Dit protocol beschrijft de methode voor het verminderen van de inname van foliumzuur of choline via de voeding via de voeding bij vrouwelijke muizen voorafgaand aan de zwangerschap, met als doel de impact van het dieet van de moeder op de gezondheidsresultaten van het nageslacht te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Modificatie van niveaus van maternale foliumzuur of choline in de voeding om de impact van tekorten op de gezondheidsresultaten van nakomelingen te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Maternale voeding tijdens dracht en borstvoeding speelt een belangrijke rol in de neurologische ontwikkeling van het nageslacht. Het metabolisme van één koolstof (1C), dat zich concentreert rond foliumzuur en choline, evenals andere B-vitamines, speelt een sleutelrol tijdens de sluiting van de neurale buis van de zich ontwikkelende foetus. De impact van deze maternale voedingstekorten tijdens de zwangerschap op de gezondheidsresultaten van het nageslacht na de geboorte blijft echter relatief ongedefinieerd. Bovendien kunnen maternale voedingstekorten aan foliumzuur of choline van invloed zijn op andere gezondheidsresultaten bij nakomelingen - waardoor dit een waardevol model is. Dit protocol heeft tot doel de procedure te schetsen voor het induceren van een tekort aan het 1C-metabolisme bij vrouwelijke muizen door middel van dieetaanpassingen. Vrouwtjes worden bij het spenen, tot de leeftijd van 2 maanden, gedurende 4-6 weken voorafgaand aan de paring op een dieet gezet en blijven tijdens de dracht en lactatie op dieet. Nakomelingen van deze vrouwtjes kunnen worden beoordeeld op gezondheidsresultaten. Vrouwtjes kunnen meerdere keren worden gebruikt om nakomelingen te genereren, en weefsels van vrouwtjes kunnen worden verzameld om te meten voor metingen van 1C-metabolieten. Dit protocol geeft een overzicht van hoe maternale voedingstekorten aan foliumzuur of choline kunnen worden geïnduceerd om de gezondheidsresultaten van het nageslacht te bestuderen.
Inleiding
Maternale voeding tijdens zwangerschap en borstvoeding speelt een cruciale rol bij de ontwikkeling van het nageslacht. One-carbon (1C) metabolisme is een belangrijk metabolisch netwerk dat voedingssignalen integreert met biosynthese, redoxhomeostase en epigenetica. Foliumzuur en choline zijn centrale componenten van 1C die een belangrijke rol spelen bij de sluiting van de neurale buis. Het wordt algemeen aanbevolen voor vrouwen om foliumzuur en choline aan te vullen tijdens hun vruchtbarejaren1. Hoewel de cruciale rol van foliumzuur in de ontwikkeling van de foetus duidelijk is vastgesteld, blijven de onderliggende mechanismen onduidelijk. Vrouwen in de vruchtbare leeftijd wordt aangeraden foliumzuur te slikken voordat ze zwanger worden, aangezien de sluiting van de neurale buis plaatsvindt in het eerste trimester2. Zwangere moeders met een tekort aan foliumzuur of andere componenten van 1C, zoals choline, hebben een hogere incidentie van het baren van nakomelingen met neurale buisdefecten vanwege de hoge vraag naar nucleotidesynthese en andere processen die nodig zijn voor de vroegezwangerschapsperiode.
De langetermijnimpact van maternale diëten met een tekort aan inname van het 1C-metabolisme op de gezondheidsresultaten van het nageslacht wordt slecht begrepen. Onderzoek van onze laboratoria, evenals andere, heeft aangetoond dat maternale diëten met een tekort aan foliumzuur of choline inderdaad van invloed zijn op de gezondheidsresultaten van het nageslacht na ischemische beroerte met behulp van preklinische modellen 4,5,6. De impact van maternale voeding is ook aangetoond in klinische onderzoeken waarbij kleinere hersenvolumes en veranderde methylatieniveaus zijn beschreven7. De theorie van de Developmental Origins of Health and Disease (DOHaD) suggereert dat toekomstige chronische ziekten in de baarmoeder worden geprogrammeerd 8,9, en dat het dieet van de moeder een belangrijke rol speelt.
