Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

Angela C. Debruyne; Gabriele Ferrari; Hang Zhou; Nore Van Loon; Nina Heymans; Irina A. Okkelman; Ruslan  I. Dmitriev

doi:10.3791/66845

Method Article

Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

DOI:

10.3791/66845

⸱

August 9th, 2024

Angela C. Debruyne^*¹ , Gabriele Ferrari^*¹ , Hang Zhou^*¹ , Nore Van Loon¹ , Nina Heymans¹ , Irina A. Okkelman¹^,² , Ruslan I. Dmitriev¹^,²

¹Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, ²Ghent Light Microscopy Core, Ghent University

^* These authors contributed equally

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we verschillende methoden voor de vorming van meercellige sferoïden om follow-up multi-parameter live celmicroscopie uit te voeren. Met behulp van fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM), cellulaire autofluorescentie, kleuringskleurstoffen en nanodeeltjes wordt de benadering voor analyse van celmetabolisme, hypoxie en celdood in levende driedimensionale (3D) kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden gedemonstreerd.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meercellige tumorsferoïden zijn een populair 3D-weefselmicroaggregaatmodel voor het reproduceren van tumormicro-omgevingen, het testen en optimaliseren van medicamenteuze therapieën en het gebruik van bio- en nanosensoren in een 3D-context. Hun productiegemak, voorspelbare grootte, groei en waargenomen nutriënten- en metabolietgradiënten zijn belangrijk om de 3D-niche-achtige celmicro-omgeving samen te vatten. Sferoïde heterogeniteit en variabiliteit van hun productiemethoden kunnen echter het algehele celmetabolisme, de levensvatbaarheid en de geneesmiddelrespons beïnvloeden. Dit maakt het moeilijk om de meest geschikte methodologie te kiezen, rekening houdend met de vereisten in grootte, variabiliteit, behoeften van biofabricage en gebruik als in vitro 3D-weefselmodellen in de stam- en kankercelbiologie. In het bijzonder kan de productie van sferoïde invloeden van invloed zijn op hun compatibiliteit met kwantitatieve levende microscopieën, zoals optische metabole beeldvorming, fluorescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie (FLIM), monitoring van sferoïde hypoxie met nanosensoren of levensvatbaarheid. Hier worden een aantal conventionele sferoïde vormingsprotocollen gepresenteerd, waarbij hun compatibiliteit met de live widefield-, confocale en twee-foton-microscopieën wordt benadrukt. De follow-up beeldvorming tot analysepijplijn met gemultiplexte autofluorescentie FLIM en, met behulp van verschillende soorten kanker en stamcelsferoïden, wordt ook gepresenteerd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meercellige sferoïden vertegenwoordigen een groep 3D-weefselmodellen die zijn verkregen door de zelfaggregatie van cellen en die een bolvorm vertonen. Ze worden veel gebruikt om de interactie tussen cellen en cellen en cellen in vitro na te bootsen en om een 3D-context te reproduceren binnen een groot aantal van kanker en stamcellen afgeleide constructies. Er worden verschillende technieken gebruikt om de celhechting te verminderen en de aggregatie te bevorderen. Deze omvatten de ophang-druppelmethode die afhankelijk is van de oppervlaktespanning¹; methoden voor het afstoten van celhechting, zoals ultralage bevestigingsplaten, micromallen en microwells ^2,3; benadering op basis van akoestische golven⁴; stroomgeïnduceerde aggregatiemethoden (spinnerkolven, bioreactor en microfluïdische apparaten)⁵; magnetische deeltjes-geassisteerde vorming⁶ en gebruik van de aggregatiebevorderende synthetische en ECM-gebaseerde matrices en steigers ^7,8,9.

In kankeronderzoek, ontwikkeling en validatie van nieuwe medicamenteuze therapieën zijn sferoïden een aantrekkelijk model vanwege hun vermogen om de ruimtelijke diffusie-beperkte gradiënten van voedingsstoffen, afvalproducten en O₂ te recapituleren, wat vaak leidt tot de vorming van een necrotische kern, typisch voor de solide tumoren^10,11. Deze betrouwbaardere en geavanceerdere in-vitromodellen dagen de noodzaak uit van uitgebreid gebruik van diermodellen (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.0¹²), volgens het 3V-principe van dieronderzoek (vervanging, vermindering en verfijning). Naast kanker vinden sferoïden hun toepassing in stamcelonderzoek. Pluripotente stamcellen hebben bijvoorbeeld het vermogen om embryoïde lichamen (EB) te vormen, die kunnen worden gebruikt voor de differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) naar gespecialiseerde celtypen die moeilijk rechtstreeks van patiënten te verkrijgen zijn, zoals neurale voorlopercellen¹³ of ovariumgranulosacellen^13,14. Bovendien is de vorming van een EB vaak de eerste stap in de ontwikkeling van complexere organoïde modellen, bijvoorbeeld neuraal¹⁵, retinaal¹⁶, hart¹⁷, lever¹⁸, maag¹⁹ en darmorganoïden²⁰. Factoren zoals grootte, reproduceerbaarheid, doorvoer en stroomafwaartse toepassingen moeten in overweging worden genomen bij het kiezen van een geschikte sferoïde vormingsmethode voor de experimenten.

