Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66845

⸱

9 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 2Ghent Light Microscopy Core, Ghent University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we verschillende methoden voor de vorming van meercellige sferoïden om follow-up multi-parameter live celmicroscopie uit te voeren. Met behulp van fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM), cellulaire autofluorescentie, kleuringskleurstoffen en nanodeeltjes wordt de benadering voor analyse van celmetabolisme, hypoxie en celdood in levende driedimensionale (3D) kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden gedemonstreerd.

Samenvatting

Meercellige tumorsferoïden zijn een populair 3D-weefselmicroaggregaatmodel voor het reproduceren van tumormicro-omgevingen, het testen en optimaliseren van medicamenteuze therapieën en het gebruik van bio- en nanosensoren in een 3D-context. Hun productiegemak, voorspelbare grootte, groei en waargenomen nutriënten- en metabolietgradiënten zijn belangrijk om de 3D-niche-achtige celmicro-omgeving samen te vatten. Sferoïde heterogeniteit en variabiliteit van hun productiemethoden kunnen echter het algehele celmetabolisme, de levensvatbaarheid en de geneesmiddelrespons beïnvloeden. Dit maakt het moeilijk om de meest geschikte methodologie te kiezen, rekening houdend met de vereisten in grootte, variabiliteit, behoeften van biofabricage en gebruik als in vitro 3D-weefselmodellen in de stam- en kankercelbiologie. In het bijzonder kan de productie van sferoïde invloeden van invloed zijn op hun compatibiliteit met kwantitatieve levende microscopieën, zoals optische metabole beeldvorming, fluorescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie (FLIM), monitoring van sferoïde hypoxie met nanosensoren of levensvatbaarheid. Hier worden een aantal conventionele sferoïde vormingsprotocollen gepresenteerd, waarbij hun compatibiliteit met de live widefield-, confocale en twee-foton-microscopieën wordt benadrukt. De follow-up beeldvorming tot analysepijplijn met gemultiplexte autofluorescentie FLIM en, met behulp van verschillende soorten kanker en stamcelsferoïden, wordt ook gepresenteerd.

Inleiding

Meercellige sferoïden vertegenwoordigen een groep 3D-weefselmodellen die zijn verkregen door de zelfaggregatie van cellen en die een bolvorm vertonen. Ze worden veel gebruikt om de interactie tussen cellen en cellen en cellen in vitro na te bootsen en om een 3D-context te reproduceren binnen een groot aantal van kanker en stamcellen afgeleide constructies. Er worden verschillende technieken gebruikt om de celhechting te verminderen en de aggregatie te bevorderen. Deze omvatten de ophang-druppelmethode die afhankelijk is van de oppervlaktespanning1; methoden voor het afstoten van celhechting, zoals ultralage bevestigingsplaten, micromallen en microwells 2,3; benadering op basis van akoestische golven4; stroomgeïnduceerde aggregatiemethoden (spinnerkolven, bioreactor en microfluïdische apparaten)5; magnetische deeltjes-geassisteerde vorming6 en gebruik van de aggregatiebevorderende synthetische en ECM-gebaseerde matrices en steigers 7,8,9.

In kankeronderzoek, ontwikkeling en validatie van nieuwe medicamenteuze therapieën zijn sferoïden een aantrekkelijk model vanwege hun vermogen om de ruimtelijke diffusie-beperkte gradiënten van voedingsstoffen, afvalproducten en O2 te recapituleren, wat vaak leidt tot de vorming van een necrotische kern, typisch voor de solide tumoren10,11. Deze betrouwbaardere en geavanceerdere in-vitromodellen dagen de noodzaak uit van uitgebreid gebruik van diermodellen (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), volgens het 3V-principe van dieronderzoek (vervanging, vermindering en verfijning). Naast kanker vinden sferoïden hun toepassing in stamcelonderzoek. Pluripotente stamcellen hebben bijvoorbeeld het vermogen om embryoïde lichamen (EB) te vormen, die kunnen worden gebruikt voor de differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) naar gespecialiseerde celtypen die moeilijk rechtstreeks van patiënten te verkrijgen zijn, zoals neurale voorlopercellen13 of ovariumgranulosacellen13,14. Bovendien is de vorming van een EB vaak de eerste stap in de ontwikkeling van complexere organoïde modellen, bijvoorbeeld neuraal15, retinaal16, hart17, lever18, maag19 en darmorganoïden20. Factoren zoals grootte, reproduceerbaarheid, doorvoer en stroomafwaartse toepassingen moeten in overweging worden genomen bij het kiezen van een geschikte sferoïde vormingsmethode voor de experimenten.

De toegenomen complexiteit van 3D-cultuur kan leiden tot een hogere variabiliteit in vergelijking met 2D-cultuur. Factoren zoals de samenstelling van voedingsstoffen21, mediaverdamping22, viscositeit23, pH-regeling24, sferoïde vormingsmethode en zelfs de tijd in de cultuur25,26 kunnen resulteren in het verkrijgen van sferoïden met verschillende morfologie, groottes, levensvatbaarheid en verschillende chemoresistentie27,28. Recent onderzoek heeft aangetoond dat sferoïde zuurstofgradiënten niet altijd statisch zijn en worden beïnvloed door de vormingsmethode, de sferoïde grootte en extracellulaire viscositeit, wat de sferoïde heterogeniteit beïnvloedt29. Om de reproduceerbaarheid en toegankelijkheid van gegevens op sferoïden te verbeteren, is de MISpheroID-kennisbank ontwikkeld26, waarbij de cellijn, het kweekmedium, de vormingsmethode en de grootte van de sferoïden worden geïdentificeerd als de minimale informatie voor een reproduceerbaar resultaat. Daarom werd een gedetailleerde vergelijking gemaakt van meerdere high-throughput (SphericalPlate 5D, in het laboratorium gemaakte micromallen en Microtissue malls) en lage bevestigingsmethoden (d.w.z. Biofloat en met lipide gecoate 96-wells platen, zowel steigervrij als op steigers) (Figuur 1 en Tabel 1), inclusief de putgrootte (gegeven een schatting van de maximale sferoïde grootte), gebruikte verbruiksartikelen, bereidingstijd en de mogelijkheid om sferoïden te monitoren zonder ze naar microscopieschalen te transporteren. Dit laatste maakt langetermijnstudies mogelijk, terwijl sferoïden geproduceerd met high-throughput-methoden vaak resulteren in eindpuntexperimenten. Alle methoden, met uitzondering van de roosters van de 5DspheriPlate, brengen geen ongewenste autofluorescentie met zich mee, waardoor ze direct in microscopie kunnen worden gebruikt.

figure-introduction-1
Figuur 1: Sferoïde vormingsmethoden uitgelegd. High-throughput methoden zoals de SphericalPlate 5D, die gepatenteerde microwells in de plaat heeft geïntegreerd, terwijl de in het laboratorium geproduceerde micromallen en de MicroTissue mallen stempels gebruiken om meerdere microwells in agarose (blauw) te maken. Platen met een lage hechting, zoals Lipidure (Amsbio) en Biofloat (Sarstedt), gebruiken een niet-hechtende coating die de hechting aan het celoppervlak remt en de zelfaggregatie van cellen bevordert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5D SpheriPlateZelf geproduceerde micromallsMicroweefselLage bevestigingsmethoden
Aantal sferoïden/putje7501589811
Diameter goed90 μm400 μm800 μm1 mm
Volume van de cultuur1 ml5 ml1 ml200 μL
Andere verbruiksartikelen/7 ml 3% agarose500 μL van 2% agarose/ *
Bereidingstijd10 minuten2 uur + 3 dagen mediabewerking0,5 uur + 15 min media-aanpassing10–30 min + 1 uur drogen
MonitoringJaNee**JaJa
AutofluorescerendJaNeeNeeNee
HerbruikbaarNeeJaJaNee**
Kosten€€€€€€€€€€€: Coating en Matrigel
€€: Commerciële plaat met 96 putjes
*Sommige cellijnen hebben toevoeging van ECM nodig (d.w.z. 2%-5% Matrigel) om compacte sferoïden te vormen.
**De coating is herbruikbaar totdat deze leeg is. Elke plaat verbruikt echter een kleine hoeveelheid media en stof kan zich na verloop van tijd ophopen. Filtersterilisatie is regelmatig nodig.

Tabel 1: Vergelijking van meerdere sferoïde vormingsmethoden29. "Monitoring": de mogelijkheid om sferoïde te bewaken zonder dat overdracht naar een microscopieschaal nodig is. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€: 150-500€ , €€€: >500€

Fluorescentiemicroscopie maakt directe monitoring mogelijk van de belangrijkste biologische aspecten in sferoïden, waaronder celdood, levensvatbaarheid, proliferatie, metabolisme, viscositeit en zelfs mechanische eigenschappen30. Fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) biedt een extra kwantitatieve dimensie voor het bestuderen van fluorescerende sonde-interacties binnen hun (micro)omgeving 31,32,33,34, waardoor de overlappende emissiespectra kunnen worden opgelost volgens verschillende emissielevensduurs 35,36 en het onderzoeken van het celmetabolisme op basis van intrinsieke cellulaire autofluorescentie. Zo kunnen wijdverspreide cellulaire autofluorescerende verbindingen zoals nicotinamide-adenine-dinucleotidefosfaat (NAD(P)H), flavine-mononucleotide (FMN), flavine-adenine-dinucleotide (FAD), protoporfyrine IX en andere worden gemeten met één- en twee-foton FLIM en dienen als intrinsieke 'sensoren' van glucosekatabolisme, oxidatieve fosforylering (OxPhos) en geven een algemeen overzicht van de celredoxtoestand. NAD(P)H komt voor in vrije cytoplasmatische of in eiwitgebonden mitochondriale vormen37,38. Evenzo is de geoxideerde toestand van FAD fluorescerend met een langere levensduur van de vrije vorm. NAD(P)H- en FAD-microscopieën omvatten meestal twee-foton geëxciteerde FLIM, gericht op het voorkomen van fotoschade door monsters39. Vaak kan 'optische metabole beeldvorming' FLIM worden gecombineerd met het gebruik van op kleurstof gebaseerde sondes, genetisch gecodeerde biosensoren, fosforescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie (PLIM) en op ratiometrische intensiteit gebaseerde metingen om een completer beeld te krijgen van het sferoïde of organoïde metabolisme, oxygenatie, proliferatie en levensvatbaarheid van cellen 29,30,31. Daarnaast kan FLIM ook worden gecombineerd met de Förster-resonantie-energieoverdrachtsmethode (FRET) om de levensduurvariatie van de donorfluorofoor te meten wanneer deze in nauw contact staat met de acceptor om de binding van een geneesmiddel met zijn doeldomein te onderzoeken 33,40,41.

