Methodenartikel

LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen en de validatie ervan

4.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66831

⸱

3 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol is gebaseerd op LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen. We gebruiken flowcytometrie om Annexine V en 7-AAD dubbele kleuring te analyseren om celdood te detecteren, waarbij we de hele cel gebruiken en scanning-elektronenmicroscopie gebruiken om de morfologie van het celmembraan te observeren.

Samenvatting

Celdood is een fundamenteel proces in alle levende organismen. Het protocol stelt een door lipopolysaccharide (LPS) en adenosinetrifosfaat (ATP) geïnduceerde phorbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA)-gedifferentieerde lipideafzetting in humaan monocyt (THP-1) macrofaagmodel vast om celdood te observeren. LPS in combinatie met ATP is een klassieke inflammatoire inductiemethode, die vaak wordt gebruikt om pyroptose te bestuderen, maar apoptose en necroptose reageren ook op stimulatie door LPS/ATP. Onder normale omstandigheden is fosfatidylserine alleen gelokaliseerd in de binnenste blaadje van het plasmamembraan. In de vroege stadia van pyroptose, apoptose en necroptose blijft het celmembraan echter intact en wordt het blootgesteld aan fosfatidylserine, en in de latere stadia verliest het celmembraan zijn integriteit. Hier werd flowcytometrie gebruikt om de dubbele kleuring van Annexine V en 7-aminoactinomycine D (AAD) te analyseren om de celdood van de hele cellen te detecteren. De resultaten laten zien dat substantiële cellen stierven na stimulatie met LPS/ATP. Met behulp van scanning-elektronenmicroscopie observeren we de mogelijke vormen van celdood in individuele cellen. De resultaten geven aan dat cellen pyroptose, apoptose of necroptose kunnen ondergaan na stimulatie met LPS/ATP. Dit protocol richt zich op het observeren van de dood van macrofagen na stimulatie met LPS/ATP. De resultaten toonden aan dat celdood na LPS- en ATP-stimulatie niet beperkt is tot pyroptose en dat apoptose en necrotische apoptose ook kunnen voorkomen, waardoor onderzoekers celdood na LPS- en ATP-stimulatie beter kunnen begrijpen en een betere experimentele methode kunnen kiezen.

Inleiding

Celdood is een fundamenteel fysiologisch proces in alle levende organismen. In de afgelopen jaren hebben substantiële studies aangetoond dat celdood betrokken is bij de immuniteit en het evenwicht binnen het organisme. Het bestuderen van celdood helpt ons het ontstaan en de ontwikkeling van ziekten beter te begrijpen. Er zijn verschillende vormen van geprogrammeerde celdood beschreven en enkele belangrijke doelen in deze processen zijn geïdentificeerd. Pyroptose, apoptose en necroptose zijn de drie genetisch gedefinieerde geprogrammeerde celdoodroutes die betrokken zijn bij intern evenwicht en ziekte1.

Pyroptose wordt gekenmerkt door de vorming van membraanporiën en het vrijkomen van celinhoud. Geactiveerde caspasen of granzymen splijten gasdermins om hun N-terminale domeinen te scheiden, die vervolgens oligomeriseren, binden aan het membraan en poriën vormen 2,3,4. De gasdermine-porie biedt een atypisch secretiekanaal over celmembranen, wat resulteert in stroomafwaartse celreacties, waaronder inhoudsafgifte en ioneninstroom 2,3,4. Uiteindelijk ervaren de cellen uiteindelijk plasmamembraanruptuur en pyroptotische lysis die wordt vergemakkelijkt door ninjurin-15. Bij apoptose vormen geactiveerde Bax en Bak oligomeren op het mitochondriale buitenmembraan en geven ze cytochroom C af, dat wordt gereguleerd door een evenwicht tussen proapoptotische en anti-apoptotische eiwitten van de BCL-2-familie, initiator-caspasen (caspase-8, -9 en -10) en effectorcaspasen (caspase-3, -6 en -7)1,6,7. De morfologische veranderingen van apoptose omvatten membraanblebbing, celkrimp, nucleaire fragmentatie, chromatinecondensatie en apoptotische lichaamsvorming 6,8. Het receptor-interagerende serine/threonine-proteïnekinase 1 (RIPK3) en mixed-lineage kinase domain-like (MLKL) zijn twee stroomafwaartse kerncomponenten van het necroptotische mechanisme1. RIPK3 rekruteert en fosforyleert MLKL, p-MLKL oligomeriseert, associeert met het celmembraan, initieert membraanperforaties, veroorzaakt ioneninstroom, verhoogt de intracellulaire osmolariteit en uiteindelijk celbreuk 6,9. Gasdermines en MLKL binden aan het plasmamembraan en mediëren respectievelijk pyroptose en necroptose, terwijl BAX/BAK apoptose bemiddelt door te binden aan het buitenmembraan van mitochondriën6.

