Methodenartikel

Een webgebaseerde workflow voor het selecteren van gen- en weefselspecifieke versterkers

DOI:

10.3791/66840

⸱

18 juli 2025

 ,  ,  , 
1Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 3Stem Cell Medicine Department, Murdoch Children's Research Institute, The Royal Children's Hospital, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine, reNEW Melbourne, Murdoch Children's Research Institute, 5Systems Biology Institute (SBI) Australia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een coderingsvrije workflow voor biologen om weefselspecifieke genenverbeteraars te identificeren met behulp van alleen browsergebaseerde tools. Ons protocol maakt gebruik van openbare H3K4me1/H3K27ac-histonmarkeringen en Hi-C-gegevens, waardoor onderzoekers zonder programmeerexpertise toegang kunnen krijgen tot potentiële regulerende elementen die verband houden met hun genen van belang, deze kunnen analyseren en identificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enhancers zijn DNA-regio's die genexpressie reguleren. Mutaties in enhancers kunnen leiden tot abnormale genregulatie die tot ziekte leidt. Daarom is het identificeren van versterkers die genactiviteit in specifieke weefsels reguleren cruciaal voor het begrijpen van de genetische basis van ziekte. Enhancers zijn echter moeilijk te identificeren omdat ze niet coderen voor eiwitten. Hoewel er tal van enhancer-repositories en identificatietools beschikbaar zijn, kan de complexiteit van deze tools een uitdaging vormen voor biologen. Om biologen te helpen bij het gebruik van deze bronnen, presenteren we een bioloogvriendelijk protocol (https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow) dat gebruikmaakt van bestaande webgebaseerde genomics-gegevens zoals H3K4me1 en H3K27ac histonmarkeringen en chromatineconformatieanalyse (Hi-C) gegevens om enhancers te ontdekken die geassocieerd zijn met een gen van belang (GoI) in een doelweefsel waar de enhancer actief is. Dit protocol is volledig webgebaseerd en vereist geen programmeervaardigheden van eindgebruikers. We hebben het nut van deze aanpak aangetoond door kandidaat-versterkers te karakteriseren die TBX5 reguleren, een gen dat cruciaal is voor de ontwikkeling van het hart. Dit protocol vergemakkelijkt de identificatie van versterkers die geassocieerd zijn met dit gen in de linkerhartkamer.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enhancers zijn niet-coderende DNA-regio's die gentranscriptie, ontwikkeling en cellulaire differentiatie reguleren 1,2. Mutatie van versterkers kan leiden tot verschillende ziekten, waaronder ontwikkelingsstoornissen, kanker en andere genetische aandoeningen 3,4,5,6. Daarom is het begrijpen van enhancers van het grootste belang voor het begrijpen van genexpressie, mutatie en ziekten.

Om te begrijpen hoe enhancers interageren met hun doelgenen, is het belangrijk om hun locaties in het genoom te identificeren. Het identificeren van de locaties van de enhancer is echter niet altijd eenvoudig, aangezien enhancers zowel dicht bij de transcriptionele startplaats (TSS) als veel verder weg kunnen worden geplaatst, met tientallen tot honderden kilobasen 2,7,8,9.

Ondanks hun onvoorspelbare genomische locatie vertonen enhancers verschillende biochemische en structurele handtekeningen, waardoor ze systemisch kunnen worden getraceerd. Over het algemeen hebben enhancers de neiging om verrijkt te zijn in intergene en intronische regio's, met een klein aantal gevonden in exonen 2,8. Ze worden vaak gekenmerkt door specifieke histonmodificaties en transcriptiefactorbinding, die hun regulerende rol definiëren en hun spatio-temporele activiteit in verschillende ontwikkelingsstadia en weefsels bepalen10,11.

ChIP-seq wordt gebruikt om transcriptiefactorbindingsplaatsen (TFBS's) en histonmodificatiemarkeringen te identificeren, zoals het keurmerk van enhancers, H3K4me1, actieve enhancer-markeringen, H3K27ac- en H3K4me3-markeringen, die zijn verrijkt in promotorregio's 1,12,13,14,15. Chromatineconformatie-capture (3C)-technieken en hun derivaten, zoals 4C, 5C, Hi-C en ChIA-PET, worden gebruikt om fysieke interacties tussen verre genomische regio's in kaart te brengen. Terwijl 3C zich richt op specifieke interacties in specifieke weefsels, biedt Hi-C een genoombrede architectuur voor celtypen16,17.