De verkregen FLIM-beelden worden doorgaans geanalyseerd om de levensduur pixel voor pixel te berekenen. Momenteel zijn er ten minste 3 veelgebruikte strategieën die worden gebruikt om de fluorescentielevensduur te verkrijgen: semi-kwantitatieve 'snelle FLIM'42 (soms aangeduid als 'tau-sense'43,44), vervalcurve-aanpassing, met behulp van één-, twee- of drie-exponentiële aanpassing, en 'fittingvrije' benadering met fasetransformatie en fase-plotanalyse. Afhankelijk van de leverancier kan ofwel de meegeleverde (LAS X, Symphotime, SPCImage, enz.) ofwel open-source software (bijv. FLIMfit45, FLIMJ46 of andere47) worden gebruikt om gemeten FLIM-gegevens te verwerken. Doorgaans is door de leverancier geleverde software nuttig voor voorlopige gegevensanalyse, terwijl open-sourceoplossingen kunnen zorgen voor nauwkeurigere onderzoeken met behulp van bijvoorbeeld fasorplots en 3D-visualisatie.

Ondanks het nut en de aantrekkelijkheid van FLIM als methode voor het bestuderen van sferoïden, zijn er zeer weinig experimentele protocollen beschikbaar en is er een algemeen gebrek aan kennis bij het kiezen van de meest geschikte vormingsmethode voor succesvolle live multiparametrische microscopie-experimenten met FLIM. Hier wordt een gedetailleerde vergelijking gepresenteerd van veelgebruikte sferoïde vormingsprotocollen op basis van hun morfologie, levensvatbaarheid en oxygenatie met de onlangs gevalideerde en gekarakteriseerde verrode en nabij-infrarood (NIR) zuurstofgevoelige nanosensor (MMIR1). Het kationische nanodeeltje is geïmpregneerd met twee reporterkleurstoffen, de referentie O2-ongevoelige aza-BODIPY (excitatie 650 nm, emissie 675 nm) en de NIR O2-gevoelige metalloporfyrine, PtTPTBPF (excitatie 620 nm, emissie 760 nm). De MMIR1 maakt real-time analyse van zuurstofgradiënten mogelijk op een conventionele fluorescentiemicroscoop (met behulp van ratiometrische analyse) of fosforescentie-levensduurmicroscoop (PLIM) zonder cellulaire toxiciteit te introduceren en stabiele signalen, langdurige monitoring en multiplexing mogelijkte maken 25,29. Afhankelijk van de noodzaak om te kleuren met kleurstoffen of nanosensoren, sferoïde doorvoer of celtype, kan het meest geschikte vormingsprotocol worden gekozen. Aangezien de studies naar de levensvatbaarheid en oxygenatie van sferoïden relevant zijn voor studies van kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden, bevatten de gepresenteerde protocollen ook voorbeelden en verwachte typische resultaten van NAD(P)H-FLIM en FAD-FLIM met deze modellen. De gepresenteerde beeldvormings- en analysepijplijnen zijn gericht op de meest populaire op tijd gecorreleerde FLIM-microscopieplatforms op basis van enkelvoudige fotonentelling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Generatie van meercellige sferoïden