Hoewel elke route specifieke mechanismen en resultaten heeft, leiden ze tot vergelijkbare veranderingen op het celmembraan. Onder normale omstandigheden is fosfatidylserine (PS) alleen gelokaliseerd in de binnenste blaadje van het plasmamembraan. In de vroege stadia van pyroptose, apoptose en necroptose zal PS echter buiten het plasmamembraan worden blootgesteld. Caspase-3/caspase-7 activeert de TMEM16- en XKR-families, wat leidt tot een asymmetrisch celmembraan en PS externaliseert tijdens apoptose10. Gasdermin D-gemedieerde en MLKL-gemedieerde Ca2+ influx leidt tot verlies van de symmetrie van de fosfolipide dubbellaag op het celmembraan en de blootstelling van PS. De blootstelling vindt plaats vóór het verlies van de integriteit van het celmembraan11,12. Op basis van de vergelijkbare veranderingen in het membraan van deze drie soorten geprogrammeerde celdood, gebruiken we flowcytometrie om Annexine V/7-Aminoactinomycine D (7-AAD) dubbele kleuring te analyseren om celdood te detecteren. Annexine V, een calciumafhankelijk fosfolipidebindend eiwit, heeft een hoge affiniteit voor PS, dat kan dienen als een gevoelige sonde om blootgestelde PS op het oppervlak van het plasmamembraan te detecteren13. 7-AAD is een nucleïnezuurkleuring die niet door het hele celmembraan kan gaan. Het is vergelijkbaar met propidiumjodide (PI), een veelgebruikte nucleïnezuurkleurstof. Ze hebben vergelijkbare fluorescentie-eigenschappen, maar 7-AAD heeft een smaller emissiespectrum en minder interferentie met andere detectiekanalen. Vanwege deze overeenkomsten is het niet voldoende om onderscheid te maken tussen pyroptose, apoptose en necroptose. We gebruikten flowcytometrie om de celdood van hele cellen te detecteren. Een tweede methode wordt gebruikt om het celmembraan vast te leggen met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (SEM) om de mogelijke vormen van celdood in individuele cellen te observeren.

We hebben een door lipopolysaccharide (LPS) en adenosinetrifosfaat (ATP) geïnduceerde phorbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA)-gedifferentieerde lipideafzetting in humaan monocyt (THP-1) macrofaagmodel opgesteld om celdood te observeren. Dit protocol richt zich op het observeren van celdood in plaats van het onderzoeken van mechanismen.

Protocol

1. Cellijn en celcultuur

  1. Kweek de menselijke monocytaire cellijn THP-1 in RPMI-1640 compleet kweekmedium met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 0,05 mM β-mercaptoethanol. Kweek de cellen bij 37 °C in 5% CO2 bevochtigde lucht. Subcultuurcellen om de 2-3 dagen.
    OPMERKING: THP-1 is een suspensiecel, selecteer om de helft van het medium te veranderen voor subteelt. Wanneer u veel celfragmenten onder de lichtmicroscoop observeert, centrifugeer dan 3 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g . Resuspendeer de cellen in het voorverwarmde verse, complete celkweekmedium.
  2. Gebruik cellen (in passages 4-10) in de logaritmische groeifase voor alle experimenten. Wanneer de cellen in goede conditie zijn en logaritmische groeifase, zijn ze rond, helder, dicht en zonder klonten en celfragmenten onder de lichtmicroscoop op 100 x.

