizen (volgens stap 1 van het protocol), oogst de bilaterale heupzenuwen en euthanaseer het dier vervolgens onmiddellijk (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  2. Plaats de heupzenuwen gedurende 20 minuten rechtstreeks in 4% paraformaldehyde in 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en breng ze vervolgens over naar 20% sucrose in 0,1 M PBS voor cryoprotectie 's nachts bij 4 °C.
  3. Snijd de heupzenuwen in de lengterichting door met behulp van een cryostaat op 20 μm en plaats de secties op geladen objectglaasjes.
  4. Blokkeer de zenuwsecties met 10% normaal geitenserum (NGS) in tris gebufferde zoutoplossing met 1% Tween 20 (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  5. Verwijder de blokkeerbuffer en vervang deze door de primaire antilichamen konijn anti-tyrosine hydroxylase en kip anti-neurofilament-zwaar verdund in de blokkeerbuffer (10% NGS in TBST) bij respectievelijk 1:750 en 1:1000. Laat de primaire antilichamen een nacht incuberen in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur.
  6. Wasglaasje met TBST 3 keer, 10 min per wasbeurt, voordat u de secundaire antilichamen geit anti-konijn 647 en geit anti-kip 488 aanbrengt, beide verdund op 1:200 in de blokkeerbuffer. Laat de secundaire antilichamen 2 uur bij kamertemperatuur incuberen in een vochtigheidskamer.
  7. Was de glijbaan 4 keer met TBST, 10 minuten per wasbeurt, en laat de glijbaan drogen op een tegen licht beschermde plaats voordat u deze monteert.
  8. Beeld zenuwsecties ten minste 40 μm uit elkaar op een fluorescerende microscoop op het 10x-objectief.
  9. Strek op Fiji de zenuwsecties recht en teken drie willekeurig geplaatste verticale lijnen die de breedte van de sectie overspannen. Tel het aantal axonen dat elke verticale lijn kruist en deel dat door de breedte van de sectie op de verticale lijn. Herhaal dit voor elk van de drie verticale lijnen per sectie. Gemiddeld het gemiddelde van de drie verkregen waarden per sectie en neem verder het gemiddelde van de waarden van de drie secties per zenuw.

Resultaten

Dit protocol beschrijft de chirurgische verwijdering van postganglionische lumbale sympathische neuronen uit een muis. Twee muizen kregen lumbale sympathectomieën en twee muizen dienden als controles. Om een succesvolle chirurgische lumbale sympathectomie te bereiken, moet een adequate visualisatie van ten minste de bilaterale lumbale sympathische ganglia L2 en L3 worden bereikt, zoals te zien is in figuur 1. Verwijdering van de ganglia L4 en L5 zou volledige sympathische denervatie van het onderlichaam bereiken; De visualisatie van de onderste ganglia kan echter worden belemmerd door de urogenitale organen. Eerdere retrograde traceringsstudies hebben aangetoond dat de meerderheid van de neuronen in de L2-L5 ganglia zich in de L2 en L3 ganglia bevinden. Hoewel alleen vrouwelijke muizen van dezelfde leeftijd werden gebruikt om de representatieve resultaten te bereiken, is deze chirurgische ingreep vele malen gereproduceerd bij zowel mannelijke als vrouwelijke muizen zonder significante anatomische verschillen waargenomen in termen van de locaties van de testiculaire of eierstokslagader en de sympathische ganglia.

Na verwijdering van de ganglia neemt de zweetreactie als reactie op pilocarpine snel af, met significante verschillen gezien op postoperatieve dag 7 (Figuur 2). Postoperatieve dag 7 werd gekozen vanwege de exponentiële afname van sympathisch gemedieerde zweetactiviteit binnen 7 dagen na verschillende heupzenuwletsels bij ratten34. Omdat axondegeneratie tot 14 dagen kan duren om te voltooien en vanwege mogelijke moeilijkheden bij het intraoperatief visualiseren van de L4- en L5-ganglia (blaas en geslachtsorganen kunnen het zicht belemmeren), is het mogelijk dat de zweetreactie niet volledig wordt opgeheven35,36.

