Dit protocol beschrijft een verbeterd muismodel voor verwondingen aan de botgroeischijf bij adolescenten. Met behulp van transgene muizen met tri-lineage fluorescerende reporters voor collageentypen I, II en X, de primaire matrices geassocieerd met drie verschillende substrata van de groeischijf, wordt de plaatsing van de verwonding geleid door native fluorescentie onder de microscoop.
Methodenartikel
Driekleurig transgeen muizenmodel voor het bestuderen van groeischijfletsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De kraakbeengroeischijven in de botten van kinderen maken verlenging van ledematen mogelijk, maar zijn zwak ten opzichte van het bot, waardoor ze vatbaar zijn voor breuken wanneer botten overbelast zijn. Betere behandelingen voor ernstig gebroken groeischijven zijn nodig omdat de reactie op letsel een benige brug is die de groeischijf voortijdig samensmelt, wat leidt tot onvolgroeide en/of scheve ledematen. Muizenmodellen van groeischijfletsel zijn voordelig voor mechanistische studies, maar zijn uitdagend omdat het moeilijk is om de kleine groeischijven bij jonge muizen te visualiseren en precies te verwonden. We beschrijven hier een verbeterd groeischijfletselmodel met behulp van transgene muizen met tri-lineage fluorescerende reporters voor collageentypen I, II en X.
Deze muizen vertonen natuurlijke fluorescentie geassocieerd met de drie primaire substrata van de groeischijf. Een letsel aan de groeischijf, vergelijkbaar met een Salter-Harris Type II-letsel, wordt reproduceerbaar gecreëerd met een boor waarbij het hypertrofische gedeelte van de groeischijf als referentie wordt gebruikt tijdens live beeldvorming onder begeleiding van fluorescentie-stereomicroscopie. Bevroren histologieanalyse van de natuurlijke fluorescentie vereenvoudigt het beoordelen van de cellulaire respons op letsel. Deze methodologie vertegenwoordigt een substantiële sprong voorwaarts in het onderzoek naar groeischijfletsel en biedt een gedetailleerde en reproduceerbare methode voor het onderzoeken van pathologie en het evalueren van nieuwe therapeutische strategieën.
Inleiding
Botgroeischijven spelen een cruciale rol bij de longitudinale groei van lange botten tijdens de kindertijd en adolescentie1. De groeischijf bevindt zich aan de uiteinden van lange botten en bestaat uit meerdere zones, waarbij chondrocyten de belangrijkste cellulaire componenten zijn die verantwoordelijk zijn voor de productie en het onderhoud van dit dynamische groeigebied. Endochondrale verbening van de groeischijf vindt plaats om de botten te verlengen en uit te zetten door een opeenvolgende progressie van proliferatie van chondrocyten, hypertrofie, apoptose, invasie door bloedvaten, rekrutering van osteoprogenitorcellen en ten slotte botvorming2. Omdat de groeischijf relatief zachter is dan bot, is deze zeer vatbaar voor breuken wanneer botten worden overbelast tijdens sport of andere activiteiten. De Salter-Harris-classificatie schetst vijf verschillende soorten groeischijfletsels3. De Type II-fractuur door de hypertrofische zone van de groeischijf en het aangrenzende onderste botweefsel komt het meest voor4. Een benige brug vormt zich vaak als reactie op verwondingen van de hypertrofische zone of het aangrenzende bot en leidt tot voortijdige fusie van de aangrenzende lange botsecties5. Benige bruggen belemmeren de normale uitzetting van de groeischijf. Momenteel zijn er geen preventieve behandelingen beschikbaar voor de vorming van de benige brug, en sommige blijven onbehandeld, afhankelijk van de leeftijd van de patiënt en de grootte en locatie van de benige brug6. Wanneer de misvorming van de ledematen ernstig is, omvatten chirurgische opties verwijdering gevolgd door het implanteren van interpositionele materialen zoals vet of siliconenrubber of corrigerende osteotomie en botverlengende procedures; Toch kan een benige brug nog steeds hervormen6. Er is meer onderzoek nodig om de vorming van benige bruggen te voorkomen en om de resultaten van kinderen met botgroeischijfletsels te verbeteren.
Er zijn verschillende diermodellen opgesteld om de onderliggende mechanismen te onderzoeken en nieuwe strategieën te ontwikkelen om aantasting van de benige brug van groeischijven na letsel te voorkomen 7,8,9,10,11,12. Deze diermodellen richten zich vaak op de proximale tibiale groeischijf en de distale dijbeengroeischijf als de primaire verwondingsplaats, aangezien dit meestal de plaats is waar menselijke verwondingen optreden. De dierlijke botdefecten worden gecreëerd door een laterale benadering die lijkt op een daadwerkelijke breukroute of een benadering van boven of onder de groeischijf die leidt tot een centraal boorgat in de groeischijf. In een eerder gerapporteerd rattenmodel wordt een groeischijfdefect gecreëerd door een tandbraam door een corticaal venster in de tibiale middenschacht in te brengen en omhoog te boren door het merg naar het kniegewricht om de groeischijf centraal te verwonden 7,13. Als alternatief gebruikt een recent muismodel een laterale benadering met een naald met een kleine boring om een vlak naaldspoor door de groeischijf te creëren8. In een veel gebruikt rattenmodel wordt het defect in de groeischijf van het distale dijbeen gecreëerd door door het gewrichtskraakbeen tussen de condylen te boren 9,14. Bij grotere dieren zoals konijnen en schapen zijn groeischijfdefecten zowel lateraal direct in het proximale scheenbeen als in het distale dijbeen geïnduceerd door in de groeischijf te boren of te snijden of door van onderaf te benaderen en een centraal defect te creëren waarbij de randen van de groeischijf ongewijzigd blijven 10,11,12,15.
Muizenmodellen voor verwondingen aan de groeischijf zijn voordelig voor mechanistische studies die kunnen worden uitgevoerd met genetisch gemodificeerde muizen, zoals onderzoek naar het traceren van stamcellijnen8. Een belangrijke uitdaging in diermodellen van muizen of ratten is echter het bereiken van consistente en nauwkeurige schade aan een bepaald subgebied van de groeischijf. Letsel aan bepaalde zones van de groeischijf en aangrenzend bot is vereist om een van de klinisch relevante breukpaden na te bootsen die worden beschreven door de Salter-Harris-classificaties. De uitdagingen tot nu toe in knaagdiermodellen zijn voornamelijk te wijten aan het ontbreken van een visueel middel om de onderlaag van de groeischijf te identificeren tijdens het chirurgisch ontstaan van de verwonding. Dit protocol beschrijft een verfijnde techniek voor het creëren van groeischijfdefecten in gerichte substrata van de muizengroeischijf door gebruik te maken van drievoudige transgene muizen die collageen I, II en X fluorescerende reporters tot expressie brengen 16,17,18. De verschillend gekleurde fluorescentie van deze collagenen in elk van de primaire zones van de groeischijf maakt visuele discriminatie van de verschillende delen van de groeischijf mogelijk onder een fluorescentie-stereomicroscoop tijdens het chirurgisch creëren van de groeischijfletsel. Het gebruik van deze transgene muizen zorgt voor een ongekende verwondingsnauwkeurigheid bij een jonge muis in een vergelijkbare ontwikkelingsfase als de kinderen die gewond zijn.