2. Differentiatie van THP-1-cellen

  1. Bereid een stockoplossing van PMA met een concentratie van 1 mM (los 1 mg PMA op in 1,62 ml dimethylsulfoxide). Verdun de PMA-stockoplossing met volledig celkweekmedium tot een uiteindelijke werkconcentratie van 100 nM.
  2. Verzamel de cellen in het kweekschaaltje in een steriel centrifugebuisje van 10 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, resuspendeer de cellen met 3 ml volledig kweekmedium dat PMA bevat.
  3. Open de cellenteller en de telsoftware. Pipetteer 20 μL celsuspensie op het celtellerbord en plaats het in het celtellerbord. Klik op Voorbeeld B1, draai aan de knop rechtsonder op het instrument en pas de brandpuntsafstand aan om de cellen met een helder midden met duidelijke contouren op de software te maken. Klik op Tellen om te beginnen met tellen.
  4. Gebruik op basis van de telresultaten een volledig kweekmedium met PMA om een celdichtheid aan te passen tot 1 x 106 cellen/ml. Zaadcellen in een plaat met 6 putjes, incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 voordat met de verdere behandeling wordt begonnen.

3. Behandeling van THP-1-cellen

  1. Bereid een stockoplossing van LPS met een concentratie van 1 mg/ml (los 1 mg LPS op in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)). Verdun de LPS-stockoplossing met serumvrij medium tot een uiteindelijke werkconcentratie van 1 μg/ml. Bereid een stockoplossing van Na2ATP met een concentratie van 500 mM (los 0,3026 g ATP op in 1 ml PBS).
  2. Zuig het PMA-bevattende medium uit putjes en was met PBS 1x. Voeg serumvrij medium toe aan de controlegroep en serumvrij medium met LPS aan de modelgroep. Incubeer de plaat gedurende 6 uur bij 37 °C + 5% CO2 alvorens verder te gaan met de behandeling.
  3. Voeg na 6 uur de ATP-voorraadoplossing toe aan de modelgroep tot een uiteindelijke werkconcentratie van 500 nM. Incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij 37 °C + 5% CO2 alvorens verder te gaan.