De tyrosinehydroxylase-positieve (TH+) axondichtheid was significant afgenomen op postoperatieve dag 21 zonder verandering in de dichtheid van de neurofilamentzware keten (NF-H) (Figuur 3). Het is onwaarschijnlijk dat TH+-axonen volledig uitgeput zijn vanwege de aanwezigheid van TH+-sensorische axonen die laagdrempelige mechanoreceptoren innerveren en mogelijke problemen met het visualiseren van de volledige lumbale sympathische keten37.

figure-results-1
Figuur 1: Intraoperatief beeld van de lumbale sympathische ganglia. (A) Schema met verwachte oriëntatiepunten. (B) Representatief intraoperatief beeld met gelabelde herkenningspunten. De lumbale sympathische ganglia bevinden zich achter de dalende abdominale aorta en de inferieure vena cava (afgebogen). De ganglia worden naar rechts van de muis getrokken met de afbuiging van de buikvaten en bevinden zich op de rechter psoas, inferieur en superieur doorkruisend. De bilaterale L2-ganglia kunnen worden gevisualiseerd tussen de linker nierslagader en de linker testiculaire of eierstokslagader, en de L3-ganglia worden inferieur gezien aan de linker testiculaire of eierstokslagader. Schaalbalk: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Chirurgische lumbale sympathectomie vermindert het aantal zweetplekken op de achterpoot . (A) Schema van de locaties van de voetzolen op het plantaire oppervlak van de achterpoot van de muis. (B) Een representatief beeld van de zweetreactie 8 minuten na de injectie van pilocarpine bij een intact dier. (B') Ingezoomde afbeelding met witte pijlen die een select aantal zweetplekken aangeven. (C) Een representatief beeld van de zweetreactie 8 minuten na de injectie van pilocarpine bij een dier met sympathectomie op postoperatieve dag 7. (C') Ingezoomde afbeelding met witte pijlen die een select aantal zweetplekken aangeven. (D) Het totale aantal zweetplekken op alle zes voetzolen van de achterpoot bij muizen die intact zijn versus muizen die sympathectomie hebben ondergaan. De gegevens worden weergegeven met de lijn die de mediaan voorstelt. Mann-Whitney-test. *P < 0,05. Schaal balken: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Chirurgische lumbale sympathectomie (Sympx) vermindert het aantal sympathische axonen in de heupzenuw. (A) Tyrosinehydroxylase (TH)-positieve axonen per μm van de heupzenuw (breedte van de zenuw) op postoperatieve dag 21. Representatieve zenuwsecties van TH-kleuring in een intacte (B) en gesympathectomiseerde (B') muis. (C) Neurofilament-zware keten (NF-H)-positieve axonen per μm van de heupzenuw. Representatieve zenuwdoorsnede van NF-H-kleuring in een intacte (D) en gesympathectomiseerde (D') muis. Magenta stippellijnen vertegenwoordigen mogelijke willekeurig geplaatste verticale lijnen die de breedte overspannen van het zenuwgedeelte dat wordt gebruikt om de axondichtheden in de zenuw te berekenen. Magenta pijlen geven een select aantal axonen aan die de willekeurig geplaatste verticale lijnen kruisen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Ongepaarde t-toets. **p < 0,01. Schaal balken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De lumbale sympathische ganglia zijn zeer kleine structuren die zich achter veel kritieke buikorganen en grote bloedvaten bevinden. Daarom vereist deze procedure aanzienlijke precisie en nauwkeurigheid. Een groot deel van de moeilijkheid ligt in het intraoperatief identificeren van de sympathische ganglia. Er wordt gesuggereerd dat de leerling eerst in staat is om de ganglia in een muiskadaver te identificeren voordat hij deze procedure in een levende muis probeert. Het oplossen van problemen zal vaak moeten plaatsvinden bij het identificeren van de sympathische ganglia na de omleiding van de darmen. Om een adequate visualisatie te garanderen, moet de dalende dikke darm zichtbaar zijn. De darmomleiding buiten de buikholte moet de blindedarm omvatten. Bovendien kan de blaas vol en vergroot zijn, wat het zicht op de dalende dikke darm en vervolgens de dalende abdominale aorta en de inferieure vena cava kan belemmeren. Idealiter wordt de blaas handmatig afgekolfd zodra de muis onder narcose is voordat de eerste incisie in de huid wordt gemaakt. Als de blaas echter niet wordt afgekolfd en het intraoperatieve zicht wordt geblokkeerd, is zachte expressie met 2 steriele applicators met wattenstaafjes mogelijk. Zorg ervoor dat u de urineleiders, die aan het achterste deel van de blaas zijn bevestigd, niet beschadigt. Zodra de abdominale aorta en de inferieure vena cava achter de dalende dikke darm zijn geïdentificeerd, is adequate afbuiging en stabilisatie van de bloedvaten van cruciaal belang voor visualisatie van de sympathische ganglia. De fascia is relatief taai en als de hechting uitsluitend door de laag fascia en neuronale verbindingen wordt geplaatst en niet door de vaatwanden, moeten de bloedvaten ten minste 1 mm van de middellijn worden getrokken. De fascia die over de sympathische ganglia ligt, kan voorzichtig worden weggesneden met een pincet. Mocht een klein bloedvat tijdens de procedure breken, oefen dan gedurende ten minste 10 s druk uit met een steriele applicator met katoenen punt om voldoende hemostase te garanderen voordat u het sluit. Als de grote buikvaten tijdens de operatie worden doorboord, moet de muis snel worden geëuthanaseerd.