Dit protocol is ontworpen om de methode te schetsen voor het veranderen van 1C-voedingsconsumptie bij vrouwelijke muizen vóór de zwangerschap, met als doel de effecten van maternale voeding op de gezondheidsresultaten van het nageslacht te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd en alle proefdieren werden gebruikt in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Midwestern University (Protocol 2983). Vrouwelijke C57BL/6J-muizen, 2 maanden oud (lichaamsgewicht, ~20 g), werden in deze studie gebruikt. Over het algemeen kunnen vrouwelijke muizen in de vruchtbare leeftijd worden gebruikt10. Om ervoor te zorgen dat de effecten van kattenbakvulling worden vermeden, moeten voor elk dieet meerdere vrouwtjes worden gebruikt11. De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Experimentele voorbereiding
- Verkrijg foliumzuur- of choline-deficiënte voeding van commerciële fabrikanten van knaagdiervoeding. Raadpleeg Tabel 1 voor de gedetailleerde lijst van micro- en macronutriënten, inclusief de exacte hoeveelheid foliumzuur of choline die nodig is in deficiënte diëten.
OPMERKING: Er moet ook een bijbehorend controledieet worden besteld; De details zijn vermeld in tabel 1. Deze diëten waren gebaseerd op AIN93G en bevatten de aanbevolen voedingsstoffen voor knaagdieren10. - Bepaal in samenwerking met de fabrikant de kleuring van de diëten, omdat dit kan helpen bij de verdeling van de juiste diëten tijdens experimentele studies. Deze studie gebruikte groen voor foliumzuurdeficiënte diëten, geel voor choline en wit voor controlediëten. Ze zijn allemaal gemakkelijk te onderscheiden.
OPMERKING: Er zijn geen beperkingen op het waterverbruik. Het water bevat geen foliumzuur, choline of andere 1C-metabolieten.
2. Induceren van foliumzuur- of choline-voedingsdeficiëntie
- Voordat u de vrouwtjes op dieet zet, moet u alle dieren wegen. Dit wordt het basisgewicht genoemd.
- Afhankelijk van de individuele opstelling van de laboratoriumkooi (geventileerd of ongeventileerd, zie Materiaaltabel), vervang of vul de speciale dieetkorrels voor elke kooi een paar keer per week bij. Vul de kooivoederhoopers niet te vol met speciale diëten, omdat dit kan leiden tot verslechtering van de pellets zodra ze in wisselwerking staan met speeksel van dieren en na verloop van tijd bederf veroorzaken.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de dieetvoorraad wordt bewaard volgens de richtlijnen van de fabrikant en vóór de houdbaarheidsdatum wordt gebruikt. - Houd de vrouwelijke muizen 4-6 weken voor de paring op de diëten.
- Introduceer de mannelijke muizen in de vrouwelijke kooien om te paren. Zorg ervoor dat mannetjes in vrouwenkooien worden geïntroduceerd nadat vrouwtjes minimaal 4-6 weken op speciale diëten zijn geweest. Introduceer één mannetje in één vrouwelijke kooi voor één tot meerdere dagen.
OPMERKING: In de huidige studie werden de mannetjes gedurende de gehele duur van het experiment (~4 maanden) bij de vrouwtjes gehouden om het aantal geproduceerde pups te vergroten, aangezien paring bij muizen na de geboorte kan plaatsvinden12. Vrouwen na de leeftijd van 6 maanden werden niet gebruikt voor studies. - Controleer de vrouwtjesmuizen dagelijks op een copulatieprop, wat aangeeft dat er gefokt is.
- Verzamel elke week de gewichtsmetingen van de vrouwelijke muizen om hun gezondheid en zwangerschapsstatus bij te houden.
OPMERKING: Het is veilig voor vrouwen om op het dieet te worden gehouden voor zwangerschap (~21 dagen) en borstvoeding (~21 dagen). - Wanneer de nakomelingen van de moeder worden gespeend (~21 dagen na de geboorte), plaats ze dan op een foliumzuur- en choline-deficiënt dieet, evenals een controledieet. Zie de sectie resultaten voor meer informatie.