4. Flowcytometrie-analyse (methode 1)

  1. Voorbereiding van experimentele monsters
    1. Zaai en incubeer cellen in platen met 6 putjes volgens stap 2. Stel vier controlegroepen in zonder behandeling: één controle zonder vlekken, twee controles met enkelvoudige kleuring (één voor elke vlek) en één controle met dubbele kleuring. Stel één behandelgroep samen en behandel volgens stap 3.
    2. Aspireer na de behandeling al het supernatans uit de putjes en was met PBS 2x. Voeg 500 μL 0,05% trypsine (niet-EDTA) toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 s in de incubator.
    3. Voeg 1 ml RPMI-1640 compleet kweekmedium toe aan elk putje om het loskomen van cellen te stoppen en verzamel de cellen in de buis van 5 ml. Centrifugeer op 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Voeg 1 ml PBS toe om de cellen te resuspenderen. Plaats de buisjes met cellen gedurende 3 minuten in een waterbad bij 37 °C. Centrifugeer alle monsters bij 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Verdun 200 μL 5x bindingsbuffer met 800 μL gedestilleerd water tot 1x bindingsbuffer. Voeg 100 μL 1x bindingsbuffer toe om de cellen te resuspenderen en breng de cellen over in de buis van 5 ml.
    6. Voeg 5 μL Annexin V-PE-oplossing toe aan een buisje controlegroepcellen gedurende 10 minuten en 5 μL 7-AAD-oplossing aan een ander buisje controlegroepcellen gedurende 5 minuten (als enkelvoudige kleuringscontroles afzonderlijk). Draai elke buis voorzichtig om de kleurstof te mengen en de monsters te incuberen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Voeg 400 μL PBS toe aan elke buis en draai voorzichtig om de incubatie te beëindigen.
    7. Voeg 5 μL Annexin V-PE-oplossing toe aan de resterende buisjes en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Draai elke buis voorzichtig om de kleurstof te mengen en de monsters te incuberen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Voeg na 5 minuten 5 μL 7-AAD-oplossing toe gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 400 μL PBS toe aan elke buis en draai voorzichtig om de incubatie te beëindigen.
    8. Filtreer de celsuspensie met behulp van een nylon gaas van 35 μm dat deel uitmaakt van de 5 ml polystyreen buizen met ronde bodem. Plaats de buis op ijs en wacht op het testen. Meng voorzichtig voor het testen en plaats het vervolgens in het instrument.
  2. Flowcytometrie
    1. Gebruik een fluorescentie-geactiveerde flowcytometer voor het sorteren van cellen om te testen. Open de data-analysesoftware van de flowcytometer en bevestig de prestaties van de detector en laser. Klik op de cytometer en kies Fluidics opstarten, wacht tot het systeem klaar is. Sluit luchtbellen in de stroomkamer uit door op Cytometer > Clean-modi > De-gas Flow-cel te klikken.
    2. Klik op Experiment, selecteer achtereenvolgens Nieuwe map, Experiment, Specimen, Buis en Naam bewerken. Een vijfhoekige pijl voor de buis, wordt groen als hij oplicht.
    3. Klik op het pictogram van Cytometer FACSCelesta (een sneltoetspictogram), selecteer Parameter en selecteer vervolgens FSC-, SSC- en PE-signaal . Klik op het pictogram van het algemene werkblad (een sneltoetspictogram) om een PE-histogram in te stellen. Gebruik voor de flowcytometer die in dit onderzoek wordt gebruikt PE voor annexine V bij 586 nm en plot op de X-as; PerCP-Cy5.5 voor 7-AAD bij 700 nm en plot op de Y-as.
    4. Plaats eerst een ongekleurd controlemonster in het instrument. Klik op het pictogram van Acquisition Dashboard (een sneltoetspictogram), verkrijg minimaal 10.000 evenementen van de gewenste populatie. Sluit puin uit met behulp van een poort (P1) op een FSC-A- en SSC-A-puntdiagram. Pas het debiet aan naar de gemiddelde snelheid en neem gegevens op. Pas de spanning aan om de celpopulatie op de diagonaal van het FSC/SSC-histogram te plaatsen en klik op Opnieuw opstarten. Pas het debiet aan naar de gemiddelde snelheid en neem gegevens op.
    5. Klik op Volgende buis, voer enkele kleuringscontroles uit van Annexin V en 7-AAD om de compensatie aan te passen. Laat de resterende buizen draaien en verzamel gegevens.