De toegenomen complexiteit van 3D-cultuur kan leiden tot een hogere variabiliteit in vergelijking met 2D-cultuur. Factoren zoals de samenstelling van voedingsstoffen²¹, mediaverdamping²², viscositeit²³, pH-regeling²⁴, sferoïde vormingsmethode en zelfs de tijd in de cultuur^25,26 kunnen resulteren in het verkrijgen van sferoïden met verschillende morfologie, groottes, levensvatbaarheid en verschillende chemoresistentie^27,28. Recent onderzoek heeft aangetoond dat sferoïde zuurstofgradiënten niet altijd statisch zijn en worden beïnvloed door de vormingsmethode, de sferoïde grootte en extracellulaire viscositeit, wat de sferoïde heterogeniteit beïnvloedt²⁹. Om de reproduceerbaarheid en toegankelijkheid van gegevens op sferoïden te verbeteren, is de MISpheroID-kennisbank ontwikkeld²⁶, waarbij de cellijn, het kweekmedium, de vormingsmethode en de grootte van de sferoïden worden geïdentificeerd als de minimale informatie voor een reproduceerbaar resultaat. Daarom werd een gedetailleerde vergelijking gemaakt van meerdere high-throughput (SphericalPlate 5D, in het laboratorium gemaakte micromallen en Microtissue malls) en lage bevestigingsmethoden (d.w.z. Biofloat en met lipide gecoate 96-wells platen, zowel steigervrij als op steigers) (Figuur 1 en Tabel 1), inclusief de putgrootte (gegeven een schatting van de maximale sferoïde grootte), gebruikte verbruiksartikelen, bereidingstijd en de mogelijkheid om sferoïden te monitoren zonder ze naar microscopieschalen te transporteren. Dit laatste maakt langetermijnstudies mogelijk, terwijl sferoïden geproduceerd met high-throughput-methoden vaak resulteren in eindpuntexperimenten. Alle methoden, met uitzondering van de roosters van de 5DspheriPlate, brengen geen ongewenste autofluorescentie met zich mee, waardoor ze direct in microscopie kunnen worden gebruikt.

figure-introduction-1
Figuur 1: Sferoïde vormingsmethoden uitgelegd. High-throughput methoden zoals de SphericalPlate 5D, die gepatenteerde microwells in de plaat heeft geïntegreerd, terwijl de in het laboratorium geproduceerde micromallen en de MicroTissue mallen stempels gebruiken om meerdere microwells in agarose (blauw) te maken. Platen met een lage hechting, zoals Lipidure (Amsbio) en Biofloat (Sarstedt), gebruiken een niet-hechtende coating die de hechting aan het celoppervlak remt en de zelfaggregatie van cellen bevordert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

	5D SpheriPlate	Zelf geproduceerde micromalls	Microweefsel	Lage bevestigingsmethoden
Aantal sferoïden/putje	750	1589	81	1
Diameter goed	90 μm	400 μm	800 μm	1 mm
Volume van de cultuur	1 ml	5 ml	1 ml	200 μL
Andere verbruiksartikelen	/	7 ml 3% agarose	500 μL van 2% agarose	/ *
Bereidingstijd	10 minuten	2 uur + 3 dagen mediabewerking	0,5 uur + 15 min media-aanpassing	10–30 min + 1 uur drogen
Monitoring	Ja	Nee**	Ja	Ja
Autofluorescerend	Ja	Nee	Nee	Nee
Herbruikbaar	Nee	Ja	Ja	Nee**
Kosten	€€	€	€€€€	€€€€: Coating en Matrigel
Kosten	€€	€	€€€€	€€: Commerciële plaat met 96 putjes
*Sommige cellijnen hebben toevoeging van ECM nodig (d.w.z. 2%-5% Matrigel) om compacte sferoïden te vormen.
**De coating is herbruikbaar totdat deze leeg is. Elke plaat verbruikt echter een kleine hoeveelheid media en stof kan zich na verloop van tijd ophopen. Filtersterilisatie is regelmatig nodig.

Tabel 1: Vergelijking van meerdere sferoïde vormingsmethoden²⁹. "Monitoring": de mogelijkheid om sferoïde te bewaken zonder dat overdracht naar een microscopieschaal nodig is. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€: 150-500€ , €€€: >500€

Fluorescentiemicroscopie maakt directe monitoring mogelijk van de belangrijkste biologische aspecten in sferoïden, waaronder celdood, levensvatbaarheid, proliferatie, metabolisme, viscositeit en zelfs mechanische eigenschappen³⁰. Fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) biedt een extra kwantitatieve dimensie voor het bestuderen van fluorescerende sonde-interacties binnen hun (micro)omgeving 31,32,33,34, waardoor de overlappende emissiespectra kunnen worden opgelost volgens verschillende emissielevensduurs ^35,36 en het onderzoeken van het celmetabolisme op basis van intrinsieke cellulaire autofluorescentie. Zo kunnen wijdverspreide cellulaire autofluorescerende verbindingen zoals nicotinamide-adenine-dinucleotidefosfaat (NAD(P)H), flavine-mononucleotide (FMN), flavine-adenine-dinucleotide (FAD), protoporfyrine IX en andere worden gemeten met één- en twee-foton FLIM en dienen als intrinsieke 'sensoren' van glucosekatabolisme, oxidatieve fosforylering (OxPhos) en geven een algemeen overzicht van de celredoxtoestand. NAD(P)H komt voor in vrije cytoplasmatische of in eiwitgebonden mitochondriale vormen^37,38. Evenzo is de geoxideerde toestand van FAD fluorescerend met een langere levensduur van de vrije vorm. NAD(P)H- en FAD-microscopieën omvatten meestal twee-foton geëxciteerde FLIM, gericht op het voorkomen van fotoschade door monsters³⁹. Vaak kan 'optische metabole beeldvorming' FLIM worden gecombineerd met het gebruik van op kleurstof gebaseerde sondes, genetisch gecodeerde biosensoren, fosforescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie (PLIM) en op ratiometrische intensiteit gebaseerde metingen om een completer beeld te krijgen van het sferoïde of organoïde metabolisme, oxygenatie, proliferatie en levensvatbaarheid van cellen 29,30,31. Daarnaast kan FLIM ook worden gecombineerd met de Förster-resonantie-energieoverdrachtsmethode (FRET) om de levensduurvariatie van de donorfluorofoor te meten wanneer deze in nauw contact staat met de acceptor om de binding van een geneesmiddel met zijn doeldomein te onderzoeken 33,40,41.

De verkregen FLIM-beelden worden doorgaans geanalyseerd om de levensduur pixel voor pixel te berekenen. Momenteel zijn er ten minste 3 veelgebruikte strategieën die worden gebruikt om de fluorescentielevensduur te verkrijgen: semi-kwantitatieve 'snelle ^FLIM'42 (soms aangeduid als 'tau-sense'43,44), vervalcurve-aanpassing, met behulp van één-, twee- of drie-exponentiële aanpassing, en 'fittingvrije' benadering met fasetransformatie en fase-plotanalyse. Afhankelijk van de leverancier kan ofwel de meegeleverde (LAS X, Symphotime, SPCImage, enz.) ofwel open-source software (bijv. FLIMfit⁴⁵, FLIMJ⁴⁶ of andere⁴⁷) worden gebruikt om gemeten FLIM-gegevens te verwerken. Doorgaans is door de leverancier geleverde software nuttig voor voorlopige gegevensanalyse, terwijl open-sourceoplossingen kunnen zorgen voor nauwkeurigere onderzoeken met behulp van bijvoorbeeld fasorplots en 3D-visualisatie.