Hoewel deze methode directe visualisatie en verwijdering van de sympathische ganglia mogelijk maakt, waardoor deze postganglionische sympathische neuronen specifieker kunnen worden aangepakt in vergelijking met chemische sympathectomieën23, zijn er enkele beperkingen. Deze operatie resulteert in de verwijdering van de L2-L5 lumbale sympathische ganglia; vanwege de visuele obstructie die wordt veroorzaakt door vitale urogenitale organen, zijn de laagste ganglia, zoals de ganglia op L4-L5-niveau, echter moeilijker te visualiseren en te verwijderen tijdens deze procedure. De meerderheid van de neuronen die de onderste ledematen innerveren, bevinden zich in de grote L2-ganglia. De L5-ganglia zijn extreem klein en bevatten minder neuronen, zoals te zien is in eerdere fluorescerende retrograde traceringsexperimenten38; Het niet verwijderen van deze neuronen kan echter de analyse van de resultaten van de meest distale structuren, zoals de voeten, verstoren. Om betere resultaten te garanderen bij het bestuderen van de distale doelen in de voeten, is het raadzaam om het geëxtraheerde weefsel te controleren om het aantal ganglia te tellen dat is verwijderd. Dit kan worden gedaan via een fluorescerende reportermuis waarin de postganglionische sympathische neuronen gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd of via een fluorescerende retrograde tracer die voorafgaand aan de operatie in het distale doelwit wordt geïnjecteerd. Enkele fluorescerende reportermuizen voor dit doel zijn de ThCre:mTmG (zie Tabel met materialen), die extreem schaarse etikettering van tyrosinehydroxylase-positieve neuronen heeft39, de Phox2bCre:tdTomato (zie Tabel met materialen), die een matige labeling van postganglionische sympathische neuronenheeft 40,41, en de ThCre:tdTomato (zie Tabel met materialen), die een uitgebreide labeling heeft van de postganglionische sympathische neuronen42. Dit is geen uitputtende lijst van beschikbare lijnen.