5. SEM-beeldvorming (methode 2)

  1. Voorbereiding van experimentele monsters
    1. Zaai en incubeer cellen in platen met 6 putjes volgens stap 2 en behandel volgens stap 3.
    2. Aspireer na de behandeling al het supernatant uit de putjes en was 2x met PBS. Voeg 500 μL 0,05% trypsine (niet-EDTA) toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 s in de incubator.
    3. Voeg 1 ml RPMI-1640 compleet kweekmedium toe aan elk putje om het loskomen van cellen te stoppen en verzamel de cellen in de buis van 5 ml. Centrifugeer op 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Fixeer de cellen met 500 μl elektronenmicroscoopfixeermiddel (2,5% glutaardialdehyde, 100 mM fosforzouten) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door een nacht bij 4 °C.
    5. Bereid chroomaluinoplossing voor: Voeg 1,0 g gelatine toe aan 100 ml ultrapuur water, 70 °C waterbadverwarming en roer gelijkmatig. Voeg 0,05 g chroomaluin toe, roer gelijkmatig en filtreer met filtreerpapier. Dompel het schone dekglas 2 uur in chroom-aluinoplossing bij 37 °C en droog het in een oven van 37 °C voor later gebruik.
      OPMERKING: Het doel is om celloslating tijdens het experiment te voorkomen.
    6. Verzamel cellen uit de vaste oplossing. Centrifugeer op 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 100 μL PBS toe en blaas de cellen voorzichtig weg. Laat de celsuspensie op het afdekglas vallen en laat 5 minuten staan. Zuig al het supernatans op en was 3x met PBS gedurende 5 minuten per keer.
      NOTITIE: De operatie moet voorzichtig worden uitgevoerd om celloslating te voorkomen. Schud niet krachtig, beweeg langzaam en voeg langzaam vloeistof toe langs de muur.
    7. Voeg 500 μL 1% osmische zuurfixatie toe gedurende 1 uur. Zuig al het supernatans op en was 3x met PBS gedurende 5 minuten per keer.
    8. Dehydrateer de monsters achtereenvolgens in een reeks ethanolconcentraties (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) gedurende 15 minuten per EtOH-oplossing.
      LET OP: De overdekglazen kunnen enkele dagen in 100% EtOH bij 4 °C worden bewaard, maar moeten zo snel mogelijk drogen om overmatige uitdroging te voorkomen.
    9. Schakel de kritische puntdroger in, open de CO2 -tank en koel de kamer af tot 10 °C. Wikkel het monster snel in filtreerpapier wanneer de kamerdruk 0 psi is en plaats het in de kamer.
    10. Open de inlaatklep, observeer door het CO2 -observatievenster, verhoog het vloeibare CO2 -niveau tussen de twee rode lijnen (overschrijd de bovengrens niet), sluit de inlaatklep. Week het monster 10 minuten. Open de inlaat- en uitlaatkleppen tegelijkertijd om de CO2 gedurende 1 minuut te egaliseren (vloeibare CO2 verdringt EtOH). Sluit de uitlaatklep om het vloeibare CO2 - niveau naar de gespecificeerde positie te brengen, sluit de inlaatklep.
    11. Stel de temperatuur in op 35 °C en de druk op 1250 psi. Zodra de temperatuur en druk stabiliseren, verlaagt u de druk bij 100 psi/min. Haal het monster eruit wanneer de kamerdruk nul is en schakel het instrument uit.
    12. Monteer de samples op SEM aluminium samplehouders met behulp van geleidende tape. Gebruik een sputtercoater om de monsters te bedekken met een laag (2-5 nm) goud.
  2. Beeldvorming
    1. Gebruik SEM met hoge resolutie koudeveldemissie voor beeldvorming. Stel de acceleratiespanning van SEM in op 3 kV. Stel de werkafstand in op 10 mm. Stel de vergroting in op 1.000x om het panorama te observeren. Stel de vergroting in op 5.000x en 20.000x om het plasmamembraan te lokaliseren en het monster af te beelden.
      OPMERKING: Het proces van het visualiseren van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen via SEM is vergelijkbaar met andere soorten cellen en weefsels en is afhankelijk van de gebruikte instrumenten. De referentie14 biedt een gedetailleerd SEM-protocol met bijbehorende video's.

Resultaten

De celmonsters werden behandeld zoals beschreven in het protocol en er werd flowcytometriedetectie uitgevoerd. Normale cellen kunnen niet worden gekleurd met Annexine V en 7-AAD (Annexine V-/7-AAD-). In de vroege stadia van pyroptose, apoptose en necroptose werd PS blootgesteld aan en gebonden aan Annexine V, maar het celmembraan was nog intact en sloot 7-AAD uit van de extracellulaire ruimte (Annexine V+/7-AAD-). In de latere stadia verliest het celmembraan zijn integriteit, cellen worden tegelijkertijd gekleurd door Annexine V en 7-AAD, wat dubbele positieve resultaten vertoont (Annexine V+/7-AAD+). De necrotische cellen werden alleen gekleurd met 7-AAD (Annexine V-/7-AAD+). Figuur 1 laat zien dat na LPS/ATP-stimulatie de cellen in het Q2-gebied significant toenamen, wat wijst op celdood.