Naast de huidige methoden zijn er gespecialiseerde benaderingen ontwikkeld om enhancers te karakteriseren, waaronder gepoolde enhancer-databases, zoals EnhancerAtlas of EnhancerFinder18,19. Deze tools vereisen echter vaak dat onderzoekers meerdere datasets integreren om meerdere enhancers in veel weefsels te onderzoeken, wat overweldigend kan zijn voor biologen zonder ervaring in bio-informatica en datamining.

Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijk protocol om enhancers te selecteren, volledig gebaseerd op bestaande webtools. Dit stelt onderzoekers in staat om een gen van belang (GoI) op te vragen en overeenkomstige enhancers op te halen. Het protocol selecteert hier versterkers op basis van een specifieke reeks criteria: histonmodificaties, chromatine-interacties en weefselspecificiteit 1,12,13,14,15,16,17,20,21. Enhancers die in introns worden aangetroffen, vertonen meer kans om weefselspecifieke activiteit te vertonen in vergelijking met intergene enhancers, die zich in de genomische regio's tussen genen22 bevinden. Om een uitgebreide dekking van potentiële actieve enhancers te garanderen, hebben we het zoekbereik tussen twee naburige GoI's gedefinieerd om de kans te vergroten dat regulerende elementen zich buiten genlichamen bevinden. We gebruikten een enhancer-specifiek epigenetisch keurmerk, H3K4me1, en een actief enhancer-merk, H3K27ac, om enhancer-kandidaten op te sommen. Deze kandidaten werden vervolgens verfijnd op basis van Hi-C-gegevens, waarbij enhancers met fysieke interacties met de corresponderende promotor werden behouden. Dit protocol is ontworpen om biologen door het proces van enhancer-identificatie te leiden met behulp van alleen openbaar beschikbare webgebaseerde tools. Door epigenetische en chromatine-interactiegegevens te integreren, biedt de hier beschreven aanpak een praktisch kader om hypothesen te genereren over potentiële enhancers voor verdere experimentele validatie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Een stap-voor-stap walkthrough is beschikbaar op https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow. De gegevens die in het protocol worden gebruikt, zijn samengevat in tabel 1 en tabel 2. Probleemoplossing is beschikbaar in Aanvullend bestand 1.

1. Lokaliseren van Indiase overheid (Figuur 1)

  1. Open de EnsEMBL genoombrowser (https://www.EnsEMBL.org).
  2. Kies de juiste genoomassemblage die past bij de soort en de versie.
  3. Voer Indiase kaart in het zoekveld in en klik op Start.
  4. Selecteer de link naar de juiste EnsEMBL-gen-ID.
  5. Klik op de link naar de viewer van het tabblad Regio in detail , onder het overzichtsgedeelte, om door de regio rond de Indiase overheid te navigeren.

2. Detectiegebied voor verbeteraars definiëren (Figuur 2)

  1. Identificeer de twee naburige genen van de Indiase overheid om het detectiegebied te definiëren. Gebruik de Gene Legend-track om naar deze genen te zoeken, die zijn geannoteerd als visuele elementen die verband houden met samengevoegde EnsEMBL/Havana in de Basic Gene Annotations from GENCODE-track . Bepaal de directionaliteit van de Indiase overheid aan de hand van de < en > tekens op de juiste gennaam in het GENCODE-spoor.
  2. Klik en sleep om het intergene gebied tussen deze genen te selecteren en klik op Ga naar regio in het pop-upvenster om het geselecteerde gebied te visualiseren. Definieer het interessegebied op elk gewenst moment opnieuw door deze stap te herhalen.
  3. (OPTIONEEL) Pas de weergave aan door Tracks toevoegen/verwijderen bovenaan de trackviewer te selecteren. Moduleer het zoomniveau met behulp van de zoom-/navigatieknoppen boven de trackviewer.