  1. Celcultuur
    OPMERKING: Celculturen kunnen worden verzameld bij de American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich of andere leveranciers. ATCC biedt alle vereiste verwerkingsinformatie, waaronder voorkeursgroeimedia, subteeltprocedures, bioveiligheidsniveau, groeisnelheid en STR-profielen. Hier worden 500 cellen/sferoïde van de menselijke darmkankercellijn HCT116 gebruikt in McCoy's 5A-media (VWR, 392-0420) aangevuld met 10% FBS en 1 mM natriumpyruvaat. Voor langdurige experimenten die dagelijks worden gecontroleerd, kan 10 mM HEPES, pH 7,2 aan de media worden toegevoegd.
    1. Kweek de celcultuur om 70%-90% samenvloeiing te bereiken.
    2. Spoel de cellen af met voorverwarmd (37 °C) steriel PBS (5 ml voor 25cm2 of 10 ml per kolf van 75cm2 ).
    3. Voeg 0,05% trypsine - 1 mM EDTA-oplossing toe (0,5 ml voor 25 cm² of 1 ml per kolf van 75cm2 ) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C in 5% CO2, 95% vochtigheid om celloslating te bereiken.
      NOTITIE: Controleer de celloslating onder de microscoop van het transmissielicht (helderveld). De overmatige blootstelling van cellen aan de dissociërende enzymoplossing kan hun levensvatbaarheid beïnvloeden.
    4. Neutraliseer trypsine door overtollige celkweekmedia toe te voegen die 10% FBS bevatten (ten minste 5 ml media per 1 ml dissociatieoplossing).
      OPMERKING: Voor cellen gekweekt op lage FBS of FBS-vrije kweekmedia, kan trypsineneutralisatie worden gedaan door toevoeging van 0,5 ml 100% FBS aan de met trypsine behandelde celcultuur, gevolgd door centrifugatie om cellen over te brengen naar hun oorspronkelijke kweekmedia.
    5. Dissocieer celaggregaten door pipetteren om eencellige suspensie in media te verkrijgen.
      OPMERKING: Pieteren met een serologische pipet met een pipetpunt van 1000 μl aan de bovenkant verbetert de productie van eencellige suspensies in een groot volume suspensiecelcultuur aanzienlijk.
    6. Gebruik een telkamer (door Neubauer geregeerde hemocytometer of alternatieven) om het celgetal per 1 ml van de celsuspensie te tellen.
    7. Verdun de celsuspensie om het gewenste aantal cellen per milliliter te verkrijgen.
    8. Voeg geconcentreerde O2-sonde (nanodeeltjes) oplossing toe aan de celsuspensie met een eindconcentratie van 10 μg/ml voor ratiometrische analyse van O2.
      OPMERKING: Om een homogene celsuspensie (met de sonde) te garanderen, moet u meerdere keren resuspenderen voordat sferoïde wordt gevormd. Als de O2-sonde niet nodig is, sla deze stap dan over en ga verder met de vorming van de sferoïden. Bij het omgaan met iPSC's moet een aangepast protocol worden toegepast. In het kort worden iPSC's gekweekt in kolonies op met Geltrex gecoate platen en gepasseerd met behulp van ReLeSR zoals beschreven in het door de leverancier verstrekte protocol48. Op de dag van de vorming van sferoïde moeten kolonies groot en compact zijn en meerlagige centra met duidelijke grenzen vertonen. Spoel de cellen af met voorverwarmd steriel PBS. Voeg 1 ml zacht celdissociatiereagens (GCDR) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 8-10 minuten. Gebruik een punt van 1000 μL om de cellen voorzichtig los te maken van het putje en om een eencellige suspensie te verkrijgen. Breng eencellige suspensie over in een steriele conische buis van 50 ml en voeg 4 ml voorverwarmd DMEM-F12-medium toe om de GCDR te neutraliseren. Was het putje met 1 ml DMEM-F12 en breng het over naar de rest van de celsuspensie. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Resuspendeer in 1 ml van geschikte media voor verdere experimenten. Voor experimenten die in dit manuscript worden beschreven, werd mTeSR + 10 μM Rock Inhibitor gebruikt. Tel en verdun de celsuspensie om het gewenste aantal cellen per milliliter te verkrijgen.
  2. Methoden voor sferoïde vorming
    1. 3D petrischaal micro-mallen
      OPMERKING: Deze methode met hoge doorvoer wordt gebruikt om tegelijkertijd een groot aantal sferoïden (81 sferoïden) te genereren in een 9 x 9 micromold-array met een diameter van 800 μm en een diepte van 800 μm.
      1. Spoel micromallen voor het gieten van 3D-petrischalen af in dH2O en doe ze in een autoclaveerbare container.
      2. Meet 2 g agarosepoeder van elektroforesekwaliteit af en doe dit in een droge autoclaafbestendige glazen fles van 200 ml.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat de fles en het agarosepoeder droog zijn en geen vloeistof of vocht bevatten.
      3. Autoclaaf micromallen voor het gieten van 3D petrischalen en -flessen met agarosepoeder gedurende 30 minuten op een droge cyclus.
      4. Maak een zoutoplossing van 0,9 w/v% door toevoeging van 0,9 g NaCl in 100 ml ultrapuur water en steriliseer door middel van autoclaveren.
        OPMERKING: NaCl wordt aanbevolen door de fabrikant. Het verhoogt de stabiliteit van de agarose.
      5. Bereid de agarose-oplossing voor door de steriele zoutoplossing toe te voegen aan het gesteriliseerde agarosepoeder. Schroef het losjes gemonteerde deksel erop om drukopbouw te voorkomen. Draai de fles rond om het agarosepoeder te mengen.
      6. Kook en los het agarosepoeder op met behulp van een magnetron. Stop de magnetron regelmatig (~elke 10 s). Draai de fles rond en herhaal totdat de agarose is opgelost.
        LET OP: De agarose-oplossing is heet en vereist een zorgvuldige behandeling. Door onmiddellijk na het smeltproces te schudden, kan de oplossing uit het vat barsten. Om ongelukken te voorkomen, gebruikt u voldoende grote vaten die tot niet meer dan 50% van de capaciteit zijn gevuld en gebruikt u geschikte persoonlijke bescherming (handschoenen, ovenwant, oogbescherming en laboratoriumjas).
      7. Laat de opgeloste agarose-oplossing afkoelen tot 60-70 °C. Met behulp van aseptische technieken en omstandigheden wordt gesmolten agarose in de micromal gepipeteerd (500 μl voor 12-serie of 330 μl voor 24-serie).
        OPMERKING: Vermijd luchtbelvorming tijdens het mengen of pipetteren van agarose. Verwijder eventuele ingesloten kleine belletjes in de kleine kenmerken van de micromal door te pipetteren of voorzichtig te schrapen voordat de agarose stolt.
      8. Laat de agarose ongeveer 2-3 minuten stollen. Buig daarna de micromal voorzichtig om de 3D-petrischaal te verwijderen en over te brengen naar een weefselkweekplaat met 12 putjes.
        OPMERKING: Overbuiging van de micromal kan leiden tot de vorming van scheuren in de agarosemal.
      9. Om de 3D-petrischaal in evenwicht te brengen, voegt u 2,5 ml/putje celkweekmedium toe. Incubeer gedurende 15 minuten of langer. Verwijder het kweekmedium en vervang het door vers medium. Herhaal dit nog een keer om de 3D petrischaal in evenwicht te brengen met een kweekmedium.
        OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken tot celseeding. Voor langdurige opslag (tot 2 weken bij 4 °C) gebruikt u PBS-oplossing in plaats van medium.
      10. Verwijder de 3D petrischaal rond het kweekmedium (of PBS) volledig en verwijder de media in de 3D petrischaal nauwkeurig door de weefselkweekplaat te kantelen.
      11. Zaai voorzichtig 190 μL celsuspensie met 40.500 cellen druppelsgewijs in de celzaaikamer (zie stap 1.1).
        OPMERKING: Het aantal microputjes in agarosestempels bepaalt het aantal sferoïden dat per stempel wordt geproduceerd. In dit geval bevat deze agaroseschimmel 81 microwells (81 x 500 cellen/sferoïde). Variatie van de celconcentratie in suspensie toegevoegd aan een macrowell maakt het mogelijk om het celaantal per sferoïde te veranderen, waardoor de grootte van de sferoïde wordt gecontroleerd.
      12. Wacht ~10 minuten totdat de cellen zich in de kenmerken van de 3D Petri dsh hebben genesteld. Voeg vervolgens 2 ml medium toe aan de buitenkant van de 3D petrischaal.
      13. Plaats de weefselkweekplaat in de celkweekincubator en vervang indien nodig het medium rond de 3D-petrischaal.
    2. Lage bevestigingsplaat
      OPMERKING: Deze methode wordt gebruikt om een enkele sferoïde per putje te genereren. Gecoate platen (Lipidure of Biofloat) zijn in de handel verkrijgbaar (sla de stappen 1.2.2.1-1.2.2.4 over). Als alternatief kan de coating apart worden gekocht en worden gebruikt om onbehandelde multi-well-platen te coaten. Het wordt aanbevolen om putjes aan de randen van platen met 96 putjes te vullen met steriel water of PBS vanwege de snellere verdamping in deze putjes, waardoor het aantal putjes voor sferoïden wordt beperkt tot 60. Als er minder sferoïden nodig zijn, vul dan de omliggende lege putten met water of PBS. Gebruik stofvrije tips voor het omgaan met vloeistoffen om te voorkomen dat kleine deeltjes in de putten terechtkomen, omdat deze de vorming van sferoïde deeltjes verstoren.
      1. Bereid een coatingoplossing van 0,5 w/v% voor door 0,25 g polymeerpoeder op te lossen in 50 ml ethanol in een glazen fles. Filter de coating.
        OPMERKING: Filtersterilisatie en alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd in steriele omstandigheden onder laminaire stroming.
      2. Voeg 200 μL van de coatingoplossing toe aan elk putje van een 96 U-bodem kweekplaat.
      3. Incubeer gedurende 1 minuut en verwijder overtollige coating.
        OPMERKING: De coatingoplossing kan meerdere keren worden gebruikt. Bewaar in een glazen verpakking bij kamertemperatuur (RT). Plastic containers worden niet geadviseerd, omdat het plastic gedeeltelijk kan oplossen en een deel van de oplossing kan worden. Als er stof aanwezig is, steriliseer het filter dan met een 0,22 μm polyethersulfon (PES) of nylon spuitfilter.
      4. Laat de plaat met 96 putjes ongeveer 1 uur aan de lucht drogen.
        OPMERKING: Als cellen een extracellulaire matrix nodig hebben, gaat u verder met stap 1.2.3. Gecoate platen kunnen maximaal 1 maand bij RT worden opgeslagen wanneer ze in aluminium zijn gewikkeld. Bij het zaaien van een lagere hoeveelheid cellen/putje kan het centrifugeren van de plaat gedurende 5 minuten op 300 g helpen om de cellen naar beneden te trekken.
    3. Extracellulair matrix-ondersteund vormingsprotocol
      OPMERKING: Sommige cellijnen produceren zelf niet genoeg extracellulaire matrix (ECM) en hebben de toevoeging van ECM nodig, zoals Matrigel, Cultrex of Geltrex, om compacte sferoïden te vormen 49,50,51. Voor celtypen zoals borstkanker MDA-MB-231, menselijke dermale papillen, prostaatkankercellen en andere, is het mogelijk om stap 1.2.2 te gebruiken met de volgende wijzigingen52, waarvoor de toevoeging van ECM nodig is. Gebruik bij voorkeur stofvrije tips voor het hanteren van vloeistoffen om te voorkomen dat stof de sferoïde vorming verstoort. Stappen 1 en 4-7 moeten worden uitgevoerd onder een biologische veiligheidskast (klasse II).
      1. Ga verder met de stappen 1.2.2.1-1.2.2.4 (lage bevestigingsplaten) voor oppervlaktebehandeling.
      2. Koel de plaat met 96 putjes voor op 4 °C in de koelkast.
      3. Bereid de centrifuge voor met de juiste adapter voor de plaat met 96 putjes en koel deze voor op 4 °C.
      4. Bereid een 5%-oplossing van de basale membraanmatrix (BMM) in voorgekoelde (4 °C) celkweekmedia.
        OPMERKING: BMM crosslinkt snel bij RT. Bewaar bij het hanteren voorraden en oplossingen op het ijs.
      5. Bereid de celsuspensie voor (zie stap 1.1).
      6. Voeg 50 μL van de BMM-oplossing toe aan elk putje.
      7. Voeg voorzichtig 50 μl celsuspensie toe aan elk putje bovenop de BMM-oplossing (25.000 cellen/putje).
        OPMERKING: Blaas dit volume niet in de put, anders verspreiden de cellen zich langs de zijkanten van de putten en verzamelen ze zich niet op de bodem. Een lager aantal cellen per putje kan worden verkregen door de celdichtheid dienovereenkomstig aan te passen. Niet alle cellen zullen sferoïden vormen bij alle zaaidichtheden; De optimalisatie moet worden uitgevoerd celtype en gewenste dimensies. Met de verstrekte volumes is de uiteindelijke concentratie van BMM 2,5%. Als een andere concentratie nodig is, moet de bouillonoplossing in een lagere/hogere concentratie worden bereid.
      8. Centrifugeer de plaat met 96 putjes gedurende 5 minuten op 300 x g en 4 °C.
        OPMERKING: Zonder deze stap aggregeren cellen niet goed op de bodem van de put, waardoor er meerdere kleinere aggregaten worden gevormd. De centrifuge moet in dit stadium worden afgekoeld om verknoping te voorkomen.
      9. Plaats de plaat in de celcultuurincubator. Aggregaten worden als rijp beschouwd op dag 4 na het zaaien.
        OPMERKING: Voor aanvullende protocollen over sferoïde vorming, zie Aanvullend Bestand 1.