Protocol
Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling. Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het University of Connecticut Health Center voordat met het werk werd begonnen. Een schets van het protocol is beschreven in het schema van figuur 1 .
Figuur 1: Overzicht van het protocol voor beschadiging van de groeischijf bij driekleurige collageenreportermuizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Muizenfokken en voorbereiding op een operatie
- Fok driekleurige transgene collageenreportermuizen die Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP en Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 tot expressie brengen volgens standaard fokprocedures om pups voor chirurgie te verkrijgen die 2 weken oud zijn (± 1 dag). Verifieer de expressie van het drievoudige transgen door een fragment van de staartpunt te genotyperen onder een fluorescentiemicroscoop. Gebruik alleen de muizen die positief zijn voor alle drie de kleuren om het voordeel van het reportersysteem te maximaliseren tijdens de daaropvolgende histologische analyse.
OPMERKING: Deze leeftijd van 2 weken oud (± 1 dag) is gekozen omdat hun botgroeischijven zich in een vergelijkbaar ontwikkelingsstadium bevinden als de menselijke adolescent22. Dit protocol is van toepassing op muizen van beide geslachten. - Identificeer op de dag van de operatie of een dag ervoor elke muis die voor de operatie wordt gebruikt op unieke wijze met behulp van een oorpunch na het desinfecteren van het oor en de oorpunch met alcoholantiseptische pads, weeg elke muis en noteer de waarde.
- Scheer de hele rechter achterpoot van de heup tot de voet met een elektrische tondeuse terwijl de muis onder invloed is van isofluraan anesthesie. Om anesthesie bij muizen te induceren, gebruikt u een mengsel van isofluraan (2-3%) en 100% zuurstof, toegediend met een stroomsnelheid van 1 l/min in een inductiekamer van 1-2 l. Verwijder de muis en controleer of de anesthesiediepte voldoende is met een teenknijp waardoor de muis niet mag bewegen.
OPMERKING: Deze diepte van de anesthesie duurt lang genoeg om het scheren uit te voeren zonder dat een anesthesieneuskegel nodig is. - Gebruik röntgenbeeldvorming met een vermogensinstelling van 26 kV (800 mA) om scheenbeenbeelden vast te leggen bij levende muizen onder door isofluraan geïnduceerde anesthesie om de initiële lengte van de ledematen vast te leggen.
- Voordat u de muizen in de röntgenkast plaatst, induceert u een diepe staat van anesthesie met behulp van een mengsel van isofluraan (2-3%) en 100% zuurstof, toegediend met een stroomsnelheid van 1 l/min in een inductiekamer van 1-2 l.
- Plaats drie verdoofde muizen tegelijk parallel op hun buik in de röntgenkast op een plankhoogte waarmee één beeld kan worden verkregen dat alle drie de muizen omvat. Spreid de poten zodat de scheenbeenderen niet onder de muis worden verborgen. Voor een betere meetnauwkeurigheid plaatst u tijdens de beeldvorming een radiopake weegschaal in de buurt van de muis (Figuur 2A).
- Breng de voorbereide muizen terug naar hun huisvestingskooi met de moedermuis om volgende chirurgische ingrepen af te wachten.
2. Voorbereiding van chirurgische benodigdheden en steriel werkgebied
- Steriliseer de volgende items: 10-20 gaasjes, wattenstaafjes met wattenstaafjes, tandboren (diameter 0.5 mm), tandhandstukken, Graefe-pincetten, gebogen hemostatische muggentangen, gebogen fijne scharen, naaldhouders, parodontale sondes en tandcleoïde schijfvormige snijders.
- Verzamel extra noodzakelijke steriele benodigdheden: een injecteerbare suspensie van buprenorfine, naalden van 20 G, spuiten van 1 ml, handdoekgordijnen, 5-0 ongeverfd, gevlochten, gecoat, vicrylhechtingen, povidonjodium, fosfaatgebufferde zoutoplossing, antiseptische pads voor alcohol, #15 scalpels, chirurgische handschoenen, sox voor omgevingsbarrièrebuis, oogsmeermiddel, 70% ethanolspray. Zet een glaskralensterilisator aan voor extra sterilisatie van items tijdens de operatie en het elektrische verwarmingskussen onder een schone muizenkooi met gesteriliseerd beddengoed.
- Reinig en steriliseer de fluorescentie-stereomicroscooptafel, aangrenzende oppervlakken en de standaard van het chirurgisch instrument met 70% ethanol. Bedek deze gebieden, die de chirurgische werkruimte zullen worden, met steriele handdoekgordijnen.
- Monteer het elektronische high-speed tandheelkundig boorsysteem. Sluit het elektronische voetpedaal aan op de bedieningseenheid en bedek het snoer van het handstuk met een gedesinfecteerde oppervlaktebarrièrebuis. Bevestig de steriele ronde tandboor van 0,5 mm. Zet de controller aan en stel deze in op een aandrijfverhouding van 1:1 en een maximum van 30.000 tpm.
- Zet de flexibele isofluraanmachineslang vast met tape die eindigt met de neuskegel bedekt met een gedesinfecteerde oppervlaktebarrièrebuis sox op de fluorescentie-stereomicroscooptafel.
- Schakel de fluorescentie-stereomicroscoop en hulpapparatuur in en open de beeldacquisitiesoftware.
Figuur 2: Belangrijkste stappen van de procedure voor letsel aan de trilineage fluorescerende reporter muizen groeischijfletsel. (A) Het meten van de scheenbeenlengte door middel van faxitron röntgenbeeldvorming met behulp van een radiopake liniaal die naast de muizen in de röntgenkast is geplaatst. (B) Juiste positie van een verdoofde muis voor chirurgie onder een fluorescentie-stereomicroscoop. Proximaal scheenbeen aangegeven door een zwarte pijl. (C) Een voorbeeld van een incisie die is gemaakt om toegang te krijgen tot de groeischijf. (D) Fluorescentie-stereomicroscopie die de hypertrofische zone van de groeischijf verlicht (witte pijl). De aangrenzende proliferatieve zone wordt aangegeven met een gele pijl. (E) Heldere lichtverlichting van de chirurg die de tandboor van 0,5 mm tegen de groeischijf plaatst. (F) Nauwkeurige plaatsing van de tandboor wordt geleid door fluorescentie-stereomicroscopie in de hypertrofische zone. (G) Een voorbeeld van een Salter-Harris Type II-achtig groeischijfdefect (witte pijl). Schaal balken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Procedure voor beschadiging van de proximale groeischijf van het scheenbeen
- Verdoof de muis in de isofluraan-anesthesiekamer en stel de isofluraanconcentratie in op 2-3% en de zuurstofstroomsnelheid op 1 l/min. Wacht op de inductie van een diepe anesthesietoestand, geverifieerd door een teenknijptest en de observatie van ademhalingspatronen.