3. Analyse van histonmarkeringen (Figuur 3)

  1. Selecteer in de zijbalk van de viewer van het tabblad Regio in detail de optie Deze pagina configureren.
  2. Selecteer in de zijbalk van het tabblad Regioafbeelding configureren onder de vervolgkeuzelijst Regulatie de optie Activiteit per cel/weefsel.
  3. Gebruik de zoekbalk voor cellen/weefsels om interessante weefsels te zoeken en te selecteren. U kunt ook de alfabetische navigatiebalk onder de zoekbalk gebruiken om interessante weefsels te vinden.
  4. Selecteer het tabblad Experimenten naast Cel/weefsel.
  5. Selecteer H3K4me1 en H3K27ac als een marker van enhancers, en H3K4me3 als een marker van promoters.
  6. Selecteer Trackweergave configureren.
  7. Selecteer Tracks weergeven om H3K4me1-gemarkeerde regio's in het detectiegebied van de verbetering en H3K4me3-gemarkeerde regio's stroomopwaarts van de Indiase overheid te visualiseren.
  8. Voor de enhancer-kandidaten, haal de coördinaten op van genomische regio's gemarkeerd met H3K4me1 binnen de gedefinieerde detectiegebieden door te klikken op de gekleurde visual-/box-elementen in de nieuw toegevoegde H3K4me1-tracks. Dit onthult de pop-up "Hists & Pols", die informatie bevat over de genomische locatie van het element in basenpaar (bp).
    1. Haal actieve enhancer-kandidaten op door H3K4me1-regio's te kiezen waar de gekleurde visual-/box-elementen van zowel H3K4me1 als H3K27ac overlappen. De granulariteit van het zoomniveau kan van invloed zijn op het aantal enhancer-kandidaten dat in deze track wordt weergegeven.
    2. U kunt ook handmatig de interessegebieden voor elk genomisch kenmerk definiëren door op de track te klikken en te slepen om grafiekpieken onder de H3K4me1/H3K27ac-track in te kapselen. Kopieer de genomische locatiecoördinaten naar een tekstbestand en sla ze op als .bed-indeling .
  9. Evenzo, voor promotorregio's, repliceert u stap 3.8 met behulp van de H3K4me3-track, met de nadruk op de regio stroomopwaarts van de Indiase overheid.