Ondanks het nut en de aantrekkelijkheid van FLIM als methode voor het bestuderen van sferoïden, zijn er zeer weinig experimentele protocollen beschikbaar en is er een algemeen gebrek aan kennis bij het kiezen van de meest geschikte vormingsmethode voor succesvolle live multiparametrische microscopie-experimenten met FLIM. Hier wordt een gedetailleerde vergelijking gepresenteerd van veelgebruikte sferoïde vormingsprotocollen op basis van hun morfologie, levensvatbaarheid en oxygenatie met de onlangs gevalideerde en gekarakteriseerde verrode en nabij-infrarood (NIR) zuurstofgevoelige nanosensor (MMIR1). Het kationische nanodeeltje is geïmpregneerd met twee reporterkleurstoffen, de referentie O_{2-ongevoelige} aza-BODIPY (excitatie 650 nm, emissie 675 nm) en de NIR O_2-gevoelige metalloporfyrine, PtTPTBPF (excitatie 620 nm, emissie 760 nm). De MMIR1 maakt real-time analyse van zuurstofgradiënten mogelijk op een conventionele fluorescentiemicroscoop (met behulp van ratiometrische analyse) of fosforescentie-levensduurmicroscoop (PLIM) zonder cellulaire toxiciteit te introduceren en stabiele signalen, langdurige monitoring en multiplexing mogelijk^{te maken 25,29}. Afhankelijk van de noodzaak om te kleuren met kleurstoffen of nanosensoren, sferoïde doorvoer of celtype, kan het meest geschikte vormingsprotocol worden gekozen. Aangezien de studies naar de levensvatbaarheid en oxygenatie van sferoïden relevant zijn voor studies van kanker en van stamcellen afgeleide sferoïden, bevatten de gepresenteerde protocollen ook voorbeelden en verwachte typische resultaten van NAD(P)H-FLIM en FAD-FLIM met deze modellen. De gepresenteerde beeldvormings- en analysepijplijnen zijn gericht op de meest populaire op tijd gecorreleerde FLIM-microscopieplatforms op basis van enkelvoudige fotonentelling.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generatie van meercellige sferoïden