- Dien de helft van de voorgeschreven dosis buprenorfine subcutaan toe onmiddellijk na verwijdering van de muis uit de kamer. De dosering van buprenorfine is volgens het goedgekeurde dierprotocol.
- Breng oculair glijmiddel aan om de ogen van de muis te beschermen tegen uitdroging tijdens de operatie en breng de muis in rugligging over naar de neuskegel van de isofluraanmachine op de stereomicroscooptafel (Figuur 2B). Stel de anesthesiestroom door de neuskegel in op 2% en de zuurstofstroomsnelheid op 1 l/min.
- Desinfecteer de rechter achterpoot, het bekkengebied, het voorste aspect van de linker achterpoot en de staart achtereenvolgens met povidonjodium gevolgd door 70% ethanol.
- Controleer een aanhoudende stabiele diepte van anesthesie door middel van een extra teenknijptest en observatie van ademhalingspatronen voordat de operatie begint.
- Gebruik onder fel licht een #15 scalpel om een incisie in de huid te maken net onder het kniegewricht met een initiële lengte van ongeveer 5 mm, om het proximale uiteinde van het rechter scheenbeen te onthullen (Figuur 2C). Gebruik indien nodig een schaar om de snede te verlengen. Houd het linker contralaterale scheenbeen ongedeerd, zodat het dient als een interne niet-gewonde controle.
- Voer een verticale stompe dissectie uit door de bovenliggende spier bij het proximale scheenbeen met behulp van de achterkant van de #15 scalpel, waarbij het zachte weefsel wordt verwijderd voor een duidelijke blootstelling van de groeischijf.
- Schakel de lichten in de operatiekamer uit en selecteer het juiste fluorescentiekanaal om het gewenste gebied van de groeischijf te verlichten. Filtersets die nodig zijn om elk van de fluorescerende collageen af te beelden, zijn Col 2 Cyaan: ET436/20x (excitatie), ET480/40 m (emissie), Col 10 mCherry: ET577/20x (excitatie), ET640/40 m (emissie), Col 1 Topaz: ET500/20x (excitatie), ET535/30 m (emissie). Plaats de muis om de proximale tibiale groeischijf te observeren (Figuur 2D). Pas de huidopening iets meer proximaal en vervolgens distaal aan om ervoor te zorgen dat de tibiale groeischijf in zicht is en niet de dijbeengroeischijf.
- Creëer een Salter-Harris Type II-achtige laesie terwijl u door het microscoopoculair kijkt door de 0,5 mm tandboorboor evenwijdig aan de tibiale as in het midden van de hypertrofische groeischijfzone te plaatsen, met behulp van een laterale benadering (Figuur 2E,F). Om reproduceerbaar een defect te maken dat een Salter-Harris Type II-laesie nabootst, houdt u de ledemaat evenwijdig aan het werkoppervlak, zodat de toegangsroute van de boor niet in de epifyse kantelt. Oefen druk uit op het boorpedaal om de rotatie van de boor te starten en druk de boor voorzichtig in de groeischijf en stop voordat het defect dieper gaat dan de diameter van de boor (Figuur 2G).
OPMERKING: Een tweede paar handen dat helpt bij het stabiliseren van de muisledemaat is nuttig. - Spoel de plaats van de laesie met een druppel steriele PBS om vuil te verwijderen.
- Bevestig de diepte van het defect op 0,5 mm met behulp van een parodontale sonde.
4. Procedures na een blessure en sluiting
- Voor karakterisering van het defect zonder tijd, oogst u de gewonde achterpoot en de controleledemaat voordat het weefsel wordt gesloten. Volg het oogsten van het weefsel en de voorbereiding op de daaropvolgende microcomputertomografie (microCT) en cryo-histologiebeeldvorming in rubriek 6.
OPMERKING: Voor experimenten waarbij een therapeutische stof in het groeischijfdefect wordt geïmplanteerd, kan het defect zelf alleen een stuk biomateriaal bevatten dat ongeveer bolvormig is en een diameter van 0,5 mm of 0,082mm3 (0,082 μL) in volume heeft. - Gebruik een pincet onder microscopische visualisatie om het biomateriaal in te brengen of injecteer een vloeibaar therapeutisch middel in het defect in de groeischijf. Gebruik een grotere hoeveelheid biomateriaal of geïnjecteerde stof als de onderzoeksopzet niet vereist dat het therapeutisch middel beperkt blijft tot alleen het defect.
- Lijn de huidranden voorzichtig opnieuw uit en zorg ervoor dat het geïmplanteerde materiaal, indien aanwezig, stevig op de defecte plaats blijft.
- Gebruik onderbroken hechttechnieken met 5-0 polyglycolzuurhechtingen om de huidincisie effectief af te dichten.
- Reinig de gebieden buiten het operatiegebied grondig van povidonjodiumresten met behulp van wattenstaafjes met steriel water, zorg ervoor dat contact met de wond en de nabijgelegen gebieden wordt vermeden.
- Haal de muis van de isofluraanneuskegel op de microscooptafel naar een herstelkooi en plaats deze zijdelings op vers beddengoed over een verwarmingskussen.
- Observeer de ademhalingsfrequentie van de muis nauwkeurig gedurende ongeveer 5 minuten en dien de resterende dosis buprenorfine voor analgesie toe, net op het moment dat de effecten van de isofluraananesthesie afnemen, wat wordt aangegeven door een toename van de ademhalingsfrequentie, maar vóór het begin van de mobiliteit. Houd de muis in een geïsoleerde herstelkooi totdat hij volledige ambulante capaciteiten vertoont, en herenig hem daarna met zijn moeder en broers en zussen.
- Voer dagelijkse inspecties uit gedurende de eerste 48 uur na de operatie, gevolgd door wekelijkse beoordelingen tot aan het punt van euthanasie. Concentreer u op tekenen van infectie, voortbewegingsefficiëntie, toegankelijkheid tot voedsel en de integriteit van hechtingen.
- Spenen van de muizen op de standaardtijd (d.w.z. 3 weken oud).
5. Lengtemetingen van ledematen
- Op basis van de tijdstippen bepaald door de experimentele hypothese en het ontwerp, verdooft u de muizen met isofluraan en voert u röntgenbeeldvorming uit van de volledige lengte van zowel de gewonde als de niet-gewonde scheenbeenderen, zoals weergegeven in figuur 2A en beschreven in rubriek 1.4. Geschikte oriëntatiepunten voor het uitvoeren van consistente ledemaatlengtemetingen zijn onder meer de bovenkant van de scheenbeenepifyse en het distale uiteinde van het scheenbeen bij het tibiotalaire gewricht, zoals weergegeven in figuur 3.