4. Analyse van chromatineconformatie-capture (Hi-C) (Figuur 4)

  1. Toegang tot het 4DN dataportaal (https://data.4dnucleome.org/). Zorg er in het gestapelde hoofdstaafdiagram van de startpagina van 4DN (Afbeelding 5) voor dat Experimentsets is geselecteerd als de Y-as, Experimenttype is geselecteerd als de X-as en de plot is gegroepeerd per organisme.
  2. Zoek langs de X-as van het hoofdstaafdiagram de in-situ Hi-C-balk . Klik op het gedeelte van de balk dat is gegroepeerd voor sets menselijke experimenten en klik vervolgens op de knop Bladeren in de pop-up. Filter relevante datasets met behulp van het linkerzijpaneel.
  3. Klik op de link in de titelkolom van het relevante biosample voor het weefsel van interesse.
  4. Klik op Gegevens verkennen op het tabblad Verwerkte bestanden om de Hi-C-gegevensset in meer detail te verkennen.
  5. Voer de coördinaten van de geïdentificeerde promotor in het weefsel van interesse in (vanaf stap 3.9) en markeer het gebied horizontaal door met de rechtermuisknop op de heatmap te klikken (Figuur 4). De toegevoegde lijnen zorgen ervoor dat het promotorgebied visueel wordt gevolgd op de heatmap. Verwijder onbedoelde lijnen door met de rechtermuisknop op de lijn te klikken en horizontale/verticale liniaal en Serie sluiten te selecteren.
  6. Voer de coördinaten van alle experimenteel gevalideerde controleversterkers23 in om de interactiedrempel te berekenen op basis van hun minimum. Van deze controleversterkers is eerder bevestigd dat ze interageren met de promotorregio en dienen als benchmarks voor het definiëren van de minimale significante interactie.
  7. Definieer de drempelwaarde voor promotor-enhancer, met behulp van de controleverbeteraars, op basis van de laagste interactiescore die niet nul is volgens de kleurtoets aan de rechterkant van de matrix.
  8. Voer de genomische coördinaten van alle H3K4me1-geassocieerde regio's in (vanaf stap 3.8) en markeer deze verticaal op de Hi-C-heatmap. Dit maakt een kruiscontrolepatroon mogelijk, waarbij de intersectie tussen H3K4me1-gemarkeerde enhancers (verticaal) en het promotorgebied (horizontaal) kan worden onderzocht op significante interacties.
    1. Filter vervolgens zwak interagerende regio's uit door de interactiescores van H3K4me3-gemarkeerde regio's te vergelijken met de interactiedrempel (stap 4.6).
    2. Selecteer de genomische coördinaten die interactiefrequenties vertonen die hoger zijn dan de gedefinieerde drempel in de 4DN-portal-heatmap. Deze regio's verschijnen als meer geconcentreerde (donkerdere) signalen in de heatmap, opgeslagen in BED-indeling.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het gebruik van het gepresenteerde protocol te illustreren, hebben we het TBX5-gen in het menselijk hart onderzocht, waarbij we TBX5-geassocieerde enhancers hebben onderzocht met behulp van de uitgebreide workflow met H3K4me1-, H3K27ac- en Hi-C-gegevens. TBX5 is een gen dat bijdraagt aan de ontwikkeling van ledematen en hart, inclusief de vorming van de vier kamers en septumscheiding24. Mutatie in dit gen is een hoofdoorzaak van het Holt-Oram-syndroom (HOS), dat afwijkingen aan de ledematen en aangeboren hartaandoeningen (CHD) veroorzaakt, waaronder septumdefecten24. De mutatie van TBX5-geassocieerde hartversterkers kan CHD24 kritisch beïnvloeden. Een eerdere studie ontdekte drie bekende TBX5-versterkers in menselijk hartspecifiek weefsel - namelijk "Enhancer 2", "Enhancer 9" en "Enhancer 16" (aanvullend bestand 2), waarvan werd aangetoond dat ze vergelijkende fenotypes hebben bij transgene muizen23.

We onderzochten H3K4me1- en H3K27ac-verrijkte regio's tussen RBM19 en TBX3, twee flankerende genen stroomafwaarts en stroomopwaarts van TBX5 bij de mens, om vermeende enhancers op de TBX5-locus te vinden (Figuur 1 en Figuur 2). Om hartspecifieke versterkers te identificeren, werden de hartspiercellen gekozen. De vermeende TBX5-hartversterkerregio's werden opgehaald als coördinaten (chr12: start-end) en 22 zowel H3K4me1- als H3K27ac-geassocieerde regio's werden geïdentificeerd (Figuur 3 en aanvullend bestand 3). Vermeende TBX5-hartversterkers werden opgehaald uit de EnsEMBL-genomische database om Hi-C-gegevens in de 4DNucleome-database te vergelijken (Figuur 4). Dit werd gedaan om mogelijke interacties tussen potentiële versterkers en de TBX5-hartpromotor te meten. Volgens het hier beschreven protocol werd bevestigd dat 21 van de 22 genomische regio's interageren met de TBX5-promotor (chr12: 114400143-114410103) in de hartspiercellen (aanvullend dossier 4). Er was één gebied dat geen fysieke interactie had met de promotor (Figuur 4, stap 4.8). Ten slotte hebben we dit protocol vergeleken met deze biologisch gevalideerde enhancers en de huidige gouden standaarddatabase van hartversterkers, VISTA Cardiac Enhancers Browser, en hebben we aanvullende enhancers onthuld die momenteel niet in de database zijn vastgelegd25.