2. Live microscopie van sferoïden

  1. Voorbereiding van sferoïden voor live beeldvormingsanalyse
    OPMERKING: Afhankelijk van de opzet van het experiment (bijv. langetermijnmonitoring of eindpuntanalyse, opstelling van de microscoop of spectrale eigenschappen van de gemeten fluorescentie) of vanwege onverenigbaarheid van de sferoïde productiemethode met de microscopie (bijv. monsterdikte, autofluorescentie van het materiaal, zweven van sferoïden tijdens beeldvorming) directe monitoring van sferoïden in de plaat, waar ze zijn geproduceerd, is misschien niet mogelijk. Het protocol legt de bereiding van sferoïden voor beeldvorming uit, die geschikt zijn voor de meeste omgekeerde breedveld- en confocale microscopen.
    1. Beeldvormingsmedia voorbereiden en voorverwarmen (37 °C): DMEM aangevuld met HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), natriumpyruvaat (1 mM), L-glutamine (2 mM) en glucose (5 mM), zonder fenolrood.
      OPMERKING: Natriumbicarbonaat alleen of in combinatie met HEPES-Na kan worden gebruikt als CO2 -controle wordt geboden tijdens beeldvorming24. Sommige celcultuurtypen kunnen de aanwezigheid van HEPES niet verdragen. Afhankelijk van het experimentele ontwerp kan het pyruvaat-, glutamine- en glucosegehalte worden gewijzigd.
    2. Bereid steriele microscopieschalen voor (in de handel verkrijgbaar of in het laboratorium gemaakt) met gecoate (voor een sterke sferoïde hechting) of niet-gecoate (lage sferoïde hechting) afdekglasoppervlakken (dikte #1.5).
      OPMERKING: De behoefte en het type coating zijn afhankelijk van het celtype, de hechtingseigenschappen van sferoïden en de snelheid van hun celmigratie van de 3D- naar de 2D-kweekinterface. Dit is belangrijk om te overwegen, omdat de coating het verlies van 3D-organisatie kan vergemakkelijken, waardoor de vorm van microgradiënten in sferoïden en als gevolg daarvan het celgedrag verandert. Voor sommige experimenten (bijv. Beeldvorming analyseerde de reactie op geneesmiddelstimulatie) is een sterke sferoïde hechting aan het oppervlak vereist en heeft een coating met gelatine, BMM, collageen, collageen / poly-D-lysine of poly-D-lysine de voorkeur.
    3. Spoel de met O2-sonde gekleurde sferoïden voorzichtig uit de microputjes van de agarose met micropatroon of de plaat met 96 putjes en breng de nog drijvende sferoïden over in een injectieflacon van 2 ml.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat alle sferoïden van de methode met hoge doorvoer worden verzameld, spoelt u de mal 1-3 keer met het extra volume kweekmedia, waarbij u alle sferoïde suspensies in één injectieflacon combineert. Voor sferoïden in een lage bevestigingsplaat, verzamel sferoïden één voor één uit individuele putjes naar een injectieflacon of rechtstreeks naar een microscopieschaaltje als een klein aantal sferoïden voldoende is voor het experiment. Snijd bij het overbrengen van grote sferoïden het uiteinde van de pipetpunt af om ervoor te zorgen dat er geen schade ontstaat tijdens het pipetteren.
    4. Laat de injectieflacon maximaal 5 minuten in een verticale positie staan om de sferoïden op de bodem van de injectieflacon te laten bezinken en een zichtbare korrel te vormen.
    5. Verwijder de media uit de buis, laat de sferoïden ongemoeid en suspendeer ze voorzichtig in een voldoende hoeveelheid verse cultuur.
      OPMERKING: Voor het gemak van het hanteren van sferoïden kan de overdracht van sferoïden naar de beeldvormingsmedia in dit stadium ook in kleine batches worden gedaan; Zie de stappen 2.1.7 en 2.1.8. Sferoïden uit de verschillende experimentele groepen moeten gelijk worden behandeld, omdat de samenstelling van de media en de preconditioneringstijd van de media hun metabolisme kunnen beïnvloeden.
    6. Terwijl de sferoïden drijven, brengt u een gelijk volume sferoïde suspensie over per putje van de microscopieschaal.
    7. Incubeer sferoïden gedurende 1-2 uur bij 37 °C in een CO2 -incubator om ervoor te zorgen dat ze aan het oppervlak van de microscopieschaal/put worden bevestigd. Ga voor beeldvorming verder met stap 2.1.9. Voor het kleuren van sferoïden met extra sondes gaat u verder met stap 2.1.8.
      OPMERKING: De snelheid van celmigratie van de 3D-sferoïde naar de 2D-oppervlakte-interface is een functie van de tijd. Om verlies van 3D-organisatie te voorkomen, moet de incubatietijd worden geoptimaliseerd met betrekking tot het celtype, het type oppervlaktecoating en het ontwerp van het experiment. HCT116 heeft bijvoorbeeld, afhankelijk van de sferoïde grootte, ten minste 2 uur nodig voor een goede sferoïde hechting aan het met collageen IV/poly-D-lysine gecoate oppervlak, terwijl hDPSC-bevestiging en migratie naar 2D-interface extreem snel is, wat leidt tot verlies van 3D-organisatie in 1-2 uur. Om te voorkomen dat '2D-sferoïden' worden afgebeeld als gevolg van overmatige verspreiding, worden niet-gecoate glasoppervlakken gebruikt met de verminderde incubatietijd.
    8. Voeg fluorescentiesonde(n) in aanbevolen of empirisch geoptimaliseerde concentraties toe aan een bekend volume sferoïde suspensie. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C CO2 -incubator voorafgaand aan de beeldvorming.
      OPMERKING: Gebruik voor de bepaling van levend/dood propidiumjodide en Calceïne Green-AM in een standaard eindconcentratie van 1 μg/ml. Om het toxische effect van propidiumjodidekleuring op iPSC-embryoïde lichamen te voorkomen, was de uiteindelijke propidiumjodideconcentratie 0,5 μg/ml. De laadtijd van de sonde kan worden verlengd als de diffusie van de sonde niet efficiënt is vanwege de grote sferoïde grootte. De laadtijd moet altijd worden beschouwd als een onderdeel van de totale incubatietijd die nodig is voor de bevestiging van sferoïde aan het oppervlak. Als er meer tijd nodig is voor de hechting van sferoïden, moet de kleuringsprocedure aan het einde van deze periode worden geregeld. Houd er rekening mee dat een langere incubatietijd kan leiden tot het verlies van 3D-organisatie.
    9. Verwijder celkweekmedia of media die fluorescerende sondes bevatten en vervang deze door een benodigde hoeveelheid beeldvormingsmedia. Om ervoor te zorgen dat er geen mediafluorescentieachtergrond in de weg staat van sferoïde beeldvorming, herhaalt u de media-uitwisselingsstap (wassen) tot 5 keer.
      OPMERKING: Om verwijdering van sferoïden tijdens mediawisseling te voorkomen, wordt aanbevolen om media voorzichtig op te zuigen met een pipet van 200 μL vanaf de randen van de microscopieschalen en de toevoeging van media aan de muur of zijwaarts in de microscopieschaal uit te voeren.
    10. Ga direct verder met stap 2.2.1 van het beeldvormingsprotocol.
      OPMERKING: Een te lange pauze tussen de voorbereiding op de beeldvorming en de daadwerkelijke beeldvormingsverwerving kan het celmetabolisme beïnvloeden (bijv. via een veranderde mediumsamenstelling), de levensvatbaarheid (sommige fluorescerende sondes die worden gebruikt voor eindpuntanalyse hebben toxische effecten, die de celdood na een lange incubatietijd kunnen stimuleren) en kan leiden tot een verlies van 3D-organisatie. Als meerdere groepen sferoïden of experimentele omstandigheden moeten worden vergeleken, moet het experimentele ontwerp dienovereenkomstig worden ontwikkeld om de timing van de behandeling, preconditionering en beeldvormingsprocedures zo gelijk mogelijk te houden tussen de geanalyseerde groepen.
  2. Acquisitie van afbeeldingen
    OPMERKING: Het protocol beschrijft de multiparametrische beeldvorming van levende sferoïden met behulp van de Stellaris 8 Falcon (Leica) confocale microscoop en Leica Application Suite X (LAS X) softwareversie 4.7. Er zijn echter slechts kleine aanpassingen nodig om een dergelijke analyse op alternatieve microscopieplatforms uit te voeren.
    1. Schakel de temperatuurklimaatregeleenheid 30-60 minuten voor de beeldvorming in. Stel de gewenste ventilatiesnelheid en temperatuur in (35-37 °C).
      NOTITIE: Als naast de temperatuurregeling ook de gasconcentratie (bijv. CO2 of O2) tijdens de beeldvorming moet worden gecontroleerd, moeten de bijbehorende apparaten ook van tevoren worden gestart om de noodzakelijke omstandigheden vóór de beeldvorming te bereiken.
    2. Schakel de microscoop en aangesloten apparaten in (d.w.z. WLL-laser, computer, waterpomp voor het wateronderdompelingsobjectief en andere werkende elektronische blokken). Start de microscoopbesturingssoftware (bijv. LAS X Machine Mode of Machine Mode with Environmental Control) die is voorzien van de exacte microscoopopstelling en initialiseer de objectobjectiefkalibratie.
    3. Kies het gewenste objectief in de software en breng indien nodig de immersievloeistof aan.
      OPMERKING: Voor live microscopie wordt aanbevolen om water- of glycerolonderdompelingsobjectieven te gebruiken met voldoende ('lange') werkafstand, bijv. HC Fluotar L 25x/0,95 W VIS IR (2,4 mm werkafstand), HC PL Apo 40x/1,25 GLYC (0,35 mm werkafstand) of ten minste NA = 0,4 of hoger voor de luchtobjectieven. De keuze van de vergroting en de werkafstand hangt af van de aard en grootte van het afgebeelde monster en de gemeten fluorescentiesignalen (helderheid, kwantumopbrengst, kleuringsefficiëntie, zie bijv. bespreking van kleurstoffen en nanodeeltjes53). Grote objecten (sferoïden of organoïden, >500 μm groot), 'bioreactor'- of microfluïdische chips vereisen objectieven met een lange werkafstand en een lagere vergroting, terwijl analyse van individuele cellen of celorganellen een hoge vergroting vereist, vaak bereikt via 'mozaïek'-beeldvorming.
    4. Zet de microscopieschaal met sferoïden op het podium. Pas de focus aan en zoek een object/interessegebied (ROI).
      OPMERKING: Als er kleine, zwak fluorescerende, slecht contrast of zeldzame objecten moeten worden gevonden en het vinden van de focus moeilijk is, wordt aanbevolen om vooraf scherp te stellen op de wanden van de microscopieschaal en het oppervlak voor het interessante object te 'screenen' door middel van serpentijn, beginnend bij een van de hoeken van de put.
    5. Kies het venster Project openen en klik op het bijbehorende pictogram Een nieuw project maken. Geef een standaardnaam (bijvoorbeeld beginnend met "YY-MM-DD+ beschrijving") aan het onderzoeksprojectbestand. Tijdens de imaging worden alle geproduceerde afbeeldingen automatisch opgeslagen in het gemaakte project .lif-bestand .
    6. Open het venster Acquisitie . Stel de excitatiegolflengte van de witlichtlaser (WLL) en het vereiste bereik van hybride of resonantiescandetectoren (type HyD S, HyD X of HyD R) in op basis van de bekende spectrale eigenschappen van de gemeten fluorescentie (excitatie/absorptie en emissiespectra). Kies de scantypen Lijn of Frame .