OPMERKING: Beeldvorming wordt gebruikt om verschillen in ledemaatlengte en ledemaatlengte als gevolg van het letsel te beoordelen, evenals de ontwikkeling van de benige brug in de groeischijfweefsels met specifieke postoperatieve tussenpozen.
6. Weefseldissectie, fixatie, microCT-beeldvorming en inbedding
- Euthanaseer de muis via CO2 -verstikking, bij voorkeur met behulp van een geautomatiseerd CO2 -inductiesysteem met een bevestiging van de dood door een alternatieve methode zoals cervicale dislocatie.
- Isoleer beide intacte achterpoten en verwijder huid en spieren uit het bot- en kniekapselgebied ter voorbereiding op histologische en microCT-analyse.
- Voordat u de achterpoten in het fixeermiddel plaatst, snijdt u de knieschijf voorzichtig weg door deze af te knippen met een micro-ontleedschaar om de fixerende penetratie in de knieholte te vergemakkelijken. Gebruik een insulinespuit van 29 G om de koude 10% gebufferde formaline grondig te verdelen in alle delen van de knieholte. Ernstige het diafysaire gebied van het dijbeen en het scheenbeen om de fixatieve toegang tot de mergruimte te verbeteren. Houd het gewrichtsweefsel gedurende 24-36 uur bij 4 °C in een volledig gestrekte positie in het fixeermiddel door het met gaas aan een dunne plug vast te binden.
LET OP: Formaline is giftig en moet worden gehanteerd in een zuurkast terwijl u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
- Voordat u de achterpoten in het fixeermiddel plaatst, snijdt u de knieschijf voorzichtig weg door deze af te knippen met een micro-ontleedschaar om de fixerende penetratie in de knieholte te vergemakkelijken. Gebruik een insulinespuit van 29 G om de koude 10% gebufferde formaline grondig te verdelen in alle delen van de knieholte. Ernstige het diafysaire gebied van het dijbeen en het scheenbeen om de fixatieve toegang tot de mergruimte te verbeteren. Houd het gewrichtsweefsel gedurende 24-36 uur bij 4 °C in een volledig gestrekte positie in het fixeermiddel door het met gaas aan een dunne plug vast te binden.
- Na 24-48 uur formalinefixatie bij 4 °C, voert u röntgenmicroCT met hoge resolutie uit van contralaterale en gewonde monsters door middel van microCT-beeldvorming na het overbrengen van monsters naar PBS, voor beoordeling van de ontwikkeling van de benige brug. Gebruik een voxelgrootte van 6,0 μm, sampletijden van 330.000 ms en energie-instellingen van 55.000 V met een intensiteit van 145 μA.
- Na microCT-beeldvorming en nog eens 24 uur formalinefixatie bij 4 °C, spoelt u de monsters gedurende 3 x 5 minuten in 1X PBS en dompelt u de monsters vervolgens onder in 10% sucrose in 1X PBS gedurende 1 uur, 20% sucrose in 1X PBS gedurende 1 uur en 30% sucrose in 1X PBS gedurende een nacht. Gebruik een insulinespuit van 29 G gevuld met sucroseoplossing om ervoor te zorgen dat de sucroseoplossing in alle knieholten doordringt. Breng over naar een vriezer van -80 °C als deze niet wordt ingebed na de nachtelijke onderdompeling van sucrose om ervoor te zorgen dat de GFP-reporter en de enzymatische activiteit van het weefsel behouden blijven.
- Verwijder eventueel achtergebleven spierweefsel uit het gewrichtsgebied voordat u het inbedt. Breng het monster 's nachts in evenwicht met een cryo-inbeddingsmedium, waardoor het medium gemakkelijker in de knieholte kan doordringen.
- Bekijk de microCT-beelden om te bepalen waar het defect en de benige brug zich bevinden voordat ze worden ingebed. Breng een dunne laag van het cryo-inbeddingsmedium aan in een cryomal en plaats het ontlede en nog verbonden scheenbeen/dijbeen/gewricht zodanig dat het interessegebied 90° naar het oppervlak van het inbeddingsmedium wijst.
OPMERKING: Deze oriëntatie stelt de doorsnede in staat om het zijaanzicht van het zijdelings gecreëerde defect vast te leggen. Als de benige brug zich aan de rand van het defect bevindt, voorkomt deze oriëntatie ook de mogelijkheid dat het interessegebied wordt gemist tijdens de eerste dikkere secties die door het weefsel worden genomen. - Plaats de cryomal op droogijs totdat het cryo-inbeddingsmedium stolt en het monster vastzet. Blijf de cryomold vullen met het medium terwijl je het op droogijs houdt.
- Nadat u het monster hebt vastgezet, dompelt u de cryomal onder in 2-methylbutaan gekoeld met droogijs tot deze volledig bevroren is. Verwijder na het invriezen overtollig 2-methylbutaan, wikkel de cryomallen in cellofaan en bewaar ze bij -20 °C of -80 °C.
OPMERKING: Voor langdurige opslag langer dan 1-2 maanden in een cryo-inbeddingsmedium wordt -80 °C aanbevolen om uitdroging te voorkomen. Tape-geassisteerde cryosecties en hechting van de secties aan de glasplaatjes zijn eerder beschreven23.
7. Sequentiële beeldvorming, kleuring en opnieuw beeldvorming
- Implementeer een sequentiële procedure van beeldvorming, kleuring en herbeelding om de detectie en colokalisatie van meerdere biologische signalen binnen hetzelfde weefselgedeelte te vergemakkelijken, zoals eerder beschreven23. Specifiek voor de groeischijfsecties van de driekleurige collageenreportermuizen worden de volgende stappen aanbevolen. Deze geordende aanpak zorgt voor een uitgebreide visualisatie van zowel moleculaire signalen als structurele details.
- In eerste instantie vangt u endogene fluorescerende signalen op voor de drie collagenen in de eerste beeldvormingsronde.
- Breng calceïne blauwe kleuring en beeld aan voor gemineraliseerd weefsel23, gevolgd door de tartraatresistente zure fosfatase (TRAP) enzymatische activiteitskleuring en beeldvorming23.
OPMERKING: Hoewel de kleuringsresultaten van de enzymatische activiteit van TRAP hier niet worden weergegeven, wordt deze kleuringsstap uitgevoerd omdat deze essentieel is voor de verwijdering van mineraal vóór de Safranin O/Fast Green-kleuringsresultaten die worden gepresenteerd in de sectie met representatieve resultaten. - Voer 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) nucleaire kleuring uit zoals hieronder beschreven en maak vervolgens beeld.
- Plaats objectglaasjes die eerder zijn afgebeeld in een Coplin-pot met 1x PBS. Laat ze ondergedompeld totdat de dekglaasjes loskomen van de dia's. Eenmaal losgemaakt, verwijdert u de dekglaasjes en droogt u ze grondig.
- Breng DAPI-tegenkleuringsoplossing aan op de dekglaasjes, met behulp van een verdunning van 1:1.000 DAPI in een mengsel van 50% glycerol en 1x PBS. Ga verder met het beeldvormingsproces na het aanbrengen.