We hebben een kruisvergelijking gemaakt van de 21 TBX5-enhancers die door het hier gepresenteerde protocol zijn opgehaald met bestaande databases. We hebben 4 TBX5-versterkers opgehaald uit de VISTA Cardiac Enhancer Browser (aanvullend bestand 5)25. Van de 4 door VISTA geïdentificeerde hartversterkers overlapten 3 enhancers, hs2329, mm1282 en m370 met de regio's die werden geïdentificeerd door dit webgebaseerde detectieprotocol (Figuur 5). Elk van de voorspelde enhancers deelde ook de genomische regio's met eerder experimenteel gevalideerde enhancers van Smemo et al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) en Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), terwijl ze geen overlap vertoonden met Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). Een van de door VISTA geïdentificeerde enhancers, hs498 , overlapte niet met voorspelde enhancers door dit protocol of de experimenteel gevalideerde enhancers van Smemo et al.23 (Figuur 5), hoewel de regio gedeeltelijke overlap vertoonde met H34Kme1-markeringen (Figuur 5). Evenzo overlapte Enhancer 9 niet met de voorspelde enhancers door deze pijplijn, maar was het geassocieerd met H3K4me1-markeringen (Figuur 5).

figure-results-1
Figuur 1: Stap-voor-stap handleiding voor het lokaliseren van de Indiase overheid in de EnsEMBL Genome Browser. De gebruiker opent eerst de EnsEMBL-homepage (1.1), selecteert de soort (Mens) en voert het gen in de zoekbalk in (1.2-1.3). Uit de lijst met resultaten wordt de juiste gen-ID geselecteerd (1.4), waarmee de overzichtspagina van het gen wordt geopend. De gebruiker klikt vervolgens op de hyperlink Regio in detail (1.5) om het genomische gebied rond de Indiase overheid te visualiseren, inclusief aangrenzende elementen en regulerende kenmerken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Definiëren van het detectiegebied van de enhancer rond de Indiase overheid met behulp van de EnsEMBL Genome Browser. Om het detectiegebied van de enhancer te definiëren, identificeert u de twee naburige genen die de Indiase overheid flankeren met behulp van de Basic Gene Annotations from GENCODE-track , waarbij genen worden weergegeven als donkergele blokken gelabeld met samengevoegde EnsEMBL/Havana-annotaties. De transcriptierichting van elk gen wordt aangegeven door pijlpunten (< of >) naast de gennaam (2.1). Als u het intergene gebied tussen de aangrenzende genen wilt selecteren, klikt en sleept u over het interessegebied en kiest u vervolgens Naar gebied springen in het pop-upvenster om in te zoomen (2.2). Als u annotaties met betrekking tot regelgeving of verbetering wilt toevoegen, klikt u op Tracks toevoegen/verwijderen (2.3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Configuratie van histonmodificatiesporen in het detectiegebied van de enhancer met behulp van de EnsEMBL Genome Browser. Klik in de linkerwerkbalk op Deze pagina configureren (3.1) om het trackconfiguratiepaneel te openen en navigeer naar "Activiteit per cel/weefsel" onder de sectie Regelgeving (3.2). Selecteer op het geopende tabblad het gedeelte "Experimenten" (3.3) en gebruik de zoekbalk voor cellen/weefsels om het weefsel van uw interesse (hartspiercel) (3.4) te lokaliseren en te selecteren. Schakel in het histonmarkeringspaneel (3.5) H3K4me1 en H3K27ac in als actieve verbeterpunten en H3K4me3 als promotormarkering en klik vervolgens op "Trackweergave configureren" (3.6). Nadat u de trackselecties hebt bevestigd, klikt u op "View tracks" (3.7) om terug te keren naar de genoomviewer. Histonmarkeringspieken worden nu in het detectiegebied (3.8) weergegeven als gekleurde blokken onder het bijbehorende weefsellabel (geel: H3K4me1, blauw: H3K27ac en oranje: H3K4me3). "Hists & Pols" pop-up met de genomische coördinaten van de regio in basenparen (chr:start-end), die kunnen worden gekopieerd en opgeslagen voor downstream-analyse. Een "Hists & Pols" pop-up verschijnt na het klikken op de gekleurde elementen in de track. De pop-up bevat de genomische coördinaten van de regio in basenparen (bijv. chr12:11443450-114451611 voor de promotorregio), die kunnen worden gekopieerd en opgeslagen voor downstream-analyse (3.8). Om kandidaat-verbeteraars te extraheren, moet u prioriteit geven aan regio's waar H3K4me1- en H3K27ac-pieken elkaar overlappen, zoals blijkt uit de verticale uitlijning van pieken en vakken over sporen (3.9). Overlappende regio's kunnen direct worden geselecteerd door op hun vakjes te klikken of door handmatig over de uitgelijnde pieken te slepen om een regio te definiëren (bijv. chr12:114400143-114410103 voor een actieve kandidaatregio). Coördinaten die in de pop-up worden weergegeven, moeten