Celcultuur
OPMERKING: Celculturen kunnen worden verzameld bij de American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich of andere leveranciers. ATCC biedt alle vereiste verwerkingsinformatie, waaronder voorkeursgroeimedia, subteeltprocedures, bioveiligheidsniveau, groeisnelheid en STR-profielen. Hier worden 500 cellen/sferoïde van de menselijke darmkankercellijn HCT116 gebruikt in McCoy's 5A-media (VWR, 392-0420) aangevuld met 10% FBS en 1 mM natriumpyruvaat. Voor langdurige experimenten die dagelijks worden gecontroleerd, kan 10 mM HEPES, pH 7,2 aan de media worden toegevoegd.
1. Kweek de celcultuur om 70%-90% samenvloeiing te bereiken.
2. Spoel de cellen af met voorverwarmd (37 °C) steriel PBS (5 ml voor 25^cm2 of 10 ml per kolf van 75^cm2 ).
3. Voeg 0,05% trypsine - 1 mM EDTA-oplossing toe (0,5 ml voor 25 cm² of 1 ml per kolf van 75^cm2 ) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C in 5% CO₂, 95% vochtigheid om celloslating te bereiken.
  NOTITIE: Controleer de celloslating onder de microscoop van het transmissielicht (helderveld). De overmatige blootstelling van cellen aan de dissociërende enzymoplossing kan hun levensvatbaarheid beïnvloeden.
4. Neutraliseer trypsine door overtollige celkweekmedia toe te voegen die 10% FBS bevatten (ten minste 5 ml media per 1 ml dissociatieoplossing).
  OPMERKING: Voor cellen gekweekt op lage FBS of FBS-vrije kweekmedia, kan trypsineneutralisatie worden gedaan door toevoeging van 0,5 ml 100% FBS aan de met trypsine behandelde celcultuur, gevolgd door centrifugatie om cellen over te brengen naar hun oorspronkelijke kweekmedia.
5. Dissocieer celaggregaten door pipetteren om eencellige suspensie in media te verkrijgen.
  OPMERKING: Pieteren met een serologische pipet met een pipetpunt van 1000 μl aan de bovenkant verbetert de productie van eencellige suspensies in een groot volume suspensiecelcultuur aanzienlijk.
6. Gebruik een telkamer (door Neubauer geregeerde hemocytometer of alternatieven) om het celgetal per 1 ml van de celsuspensie te tellen.
7. Verdun de celsuspensie om het gewenste aantal cellen per milliliter te verkrijgen.
8. Voeg geconcentreerde O_2-sonde (nanodeeltjes) oplossing toe aan de celsuspensie met een eindconcentratie van 10 μg/ml voor ratiometrische analyse van O₂.
  OPMERKING: Om een homogene celsuspensie (met de sonde) te garanderen, moet u meerdere keren resuspenderen voordat sferoïde wordt gevormd. Als de O_2-sonde niet nodig is, sla deze stap dan over en ga verder met de vorming van de sferoïden. Bij het omgaan met iPSC's moet een aangepast protocol worden toegepast. In het kort worden iPSC's gekweekt in kolonies op met Geltrex gecoate platen en gepasseerd met behulp van ReLeSR zoals beschreven in het door de leverancier verstrekte protocol⁴⁸. Op de dag van de vorming van sferoïde moeten kolonies groot en compact zijn en meerlagige centra met duidelijke grenzen vertonen. Spoel de cellen af met voorverwarmd steriel PBS. Voeg 1 ml zacht celdissociatiereagens (GCDR) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 8-10 minuten. Gebruik een punt van 1000 μL om de cellen voorzichtig los te maken van het putje en om een eencellige suspensie te verkrijgen. Breng eencellige suspensie over in een steriele conische buis van 50 ml en voeg 4 ml voorverwarmd DMEM-F12-medium toe om de GCDR te neutraliseren. Was het putje met 1 ml DMEM-F12 en breng het over naar de rest van de celsuspensie. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Resuspendeer in 1 ml van geschikte media voor verdere experimenten. Voor experimenten die in dit manuscript worden beschreven, werd mTeSR + 10 μM Rock Inhibitor gebruikt. Tel en verdun de celsuspensie om het gewenste aantal cellen per milliliter te verkrijgen.
Methoden voor sferoïde vorming
1. 3D petrischaal micro-mallen
  OPMERKING: Deze methode met hoge doorvoer wordt gebruikt om tegelijkertijd een groot aantal sferoïden (81 sferoïden) te genereren in een 9 x 9 micromold-array met een diameter van 800 μm en een diepte van 800 μm.
  1. Spoel micromallen voor het gieten van 3D-petrischalen af in dH₂O en doe ze in een autoclaveerbare container.
  2. Meet 2 g agarosepoeder van elektroforesekwaliteit af en doe dit in een droge autoclaafbestendige glazen fles van 200 ml.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de fles en het agarosepoeder droog zijn en geen vloeistof of vocht bevatten.
  3. Autoclaaf micromallen voor het gieten van 3D petrischalen en -flessen met agarosepoeder gedurende 30 minuten op een droge cyclus.
  4. Maak een zoutoplossing van 0,9 w/v% door toevoeging van 0,9 g NaCl in 100 ml ultrapuur water en steriliseer door middel van autoclaveren.
    OPMERKING: NaCl wordt aanbevolen door de fabrikant. Het verhoogt de stabiliteit van de agarose.
  5. Bereid de agarose-oplossing voor door de steriele zoutoplossing toe te voegen aan het gesteriliseerde agarosepoeder. Schroef het losjes gemonteerde deksel erop om drukopbouw te voorkomen. Draai de fles rond om het agarosepoeder te mengen.
  6. Kook en los het agarosepoeder op met behulp van een magnetron. Stop de magnetron regelmatig (~elke 10 s). Draai de fles rond en herhaal totdat de agarose is opgelost.
    LET OP: De agarose-oplossing is heet en vereist een zorgvuldige behandeling. Door onmiddellijk na het smeltproces te schudden, kan de oplossing uit het vat barsten. Om ongelukken te voorkomen, gebruikt u voldoende grote vaten die tot niet meer dan 50% van de capaciteit zijn gevuld en gebruikt u geschikte persoonlijke bescherming (handschoenen, ovenwant, oogbescherming en laboratoriumjas).
  7. Laat de opgeloste agarose-oplossing afkoelen tot 60-70 °C. Met behulp van aseptische technieken en omstandigheden wordt gesmolten agarose in de micromal gepipeteerd (500 μl voor 12-serie of 330 μl voor 24-serie).
    OPMERKING: Vermijd luchtbelvorming tijdens het mengen of pipetteren van agarose. Verwijder eventuele ingesloten kleine belletjes in de kleine kenmerken van de micromal door te pipetteren of voorzichtig te schrapen voordat de agarose stolt.
  8. Laat de agarose ongeveer 2-3 minuten stollen. Buig daarna de micromal voorzichtig om de 3D-petrischaal te verwijderen en over te brengen naar een weefselkweekplaat met 12 putjes.