Bovendien kunnen muizen, vanwege de grote incisie die nodig is voor deze chirurgische ingreep, een langere herstelperiode nodig hebben voordat verdere experimenten kunnen worden uitgevoerd. Muizen moeten gedurende ten minste 3 dagen worden gecontroleerd op de juiste ontlasting, urineren en voeding. Bovendien kan onjuiste hemostase leiden tot niet-geadresseerde intra-abdominale bloedingen, wat op onverwachte tijdstippen kan leiden tot de dood van muizen. Daarom is het van cruciaal belang voor het succes van toekomstige experimenten om ervoor te zorgen dat hemostase wordt bereikt voordat de operatie wordt afgesloten. De sympathische neuronen kunnen ook chemisch worden aangevallen, zoals eerder vermeld24.

Het gebruik van chirurgische sympathectomieën zal een groot aantal onderzoeken mogelijk maken die gericht zijn op het onderzoeken van de rol van postganglionische sympathische innervatie in distale doelen, zoals de rol van sympathische innervatie bij de neuromusculaire junctie12. Bovendien kunnen fluorescerende retrograde traceringstechnieken worden gebruikt om sympathische reïnnervatie van distale weefsels te kwantificeren, aangezien dit protocol kan worden aangepast om de ganglia en bloc te extraheren uit paraformaldehyde-gefixeerde muizen38. In de context van perifere zenuwletsels zal dit chirurgische "knock-out" -model een betere karakterisering mogelijk maken van het verwachte sympathische functionele herstel in eerder geïnnerveerde weefsels.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke onder toekenningsnummer K01NS124912 en gedeeltelijk door een ontwikkelingssubsidie van het door de NIH gefinancierde Emory Specialized Center of Research Excellence in Sex Differences U54AG062334 en het Medical Scientist Training Program van Emory University School of Medicine. Dank aan David Kim, postbaccalaureaat, voor het doorsnijden van heupzenuwen en aan HaoMin SiMa, onderzoeksspecialist, voor het 3D-printen van een telefoonhouder voor onze stereomicroscoop waarmee de video kon worden gefilmd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-0 absorable sutureCP Medical421A
5-0 nylon sutureMed-Vet InternationalMV-661
70% ethanolSigma-AldrichE7023-4L
Anesthesia Induction ChamberKent Scientific VetFloVetFlo-0530XS
Anesthesia VaporizerKent Scientific VetFlo13-005-202
BetadineHealthyPetsBET16OZ
C57BL/6J miceJackson Laboratory#000664
Chicken anti-neurofilament-heavyAbcamab72996
CryostatLeicaCM1850
Data Analysis SoftwarePrism
Fine-tipped tweezersWorld Precision Instruments500233
Fluorescent microscopeNikonTi-E
Goat anti-chicken 488InvitrogenA32931
Goat anti-rabbit 647InvitrogenA21245
Heating padBraintree Scientific39DP
Image Analysis SoftwareFiji
Imaging SoftwareNikonNIS-Elements
IsofluraneMed-Vet InternationalRXISO-250
MeloxicamMed-Vet InternationalRXMELOXIDYL32
Needle driverRoboz Surgical StoreRS-7894
Normal Goat SerumAbcamab7481
Ophthalmic ointmentRefreshRefresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato mutant miceJackson Laboratory #016223, #007914
Pilocarpine hydrochlorideSigma-AldrichP6503
Rabbit anti-tyrosine hydroxylaseAbcamab112
Small straight scissors Fine Science Tools14084-09
Sterile cotton swabs 2x2Dynarex3252
Sterile cotton tipped applicatorsDynarex4301
Sterile drapeMed-Vet InternationalDR4042
Sterile saline solutionMed-Vet International1070988-BX
ThCre:mTmG mutant miceMutant Mouse Resource and Research Centersstrain #017262-UCDJackson Laboratory, strain #007576
ThCre:tdTomato mutant miceEuropean Mouse Mutant Archivestrain #00254Jackson Laboratory, strain #007914