- Sluit af met het aanbrengen van Safranin O/Fast Green-beits om de weefselarchitectuur en vervolgens het beeld te accentueren.
OPMERKING: Voer dit uit als de laatste stap om chromogene beelden te correleren met fluorescerende signalen.- Bereid Weigert's Iron Hematoxyline-oplossingen voor. Bereid oplossing A voor door 1 g hematoxyline op te lossen in 100 ml 95% ethanol en oplossing B door 4 ml 29% ijzerchloride-oplossing, 95 ml gedeïoniseerd water en 1 ml geconcentreerd HCl te combineren. Meng gelijke delen oplossing A en B om de werkende hematoxyline-oplossing van Weigert te maken, stabiel gedurende ongeveer 4 weken.
- Dompel de dia's 2 x 2 minuten onder in gedeïoniseerd water om te hydrateren.
- Breng de werkende hematoxyline-oplossing van Weigert aan gedurende 5 minuten.
- Was de glaasjes 5 minuten in kraanwater en daarna 1 minuut kort in gedeïoniseerd water.
- Vlek met 0,2% Fast Green-oplossing (0,2 g Fast Green FCF in 100 ml gedeïoniseerd water) gedurende 2 minuten.
- Spoel kort af in 1% azijnzuur gedurende 1 min.
- Kleuring met 0,1% Safranin O-oplossing (0,1 g Safranin O in 100 ml gedeïoniseerd water) gedurende 1 minuut.
- Spoel af in gedeïoniseerd water tot een visueel uitgebalanceerde kleur, ongeveer 5 min.
- Monteer objectglaasjes in 30% glycerol in gedeïoniseerd water (vermijd PBS) en ga onmiddellijk verder met beeldvorming om kleurdiffusie uit het weefsel te voorkomen. Om de cellen van de rustzone van de groeischijf te accentueren, voert u het beeld uit met een Cy5-filter: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).
Resultaten
Dit protocol maakt gebruik van trilineage fluorescerende reportermuizen om met precisie een lateraal groeischijfdefect in het proximale scheenbeen te induceren door gebruik te maken van de inherente rode fluorescentie die wordt uitgezonden door type X-collageen voor chirurgische begeleiding. Het zicht dat de chirurg heeft terwijl hij door het stereomicroscoopoculair met de mCherry-filterset kijkt, wordt weergegeven in figuur 2D. De natuurlijke Type X-fluorescentie stelt de chirurg in staat om de boor in de hypertrofische zone te plaatsen en een verwonding te creëren die een veelvoorkomend type groeischijfletsel nabootst dat leidt tot een benige brug (Figuur 2F). De fluorescentie onder het rode kanaal is het helderst en wordt daarom aanbevolen voor gebruik tijdens het plaatsen van de boor. Als alternatief kan het creëren van defecten worden geleid door andere kleuren van de natuurlijke fluorescentie van de drievoudige transgene muizen te gebruiken als het doel van het experiment is om verwondingen aan andere zones van de groeischijf dan de hypertrofische zone en het aangrenzende verkalkte gebied te bestuderen.
De creatie van een Salter-Harris Type II-achtig defect in de hypertrofische zone van de groeischijf en het aangrenzende onderste botweefsel, met behulp van een tandboor met een diameter van 0,5 mm, werd gevalideerd door middel van microCT en cryo-histologiebeeldvorming van de gewonde (tijd 0) proximale tibias in vergelijking met de niet-gewonde laterale controles bij N = 3 muizen (Figuur 4). De defecten waren moeilijk te zien in de 3D microCT-beelden, maar waren detecteerbaar in de 2D-doorsneden (Figuur 3A, B, E, F). Figuur 3G toont de verdeling van type I collageenproducerende botcellen (groene fluorescentie), type II collageenproducerende proliferatieve chondrocyten (cyaanfluorescentie) en type X collageenproducerende hypertrofische chondrocyten. In het beeld van de gewonde muis (Figuur 4G) is er een verstoring van de hypertrofische zone, de voorlopig verkalkte laag en een deel van het nieuw gevormde bot ten opzichte van de controlegroep, waarbij de proliferatieve zone slechts licht verstoord is. Safranin O/Fast Green-kleuring (Figuur 4H) illustreert het beste de locatie van het defect in de beschadigde groeischijf, aangezien alle cellen duidelijk zichtbaar zijn.
Röntgenanalyse geeft enig inzicht bij levende muizen over de impact van dit type groeischijfletsel op de lengte van het scheenbeen en de vorming van benige bruggen in de loop van de tijd (Figuur 3). Vergelijkende beeldvorming tussen niet-gewonde (Figuur 3A) en gewonde (Figuur 3B) scheenbenen, genomen vóór de operatie en 3 weken na de operatie, onthult een grote hoeveelheid groei van de ledematen, dunner worden van de groeischijven en een duidelijk ondoorzichtig gebied dat zich na 3 weken heeft ontwikkeld in het gebied van de geblesseerde groeischijf. Deze troebelheid in de groeischijf is niet aanwezig bij de niet-gewonde tegenhanger of de muizen vóór de operatie. Faxitron is dus een manier om pathologische veranderingen te observeren die worden veroorzaakt door de verwonding bij levende muizen, zoals de vorming van een benige brug en veranderingen in de lengte van de ledematen.
MicroCT-beeldvorming van ontlede botten biedt een gedetailleerde visualisatie van de vorming van benige bruggen in de beschadigde groeischijven drie weken na de operatie (Figuur 5). Zoals te zien is in de afbeeldingen van zes verschillende gewonde muizen in figuur 5, is er bij alle muizen een consistente ontwikkeling van de benige brug. Met behulp van de software van Scanco Medical werd het volume van de benige brug berekend door elk deel van de proximale tibiale groeischijf te bekijken, het gebied van de benige brug af te bakenen (Figuur 5B) met het selectiegereedschap en vervolgens elk sectiegebied in het gehele volume van de groeischijf te integreren om het totale volume24 te krijgen. Het op deze manier berekende volume van de benige brug was 0,0761 mm3 ± 0,0246 (gemiddelde ± standaarddeviatie, N = 6). Het merendeel van de benige bruggen vormt zich in de buurt van het midden van de groeischijf, ondanks de zijdelingse benadering, die zowel de buitenrand als het midden van de groeischijf beschadigt. Dit fenomeen kan worden toegeschreven aan het feit dat mesenchymale stamcellen (MSC's) uit het beenmerg, in plaats van het perichondrium, verantwoordelijk zijn voor de vorming van benige bruggen25.