      OPMERKING: Voor de meeste in de handel verkrijgbare fluorescerende kleurstoffen zijn de spectrale eigenschappen te vinden (of toegevoegd) in het LAS X Dye Assistant-pakket. Kies de detector met het juiste spectra-gevoeligheidsbereik dat compatibel is met de spectrale eigenschappen van de sonde en, in het geval van FLIM, compatibel is met het tellen van fotonen (d.w.z. HyD X of HyD R). Voor multiparametrische beeldvorming stelt u de WLL in op meerdere excitatieposities (bijv. voor gelijktijdige beeldvorming van FAD/Flavins en twee fluorescentiekanalen van de ratiometrische MMIR1 O2-sonde - referentie en gevoelig, kunnen de excitatie-/emissie-instellingen 460 nm/510-590 nm HyD X1 en 614 nm/631-690 HyD X3 en 724-800 nm HyD R zijn, dienovereenkomstig in een of twee opeenvolgende scansequenties). Het is belangrijk om de juiste detector toe te wijzen om de emissie te verzamelen, aangezien detectoren verschillende spectrale gevoeligheid kunnen hebben54.
    7. (Optioneel voor FLIM) Kies in het venster Acquisitie de FLIM-modus om beeldvorming uit te voeren in combinatie met het tellen van fotonen (vervalverzameling). Onmiddellijk wordt een extra 'FLIM-module in LAS X-software' geopend om door FLIM-gegevens te navigeren en deze te analyseren.
    8. (Optioneel voor FLIM) Kies de WLL-pulsherhalingsfrequentie op basis van de verwachte gemiddelde levensduur van fluorofoor.
      NOTITIE: De frequentie van de laserpuls moet worden aangepast om het volledige fluorescentieverval op te vangen. Dit kan worden gedaan met behulp van een pulskiezerfunctie die op de microscoop is geïnstalleerd. De overlapping van het fluorescentieverval met de laserpuls zal leiden tot een verkorting van de geschatte fluorescentielevensduur. Het wordt aanbevolen om pulsintervallen te hebben die 4-5 keer langer zijn dan de verwachte gemiddelde fluorescentielevensduur (bijv. 25 ns/40 MHz voor een levensduur tot 5 ns). Veel gepulseerde lasers hebben een vaste herhalingsfrequentie van 80 MHz (ideaal alleen voor een bereik van maximaal 2-3 ns). Dit is belangrijk voor het kiezen van de juiste fluoroforen voor het experiment.
    9. Start de voorbeeldweergave met behulp van de FAST LIVE-modus en pas de fijne scherpstelling van het beeldobject aan op een interessant gedeelte.
      LET OP: Volg strikt de laserveiligheidsregels. Houd altijd rekening met de veiligheidsregels voor lasers en wacht tot de beeldvorming is gestopt voordat u het transmissielicht inschakelt, in het oculair of naar het monster kijkt.
      OPMERKING: In de FAST LIVE-modus wordt automatisch een high-speed scan van 600 Hz (komt overeen met een maximale framesnelheid van 4,43/s als de bidirectionele X-scanmodus wordt gebruikt) en een resolutie van 256 x 256 pixels automatisch op het beeld toegepast om de fluorescentie te beschermen tegen fotobleken. Open het gaatje (bijv. tot 3-4 AE) en/of verhoog de laserintensiteit als het fluorescentiesignaal te zwak is om op het object scherp te stellen. Vermijd onvolledige verzameling van verval.
    10. (Optioneel voor FLIM) Door te kijken naar een histogram met pixelintensiteit dat tijdens de beeldvorming in een FLIM-modulevenster (Live-modus ) verschijnt, past u de juiste laserintensiteit/pinholegrootte en resolutie aan om de telsnelheid ~1 foton/laserpulslimiet (rode lijn) te bereiken. Ga niet significant hoger dan 1 om het risico op een pile-up-effect uit te sluiten. Pas indien nodig de herhalingsfrequentie van de WLL-puls aan om een volledige vervalverzameling in een vervalvenster te hebben (zie stap 2.2.8 om onvolledige vervalverzameling te voorkomen).
      OPMERKING: Als het aantal fotonen (intensiteit) niet voldoende is om een betrouwbaar verval te reconstrueren voor passende analyse of fasediagramwolk, pas dan meerdere scanherhalingen toe (frames of lijnen, of stel de scantijd in), verhoog de laserintensiteit en/of offer de resolutie op (gescande ROI-grootte). Houd er rekening mee dat voor het verlagen van de laserherhalingssnelheid meer fotonen moeten worden verzameld voor een betrouwbare vervalreconstructie, en dat een extra correctie van de beeldvormingsparameters nodig kan zijn. Wees je bewust van de mogelijke impact van intens licht en lange continue verlichting op de levensvatbaarheid en het metabolisme van cellen55. De negatieve impact op de levensvatbaarheid en het metabolisme kan in elk individueel geval anders zijn, afhankelijk van de intensiteit, duur en golflengte van het excitatielicht, evenals de beeldvormingsmodaliteit (bijv. confocale weergave van één foton versus beeldvorming van meerdere fotonen). Pas de beeldvormingsparameters dienovereenkomstig aan en, indien nodig, controleer de levensvatbaarheid/dood van de cel door Calcein Green-AM of de intensiteit van propidiumjodide in pilotexperimenten56. Waar mogelijk moeten verdere optimalisaties van het kleuringsprotocol voor fluorescentiesondes worden overwogen om een adequaat fluorescentiesignaal te bereiken tijdens live microscopie.
    11. (Optioneel voor 3D z-stack) Stel in Fast Live de coördinaten in, scan de richting en wijs ze toe aan Begin en Einde in het Z-stack-venster (XYZ-scanmodus). Kies de grootte van de Z-stappen of het aantal stappen.
      OPMERKING: Hoewel de software automatisch het 'optimale' aantal stappen berekent, op basis van de gebruikte resolutie en scanparameters, kan live 3D-reconstructie normaal gesproken een kleiner aantal stappen vereisen om snelle acquisitie te bereiken, bijv. 1-2 μm stapgrootte, 50-100 μm stapelgrootte, bidirectioneel scannen, waarvoor 2-3 minuten van de totale scantijd nodig is. Houd er rekening mee dat de subcellulaire organellen, cellen en het 3D-celmodel ook kunnen bewegen tijdens metingen. Bovendien kan vanwege de lichtpenetratiediepte en verstrooiingslimieten doorgaans slechts een scandiepte van 50-100 μm op confocale FLIM worden bereikt.
    12. Wanneer alle benodigde instellingen zijn toegepast, begint u met beeldvorming.
    13. Geef de afbeelding een passende naam.
    14. Zoek naar het volgende beeldvormingsobject in de transmissielichtmodus en herhaal de beeldvormingsprocedure met eerder geoptimaliseerde beeldvormingsinstellingen (stappen 2.2.8-2.2.12).
      OPMERKING: Voor de op intensiteit gebaseerde vergelijking of intensiteitsverhoudingsanalyse (bijv. MMIR O 2-sondegebaseerde oxygenatieanalyse), moet u altijd dezelfde beeldvormingsinstellingen aanhouden voor alle geanalyseerde objecten (vergroting en objectieflenstype, laserintensiteit, vermogen en pulsfrequentie, excitatiegolflengte, detectorbereik, gaatje, scansnelheid, pixelverblijftijd en resolutie). Aangezien de levensduur van de fluorescentie echter niet afhankelijk is van de fluorescentie-intensiteit en vereist dat een passend aantal fotonen wordt verzameld voor een betrouwbare berekening, kunnen de FLIM-beeldvormingsparameters in de loop van het experiment opnieuw worden aangepast om de verzamelde fotonenaantallen vergelijkbaar te houden tussen verschillende behandelingen of experimentele omstandigheden. Daarom moeten voor multiparametrische analyse, waarbij analyse op basis van intensiteit en analyse op basis van fluorescentielevensduur beide nodig zijn, geoptimaliseerde universele beeldvormingsinstellingen worden toegepast voor alle objecten in de vergeleken experimentele groepen. Voor een "FLIM-only"-vergelijking is het mogelijk om beelden te vergelijken die zijn verkregen met iets andere beeldvormingsinstellingen, aangezien de LAS X-software voorziet in de berekening van de IRF voor individuele beeldmeting42. Voor FLIM-fittinganalyse buiten LAS X (bijv. FLIMfit45) moet echter de instrumentresponsfunctie (IRF) worden gemeten voor elke verschillende beeldvormingstoestand, omdat deze niet kan worden geëxporteerd vanuit de beeldvormingssoftware. Voor de eenvoud van het experimentele ontwerp en de werklast wordt daarom aanbevolen om dezelfde beeldvormingsinstellingen toe te passen voor alle afbeeldingen in de dataset. Vervolgens kunnen de overeenkomstige IRF-metingen worden uitgevoerd met behulp van gedoofde of snelle fluorescentie-levenslange fluoroforen (binnen het ps-bereik) met de emissie-eigenschappen van het gemeten spectrale kanaal 57,58,59, door luminescentie van gouden nanodeeltjes 60 of door signaal van de tweede harmonische generatie voor multifoton FLIM61. In de LAS X-software kunnen de eerder geoptimaliseerde beeldvormingsparameters voor een nieuw project worden geladen door met de rechtermuisknop op het gewenste bestand te klikken en Afbeeldingsinstellingen toepassen te kiezen.
    15. Wanneer de beeldvormingssessie is voltooid, slaat u het beeldvormingsproject op. Om de beeldvormingssessie af te ronden, verwijdert u het monster uit de microscopiefase en reinigt u het objectief van de immersievloeistof (indien gebruikt) volgens de standaardprocedure die in de beeldvormingsfaciliteit is geïmplementeerd. Sluit het project en de software. Schakel de microscoop, lasers en alle aangesloten apparaten uit.
    16. Ga verder met de analyse van beeldvormingsgegevens (stap 2.3).
  3. NAD(P)H/FAD-FLIM fasor-beeldverwerking met LAS X FLIM-module en FIJI
    OPMERKING: Het protocol beschrijft een analyse van de fluorescentielevensduur van afgebeelde sferoïden voor frequentiedomeingegevens op voorbeelden van NAD(P)H en FAD/Flavins autofluorescentie FLIM. NAD(P)H-autofluorescentiemeting werd een gouden standaard voor metabole analyse, waarbij componenten voor de korte en langere NAD(P)H-autofluorescentielevensduur worden geassocieerd met respectievelijk glycolyse of oxidatieve fosforylering (OxPhos). Dit kan worden geanalyseerd door de verschuiving op een fasorplot langs het metabole traject naar de gemeten normen van vrije-NAD(P)H of eiwitgebonden NAD(P)H31,62. Om het traject van de metabolische verschuiving te analyseren en om de positie van fasorwolken te vergelijken (zie de OPMERKING onder stap 2.3.6) op een plot tussen experimentele groepen, werd een vereenvoudigde analyse van fasorcoördinaten geïmplementeerd, gebaseerd op de berekening van het geometrische middelpunt (centroïde) van de fasorwolk29. Het beschreven protocol demonstreert de berekening van zwaartepuntcoördinaten in FIJI en het meten van de afstand tussen twee punten op een fasorplot met behulp van coördinaten (bijv. de afstand van een zwaartepunt van de sferoïde NAD(P)H autofluorescentiefasorwolk tot een "vrij NAD(P)H" theoretisch punt). Op dezelfde manier kunnen FAD en andere autofluorescentiesignalen worden geanalyseerd. Een dataset 1 met .lif (LAS X-software vereist) of .ptu Bestandsformaten voor het leren van deze procedure wordt verstrekt (Aanvullend dossier 2, aanvullend dossier 3, aanvullend dossier 4, aanvullend dossier 5, aanvullend dossier 6, aanvullend dossier 7, aanvullend dossier 8, aanvullend dossier 9, en Aanvullend bestand 10).
    1. Open de FLIM-module in LAS X, selecteer Project openen en laad het sferoïde afbeeldingsbestand (.lif) voor autofluorescentie-NAD(P)H/FAD-analyse.