worden opgeslagen in BED-indeling voor downstream-validatie of visualisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Visualisatie van promotor-enhancer chromatine-interacties met behulp van Hi-C heatmaps van het 4D Nucleome Data Portal. De startpagina van het 4D Nucleome Data Portal toont een gestapeld staafdiagram met een overzicht van de beschikbare experimenttypen per organisme. De "in situ Hi-C"-gegevensset voor menselijke monsters wordt geselecteerd door op het overeenkomstige gedeelte van de balk te klikken (4.1). Er wordt een gefilterde lijst met relevante datasets weergegeven; een Hi-C-dataset afgeleid van H9-cellen gedifferentieerd in cardiale myoblasten wordt geselecteerd (4.2). De geselecteerde dataset (4.3) wordt in de HiGlass-browser geopend via de knop Data verkennen (4.4). Het genomische gebied van interesse wordt ingevoerd in het coördinatenvak (4.5) en de contactmatrix wordt weergegeven als een heatmap op kleurschaal. Donkere kleuren (dieprood tot zwart) duiden op een sterkere contactfrequentie van chromatine, terwijl lichtere kleuren (wit tot oranje) zwakkere interacties vertegenwoordigen. Een horizontale lijn wordt op de promotorcoördinaat geplaatst en verticale lijnen worden getekend op de posities van drie experimenteel gevalideerde controleversterkers (4.6). Deze snijpunten worden gebruikt om een strikte interactiedrempel te definiëren, die wordt bepaald door het sterkste zichtbare signaal (donkerste kleur) van de promotor-enhancer-contacten (4,7). Aanvullende verticale lijnen worden getekend op de locaties van kandidaat-H3K27ac- en H3K4me1-gemarkeerde enhancers (uit stap 3.8). Kandidaten van wie de promotor-enhancer-kruispunten gelijk zijn aan of donkerder zijn dan de drempelwaarde, worden behouden, terwijl kandidaten met zwakkere signalen (lichtere kleurvierkanten) worden uitgesloten (4.8). Bewaarde coördinaten worden handmatig geëxtraheerd en opgeslagen in BED-formaat voor stroomafwaartse analyses. (a. Enhancer 2, b. Enhancer 9 en c. Enhancer 16) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Genomische browserweergave van voorspelde TBX5-enhancers vergeleken met VISTA-gevalideerde cardiale enhancers en controle-enhancers. Snapshots van genoombrowsers geven het zoekbereik van de enhancer weer (STAP 2), waarbij voorspelde enhancers die door het webgebaseerde protocol zijn opgehaald (onder) worden vergeleken met VISTA-gevalideerde enhancers (boven) en experimenteel gevalideerde controle-enhancers (midden). Het hoofdpaneel toont de volledige genomische locus met geannoteerde regulerende elementen, waaronder hartspiercelspecifieke H3K4me1 (geel), H3K27ac (blauw) en H3K4me3-pieken (oranje). Drie ingezoomde figuren geven de afstemming weer tussen het door het protocol opgehaalde door VISTA en controleverbeteraars. De overlap met controleverbeteraars wordt omlijnd met rode kaders. Coördinaten voor elke subregio worden weergegeven in de onderste browservensters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Gegevens gebruikt in het onderzoek. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Webgebaseerde tools gebruikt in het onderzoek. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Instructies voor het oplossen van problemen met de EnsEMBL Genome Browser. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Een BED-bestand in GRCh38-formaat, de experimenteel gevalideerde TBX5-hartcontroleversterkers 23. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Een BED-bestand in GRCh38-formaat, TBX5-hartversterkers opgehaald door STEP3 van EnsEMBL. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Een BED-bestand in GRCh38-formaat, TBX5-hartversterkers opgehaald door STEP4 van EnsEMBL. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: Een BED-bestand in GRCh38-formaat, TBX5-hartversterkers opgehaald uit de VISTA-hartversterkerbrowser25. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het webgebaseerde protocol dat hier wordt beschreven, functioneert als een workflow voor het ophalen van enhancers, in plaats van voor het voorspellen van enhancers. Door gebruik te maken van openbaar beschikbare weefselspecifieke datasets, histonmodificaties (H3K4me1 en H3K27ac) en Hi-C-interactiegegevens, worden potentiële versterkers die verband houden met de Indiase overheid beperkt. In tegenstelling tot computationele voorspellingstools die afhankelijk zijn van machine learning of op sequentie gebaseerde modellen, richt onze aanpak zich alleen op het ophalen van enhancers op basis van experimentele gegevens. De instructies voor het oplossen van problemen met de EnsEMBL-genoombrowser worden gegeven in aanvullend bestand 1.