OPMERKING: Bij het bestuderen van de impact van het dieet van de moeder op de gezondheidsresultaten van het nageslacht, wordt aanbevolen dat het nageslacht na het spenen op een controledieet wordt geplaatst. Het controledieet moet voldoende hoeveelheden vitamines en voedingsstoffen bevatten om te overleven. - Aan het einde van het onderzoek (het bepalen van de wekelijkse gewichten om de algehele gezondheid van vrouwen te controleren die op foliumzuur- of choline-deficiënte diëten worden gehouden), euthanaseren de moeders met behulp van een overdosis CO2 (dosering, 10%-30% volumeverplaatsing per minuut, volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) en de weefsels verzamelen (stap 3) om voedingstekorten te bevestigen.
3. Weefselafname voor de metingen van 1C en de gerelateerde metabolieten
OPMERKING: Bij het euthanaseren van dieren is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de dieren niet reageren op een teenkneep. Zodra de dieren niet meer reageren, kan de dissectie van weefsels beginnen. Het weefsel dat zal worden ontleed, moet vooraf worden bepaald13,14 en er moeten materialen worden voorbereid. Deze materialen omvatten buizen voor opslag, geschikte dissectie-instrumenten en droogijs of vloeibare stikstof.
- Verzamel bloed en leverweefsel volgens eerder gepubliceerde protocollen15,16.
- Verzamel ~500-1000 μL bloed met behulp van een hartpunctie volgens de onderstaande stappen. Voor details, zie Parasuraman et al.17:
- Maak een V-vormige snee door de huid en de buikwand. Beweeg de buikorganen opzij en steek een naald door het middenrif en in het hart om het bloedmonster te verzamelen.
- Plaats de bloedmonsters in buisjes met EDTA-coating. De buis kan op kamertemperatuur blijven totdat alle monsters zijn verzameld.
- Draai de bloedmonsters in een centrifuge bij 1000-2000 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C om het bloedplasma te isoleren. Verzamel het plasma in een microfuge-buisje van 1,5 ml en bewaar het vervolgens bij -80 °C tot analyse.
- Om de lever te verwijderen, opent u de buik en ontleedt u de hele lever volgens eerder gepubliceerd protocol15.
- Nadat u de lever uit de lichaamsholte hebt verwijderd, snijdt u het weefsel in kleinere stukjes met een kleine schaar en vriest u ze snel in met droogijs of vloeibare stikstof.
OPMERKING: De ingevroren stukjes weefsel kunnen in een cryogene microcentrifugebuis van 1,5 ml worden geplaatst en tot analyse bij -80 °C worden bewaard.
- Nadat u de lever uit de lichaamsholte hebt verwijderd, snijdt u het weefsel in kleinere stukjes met een kleine schaar en vriest u ze snel in met droogijs of vloeibare stikstof.
- Verzamel ~500-1000 μL bloed met behulp van een hartpunctie volgens de onderstaande stappen. Voor details, zie Parasuraman et al.17:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De focus van deze studie was het onderzoeken van de impact van maternale voedingstekorten op foliumzuur of choline op de gezondheidsresultaten van het nageslacht. Wekelijkse gewichten werden bepaald om de algehele gezondheid te controleren van vrouwen die een foliumzuur- of choline-deficiënte diët kregen. In ons eerdere werk werden geen veranderingen in lichaamsgewicht waargenomen tussen maternale voedingsgroepen4. Figuur 1 toont de basislijn- en wekelijkse gewichten ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Tijdens de implementatie van dit protocol in onderzoekslaboratoria zijn er een aantal belangrijke opmerkingen waarmee onderzoekers rekening moeten houden voordat ze met experimenten beginnen. Ten eerste moet bij de productie van diëten voldoende aanlooptijd worden gegeven om het diët te vervaardigen vóór de start van de experimentele studie. Doorlooptijden kunnen van bedrijf tot bedrijf verschillen en er moet ook rekening worden gehouden met de verzending van het dieet. Vrouwelijke muizen in de vruchtbare leeftijd (~2-2,...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
| C57BL/6 Female Mice | Charles River | 27 | Muizen kunnen ook in huis worden gefokt. |
| Choline Deficient Diet | Envigo | TD.06119 | |
| Control Diet | Envigo | TD.190790 | |
| EDTA tubes | |||
| Folic Acid Deficient Diet | Envigo | TD.01546 | |
| GraphPad prism | https://www.graphpad.com/features | ||
| Housing for rodents | Lab Products, LLC | One CageVentilated Racks & Cages | |
| Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) | SCIEX, Framingham, MA | 5500 QTrap | |
| Ultra-performance liquid chromatography (UPLC) | Shimadzu, Columbia, MD, USA | Nexera |
Referenties
- Van Gool, J. D., Hirche, H., Lax, H., De Schaepdrijver, L. Folic acid and primary prevention of neural tube defects: A review. Reprod Toxicol. 80, 73-84 (2018).