    OPMERKING: Overbuiging van de micromal kan leiden tot de vorming van scheuren in de agarosemal.
  9. Om de 3D-petrischaal in evenwicht te brengen, voegt u 2,5 ml/putje celkweekmedium toe. Incubeer gedurende 15 minuten of langer. Verwijder het kweekmedium en vervang het door vers medium. Herhaal dit nog een keer om de 3D petrischaal in evenwicht te brengen met een kweekmedium.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden onderbroken tot celseeding. Voor langdurige opslag (tot 2 weken bij 4 °C) gebruikt u PBS-oplossing in plaats van medium.
  10. Verwijder de 3D petrischaal rond het kweekmedium (of PBS) volledig en verwijder de media in de 3D petrischaal nauwkeurig door de weefselkweekplaat te kantelen.
  11. Zaai voorzichtig 190 μL celsuspensie met 40.500 cellen druppelsgewijs in de celzaaikamer (zie stap 1.1).
    OPMERKING: Het aantal microputjes in agarosestempels bepaalt het aantal sferoïden dat per stempel wordt geproduceerd. In dit geval bevat deze agaroseschimmel 81 microwells (81 x 500 cellen/sferoïde). Variatie van de celconcentratie in suspensie toegevoegd aan een macrowell maakt het mogelijk om het celaantal per sferoïde te veranderen, waardoor de grootte van de sferoïde wordt gecontroleerd.
  12. Wacht ~10 minuten totdat de cellen zich in de kenmerken van de 3D Petri dsh hebben genesteld. Voeg vervolgens 2 ml medium toe aan de buitenkant van de 3D petrischaal.
  13. Plaats de weefselkweekplaat in de celkweekincubator en vervang indien nodig het medium rond de 3D-petrischaal.
2. Lage bevestigingsplaat
  OPMERKING: Deze methode wordt gebruikt om een enkele sferoïde per putje te genereren. Gecoate platen (Lipidure of Biofloat) zijn in de handel verkrijgbaar (sla de stappen 1.2.2.1-1.2.2.4 over). Als alternatief kan de coating apart worden gekocht en worden gebruikt om onbehandelde multi-well-platen te coaten. Het wordt aanbevolen om putjes aan de randen van platen met 96 putjes te vullen met steriel water of PBS vanwege de snellere verdamping in deze putjes, waardoor het aantal putjes voor sferoïden wordt beperkt tot 60. Als er minder sferoïden nodig zijn, vul dan de omliggende lege putten met water of PBS. Gebruik stofvrije tips voor het omgaan met vloeistoffen om te voorkomen dat kleine deeltjes in de putten terechtkomen, omdat deze de vorming van sferoïde deeltjes verstoren.
  1. Bereid een coatingoplossing van 0,5 w/v% voor door 0,25 g polymeerpoeder op te lossen in 50 ml ethanol in een glazen fles. Filter de coating.
    OPMERKING: Filtersterilisatie en alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd in steriele omstandigheden onder laminaire stroming.
  2. Voeg 200 μL van de coatingoplossing toe aan elk putje van een 96 U-bodem kweekplaat.
  3. Incubeer gedurende 1 minuut en verwijder overtollige coating.
    OPMERKING: De coatingoplossing kan meerdere keren worden gebruikt. Bewaar in een glazen verpakking bij kamertemperatuur (RT). Plastic containers worden niet geadviseerd, omdat het plastic gedeeltelijk kan oplossen en een deel van de oplossing kan worden. Als er stof aanwezig is, steriliseer het filter dan met een 0,22 μm polyethersulfon (PES) of nylon spuitfilter.
  4. Laat de plaat met 96 putjes ongeveer 1 uur aan de lucht drogen.
    OPMERKING: Als cellen een extracellulaire matrix nodig hebben, gaat u verder met stap 1.2.3. Gecoate platen kunnen maximaal 1 maand bij RT worden opgeslagen wanneer ze in aluminium zijn gewikkeld. Bij het zaaien van een lagere hoeveelheid cellen/putje kan het centrifugeren van de plaat gedurende 5 minuten op 300 g helpen om de cellen naar beneden te trekken.
3. Extracellulair matrix-ondersteund vormingsprotocol
  OPMERKING: Sommige cellijnen produceren zelf niet genoeg extracellulaire matrix (ECM) en hebben de toevoeging van ECM nodig, zoals Matrigel, Cultrex of Geltrex, om compacte sferoïden te vormen 49,50,51. Voor celtypen zoals borstkanker MDA-MB-231, menselijke dermale papillen, prostaatkankercellen en andere, is het mogelijk om stap 1.2.2 te gebruiken met de volgende wijzigingen⁵², waarvoor de toevoeging van ECM nodig is. Gebruik bij voorkeur stofvrije tips voor het hanteren van vloeistoffen om te voorkomen dat stof de sferoïde vorming verstoort. Stappen 1 en 4-7 moeten worden uitgevoerd onder een biologische veiligheidskast (klasse II).
  1. Ga verder met de stappen 1.2.2.1-1.2.2.4 (lage bevestigingsplaten) voor oppervlaktebehandeling.
  2. Koel de plaat met 96 putjes voor op 4 °C in de koelkast.
  3. Bereid de centrifuge voor met de juiste adapter voor de plaat met 96 putjes en koel deze voor op 4 °C.
  4. Bereid een 5%-oplossing van de basale membraanmatrix (BMM) in voorgekoelde (4 °C) celkweekmedia.
    OPMERKING: BMM crosslinkt snel bij RT. Bewaar bij het hanteren voorraden en oplossingen op het ijs.
  5. Bereid de celsuspensie voor (zie stap 1.1).
  6. Voeg 50 μL van de BMM-oplossing toe aan elk putje.
  7. Voeg voorzichtig 50 μl celsuspensie toe aan elk putje bovenop de BMM-oplossing (25.000 cellen/putje).
    OPMERKING: Blaas dit volume niet in de put, anders verspreiden de cellen zich langs de zijkanten van de putten en verzamelen ze zich niet op de bodem. Een lager aantal cellen per putje kan worden verkregen door de celdichtheid dienovereenkomstig aan te passen. Niet alle cellen zullen sferoïden vormen bij alle zaaidichtheden; De optimalisatie moet worden uitgevoerd celtype en gewenste dimensies. Met de verstrekte volumes is de uiteindelijke concentratie van BMM 2,5%. Als een andere concentratie nodig is, moet de bouillonoplossing in een lagere/hogere concentratie worden bereid.
  8. Centrifugeer de plaat met 96 putjes gedurende 5 minuten op 300 x g en 4 °C.
    OPMERKING: Zonder deze stap aggregeren cellen niet goed op de bodem van de put, waardoor er meerdere kleinere aggregaten worden gevormd. De centrifuge moet in dit stadium worden afgekoeld om verknoping te voorkomen.
  9. Plaats de plaat in de celcultuurincubator. Aggregaten worden als rijp beschouwd op dag 4 na het zaaien.
    OPMERKING: Voor aanvullende protocollen over sferoïde vorming, zie Aanvullend Bestand 1.