Bij deze driekleurige transgene muizen wordt de cryo-histologische analyse van de beschadigde groeischijf verrijkt met de natuurlijke collageenfluorescentie (Figuur 6). Het onthult het complexe samenspel van botcellen en chondrocyten op de plaats van de verwonding. MicroCT-beelden zoals weergegeven in figuur 6J,K werden aan de histologietechnicus verstrekt om de inbedding en doorsnede te begeleiden. De type I collageenproducerende botcellen worden gezien in figuur 6L,O,P (groene fluorescentie), terwijl type II collageenproducerende proliferatieve chondrocyten worden gezien in figuur 6L,O,Q (cyaanfluorescentie). Type X collageenproducerende hypertrofische chondrocyten zijn te zien in figuur 6L,O,R (rode fluorescentie). Deze veelkleurige fluorescentiebenadering maakt een gedetailleerd onderzoek mogelijk van postoperatieve chondrocytendifferentiatie in het gebied van de benige brug tegen een achtergrond van gemineraliseerd weefsel. DAPI-kleuring werd gebruikt om de verdeling van alle celtypen binnen het gebied van de groeischijf te bevestigen (Figuur 6M). De Safranin O/Fast Green-kleuring demonstreert de samengestelde en structurele organisatie van kraakbeen en bot in de beschadigde groeischijf (Figuur 6N). Door deze gekleurde secties in beeld te brengen onder een Cy5-filterset, worden de cellen in de rustzone op het grensvlak tussen het epifysaire bot en het kraakbeen aanzienlijk helderder.
Figuur 3: Röntgenfoto's van contralaterale controle en gewonde scheenbeenderen van muizen. (A) Röntgenfoto's van het scheenbeen van de contralaterale controle worden gemaakt vlak voor de verwonding wanneer de muizen 2 weken oud zijn en 3 weken na de operatie wanneer de muizen 5 weken oud zijn, om de mate van groei aan te tonen die tijdens deze periode optreedt. (B) Gewond scheenbeen van dezelfde muis op dezelfde tijdstippen als in (A). De oriëntatiepunten die worden gebruikt voor het meten van de lengte van het scheenbeen zijn de top van de kop van het proximale scheenbeen tot het einde van het scheenbeen bij het enkelgewricht (rode tweepuntige pijlen). De ondoorzichtige benige brug is na 5 weken zichtbaar in de beschadigde groeischijf van het proximale scheenbeen. Schaal balken = 5,00 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: MicroCT en histologische beelden van contralaterale controle op tijd nul en gewonde proximale scheenbeenderen van muizen. (A,E) en (B,F) tonen 3D- en transversale 2D-microCT-weergaven, waarbij het defect wordt aangegeven door rode pijlen in (E) en (F). (C,G) Samengestelde samengevoegde cryo-histologische beelden die drie aangeboren fluorescentielagen samenvoegen met een gemineraliseerde weefsellaag. Groene cellen (Col3.6GFPtpz) zijn de type I collageenproducerende botcellen, cyaanblauw gekleurde cellen (Col2A1GFPcyan) zijn type II collageenproducerende proliferatieve chondrocyten en rode cellen (Col10A1RFPchry) zijn type X collageenproducerende hypertrofische chondrocyten. (D,H) Safranin O/Fast Green kleuring van dezelfde regio als (C) en (G). Schaal balken = 1,0 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: MicroCT-beelden van benige bruggen gevormd door dit protocol. (A,C,E,G,I,K) Transversale doorsneden van de proximale tibiale groeischijf van zes verschillende muizen 3 weken na het ontstaan van een boordefect. Benige brug omlijnd door een rode stippellijn in (A). (B,D,F,H,J,L) 3D reconstructies met een weggesneden langsvlak. Benige brug omlijnd door een rode stippellijn in (B). Schaal balken = 1,0 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: MicroCT en histologische beelden van contralaterale controle en gewonde proximale scheenbeenderen van muizen met vorming van benige bruggen. (A,J) en (B,K) tonen 3D- en transversale 2D-microCT-weergaven, waarbij de benige brug wordt aangegeven door gele pijlen in (J) en (K). (C,L) Samengestelde samengevoegde cryo-histologische beelden die drie aangeboren fluorescentielagen samenvoegen met een gemineraliseerde weefsellaag. Groene cellen (Col3.6GFPtpz) zijn de type I collageenproducerende botcellen, cyaanblauw gekleurde cellen (Col2A1GFPcyan) zijn type II collageenproducerende proliferatieve chondrocyten en rode cellen (Col10A1RFPchry) zijn type X collageenproducerende hypertrofische chondrocyten. Het witte vak geeft de hogere vergroting aan die wordt weergegeven in de panelen F en O. (D,M) Het gemineraliseerde weefsel en DAPI-kleuring in het gebied van de groeischijf van panelen C en L. (E,N) Safranine O/Fast Green-kleuring van hetzelfde gebied als (D) en (M) gescand met cy5-fluorescentie. (F,O) Een hogere vergroting van het gebied van de groeischijf in de samengevoegde afbeelding van panelen C en L. (G-I, P-R) Individuele kanalen van de natuurlijke fluorescentie weergegeven met een achtergrond van gemineraliseerd weefsel. Schaalbalken = 1,0 mm (A-E) en (J-N), = 250 μm in (F-I) en (O-R). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
Het innovatieve gebruik van driekleurige collageenreportermuizen maakt het mogelijk om groeischijfdefecten te creëren met een vooraf bepaalde grootte en locatie, waardoor de nauwkeurigheid van experimentele modellen van muizen voor groeischijfletsels aanzienlijk wordt verbeterd. Gezien het kleine formaat van de 2 weken oude muizen, is het van cruciaal belang om een kleine boor van 0,5 mm te gebruiken om de verwonding te veroorzaken om te voorkomen dat de ledemaat wordt verzwakt en een fractuur over de volledige dikte wordt veroorzaakt. De chirurg moet ook net genoeg druk uitoefenen bij het creëren van het defect om te voorkomen dat hij om dezelfde reden te diep in het bot boort. Het gebruik van de perioprobe is van cruciaal belang om een consistente verwondingsdiepte te bevestigen.
Zoals bij elke operatie, is het belangrijk om een voldoende diepte van anesthesie te bevestigen, bevestigd door af en toe een teenknijp en de steriliteit wordt de hele tijd gehandhaafd. Een ander chirurgisch punt van belang is dat stompe dissectie met een carver is beschreven omdat het beschadiging van zacht weefsel voorkomt en ervoor zorgt dat de muizen onmiddellijk na herstel van de anesthesie kunnen lopen om de moedermuis te bereiken voor voeding en comfort. Onze ervaring is dat de met hechtingen gesloten wonden succesvol gesloten zijn gebleven en dat wondklemmen niet nodig zijn. Chirurgie bij muizen op de leeftijd van 2 weken wordt aanbevolen om het jonge kind dat groeischijffracturen ervaart zo goed mogelijk na te bootsen. Een nadeel van dit protocol is dat, gezien de onvoorspelbare aard van de bevalling, het gebruik van dit muismodel de beschikbaarheid van de chirurg op korte termijn vereist.