Deze workflow integreert belangrijke elementen zoals histonmarkeringen en chromatine-interactiegegevens, vergelijkbaar met geavanceerde methoden zoals ChIA-PET en PLAC-seq, die enhancer-promotor-interacties met hogere nauwkeurigheid in kaart brengen10,11. Deze methode is echter nuttig wanneer experimentele technieken met een hoge resolutie niet haalbaar zijn, omdat het protocol minder arbeidsintensief is en veel tijd bespaart.

De belangrijkste beperking van de hierboven gepresenteerde benadering is de afhankelijkheid van de beschikbaarheid en kwaliteit van bestaande datasets, wat van invloed kan zijn op de precisie van de opgehaalde interacties. Het onderzoeken van de activiteit van de enhancer tijdens de ontwikkeling van het hart in de context van TBX5-geassocieerde genetische mutaties vereist een weefselspecifieke resolutie. Voor een dergelijke analyse zou embryonaal hartweefsel het meest geschikt zijn, gezien de relevantie ervan voor ontwikkelingsregulatie. Er waren echter geen embryonale datasets opgenomen die de histonmodificatiegegevens bevatten die openbaar beschikbaar waren op het moment van analyse. Om hiermee rekening te houden, kan de integratie van alternatieve bronnen zoals ENCODE, Enhancer Atlas 2.0 of EnhancerFinder het nut van de pijplijn uitbreiden door extra datasets te bieden voor de identificatie en validatie van enhancer 18,19.

In de TBX5 REPFIX onthulde de op H3K4me1 gebaseerde analyse 22 vermeende enhancers als uitgangspunt voor verder onderzoek. De daaropvolgende Hi-C-analyse toonde aan dat 21 van de 22 kandidaat-versterkers op basis van eerdere histonmodificatiemarkeringen interactie hadden met de TBX5-promotor in de hartspiercellen (Figuur 5). Dit ondersteunt de betrouwbaarheid van de op histonmodificatie gebaseerde benadering bij het voorspellen van interessegebieden.

We hebben ervoor gekozen om in dit protocol geen prioriteit te geven aan sequentiebehoud tussen soorten, hoewel het een veelgebruikt criterium is voor het identificeren van enhancers. Omdat het eerder minder effectief bleek te zijn voor weefsel- of soortspecifieke versterkers, waarvan er vele tijdens de evolutie niet sterk geconserveerd zijn26. Daarom hebben we ervoor gekozen om ons te concentreren op op chromatine gebaseerde markers die directer zijn voor functionele enhancer-activiteit. Het behoud van de sequentie kan echter nog steeds waarde hebben in specifieke contexten, zoals het bestuderen van enhancers met evolutionaire betekenis. In dit geval kan het worden toegevoegd als een optionele stap voor gebruikers die geïnteresseerd zijn in geconserveerde regelgevingselementen.

Het protocol bleek effectief bij het ophalen van 21 hartspecifieke enhancers voor het TBX5-gen van de EnsEMBL-website, die eerder aan identificatie was ontsnapt door een bestaand platform, VISTA Cardiac Enhancers Browser. Hoewel het hier beschreven protocol niet één van de enhancers, hs498, kon ophalen, wat de mogelijkheid van beperking van de detectie suggereert, bracht de aanpak enkele enhancers aan het licht die niet werden gedetecteerd door de VISTA Cardiac Enhancers Browser. Verdere validatie van de opgehaalde enhancers is echter noodzakelijk, aangezien het protocol een groter aantal vermeende regio's oplevert in vergelijking met gecureerde VISTA-databases. Dit hogere aantal verhoogt het risico op valse positieven, en een groter aantal voorspelde versterkers duidt niet noodzakelijkerwijs op een verbeterde specificiteit of functionele relevantie. Het opnemen van aanvullende experimentele datasets of functionele assays zoals genexpressieanalyse, CRISPR-verstoring of reporter-assays zal cruciaal zijn om de biologische validiteit van deze kandidaten te bevestigen, zoals uitgevoerd in Smemoet al.' s studie23.