2. Live microscopie van sferoïden

Voorbereiding van sferoïden voor live beeldvormingsanalyse
OPMERKING: Afhankelijk van de opzet van het experiment (bijv. langetermijnmonitoring of eindpuntanalyse, opstelling van de microscoop of spectrale eigenschappen van de gemeten fluorescentie) of vanwege onverenigbaarheid van de sferoïde productiemethode met de microscopie (bijv. monsterdikte, autofluorescentie van het materiaal, zweven van sferoïden tijdens beeldvorming) directe monitoring van sferoïden in de plaat, waar ze zijn geproduceerd, is misschien niet mogelijk. Het protocol legt de bereiding van sferoïden voor beeldvorming uit, die geschikt zijn voor de meeste omgekeerde breedveld- en confocale microscopen.
1. Beeldvormingsmedia voorbereiden en voorverwarmen (37 °C): DMEM aangevuld met HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), natriumpyruvaat (1 mM), L-glutamine (2 mM) en glucose (5 mM), zonder fenolrood.
  OPMERKING: Natriumbicarbonaat alleen of in combinatie met HEPES-Na kan worden gebruikt als CO₂ -controle wordt geboden tijdens beeldvorming²⁴. Sommige celcultuurtypen kunnen de aanwezigheid van HEPES niet verdragen. Afhankelijk van het experimentele ontwerp kan het pyruvaat-, glutamine- en glucosegehalte worden gewijzigd.
2. Bereid steriele microscopieschalen voor (in de handel verkrijgbaar of in het laboratorium gemaakt) met gecoate (voor een sterke sferoïde hechting) of niet-gecoate (lage sferoïde hechting) afdekglasoppervlakken (dikte #1.5).
  OPMERKING: De behoefte en het type coating zijn afhankelijk van het celtype, de hechtingseigenschappen van sferoïden en de snelheid van hun celmigratie van de 3D- naar de 2D-kweekinterface. Dit is belangrijk om te overwegen, omdat de coating het verlies van 3D-organisatie kan vergemakkelijken, waardoor de vorm van microgradiënten in sferoïden en als gevolg daarvan het celgedrag verandert. Voor sommige experimenten (bijv. Beeldvorming analyseerde de reactie op geneesmiddelstimulatie) is een sterke sferoïde hechting aan het oppervlak vereist en heeft een coating met gelatine, BMM, collageen, collageen / poly-D-lysine of poly-D-lysine de voorkeur.
3. Spoel de met O_2-sonde gekleurde sferoïden voorzichtig uit de microputjes van de agarose met micropatroon of de plaat met 96 putjes en breng de nog drijvende sferoïden over in een injectieflacon van 2 ml.
  OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat alle sferoïden van de methode met hoge doorvoer worden verzameld, spoelt u de mal 1-3 keer met het extra volume kweekmedia, waarbij u alle sferoïde suspensies in één injectieflacon combineert. Voor sferoïden in een lage bevestigingsplaat, verzamel sferoïden één voor één uit individuele putjes naar een injectieflacon of rechtstreeks naar een microscopieschaaltje als een klein aantal sferoïden voldoende is voor het experiment. Snijd bij het overbrengen van grote sferoïden het uiteinde van de pipetpunt af om ervoor te zorgen dat er geen schade ontstaat tijdens het pipetteren.
4. Laat de injectieflacon maximaal 5 minuten in een verticale positie staan om de sferoïden op de bodem van de injectieflacon te laten bezinken en een zichtbare korrel te vormen.
5. Verwijder de media uit de buis, laat de sferoïden ongemoeid en suspendeer ze voorzichtig in een voldoende hoeveelheid verse cultuur.
  OPMERKING: Voor het gemak van het hanteren van sferoïden kan de overdracht van sferoïden naar de beeldvormingsmedia in dit stadium ook in kleine batches worden gedaan; Zie de stappen 2.1.7 en 2.1.8. Sferoïden uit de verschillende experimentele groepen moeten gelijk worden behandeld, omdat de samenstelling van de media en de preconditioneringstijd van de media hun metabolisme kunnen beïnvloeden.
6. Terwijl de sferoïden drijven, brengt u een gelijk volume sferoïde suspensie over per putje van de microscopieschaal.
7. Incubeer sferoïden gedurende 1-2 uur bij 37 °C in een CO₂ -incubator om ervoor te zorgen dat ze aan het oppervlak van de microscopieschaal/put worden bevestigd. Ga voor beeldvorming verder met stap 2.1.9. Voor het kleuren van sferoïden met extra sondes gaat u verder met stap 2.1.8.
  OPMERKING: De snelheid van celmigratie van de 3D-sferoïde naar de 2D-oppervlakte-interface is een functie van de tijd. Om verlies van 3D-organisatie te voorkomen, moet de incubatietijd worden geoptimaliseerd met betrekking tot het celtype, het type oppervlaktecoating en het ontwerp van het experiment. HCT116 heeft bijvoorbeeld, afhankelijk van de sferoïde grootte, ten minste 2 uur nodig voor een goede sferoïde hechting aan het met collageen IV/poly-D-lysine gecoate oppervlak, terwijl hDPSC-bevestiging en migratie naar 2D-interface extreem snel is, wat leidt tot verlies van 3D-organisatie in 1-2 uur. Om te voorkomen dat '2D-sferoïden' worden afgebeeld als gevolg van overmatige verspreiding, worden niet-gecoate glasoppervlakken gebruikt met de verminderde incubatietijd.
8. Voeg fluorescentiesonde(n) in aanbevolen of empirisch geoptimaliseerde concentraties toe aan een bekend volume sferoïde suspensie. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C CO₂ -incubator voorafgaand aan de beeldvorming.
  OPMERKING: Gebruik voor de bepaling van levend/dood propidiumjodide en Calceïne Green-AM in een standaard eindconcentratie van 1 μg/ml. Om het toxische effect van propidiumjodidekleuring op iPSC-embryoïde lichamen te voorkomen, was de uiteindelijke propidiumjodideconcentratie 0,5 μg/ml. De laadtijd van de sonde kan worden verlengd als de diffusie van de sonde niet efficiënt is vanwege de grote sferoïde grootte. De laadtijd moet altijd worden beschouwd als een onderdeel van de totale incubatietijd die nodig is voor de bevestiging van sferoïde aan het oppervlak. Als er meer tijd nodig is voor de hechting van sferoïden, moet de kleuringsprocedure aan het einde van deze periode worden geregeld. Houd er rekening mee dat een langere incubatietijd kan leiden tot het verlies van 3D-organisatie.
9. Verwijder celkweekmedia of media die fluorescerende sondes bevatten en vervang deze door een benodigde hoeveelheid beeldvormingsmedia. Om ervoor te zorgen dat er geen mediafluorescentieachtergrond in de weg staat van sferoïde beeldvorming, herhaalt u de media-uitwisselingsstap (wassen) tot 5 keer.