      OPMERKING: Vanwege mogelijke bugs en tussentijds gegevensverlies in de FLIM-module, gebruik een kopie van het originele sferoïde afbeeldingsbestand (.lif) voor NAD(P)H/FAD-analyse, waarbij het onbewerkte bestand ongewijzigd blijft.
    2. Selecteer een enkele afbeelding en navigeer naar de FLIM-analyse-interface. Klik op Phasor om de fasorplot te openen en de fasoranalysemodus te activeren. Pas een filter toe (Mediaan of Wavelet) en stel Drempel in om de ruis te minimaliseren en de zichtbaarheid van de gegevens voor alle faseanalyses te verbeteren. Kies de harmonischen. Voor analyse van de metabole verschuiving op basis van NAD(P)H-gegevens gaat u verder met de stappen 2.3.3-2.3.5. Voor de algemene vergelijking van de fasediagrammen gaat u verder vanaf stap 2.3.6.
      OPMERKING: Pas analyse-instellingen (filtertype, harmonischen, drempelwaarde, binning en fasor-ROI's) gelijk toe op alle afbeeldingen in een vergeleken gegevensset.
    3. (Optioneel voor NAD(P)H-analyse) Kies een afbeelding die betrekking heeft op een gegevensset en gebruik de optie Draw Ratio Cursor for Two Components om de positie van 0,45 ns op een universele cirkel van een standaard fasorplotruimte nauwkeurig te bepalen. Deze positie zal worden toegekend aan een gemiddelde fluorescentielevensduur van een zuivere homogene oplossing van vrije-NAD(P)H, die normaal gesproken dicht bij het mono-exponentiële verval62 ligt.
      OPMERKING: Free-NADH en free-NAD(P)H hebben vergelijkbare spectrale eigenschappen en vergelijkbare waarden van de fluorescentielevensduur in wateroplossing, met twee componenten met een korte levensduur, 0.3 ns en 0.7 ns63. Dus, voor de eenvoud van de op fasor gebaseerde analyse en vanwege een klein verschil tussen levensduurcomponenten, wordt hun fluorescentieverval geaccepteerd als mono-exponentieel, wat toewijzing van de fasorwolk op een universele cirkel mogelijk maakt. De referentiegemiddelde levensduur van een vrije-NAD(P)H-vorm kan ook worden gemeten en uitgezet in een fasorruimte voor een vergelijkbare analyse. De referentielevensduur is gekozen op basis van de literatuur62; merk op dat in andere bronnen een iets andere waarde van een vrije-NAD(P)H in oplossing kan worden gevonden (0,4 ns64).
    4. (Optioneel voor NAD(P)H-analyse) Exporteer de fasediagram met de toegewezen vrije NAD(P)H-levensduur (zie stap 2.3.3) door met de rechtermuisknop op de grafiek te klikken en Gegevens exporteren te selecteren. Exporteer de faseplot als een bestand in .tiff-indeling naar een aangewezen opslagmap.
      OPMERKING: De oorspronkelijke pixelgrootte van de geëxporteerde faseplotafbeelding van de LAS X FLIM-module is altijd 1024 x 600 pixels. Als er andere software wordt gebruikt voor het exporteren van gegevens en pre-analyse, zorg er dan voor dat alle fasediagramafbeeldingen worden geëxporteerd met dezelfde grootte en resolutie.
    5. Als u sferoïde-gerelateerde fasewolken wilt exporteren, gebruikt u de tool Cursor-teken in de LAS X FLIM-module om de sferoïde ROI op de afbeelding te kiezen. Exporteer gegenereerde fasediagram zoals beschreven in stap 2.3.4.
      OPMERKING: De overeenkomstige g en s (vergelijkbaar met x en y) coördinaten van de fasorruimte worden toegewezen aan elke pixel van de gekozen ROI, volgens hun levensduur, getransformeerd in een frequentiedomeindataset64,65. Het cluster van pixels met vergelijkbare waarden van tf (faselevensduur) en tm (modulatielevensduur) vormt een wolkenpatroon (fasewolk) op een plot, waarbij kleurcodering (met een bereik van diepblauw tot rood) de overvloed aan levensduurwaarden weerspiegelt. Door de positie van de wolk op een universele cirkel of binnenin kunnen de mono- of multi-exponentiële vervalsen worden onderscheiden. Sommige meetmedia vertonen een sterke (auto)fluorescentie, wat leidt tot het verschijnen van een overeenkomstige wolk op een fasediagram, die niet eenvoudig kan worden verwijderd met de intensiteitsdrempel. Dit patroon is van invloed op de berekening van de zwaartepuntcoördinaten en moet worden uitgesloten van de geëxporteerde fasediagram. Door te werken met de sferoïde ROI kunnen de niet-gerelateerde pixels worden uitgesloten van verdere fase-analyse.
    6. Herhaal de exportprocedure voor de fasediagram voor alle sferoïde ROI's in een gegevensset (zie stappen 2.3.4 en 2.3.6). Controleer bovendien de geëxporteerde set van .tiff afbeeldingen om de volledige set gegevens voor verdere vergelijkende analyse te garanderen en zorg ervoor dat alle geëxporteerde afbeeldingen dezelfde pixelgrootte hebben (zie OPMERKING in stap 2.3.4).
      OPMERKING: In dit stadium van het protocol moet de beeldset een faseor bevatten met de vrije-NAD(P)H-locatie (op basis van literatuur of empirisch verkregen gegevens) en alle sferoïde ROI (of alternatieve ROI-patronen indien nodig voor de specifieke analyse) fasorplots. Vanaf deze stap wordt verdere analyse gedaan in FIJI en daarna in een spreadsheet. Gebruik het venster Analysetool om de optie Schaal in FIJI in te stellen en ervoor te zorgen dat alle faseplotafbeeldingen zijn gekalibreerd met hetzelfde eenheidstype, bijvoorbeeld alleen in pixels. Als dit niet het geval is, stelt u de eenheidslengte in in het venster Schaal instellen voor de gekozen (bijv. voor een op pixels gebaseerde schaal, plaatst u 1 in het veld Afstand in pixels en stelt u de lengte-eenheid in op Pixel). Meet voor verdere vergelijking alle geëxporteerde gegevens met behulp van hetzelfde eenheidstype.
    7. (Optioneel voor NAD(P)H-analyse) Bepaal de pixelpuntpositie van een gemiddelde fluorescentielevensduur van een vrije NAD(P)H op de bijbehorende geëxporteerde fasorplotafbeelding (zie stap 2.3.3): Open de fasorafbeelding met FIJI, vergroot de afbeelding om met een pixelresolutie duidelijk het snijpunt tussen de universele halve cirkel en de lijn Ratiocursor voor twee componenten te visualiseren; gebruik de tool Rechthoek ROI om het snijpunt te selecteren.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de rechthoekige selectie een klein gebied rond het snijpunt is voor een nauwkeurige bepaling van de coördinaten in de volgende stap (stap 2.3.9).
    8. (Optioneel voor NAD(P)H-analyse) Open de tool Analyseren , kies het venster Metingen instellen en selecteer Zwaartepunt als meetparameter. Klik op Meten in het venster van de analysetool om de zwaartepuntcoördinaten van het vrije-NAD(P)H-referentiepunt te bepalen. Exporteer deze coördinaten naar een spreadsheet.
      OPMERKING: Vrije NAD(P)H-coördinaten zullen worden gebruikt als referentiepunt om de afstanden van dit punt te vergelijken met de positie van de sferoïde fasorwolk in een dataset (de manier om de metabole verschuiving tussen glycolyse en OxPhos te karakteriseren in NAD(P)H FLIM autofluorescentieanalyse)
    9. Open met FIJI de afbeelding van de sferoïde fasorwolk. Open de tool Afbeeldingsvenster , kies Aanpassen en selecteer Kleurdrempel in de werkbalk. Selecteer de drempelmethode van uw keuze (bijv. Otsu) en stel de Tintwaarde en Helderheidswaarde in om de parameters voor de selectie van een fasewolkonderdeel met de meest voorkomende pixelcoördinaten te verfijnen. Klik op Selecteren om het clustergebied te definiëren.
      OPMERKING: Houd dezelfde drempelparameters aan voor alle faseplotafbeeldingen, die moeten worden geanalyseerd. Voor de gepresenteerde NAD(P)H-FLIM-gegevens is de drempelmethode Otsu met ingestelde Hue-waarde 9 en helderheidswaarde 160 gekozen en toegepast op alle fase-afbeeldingen. Als alternatief kan het geselecteerde gebied worden gekopieerd naar ROI Manager (volg het pad Bewerken > Selectie > Toevoegen aan Manager) om een bibliotheek met fase-ROI's te maken voor verdere analyse.
    10. Bereken de zwaartepuntcoördinaten van het geselecteerde gebied volgens de procedure die is beschreven in stap 2.3.9 terwijl u de selectie behoudt. Exporteer deze coördinaten naar het spreadsheetbestand.
    11. Herhaal stap 2.3.9 en 2.3.10 om de coördinaten van het zwaartepunt te bepalen voor alle ROI-faseafbeeldingen om een gegevensset in de spreadsheet te maken.
      OPMERKING: Het gebruik van de ROI Manager-ROI-bibliotheek helpt om de ROI-analyse te vereenvoudigen en te organiseren (zie stap 2.3.10)
    12. (Optioneel voor NAD(P)H-analyse) Open de spreadsheet met geëxporteerde referentievrije-NAD(P)H en sferoïde ROI-coördinaten van verschillende vergelijkingsgroepen. Bereken de afstand tussen elk afzonderlijk zwaartepunt van de sferoïde fasor tot de referentiepositie van vrije NAD(P)H met behulp van bepaalde coördinaten en de volgende vergelijking:
      figure-protocol-1
      Waarbij Xc en Yc zwaartepuntcoördinaten zijn, zijn Xf en Yf de referentiecoördinaten.
      OPMERKING: Toepassing van de zwaartepuntparameter voor het bepalen van de verschuiving naar de referentielevensduur is alleen geschikt als alle zwaartepunten uit een dataset op dezelfde lineaire baan naar het referentiepunt liggen. Om dit te controleren, moeten alle zwaartepuntpunten uit de dataset samen met het referentiepunt in dezelfde coördinatenruimte worden uitgezet en moet de lineaire trenduitlijning worden uitgevoerd. Als de R 2-coëfficiënt van de lineaire trendlijn die door alle punten wordt getrokken dicht bij 1 ligt (bijv. R2 is 0,8-0,99), wordt aangenomen dat de afstandsanalyse geschikt is.
    13. Organiseer alle gegevens dienovereenkomstig voor vergelijking en voer statistische analyses uit met behulp van overeenkomstige software (bijv. Origin, MatLab). Kies de juiste statistische test op basis van de kenmerken van de dataset (normaliteit van de verdeling, aantal statistische eenheden, enz.).
      OPMERKING: Vergelijk voor NAD(P)H-analyse de afstandswaarden om de metabolische verschuiving te karakteriseren, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Voor vergelijking van eventuele fasorplots tussen experimentele groepen, voert u de vergelijking uit van de coördinaten van de ROI-fasorwolkenzwaartepunten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De juiste sferoïde vormingsmethode kiezen
De geselecteerde sferoïde vormingsmethode kan een grote invloed hebben op de grootte, vorm, celdichtheid, levensvatbaarheid en gevoeligheid voor geneesmiddelen van sferoïden (Figuur 2). Eerder werden de effecten van meerdere high-throughput (SphericalPlate 5D, in het lab gemaakte micromallen en MicroTissue malls) en de 'medium throughput' lage hechtingsmethoden (Biofloat en met lipide gecoate 96-well platen) vergeleken op de leven...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Meercellige sferoïden worden een voorkeursmethode bij de studies van tumor- en stamcelniche-micro-omgevingen, de ontdekking van geneesmiddelen en de ontwikkeling van de 'weefselbouwstenen' voor biofabricage. De heterogene interne architectuur, gradiënten van voedingsstoffen en oxygenatie van sferoïden kunnen die van in vivo weefsels en tumoren nabootsen in een relatief vereenvoudigde en toegankelijke omgeving. Met de behoefte aan meer methodologische transparantie 26,28