Wat betreft de positionering van de boor om het defect te creëren, beschrijft het protocol het creëren van de verwonding met behulp van een mCherry/Texas rode filterset die de hypertrofische zone in de groeischijf verlicht vanwege de helderheid van de collageen X-fluorescentie. Om ervoor te zorgen dat de verwonding in de tibiale groeischijf ontstaat, is het nuttig om de opening van zacht weefsel iets naar links en rechts te bewegen om te bevestigen dat de proximale tibiale groeischijf in zicht is, en niet het dijbeen. Schakelen tussen filtersetkanalen om de proliferatieve chondrocytenzone of de aangrenzende botsecties te verlichten, is handig om een nauwkeurige plaatsing te bevestigen ten opzichte van de locatie van de proliferatieve zone en aangrenzende botsecties.
Terwijl de proliferatieve chondrocytenzone en het epifysaire en metafysaire bot kunnen worden onderscheiden onder fluorescentiemicroscopie bij levende muizen, wordt de echte waarde van de Type II en Type I collageenreporters gerealiseerd tijdens de histologische analyse van de groeischijf. Gezien de waterige aard van cryohistologische processen, zijn traditionele chromogene kleurstofprecipitatieprotocollen ongeschikt vanwege de mogelijke verkeerde uitlijning van de kleur met fluorescerende beeldvorming veroorzaakt door uitdrogingsstappen. Hoewel het waterige protocol kleuringspatronen oplevert die vergelijkbaar zijn met die in paraffinesecties, is snelle beeldvorming na kleuring essentieel om diffusie van kleurstof uit het weefsel te voorkomen. Door gebruik te maken van 30% glycerol in gedestilleerd water als montagemedium kan deze diffusie worden vertraagd, waardoor meerdere chromogene kleuringen op hetzelfde gedeelte mogelijk zijn, inclusief kraakbeen met Safranin O/Fast Green.
Het endochondrale verbenproces is duidelijk zichtbaar met rode chondrocyten die de evoluerende benige brug bekleden (figuur 6). Aanvullend gebruik van immunohistochemische technieken, waarvoor veel antilichamen tegen muizen beschikbaar zijn, zou de mechanistische studies bij deze transgene muizen verder kunnen verbeteren. Al met al biedt de combinatie van faxitron-, microCT- en cryo-histologische beeldvormingstechnieken in dit transgene muismodel een uitgebreid begrip van macroscopische en microscopische veranderingen die optreden als reactie op verwondingen aan de groeischijf, wat de weg vrijmaakt voor toekomstige therapeutische interventies om dergelijke nadelige resultaten te verminderen. Verdere genetische manipulaties van deze transgene muizen zouden kunnen worden gedaan om afstammingsstudies mogelijk te maken om de oorsprong te begrijpen van de cellen die tijdelijk en ruimtelijk betrokken zijn bij genezing. Experimenten op muizen met aanvullende aanpassingen zouden de studie van kraakbeenziekten zoals osteochondroom mogelijk maken - een overgroei van kraakbeen en bot in de buurt van de groeischijf.
De consistentie van ons model wordt aangetoond door de reproduceerbare vorming van benige bruggen bij alle muizen zonder dat ze muizen uit de groep hoeven weg te gooien vanwege gewrichtskraakbeenletsel. Dit is een verbetering ten opzichte van eerdere modellen die de groeischijf benaderden vanuit een corticaal venster onder de groeischijf en een scherp gereedschap of boor naar boven richtten in de richting van de groeischijf en af en toe overschoten in het gewrichtskraakbeen. Een bijkomend letsel van het gewrichtskraakbeen bootst niet de vaak voorkomende groeischijfletsels bij kinderen na. De preciezere verwonding van dit diermodel vermindert het aantal muizen dat per experiment nodig is en dat is een andere verbetering. Het gebruik van transgene muizen stelt de onderzoeker in staat om de verwonding te concentreren op subsecties van de groeischijf, zoals het hypertrofische/voorlopig verkalkte gebied of het epifyse/rustzone/proliferatieve zonegebied, zonder het gewrichtskraakbeen aan te tasten. Een beperking van dit model is echter de variabiliteit in het volume van de benige brug, die tot 30% kan verschillen bij gewonde dieren. Voor het detecteren van een klinisch significant effect op de vorming van benige bruggen zijn dus nog steeds een groot aantal dieren nodig om statistische relevantie te bereiken.
Voordelen van een muismodel zoals hier beschreven in vergelijking meteerder gepubliceerde modellen voor groeischijfletsel bij ratten of konijnen 7,9,10,14, zijn onder meer een lager aantal gebruikte dieren, kostenvermindering, een efficiënte replicatiegrootte als gevolg van reproduceerbare vorming van benige staven, een korter tijdsbestek voor onderzoek en nauwkeurigere plaatsing van letsel als gevolg van live beeldvorming van de drievoudige transgene muizen. Hoewel dit muismodel niet in detail wordt besproken, kan het worden gebruikt om weefsel-gemanipuleerde implantaten of biomaterialen die groeifactoren leveren te testen. Een opmerkelijke beperking van deze muizenmethode is dat de grootte van een implantaat dat wordt gebruikt om therapeutische geneesmiddelen of cellen af te geven, beperkt is tot het defectvolume van ongeveer een bol met een diameter van 0,5 mm. Alleen grotere diermodellen kunnen de hoeveelheid testmateriaal bevatten die bij menselijke patiënten zou worden gebruikt. Het boordefect dat in dit protocol wordt gecreëerd, heeft niet dezelfde geometrie als een dunne breuk en verschilt dus van echte menselijke verwondingen. Desalniettemin zijn de voordelen van dit muismodel talrijk, en de laterale benadering voorkomt beschadiging van het gewrichtskraakbeen dat zou optreden bij het blindelings benaderen boven of onder de groeischijf in lijn met de lange as van het scheenbeen. Deze methodologie vertegenwoordigt een substantiële sprong voorwaarts in het onderzoek naar groeischijfletsel en biedt een gedetailleerde en reproduceerbare methode voor het onderzoeken van pathologie en het evalueren van nieuwe therapeutische strategieën.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) 1R21AR079153 en een subsidie van het University of Connecticut Research Enhancement Program (REP). De auteurs willen graag de hulp van Renata Rydzik van de MicroCT Imaging Core-faciliteit van de Universiteit van Connecticut erkennen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-methyl-butaan | Sigma Aldrich | M32631 | |
| Alcohol antiseptic pads | Acme United Corporation | H305-200 | |
| Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss AG | Axio Scan.Z1 | |
| AxioVision software | Carl Zeiss AG | ||
| Betadine oplossing (10% povidoon-jood) | Avrio Health L.P. | 67618-150-01 | |
| Calcein | Sigma Aldrich | C0875 | |
| Calcein Blue | Sigma Aldrich | M1255 | |
| CFP filter set | Chroma Technology Corp. | 49001 | |
| Cryomatrix | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Cryomolds | Fisher Scientific | Fisherbrand #22-363-554 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | 3050s | |
| Cryostat blades | Thermo Scientific | 3051835 | |
| Cryotape | Section Lab | Cryofilm 2C | |
| Gebogene fijne schaar | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Gebogene hemostatische vlektang | HuFriedyGroup | H3 | |