  OPMERKING: Om verwijdering van sferoïden tijdens mediawisseling te voorkomen, wordt aanbevolen om media voorzichtig op te zuigen met een pipet van 200 μL vanaf de randen van de microscopieschalen en de toevoeging van media aan de muur of zijwaarts in de microscopieschaal uit te voeren.
10. Ga direct verder met stap 2.2.1 van het beeldvormingsprotocol.
  OPMERKING: Een te lange pauze tussen de voorbereiding op de beeldvorming en de daadwerkelijke beeldvormingsverwerving kan het celmetabolisme beïnvloeden (bijv. via een veranderde mediumsamenstelling), de levensvatbaarheid (sommige fluorescerende sondes die worden gebruikt voor eindpuntanalyse hebben toxische effecten, die de celdood na een lange incubatietijd kunnen stimuleren) en kan leiden tot een verlies van 3D-organisatie. Als meerdere groepen sferoïden of experimentele omstandigheden moeten worden vergeleken, moet het experimentele ontwerp dienovereenkomstig worden ontwikkeld om de timing van de behandeling, preconditionering en beeldvormingsprocedures zo gelijk mogelijk te houden tussen de geanalyseerde groepen.
Acquisitie van afbeeldingen
OPMERKING: Het protocol beschrijft de multiparametrische beeldvorming van levende sferoïden met behulp van de Stellaris 8 Falcon (Leica) confocale microscoop en Leica Application Suite X (LAS X) softwareversie 4.7. Er zijn echter slechts kleine aanpassingen nodig om een dergelijke analyse op alternatieve microscopieplatforms uit te voeren.
1. Schakel de temperatuurklimaatregeleenheid 30-60 minuten voor de beeldvorming in. Stel de gewenste ventilatiesnelheid en temperatuur in (35-37 °C).
  NOTITIE: Als naast de temperatuurregeling ook de gasconcentratie (bijv. CO₂ of O₂) tijdens de beeldvorming moet worden gecontroleerd, moeten de bijbehorende apparaten ook van tevoren worden gestart om de noodzakelijke omstandigheden vóór de beeldvorming te bereiken.
2. Schakel de microscoop en aangesloten apparaten in (d.w.z. WLL-laser, computer, waterpomp voor het wateronderdompelingsobjectief en andere werkende elektronische blokken). Start de microscoopbesturingssoftware (bijv. LAS X Machine Mode of Machine Mode with Environmental Control) die is voorzien van de exacte microscoopopstelling en initialiseer de objectobjectiefkalibratie.
3. Kies het gewenste objectief in de software en breng indien nodig de immersievloeistof aan.
  OPMERKING: Voor live microscopie wordt aanbevolen om water- of glycerolonderdompelingsobjectieven te gebruiken met voldoende ('lange') werkafstand, bijv. HC Fluotar L 25x/0,95 W VIS IR (2,4 mm werkafstand), HC PL Apo 40x/1,25 GLYC (0,35 mm werkafstand) of ten minste NA = 0,4 of hoger voor de luchtobjectieven. De keuze van de vergroting en de werkafstand hangt af van de aard en grootte van het afgebeelde monster en de gemeten fluorescentiesignalen (helderheid, kwantumopbrengst, kleuringsefficiëntie, zie bijv. bespreking van kleurstoffen en nanodeeltjes⁵³). Grote objecten (sferoïden of organoïden, >500 μm groot), 'bioreactor'- of microfluïdische chips vereisen objectieven met een lange werkafstand en een lagere vergroting, terwijl analyse van individuele cellen of celorganellen een hoge vergroting vereist, vaak bereikt via 'mozaïek'-beeldvorming.
4. Zet de microscopieschaal met sferoïden op het podium. Pas de focus aan en zoek een object/interessegebied (ROI).
  OPMERKING: Als er kleine, zwak fluorescerende, slecht contrast of zeldzame objecten moeten worden gevonden en het vinden van de focus moeilijk is, wordt aanbevolen om vooraf scherp te stellen op de wanden van de microscopieschaal en het oppervlak voor het interessante object te 'screenen' door middel van serpentijn, beginnend bij een van de hoeken van de put.
5. Kies het venster Project openen en klik op het bijbehorende pictogram Een nieuw project maken. Geef een standaardnaam (bijvoorbeeld beginnend met "YY-MM-DD+ beschrijving") aan het onderzoeksprojectbestand. Tijdens de imaging worden alle geproduceerde afbeeldingen automatisch opgeslagen in het gemaakte project .lif-bestand .
6. Open het venster Acquisitie . Stel de excitatiegolflengte van de witlichtlaser (WLL) en het vereiste bereik van hybride of resonantiescandetectoren (type HyD S, HyD X of HyD R) in op basis van de bekende spectrale eigenschappen van de gemeten fluorescentie (excitatie/absorptie en emissiespectra). Kies de scantypen Lijn of Frame .
  OPMERKING: Voor de meeste in de handel verkrijgbare fluorescerende kleurstoffen zijn de spectrale eigenschappen te vinden (of toegevoegd) in het LAS X Dye Assistant-pakket. Kies de detector met het juiste spectra-gevoeligheidsbereik dat compatibel is met de spectrale eigenschappen van de sonde en, in het geval van FLIM, compatibel is met het tellen van fotonen (d.w.z. HyD X of HyD R). Voor multiparametrische beeldvorming stelt u de WLL in op meerdere excitatieposities (bijv. voor gelijktijdige beeldvorming van FAD/Flavins en twee fluorescentiekanalen van de ratiometrische MMIR1 O_2-sonde- referentie en gevoelig, kunnen de excitatie-/emissie-instellingen 460 nm/510-590 nm HyD X1 en 614 nm/631-690 HyD X3 en 724-800 nm HyD R zijn, dienovereenkomstig in een of twee opeenvolgende scansequenties). Het is belangrijk om de juiste detector toe te wijzen om de emissie te verzamelen, aangezien detectoren verschillende spectrale gevoeligheid kunnen hebben⁵⁴.
7. (Optioneel voor FLIM) Kies in het venster Acquisitie de FLIM-modus om beeldvorming uit te voeren in combinatie met het tellen van fotonen (vervalverzameling). Onmiddellijk wordt een extra 'FLIM-module in LAS X-software' geopend om door FLIM-gegevens te navigeren en deze te analyseren.
8. (Optioneel voor FLIM) Kies de WLL-pulsherhalingsfrequentie op basis van de verwachte gemiddelde levensduur van fluorofoor.