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de subsidies van het Speciaal Onderzoeksfonds (BOF) van de Universiteit Gent (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO, I001922N) en de Europese Unie, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN nr. 101073507.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% Trypsin-EDTAGibco25300-054Ook verkrijgbaar bij Sigma
10 mL serologische pipettenVWR612-3700Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
12 well cell-cultuur platen, sterieelGreiner bio-one665-180Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning en andere bedrijven.
12 Well Chamber slide, verwijderbaarIbidi81201Ook verkrijgbaar bij Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific en anderen
15 mL centrifugebuizenNerbe plus02-502-3001Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
3D Petri Schaal micromalenMicrotissueZ764000-6EA
6 well cell-cultuur platen, sterieelGreiner bio-one657160Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
70% ethanolChemLabCL02.0537.5000
BiofloatSarstedt83.3925.400Commercieel verkrijgbare gecoate 96-well plate voor sfeervorming
Calcein Green-AMTebubioAS-89201Gebruik in verdunning 1:1000
CellSens Dimension softwareOlympusversie 3
Collageen uit menselijke placenta, type IVSigmaC5533Voor de bereiding van 0,07 mg/mL Collageen en 0,03 mg/mL Poly-D-lysine gecoate microscoopschijven
Confocale FLIM MicroscoopLeica MicrosystemsN/AStellaris 8 Falcon geïnverteerde microscoop met wit-licht laser, HyD X detectoren, klimaat / T controlekamer (OkoLab), 25x/0.95 W objectief
D(+)-GlucoseMerck8342Bereid 1 M stockoplossing, 1:100 voor bereiding van beeldvormingsmedium (eindconcentratie 10 mM)
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), fenolrood-, glucose-, pyruvaat- en glutamine-vrijSigma-AldrichD5030-10X1LVoor bereiding van beeldvormingsmedium
Foetaal runder serum (FBS)Gibco10270-098Ook verkrijgbaar bij Sigma. Moet voor gebruik warmte-inactivering ondergaan.
HEPES (1M)Gibco15630-080Verdunning 1/100 voor bereiding van beeldvormingsmedium (eindconcentratie 10 mM)
Menselijk colonkanker cellen HCT116ATCC
ImageJNIHversie 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)Leica Microsystemsversie 4.6.1.27508
L-glutamineGibco25030Ook verkrijgbaar bij Sigma. Gebruik in verdunning 1:100.
Lipidure-CM5206AmsbioAMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, noodzakelijk om 1 mM Natrium Pyruvaat en 10 mM HEPES toe te voegenVWR392-0420Standaard groeimedium voor HCT116 cellen
Micro-gepattered 3D-geprinte PDMS stempelsN/AN/AVerstrekt door het Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Universiteit Gent
NaClChemlabCL00.1429.100
Neubauer telkamerFisher Scientific15980396
O2 sondes: MMIR1N/AN/AVolledige karakterisering, validatie en enkele toepassingen zijn te vinden op: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110
v1
PBSFisher scientificGibco18912014Los PBS tablet op in 500 mL gedistilleerd water.
Pen Strep :Penicilline (10.000 U/mL) / streptomycine (10.000 μg/mL) 100x oplossingGibco15140-122Ook verkrijgbaar bij Sigma. Gebruik in verdunning 1:100.
Poly-D-lysineSigmaP6407-5mgVoor de bereiding van 0,07 mg/mL Collageen en 0,03 mg/mL Poly-D-lysine gecoate microscoopschijven
Propidium JodideSigma-Aldrich25535-16-4Celdoodkleuring, gebruik 1 µg/mL bij 1h incubatie
PVDF spuitfilter 0,22 µmNovolabA35149Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
Natriumpyruvaat (100 mM)Gibco11360-070Verdunning 1/100 voor bereiding van beeldvormingsmedium (eindconcentratie 1mM)
SphericalPlate 5D 24-wellKugelmeiersSP5D-24W
Steriele petrischaalGreiner bio-one633181Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
Weefselcultuur fles (25 cm² )VWR734-2311Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
Weefselcultuur fles (75 cm²)VWR734-2313Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
U-bodem 96-well plaatVWR10062-900Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one en andere bedrijven
Ultrapuur AgaroseInvitrogen (Life Technologies)16500-500Andere soorten Agarose zoals Agarose met laag smeltpunt