| cy5 filter set | Chroma Technology Corp. | 49009 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | |
| DAPI filter set | Chroma Technology Corp. | 49000 | |
| Tandborstel (0,5 mm diameter) | |||
| Tandborstel (canna discoid) | ACE Surgical Supply Inc. | 6200097A-EA | |
| Droogglaskralen sterilisator (Inotech Steri 350) | Inotech Bioscience, LLC | IS-250 | |
| Oorpunch | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Elektrische verwarmingskussen | |||
| Elektronische voetbediening | Nouvag AG | 1866nou | |
| Elektronische motoren 31 ESS | Nouvag AG | 2063nou | |
| Omgevingsoppervlakbarrière (3 x 12 inch buissokjes) | Patterson Companies, Inc. | BB-0312H | |
| Ethanol (70%) | |||
| Ethiqa XR (buprenorfine extended-release injecteerbare suspensie) 1,3 mg/mL | Fidelis Animal Health | 86084-100-30 | |
| Faxitron röntgenkast | Kubtech Scientific | Parameter | |
| Fluorescentie Stereomicroscoop | Carl Zeiss AG | Lumar V12 | |
| GFP filter set | Chroma Technology Corp. | 49020 | |
| IJsazijn | Sigma Aldrich | ARK2183 | |
| Glazuren microscoopglazen | Thermo Scientific | 3051 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Graefe pincetten | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Handstuk (contra hoek 32:1 drukknop) | Nouvag AG | 5201 | |
| Implantologie/mondchirurgie systeembesturingseenheid (Straumann) | Nouvag AG | SEM | |
| Onmiddellijk afdichtende sterilisatiezak met dubbele interne/externe procesindicatoren (3 1/2 x 5 1/4 inch) | Fisher Scientific | 01-812-50 | |
| Onmiddellijk afdichtende sterilisatiezak met dubbele interne/externe procesindicatoren (5 4/1 x 10 inch) | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Insulinenaald (29 G) | Exel International | 26028 | |
| Isofluran | Dechra Pharmaceuticals plc | 17033-091-25 | |
| Isofluran anesthesiesysteem | |||
| mCherry filter set | Chroma Technology Corp. | 39010 | |
| Micro-dissectie schaar | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Naald (20 G) | Becton, Dickinson and Company | 305178 | |
| Naaldhouder | HuFriedyGroup | NHCW | |
| Neutraal gebufferd formaline (10%) | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Niet-steriele applicatorswabs | Allegro Industries | 205 | |
| Niet-geweven gaas (3 x 3 inch) | Fisher Scientific | 22028560 | |
| Norland Optical Adhesive, 61 | Norland Optical | Norland Optical Adhesive, 61 | |
| Oogzalf (Optixcare eye lube) | CLC Medica | ||
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | |
| Parodontaal sonde | HuFriedyGroup | PQW | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 (1x) | Gibco, by Life Technologies | 10-010-023 | |
| Kunststof microscoopglazen | Electron Microscopy Sciences | 71890-01 | |
| Professionele clipper/trimmer (Wahl Classic Peanut) | Wahl Clipper Corporation | 8685 | |
| Roller | Electron Microscopy Sciences | 62800-46 | |
| Scanco Medical software | SCANCO Medical | Scanco μCT 50 | |
| Natriumacetaat watervrij | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Natriumnitriet | Sigma Aldrich | S2252 | |
| Natriumtartraat dibasisch dihydraat | Sigma Aldrich | T6521 | |
| Specimen disc | Leica Biosystems | 14037008587 | |
| Roestvrijstalen #15 chirurgische blad | Aspen Surgical Products, Inc. | 371615 | |
| Steriele chirurgische handschoenen | Cardinal Health, Inc. | 2D72PT65X | |
| Steriele handdoekdoek (18 x 26 inch) | IMCO | 4410-IMC | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Spuit (1 mL) | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| Ongeverfde gevlochten gecoate vicryl naad (5-0) | Ethicon Inc. | J490G | |
| UV zwart licht | General Electric |
Referenties
- Iannotti, J. P. Growth plate physiology and pathology. Orthop Clin North Am. 21 (1), 1-17 (1990).
- Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Injury responses and repair mechanisms of the injured growth plate. Front Biosci (Schol Ed). 3 (1), 117-125 (2011).
- Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries involving the epiphyseal plate. JBJS. 45 (3), 587-622 (1963).
- Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications in brief: Salter-harris classification of pediatric physeal fractures. Clin Orthop Relat Res. 474 (11), 2531-2537 (2016).
- Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49 (4), 904-912 (2011).
- Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Eng Part B Rev. 24 (2), 85-97 (2018).
- Xian, C. J., Zhou, F. H., Mccarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22 (2), 417-426 (2004).
- Muruganandan, S., et al. A foxa2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).
- Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).
- Lee, E. H., Gao, G. X., Bose, K. Management of partial growth arrest: Physis, fat, or silastic. J Pediatr Orthop. 13 (3), 368-372 (1993).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156 (2), 128-134 (2012).
- Foster, B. K., et al. Reimplantation of growth plate chondrocytes into growth plate defects in sheep. J Orthop Res. 8 (4), 555-564 (1990).
- Erickson, C. B., et al. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. J Vis Exp. (125), e55571(2017).
- Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).
- Mccarty, R. C., Xian, C. J., Gronthos, S., Zannettino, A. C., Foster, B. K. Application of autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells to an ovine model of growth plate cartilage injury. Open Orthop J. 4, 204-210 (2010).
- Chen, J., et al. Isolation and characterization of murine mandibular condylar cartilage cell populations. Cells Tissues Organs. 195 (3), 232-243 (2012).
- Clearfield, D. S., Xin, X., Yadav, S., Rowe, D. W., Wei, M. Osteochondral differentiation of fluorescent multireporter cells on zonally-organized biomaterials. Tissue Eng Part A. 25 (5-6), 468-486 (2019).
- Dyment, N. A., et al. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
- Kalajzic, I., et al. Use of type i collagen green fluorescent protein transgenes to identify subpopulations of cells at different stages of the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 17 (1), 15-25 (2002).
- Maye, P., et al. Generation and characterization of col10a1-mcherry reporter mice. Genesis. 49 (5), 410-418 (2011).
- Chokalingam, K., et al. Three-dimensional in vitro effects of compression and time in culture on aggregate modulus and on gene expression and protein content of collagen type ii in murine chondrocytes. Tissue Eng Part A. 15 (10), 2807-2816 (2009).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sci. 152, 244-248 (2016).
- Dyment, N. A., et al. multi-image cryohistology of mineralized tissues. J Vis Exp. (115), e54468(2016).
- Chavez, M. B., et al. Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues. JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).
- Chung, R., Xian, C. J. Recent research on the growth plate: Mechanisms for growth plate injury repair and potential cell-based therapies for regeneration. J Mol Endocrinol. 53 (1), T45-T61 (2014).
Herprints en machtigingen