- Ali, S. A., Economides, D. L. Folic acid supplementation. Curr Opin Obstet Gynecol. 12 (6), 507-512 (2000).
- Osterhues, A., Ali, N. S., Michels, K. B. The role of folic acid fortification in neural tube defects: a review. Crit Rev Food Sci Nutr. 53 (11), 575966(2013).
- Hurley, L. Maternal dietary deficiencies in folic acid and choline result in larger damage volume, reduced neuro-degeneration and -inflammation and changes in choline metabolites after ischemic stroke in middle-aged offspring. Nutrients. 15 (7), 1556(2023).
- Clementson, M. Maternal dietary deficiencies in folic acid or choline worsen stroke outcomes in adult male and female mouse offspring. Neural Regen Res. 18 (11), 2443-2448 (2023).
- Pull, K., et al. Impact of maternal dietary folic acid or choline dietary deficiencies on vascular function in young and middle-aged female mouse offspring after ischemic stroke. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (6), H1354-H1359 (2023).
- Virdi, S., Jadavji, N. M. The impact of maternal folates on brain development and function after birth. Metabolites. 12 (9), 8766(2022).
- Barker, D. J. P. Fetal nutrition and cardiovascular disease in later life. Br Med Bull. 53 (1), 96-108 (1997).
- Barker, D. J. P. Maternal nutrition, fetal nutrition, and disease in later life. Nutrition. 13 (9), 807-813 (1997).
- Jackson, S. J. Does age matter? The impact of rodent age on study outcomes. Lab Anim. 51 (2), 160-169 (2017).
- Jiménez, J. A., Zylka, M. J. Controlling litter effects to enhance rigor and reproducibility with rodent models of neurodevelopmental disorders. J Neurodev Disords. 13 (1), 2(2021).
- Breeding and Reproduction of Mice - All Other Pets. Merck Veterinary Manual. , Available from: https://www.merckvetmanual.com/all-other-pets/mice/breeding-and-reproduction-of-mice 159-185 (2024).
- Jena, S., Chawla, S. The anatomy of the laboratory mouse. Essentials of Laboratory Animal Science: Principles and Practices. , 159-185 (2021).
- The anatomy of the laboratory mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/imageindex.shtml (2024).
- Mortimer, T., Welz, P. S., Benitah, S. A., Sassone-Corsi, P., Koronowski, K. B. Collecting mouse livers for transcriptome analysis of daily rhythms. STAR Protoc. 2 (2), 100539(2021).
- Aboghazleh, R. Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Parmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Jadavji, N. M., Deng, L., Malysheva, O. V., Caudill, M. A., Rozen, R. MTHFR deficiency or reduced intake of folate or choline in pregnant mice results in impaired short-term memory and increased apoptosis in the hippocampus of wild-type offspring. Neuroscience. 300, 1-9 (2015).
- Pickell, L., et al. High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice. Birth defects research. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 91 (1), 8-19 (2011).
- Mikael, L. G., Deng, L., Paul, L., Selhub, J., Rozen, R. Moderately high intake of folic acid has a negative impact on mouse embryonic development. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (1), 47-52 (2013).
- Mikael, L. G., Pancer, J., Wu, Q., Rozen, R. Disturbed one-carbon metabolism causing adverse reproductive outcomes in mice is associated with altered expression of apolipoprotein ai and inflammatory mediators. J Nutr. 142 (3), 411-418 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