Referenties

  1. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3d spheroids. J Vis Exp. (51), e2720(2011).
  2. Moskovits, N., et al. Establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs. J Vis Exp. (190), e64564(2022).
  3. Griner, L. M., et al. Generation of high-throughput three-dimensional tumor spheroids for drug screening. J Vis Exp. (139), e57476(2018).
  4. Qian, Y., Wei, X., Chen, K., Xu, M. Three-dimensional acoustic assembly device for mass manufacturing of cell spheroids. J Vis Exp. (200), e66078(2023).
  5. He, H., et al. Dynamic formation of cellular aggregates of chondrocytes and mesenchymal stem cells in spinner flask. Cell Prolif. 52 (4), e12587(2019).
  6. Perez, J. E., Nagle, I., Wilhelm, C. Magnetic molding of tumor spheroids: Emerging model for cancer screening. Biofabrication. 13 (1), 015018(2020).
  7. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3d bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomater. 95, 357-370 (2019).
  8. Guillaume, O., et al. Hybrid spheroid microscaffolds as modular tissue units to build macro-tissue assemblies for tissue engineering. Acta Biomater. 165, 72-85 (2023).
  9. Danilevicius, P., et al. laser-made 3D microscaffolds for tissue spheroid encagement. Biointerphases. 10 (2), 021011(2015).
  10. Jamieson, L. E., Harrison, D. J., Campbell, C. Chemical analysis of multicellular tumour spheroids. Analyst. 140 (12), 3910-3920 (2015).
  11. Dmitriev, R., Borisov, S., Jenkins, J., Papkovsky, D. Multiparametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. SPIE BiOS. 9328, (2015).
  12. Zushin, P. -J. H., Mukherjee, S., Wu, J. C. FDA Modernization Act 2.0: transitioning beyond animal models with human cells, organoids, and AI/ML-based approaches. J Clin Invest. 133 (21), e175824(2023).
  13. Kim, D. -S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human es and ips cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev Rep. 6 (2), 270-281 (2010).
  14. Hart, D., Gutiérrez, D. R., Biason-Lauber, A. Generation of a human ovarian granulosa cell model from induced pluripotent stem cells. bioRxiv. , 2022(2022).
  15. Chiaradia, I., et al. Tissue morphology influences the temporal program of human brain organoid development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1351-1367 (2023).
  16. Wagstaff, E. L., Ten Asbroek, A. L., Ten Brink, J. B., Jansonius, N. M., Bergen, A. A. An alternative approach to produce versatile retinal organoids with accelerated ganglion cell development. Sci Rep. 11 (1), 1101(2021).
  17. Thavandiran, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (49), E4698-E4707 (2013).
  18. Harrison, S. P., et al. Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human pscs. Exp Mol Med. 55 (9), 2005-2024 (2023).
  19. Noguchi, T. -A. K., Kurisaki, A. Formation of stomach tissue by organoid culture using mouse embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 2017, 217-228 (2017).
  20. Takahashi, J., et al. Suspension culture in a rotating bioreactor for efficient generation of human intestinal organoids. Cell Reports Methods. 2 (11), 100337(2022).
  21. Lagziel, S., Gottlieb, E., Shlomi, T. Mind your media. Nat Metab. 2 (12), 1369-1372 (2020).
  22. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of uniform spheroid formation in 384-well plates: The effect of medium evaporation. J Biomol Screen. 21 (9), 923-930 (2016).
  23. Bera, K., et al. Extracellular fluid viscosity enhances cell migration and cancer dissemination. Nature. 611 (7935), 365-373 (2022).
  24. Michl, J., Park, K. C., Swietach, P. Evidence-based guidelines for controlling ph in mammalian live-cell culture systems. Commun Biol. 2, 144(2019).
  25. Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable oxygen microscopy-assisted biofabrication of multicellular spheroids. J Vis Exp. (182), e63403(2022).
  26. Peirsman, A., et al. Mispheroid: A knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  27. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).
  28. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: Comparison of different protocols. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  29. Debruyne, A. C., et al. Live microscopy of multicellular spheroids with the multimodal near-infrared nanoparticles reveals differences in oxygenation gradients. ACS Nano. 18 (19), 12168-12186 (2024).
  30. Debruyne, A. C., Okkelman, I. A., Dmitriev, R. I. Balance between the cell viability and death in 3D. Semin Cell Dev Biol. 144, 55-66 (2023).
  31. Barroso, M., Monaghan, M. G., Niesner, R., Dmitriev, R. I. Probing organoid metabolism using fluorescence lifetime imaging microscopy (flim): The next frontier of drug discovery and disease understanding. Adv Drug Deliv Rev. 201, 115081(2023).
  32. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging-techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  33. Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. J Cell Sci. 134 (9), 1-17 (2021).
  34. Sarder, P., Maji, D., Achilefu, S. Molecular probes for fluorescence lifetime imaging. Bioconjug Chem. 26 (6), 963-974 (2015).
  35. Alfonso-Garcia, A., et al. Mesoscopic fluorescence lifetime imaging: Fundamental principles, clinical applications and future directions. J Biophotonics. 14 (6), e202000472(2021).
  36. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
  37. Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. J Cell Biol. 217 (7), 2235-2246 (2018).
  38. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomark Med. 4 (2), 241-263 (2010).
  39. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of nad (p) h and fad. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  40. Verma, A., et al. Fluorescence lifetime imaging for quantification of targeted drug delivery in varying tumor microenvironments. bioRxiv. , 2024(2024).
  41. Smith, J. T., et al. In vivo quantitative fret small animal imaging: Intensity versus lifetime-based fret. Biophys Rep. 3 (2), 100110(2023).
  42. Alvarez, L. A., et al. Application Note: SP8 Falcon: A novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal flim. Nat Methods. , (2019).
  43. Roberti, M. J., et al. TauSense: A fluorescence lifetime-based tool set for everyday imaging. Nat. Methods. , https://www.nature.com/articles/d42473-020-00364-w.pdf (2020).
  44. Auer, J. M. T., Murphy, L. C., Xiao, D., Li, D. U., Wheeler, A. P. Non-fitting flim-fret facilitates analysis of protein interactions in live zebrafish embryos. J Microsc. 291 (1), 43-56 (2023).
  45. Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLoS One. 8 (8), e70687(2013).
  46. Gao, D., et al. Flimj: An open-source imagej toolkit for fluorescence lifetime image data analysis. PloS One. 15 (12), e0238327(2020).
  47. Tullis, I. D. C., Ameer-Beg, S. M., Barber, P. R., Rankov, V., Vojnovic, B. Mapping femtosecond pulse front distortion and group velocity dispersion in multiphoton microscopy. Proc. SPIE 6089, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VI. , 60890(2006).
  48. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio Protoc. 8 (22), e3080(2018).
  49. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  50. Badea, M. A., et al. Influence of matrigel on single-and multiple-spheroid cultures in breast cancer research. SLAS Discov. 24 (5), 563-578 (2019).
  51. Lang, S., Sharrard, R., Stark, M., Villette, J., Maitland, N. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional matrigel cultures. Br J Cancer. 85 (4), 590-599 (2001).
  52. Barra, J., et al. DMT1-dependent endosome-mitochondria interactions regulate mitochondrial iron translocation and metastatic outgrowth. Oncogene. 43 (9), 650-667 (2024).
  53. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Intracellular probes for imaging oxygen concentration: How good are they. Methods Appl Fluoresc. 3 (3), 034001(2015).
  54. Schweikhard, V., et al. Application Note: The power HyD family of detectors for confocal microscopy. Nat Methods. , https://www.nature.com/articles/d42473-020-00398-0 (2020).
  55. Alam, S. R., Wallrabe, H., Christopher, K. G., Siller, K. H., Periasamy, A. Characterization of mitochondrial dysfunction due to laser damage by 2-photon flim microscopy. Sci Rep. 12 (1), 11938(2022).
  56. Bush, P. G., Wokosin, D. L., Hall, A. C. Two-versus one photon excitation laser scanning microscopy: Critical importance of excitation wavelength. Front Biosci. 12, 2646-2657 (2007).
  57. Liu, M., et al. Instrument response standard in time-resolved fluorescence spectroscopy at visible wavelength: Quenched fluorescein sodium. Appl Spectrosc. 68 (5), 577-583 (2014).
  58. Szabelski, M., et al. Collisional quenching of erythrosine b as a potential reference dye for impulse response function evaluation. Appl Spectrosc. 63 (3), 363-368 (2009).
  59. Chib, R., et al. Standard reference for instrument response function in fluorescence lifetime measurements in visible and near infrared. Meas Sci Technol. 27 (2), 027001(2015).
  60. Talbot, C. B., et al. Application of ultrafast gold luminescence to measuring the instrument response function for multispectral multiphoton fluorescence lifetime imaging. Opt Express. 19 (15), 13848-13861 (2011).
  61. Becker, W. Recording the instrument response function of a multiphoton flim system. Becker & Hickl. , Available from: https://www.becker-hickl.com/literature/application-notes/recording-the-instrument-response-function-of-a-multiphoton-flim-system/ (2007).
  62. Leben, R., Köhler, M., Radbruch, H., Hauser, A. E., Niesner, R. A. Systematic enzyme mapping of cellular metabolism by phasor-analyzed label-free nad (p) h fluorescence lifetime imaging. Int J Mol Sci. 20 (22), 5565(2019).
  63. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using nadh and nadph autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  64. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A python gui for interactive phasor analysis of flim data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  65. Malacrida, L., Ranjit, S., Jameson, D. M., Gratton, E. The phasor plot: A universal circle to advance fluorescence lifetime analysis and interpretation. Annu Rev Biophys. 50, 575-593 (2021).
  66. Okkelman, I., Vandenberghe, W., Dmitriev, R. Role of preconditioning with oxygen and glucose deprivation in promoting differentiation of dental pulp stem cells in 3D culture. Mol Biol Cell. 34 (2), 1212(2022).
  67. Park, J. H., et al. The effect of bmp-mimetic peptide tethering bioinks on the differentiation of dental pulp stem cells (DPSCs) in 3D bioprinted dental constructs. Biofabrication. 12 (3), 035029(2020).
  68. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  69. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  70. Bryanskaya, E. O., et al. High levels of FAD autofluorescence indicate pathology preceding cell death. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1868 (1), 130520(2024).
  71. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21 (1), 152(2021).
  72. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420(2020).
  73. Gstraunthaler, G., Seppi, T., Pfaller, W. Impact of culture conditions, culture media volumes, and glucose content on metabolic properties of renal epithelial cell cultures: Are renal cells in tissue culture hypoxic. Cell Physiol Biochem. 9 (3), 150-172 (1999).
  74. Glickman, R. D. Phototoxicity to the retina: Mechanisms of damage. Int J Toxicol. 21 (6), 473-490 (2002).
  75. Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring Parameters of Oxygen Transport to Cells in the Microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , The Royal Society of Chemistry. (2018).
  76. Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41 (2), 191-197 (2006).
  77. Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of pvp-hypericin: A new strategy using ms pulses of led and the fluorescent dye cfse. J Microsc. 245 (1), 100-108 (2012).
  78. Carrasco Kind, M., et al. flimview: A software framework to handle, visualize and analyze flim data. F1000Research. 9, 574(2020).
  79. Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. Pam: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophys J. 114 (7), 1518-1528 (2018).
  80. Chen, S. -J., Sinsuebphon, N., Barroso, M., Intes, X., Michalet, X. Optical Molecular Probes, Imaging and Drug Delivery. , Optica Publishing Group. (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Live-cellmicroscopieproductie van sferoïden3D-weefselmodellenoptische metabole beeldvormingmethoden voor sferoïdevormingtumormicro-omgevingautofluorescentie-FLIMkankercelsferoïden
Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.