We gebruiken SEM om het plasmamembraanoppervlak vast te leggen, waarbij we direct de kenmerken van het membraan van een enkele cel observeren. Figuur 2A toont de controlecellen, Figuur 2B-D toont de cellen na LPS/ATP-stimulatie. We observeerden cellen met kenmerken van pyroptose, waaronder membraanblebbing en ruptuurmembraan (Figuur 2B), cellen met apoptotische kenmerken, waaronder membraanblebbing en celkrimp (Figuur 2C), en cellen met necroptose-kenmerken, waaronder celzwelling en breukmembraan (Figuur 2D).

figure-results-1
Figuur 1: Detectie van dubbele kleuring van Annexine V/7-AAD met behulp van flowcytometrie. (A) Bijlage V negatieve en 7-AAD negatieve kleuring (Q4), Annexine V positieve en 7-AAD negatieve dubbele kleuring (Q3), Annexine V positieve en 7-AAD positieve kleuring (Q2), en Annexine V negatieve en 7-AAD positieve kleuring (Q1). (B) Kwantitatieve gegevens voor (A). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n=3), ongepaarde t-test, **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Scanning elektronenmicroscopiebeelden van PMA-gedifferentieerde THP-1 macrofagen. (A) Controlegroep, 5.000x/20.000x vergroting. (B, C, D) De LPS/ATP-groep vertoont membraanblebbing, breuk van het membraan (↑), celzwelling (↑) en celkrimp (↑) bij een vergroting van 5.000x/20.000x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In dit manuscript werden twee methoden gebruikt om LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen te detecteren. Annexine V/7-AAD dubbele kleuring werd gebruikt en de resultaten werden geanalyseerd door middel van flowcytometrie van de algehele kleuring. Net als bij andere flowcytometrische analyse werden een groep ongekleurde cellen en twee groepen enkelvoudige cellen opgezet om vals-positieve en vals-negatieve resultaten uit te sluiten. De resultaten tonen aan dat na LPS/ATP-stimulatie verschillende cellen de membraanintegriteit verloren, wat aangeeft dat er mogelijk celdood is opgetreden. Deze detectiemethode stelt ons in staat om de celdood van hele cellen te evalueren. Het is vermeldenswaard dat de dubbele kleuring van Annexin V/7-AAD niet voldoende is om onderscheid te maken tussen pyroptose, apoptose en necroptose. In de vroege stadia van deze drie vormen zal PS buiten het plasmamembraan worden blootgesteld en is de Annexine V-kleuring positief. De integriteit van het membraan gaat verloren tijdens het late stadium van deze drie vormen en de kleuringsresultaten vertonen een dubbele positieve kleuring. Daarom hebben we SEM gebruikt om de mogelijke vormen van celdood die kunnen optreden verder te observeren.

Bij apoptose treedt BAX/BAK-porievorming op het mitochondriale buitenmembraan op, daaropvolgende celkrimp en celmembraanblebbing. Necroptose maakt gebruik van MLKL om poriën in het celmembraan te openen, terwijl het pyroptosesignaal gasdermin activeert om poriën in het celmembraan te vormen. Het is vermeldenswaard dat zowel pyroptose als necroptose gepaard gaan met celmembraanruptuur in de laatste fase. Gasedermine-poriën zijn echter veel groter dan MLKL-poriën, dus gasdermine-poriën hebben geen ionenselectiviteit. Necroptotische cellen vertonen een significante zwelling in de morfologie15. Ze eindigen uiteindelijk in membraanbreuk. Ongeacht de signaalroute stroomopwaarts van de activering van de celmembraanpermeabiliteit, gaan veranderingen in het celmembraan gepaard met deze drie vormen van celdood. We gebruikten SEM om het celmembraan verder te observeren, wat een intuïtieve manier biedt om celdood te onderzoeken. We hebben de kenmerken van pyroptose waargenomen, waaronder membraanblebbing en het breukmembraan, en necroptose, inclusief celzwelling en het breukmembraan, in overeenstemming met kenmerken die door eerdere onderzoekers zijn bestudeerd15. We observeerden membraanblebbing en celkrimp, consistent met de kenmerken van apoptose die door eerdere onderzoekers zijn bestudeerd16.