Referenties

  1. Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: An international survey of current treatments and future perspectives. J Reconstr Microsurg. 25 (06), 339-344 (2009).
  2. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
  3. Tian, T., Moore, A. M., Ghareeb, P. A., Boulis, N. M., Ward, P. J. A perspective on electrical stimulation and sympathetic regeneration in peripheral nerve injuries. Neurotrauma Rep. 5 (1), 172-180 (2024).
  4. Gagnon, D., Crandall, C. G. Sweating as a heat loss thermoeffector. Hand Clin Neurol. 156, 211-232 (2018).
  5. Grassi, G. Role of the sympathetic nervous system in human hypertension. J Hypertens. 16 (12), 1979-1987 (1998).
  6. Dibona, G. F. Sympathetic nervous system and the kidney in hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens. 11 (2), 197-200 (2002).
  7. Elenkov, I. J., Wilder, R. L., Chrousos, G. P., Vizi, E. S. The sympathetic nerve-An integrative interface between two supersystems: The brain and the immune system. Pharmacol Rev. 52 (4), 595-638 (2000).
  8. Besedovsky, H. O., Del Rey, A., Sorkin, E., Da Prada, M., Keller, H. Immunoregulation mediated by the sympathetic nervous system. Cell Immunol. 48 (2), 346-355 (1979).
  9. Straka, T., et al. Postnatal development and distribution of sympathetic innervation in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 19 (7), 1935(2018).
  10. Geng, T., et al. Pgc-1α plays a functional role in exercise-induced mitochondrial biogenesis and angiogenesis but not fiber-type transformation in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (3), C572-C579 (2010).
  11. Lin, J., Handschin, C., Spiegelman, B. M. Metabolic control through the pgc-1 family of transcription coactivators. Cell Metab. 1 (6), 361-370 (2005).
  12. Khan, M. M., et al. Sympathetic innervation controls homeostasis of neuromuscular junctions in health and disease. Proc Natl Acad Sci. 113 (3), 746-750 (2016).
  13. Delbono, O., Rodrigues, A. C. Z., Bonilla, H. J., Messi, M. L. The emerging role of the sympathetic nervous system in skeletal muscle motor innervation and sarcopenia. Ageing Res Rev. 67, 101305(2021).
  14. Rodrigues, A. C. Z., et al. Heart and neural crest derivative 2-induced preservation of sympathetic neurons attenuates sarcopenia with aging. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 12 (1), 91-108 (2021).
  15. Rosenberg, I. H. Summary comments. Am J Clin Nutr. 50 (5), 1231-1233 (1989).
  16. Murata, Y., Olmarker, K., Takahashi, I., Takahashi, K., Rydevik, B. Effects of lumbar sympathectomy on pain behavioral changes caused by nucleus pulposus-induced spinal nerve damage in rats. Eur Spine J. 15, 634-640 (2006).
  17. Xie, J., Park, S. K., Chung, K., Chung, J. M. The effect of lumbar sympathectomy in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. J Pain. 2 (5), 270-278 (2001).
  18. Lee, D. H., Katner, J., Iyengar, S., Lodge, D. The effect of lumbar sympathectomy on increased tactile sensitivity in spinal nerve ligated rats. Neurosci Lett. 298 (2), 99-102 (2001).
  19. Ringkamp, M., et al. Lumbar sympathectomy failed to reverse mechanical allodynia-and hyperalgesia-like behavior in rats with l5 spinal nerve injury. Pain. 79 (2-3), 143-153 (1999).
  20. Zhao, C., et al. Lumbar sympathectomy attenuates cold allodynia but not mechanical allodynia and hyperalgesia in rats with spared nerve injury. J Pain. 8 (12), 931-937 (2007).
  21. Zheng, Z. -F., et al. Recovery of sympathetic nerve function after lumbar sympathectomy is slower in the hind limbs than in the torso. Neural Regen Res. 12 (7), 1177(2017).