De kruisvergelijking met drie experimenteel gevalideerde enhancers toonde gedeeltelijke overlap met de voorspelde regio's (Figuur 5). De voorspelde enhancer "e1" was breder gepositioneerd dan gevalideerde Enhancer 2, terwijl "e18" gedeeltelijke overlap vertoonde met Enhancer 16 (Figuur 5). Deze resultaten suggereren dat deze benadering met succes regio's identificeert met bekende regulerende activiteit, hoewel de bredere reikwijdte van de voorspelde versterkers de flexibiliteit in de grenzen van de versterker kan weerspiegelen. Enhancers functioneren vaak als modulaire elementen en hun activiteit kan afhangen van de chromatinecontext, het celtype en de ontwikkelingstiming 2,27. Daarom kunnen voorspelde regio's de belangrijkste actieve plaatsen omvatten met aangrenzende sequenties die bijdragen aan de regulerende functie, ondanks de noodzaak van experimentele validatie om te bepalen welke delen van deze bredere voorspellingen functioneel actief zijn in een weefselspecifieke of ontwikkelingscontext. Terwijl VISTA Cardiac Enhancer Browser vier regio's binnen het gedefinieerde bereik identificeerde, overlapte slechts één enhancer, mm370, gedeeltelijk met een experimenteel gevalideerde enhancer, Enhancer 16, specifiek in het gebied gemarkeerd door H3K4me1 (Figuur 5)23. Het resterende deel van mm370, dat niet overlapt met Enhancer 16, kan duiden op een niet-functioneel of inactief subgebied van de enhancer28,29.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs melden geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de leden van het Ramialison-lab (Transcriptomics and Bioinformatics, reNEW Bioinformatics Hub) voor nuttige discussies. MR en HTN worden ondersteund door een NHMRC Ideas Grant (APP1180905). Wij danken Richard Saffery voor de steun. MR wordt gefinancierd door een Heart Foundation Future Leader Fellowship (107328). Aanvullende infrastructuurfinanciering aan het Murdoch Children's Research Institute werd verstrekt door het Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme van de Australische regering. Het Australian Regenerative Medicine Institute wordt ondersteund door subsidies van de deelstaatregering van Victoria en de Australische regering. Het Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine wordt ondersteund door subsidies van de Novo Nordisk Foundation (NNF21CC0073729).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Computer workstationN/AN/AWeb-browser-capable computer, Windows/Mac/Linux operating system
4DN data portal4DN data portalhttps://data.4dnucleome.org/
GalaxyGalaxyhttps://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
GithubGithubhttps://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
VISTA VISTA Cardiac Enhancer Browserhttps://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barral, A., Déjardin, J. The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation. Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).
  3. Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease. Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).
  4. Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. Enhancer redundancy in development and disease. Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).
  5. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  6. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  7. Panigrahi, A., O'Malley, B. W. Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown. Genome Biol. 22 (1), 108(2021).
  8. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  9. Krivega, I., Dean, A. Enhancer and promoter interactions-long distance calls. Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations. Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).
  11. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  12. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  13. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  14. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  15. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  16. Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  17. de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).
  18. Gao, T., Qian, J. EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).
  19. Erwin, G. D., et al. Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction. PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).
  20. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  21. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  22. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  23. Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease. Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).
  24. Boogerd, C. J., Evans, S. M. TBX5 and NuRD divide the heart. Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).
  25. Dickel, D. E., et al. Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers. Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).
  26. Pennacchio, L. A., Visel, A. Limits of sequence and functional conservation. Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).
  27. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  28. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  29. Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers. Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Identificatie van enhancersgenregulatieH3K4me1 markerH3K27ac markerchromatinoconformatieHi C dataEnsembl Genome Browserhartontwikkeling

Gerelateerde artikelen