In eerdere studies werd de combinatie van LPS en ATP vaak gebruikt om pyroptose op te wekken. Interessant is dat we kenmerken van apoptose en necroptose hebben waargenomen. Hoewel alle drie de vormen kunnen voorkomen bij LPS/ATP-geïnduceerde celdood, hebben eerdere studies aangetoond dat pyroptose de dominante manier van dood blijft. LPS is een van de meest gekarakteriseerde pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. ATP dat vrijkomt uit stervende cellen, heeft een hoge concentratie in de cel. Extracellulair ATP is een van de met gevaar verbonden moleculaire patronen17. LPS/ATP is een klassieke tweestapsstimulatiemethode om pyroptose op te wekken. Onderzoek heeft aangetoond dat de toevoeging van ATP aan LPS-gestimuleerde cellen caspase-1 snel kan activeren18, terwijl het uitschakelen van het caspase-1-gen de door LPS/ATP geïnduceerde celdood aanzienlijk kan omkeren19. In eerdere studies hebben we ook LPS/ATP-geïnduceerde activering van apoptotische en necroptotische doeleiwitten gevonden20,21. Hoewel LPS/ATP een klassieke pyroptose-inductor is, kan het ook apoptose en necroptose induceren.

In feite bestaan deze drie vormen vaak niet onafhankelijk van elkaar en overspraak tussen signaalfasen. Gasdermine-eiwitten richten zich bijvoorbeeld op de mitochondriën om de afgifte van cytochroom c te bevorderen om de mitochondriale apoptotische route te verbeteren22. Activering van caspase-3 kan gasdermin E splitsen en vervolgens pyroptose veroorzaken23. Een studie suggereert dat MLKL/PIPK3-signalering betrokken is bij de activering van NLRP3-inflammasomen24. Deze complexe overspraak leidde tot het concept van PANoptose, gedefinieerd als een inflammatoire geprogrammeerde celdoodroute die wordt gereguleerd door het PANoptosoomcomplex met belangrijke kenmerken van pyroptose, apoptose en/of necroptose die niet kunnen worden verklaard door een van deze geprogrammeerde celdoodroutes alleen25. Toen het concept van PANoptose werd voorgesteld, beschreven wetenschappers het optreden van geprogrammeerde celdood uitgebreider, dit benadrukt ook de complexiteit van geprogrammeerde celdood. Inmiddels geeft dit ook de beperkingen van deze onderzoeksmethode aan. Hoewel pyroptose als dominant wordt beschouwd bij LPS/ATP-geïnduceerde celdood, kan men niet bepalen welk deel van deze doodsvormen bestaan of dat ze allemaal bestaan, zelfs niet met betrekking tot andere vormen van geprogrammeerde dood. Dit kan een gebied zijn om in de toekomst te onderzoeken.

Dit protocol is gebaseerd op LPS- en ATP-geïnduceerde dood van macrofagen. We hebben een methode beschreven van testen van het geheel naar het individu, die ook toepasbaar is op andere modellen en cellen. De resultaten geven aan dat cellen mogelijk pyroptose, apoptose of necroptose hebben ondergaan, wat niet beperkt is tot pyroptose, waardoor onderzoekers de celdood na LPS- en ATP-stimulatie beter kunnen begrijpen en een betere experimentele methode kunnen kiezen. In eerdere studies werd Annexine V/7-AAD of Annexin V/PI dubbele kleuring vaak gebruikt om het optreden van apoptose aan te geven26,27, sommige onderzoekers hebben het ook gebruikt om apoptose28 te bestuderen. In feite kunnen we geen onderscheid maken tussen de drie soorten celdood door deze dubbele kleuring. Dit protocol herinnert onderzoekers, vooral beginners, eraan dat Annexine V/7-AAD of Annexin V/PI dubbele kleuring het type celdood niet kwalitatief kan kwalificeren. Het kan alleen celbeschadiging en dood als geheel aantonen of aangeven dat de cel mogelijk een vorm van dood heeft ondergaan. In meer gericht onderzoek is het noodzakelijk om een controlegroep te introduceren die andere sterfgevallen remt om aan te tonen dat de dood van het programma op handen is. Evenzo zal verder mechanistisch onderzoek de kritieke doelen van verschillende geprogrammeerde sterfgevallen onderzoeken.