  22. Holmberg, K., Shi, T. -J. S., Albers, K. M., Davis, B. M., Hökfelt, T. Effect of peripheral nerve lesion and lumbar sympathectomy on peptide regulation in dorsal root ganglia in the ngf-overexpressing mouse. Exp Neurol. 167 (2), 290-303 (2001).
  23. Thoenen, H., Tranzer, J. Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve endings with 6-hydroxydopamine. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 261, 271-288 (1968).
  24. Thoenen, H., Tranzer, J. P., Häusler, G. Chemical sympathectomy with 6-hydroxydopamine. New Aspects of Storage and Release Mechanisms of Catecholamines. , 130-143 (1970).
  25. Xie, W., et al. Localized sympathectomy reduces mechanical hypersensitivity by restoring normal immune homeostasis in rat models of inflammatory pain. J Neuroscience. 36 (33), 8712-8725 (2016).
  26. Zhu, X., Xie, W., Zhang, J., Strong, J. A., Zhang, J. -M. Sympathectomy decreases pain behaviors and nerve regeneration by downregulating monocyte chemokine ccl2 in dorsal root ganglia in the rat tibial nerve crush model. Pain. 163 (1), e106-e120 (2022).
  27. Tonello, R., et al. Local sympathectomy promotes anti-inflammatory responses and relief of paclitaxel-induced mechanical and cold allodynia in mice. Anesthesiology. 132 (6), 1540-1553 (2020).
  28. Kostrzewa, R. M., Jacobowitz, D. M. Pharmacological actions of 6-hydroxydopamine. Pharmacol Rev. 26 (3), 199-288 (1974).
  29. Michel, P., Hefti, F. Toxicity of 6-hydroxydopamine and dopamine for dopaminergic neurons in culture. J Neuroscience Res. 26 (4), 428-435 (1990).
  30. Andrew, R., et al. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls. Neurochemical Res. 18, 1175-1177 (1993).
  31. Glinka, Y., Gassen, M., Youdim, M. Mechanism of 6-hydroxydopamine neurotoxicity. J Neural Transm Suppl. 5, 55-66 (1997).
  32. Treuting, P. M., Dintzis, S. M., Montine, K. S. Comparative anatomy and histology: A mouse, rat, and human atlas. , Academic Press. 119(2017).
  33. Hweidi, S. A., Lee, S., Wolf, P. Effect of sympathectomy on microvascular anastomosis in the rat. Microsurgery. 6 (2), 9-96 (1985).
  34. Navarro, X., Kennedy, W. R. Sweat gland reinnervation by sudomotor regeneration after different types of lesions and graft repairs. Exp Neurol. 104 (3), 229-234 (1989).
  35. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8 (1), 1-13 (2011).
  36. Babetto, E., et al. Targeting nmnat1 to axons and synapses transforms its neuroprotective potency in vivo. J Neuroscience. 30 (40), 13291-13304 (2010).
  37. Brumovsky, P. R. Dorsal root ganglion neurons and tyrosine hydroxylase-an intriguing association with implications for sensation and pain. Pain. 157 (2), 314(2016).
  38. Tian, T., Harris, A., Owyoung, J., Sima, H., Ward, P. J. Conditioning electrical stimulation fails to enhance sympathetic axon regeneration. bioRxiv. , (2023).
  39. Tian, T., Ward, P. J. The ThCre: Mtmg mouse has sparse expression in the sympathetic nervous system. bioRxiv. , 2023(2023).
  40. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. J Comparative Neurol. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  41. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. -F. The homeobox gene phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  42. François, M., et al. Sympathetic innervation of the interscapular brown adipose tissue in mouse. Ann N Y Acad Sci. 1454 (1), 3-13 (2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Sympathisch zenuwstelselperifere zenuwbeschadigingpostganglionaire sympathische neuronenmuischirurgieregeneratie van sympathische axonendissectie van gangliatyrosinehydroxylase kleuringnervus ischiadicusneuronale celkweek

Gerelateerde artikelen