Bovendien ontdekten we tijdens de voorbereiding van het experiment dat er momenteel veel gedetailleerde experimentele procedures zijn voor SEM van aanhangende cellen, met weinig beschrijving van gesuspendeerde cellen. Hier geven we een meer gedetailleerde beschrijving van de monstervoorbereidingsmethode voor gesuspendeerde cellen. Stap 5.5 is een noodzakelijke stap om te helpen bij het immobiliseren van zwevende cellen op celglaasjes. Daaropvolgende handelingen moeten voorzichtig worden uitgevoerd om celloslating te voorkomen. Naast de chroom-aluinoplossing kan poly-L-lysine ook cellen immobiliseren.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We spreken onze grote waardering uit voor Jiayi Sun en Lu Yang van het Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, voor de hulp bij flowcytometrie, Cuiping Chen van het State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, voor de hulp bij scanning-elektronenmicroscopie. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China [82104491], de Natural Science Foundation of Sichuan [2023NSFSC0674] en de Post-doctoral Science Foundation of China [2021M693789].

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom TubeCORNING352235
5 mL centrifuge tubeLabgic Technology Co., Ltd. BS-50-M
6-well plate Sorfa Life Science Research Co.,Ltd220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kitAbsin (Shanghai) Biological Technology co.ltdabs50007Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubatorEsco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N/A
cell culture dish, 100 mmSorfa Life Science Research Co.,Ltd230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell CounterNexcelom Bioscience LLCCellometer K2
Cellometer SD100 Counting ChambersNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
centrifuge machineHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
chromium alum Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA04354
cover glasses, 9 mmLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
critical point dryerQuorum TechnologiesK850
dimethyl sulfoxideBOSTER Biological Technology co.ltdPYG0040
electron microscope fixativeServicebio Technology co.ltd G11022.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balanceSHIMADZUATX124
ethanol absoluteChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021033102
flow cytometerBecton,Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-1
flow cytometry analysis softwareBecton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM Software
gelatinGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
High resolution cold field emission scanning electron microscopeTITACHIRegulus 8100
human monocytic cell line THP-1Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.CL0233
inverted microscope Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR Vortex MixerVELP Scientifica SrlZX4
lipopolysaccharide Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. L8880LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. P6741
phosphate-buffered salineServicebio Technology co.ltd G4202
PipetteEppendorf AGN/A
pipette tips, 10 μLServicebio Technology co.ltd T-10PL
pipette tips, 1 mL Servicebio Technology co.ltd T-1250L
pipette tips, 200 μLServicebio Technology co.ltd T-200L
RPMI-1640 complete culture mediaProcell Life Science&Technology Co.,Ltd.CM0233RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.K211104
sheath fluidBECKMAN COULTER8546733
sputter coaterCressington Scientific Instruments Ltd108
thermostatic water bathGUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd HH-1

Referenties

  1. Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
  2. Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
  3. Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803(2023).
  4. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  5. Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
  6. Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378(2022).
  7. Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
  8. Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772(2020).
  9. Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
  10. Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
  11. Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
  12. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
  13. Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
  14. JoVE, JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2024).
  15. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
  16. Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
  17. Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
  18. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  19. Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48(2018).
  20. Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830(2022).
  21. Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233(2018).
  22. Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689(2019).
  23. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  24. Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515(2015).
  25. Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
  28. Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244(2023).

Herprints en machtigingen

Tags

LPS ATP-stimulatiePMA-differentiatieceldoodpyroptoseapoptosenecroptoseflowcytometriescanning elektronenmicroscopieAnnexine V-kleuring
LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen en de validatie ervan
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.