  NOTITIE: De frequentie van de laserpuls moet worden aangepast om het volledige fluorescentieverval op te vangen. Dit kan worden gedaan met behulp van een pulskiezerfunctie die op de microscoop is geïnstalleerd. De overlapping van het fluorescentieverval met de laserpuls zal leiden tot een verkorting van de geschatte fluorescentielevensduur. Het wordt aanbevolen om pulsintervallen te hebben die 4-5 keer langer zijn dan de verwachte gemiddelde fluorescentielevensduur (bijv. 25 ns/40 MHz voor een levensduur tot 5 ns). Veel gepulseerde lasers hebben een vaste herhalingsfrequentie van 80 MHz (ideaal alleen voor een bereik van maximaal 2-3 ns). Dit is belangrijk voor het kiezen van de juiste fluoroforen voor het experiment.
9. Start de voorbeeldweergave met behulp van de FAST LIVE-modus en pas de fijne scherpstelling van het beeldobject aan op een interessant gedeelte.
  LET OP: Volg strikt de laserveiligheidsregels. Houd altijd rekening met de veiligheidsregels voor lasers en wacht tot de beeldvorming is gestopt voordat u het transmissielicht inschakelt, in het oculair of naar het monster kijkt.
  OPMERKING: In de FAST LIVE-modus wordt automatisch een high-speed scan van 600 Hz (komt overeen met een maximale framesnelheid van 4,43/s als de bidirectionele X-scanmodus wordt gebruikt) en een resolutie van 256 x 256 pixels automatisch op het beeld toegepast om de fluorescentie te beschermen tegen fotobleken. Open het gaatje (bijv. tot 3-4 AE) en/of verhoog de laserintensiteit als het fluorescentiesignaal te zwak is om op het object scherp te stellen. Vermijd onvolledige verzameling van verval.
10. (Optioneel voor FLIM) Door te kijken naar een histogram met pixelintensiteit dat tijdens de beeldvorming in een FLIM-modulevenster (Live-modus ) verschijnt, past u de juiste laserintensiteit/pinholegrootte en resolutie aan om de telsnelheid ~1 foton/laserpulslimiet (rode lijn) te bereiken. Ga niet significant hoger dan 1 om het risico op een pile-up-effect uit te sluiten. Pas indien nodig de herhalingsfrequentie van de WLL-puls aan om een volledige vervalverzameling in een vervalvenster te hebben (zie stap 2.2.8 om onvolledige vervalverzameling te voorkomen).
  OPMERKING: Als het aantal fotonen (intensiteit) niet voldoende is om een betrouwbaar verval te reconstrueren voor passende analyse of fasediagramwolk, pas dan meerdere scanherhalingen toe (frames of lijnen, of stel de scantijd in), verhoog de laserintensiteit en/of offer de resolutie op (gescande ROI-grootte). Houd er rekening mee dat voor het verlagen van de laserherhalingssnelheid meer fotonen moeten worden verzameld voor een betrouwbare vervalreconstructie, en dat een extra correctie van de beeldvormingsparameters nodig kan zijn. Wees je bewust van de mogelijke impact van intens licht en lange continue verlichting op de levensvatbaarheid en het metabolisme van cellen⁵⁵. De negatieve impact op de levensvatbaarheid en het metabolisme kan in elk individueel geval anders zijn, afhankelijk van de intensiteit, duur en golflengte van het excitatielicht, evenals de beeldvormingsmodaliteit (bijv. confocale weergave van één foton versus beeldvorming van meerdere fotonen). Pas de beeldvormingsparameters dienovereenkomstig aan en, indien nodig, controleer de levensvatbaarheid/dood van de cel door Calcein Green-AM of de intensiteit van propidiumjodide in pilotexperimenten⁵⁶. Waar mogelijk moeten verdere optimalisaties van het kleuringsprotocol voor fluorescentiesondes worden overwogen om een adequaat fluorescentiesignaal te bereiken tijdens live microscopie.
11. (Optioneel voor 3D z-stack) Stel in Fast Live de coördinaten in, scan de richting en wijs ze toe aan Begin en Einde in het Z-stack-venster (XYZ-scanmodus). Kies de grootte van de Z-stappen of het aantal stappen.
  OPMERKING: Hoewel de software automatisch het 'optimale' aantal stappen berekent, op basis van de gebruikte resolutie en scanparameters, kan live 3D-reconstructie normaal gesproken een kleiner aantal stappen vereisen om snelle acquisitie te bereiken, bijv. 1-2 μm stapgrootte, 50-100 μm stapelgrootte, bidirectioneel scannen, waarvoor 2-3 minuten van de totale scantijd nodig is. Houd er rekening mee dat de subcellulaire organellen, cellen en het 3D-celmodel ook kunnen bewegen tijdens metingen. Bovendien kan vanwege de lichtpenetratiediepte en verstrooiingslimieten doorgaans slechts een scandiepte van 50-100 μm op confocale FLIM worden bereikt.
12. Wanneer alle benodigde instellingen zijn toegepast, begint u met beeldvorming.
13. Geef de afbeelding een passende naam.
14. Zoek naar het volgende beeldvormingsobject in de transmissielichtmodus en herhaal de beeldvormingsprocedure met eerder geoptimaliseerde beeldvormingsinstellingen (stappen 2.2.8-2.2.12).
  OPMERKING: Voor de op intensiteit gebaseerde vergelijking of intensiteitsverhoudingsanalyse (bijv. MMIR O 2-sondegebaseerde oxygenatieanalyse), moet u altijd dezelfde beeldvormingsinstellingen aanhouden voor alle geanalyseerde objecten (vergroting en objectieflenstype, laserintensiteit, vermogen en pulsfrequentie, excitatiegolflengte, detectorbereik, gaatje, scansnelheid, pixelverblijftijd en resolutie). Aangezien de levensduur van de fluorescentie echter niet afhankelijk is van de fluorescentie-intensiteit en vereist dat een passend aantal fotonen wordt verzameld voor een betrouwbare berekening, kunnen de FLIM-beeldvormingsparameters in de loop van het experiment opnieuw worden aangepast om de verzamelde fotonenaantallen vergelijkbaar te houden tussen verschillende behandelingen of experimentele omstandigheden. Daarom moeten voor multiparametrische analyse, waarbij analyse op basis van intensiteit en analyse op basis van fluorescentielevensduur beide nodig zijn, geoptimaliseerde universele beeldvormingsinstellingen worden toegepast voor alle objecten in de vergeleken experimentele groepen. Voor een "FLIM-only"-vergelijking is het mogelijk om beelden te vergelijken die zijn verkregen met iets andere beeldvormingsinstellingen, aangezien de LAS X-software voorziet in de berekening van de IRF voor individuele beeldmeting⁴². Voor FLIM-fittinganalyse buiten LAS X (bijv. FLIMfit⁴⁵) moet echter de instrumentresponsfunctie (IRF) worden gemeten voor elke verschillende beeldvormingstoestand, omdat deze niet kan worden geëxporteerd vanuit de beeldvormingssoftware. Voor de eenvoud van het experimentele ontwerp en de werklast wordt daarom aanbevolen om dezelfde beeldvormingsinstellingen toe te passen voor alle afbeeldingen in de dataset. Vervolgens kunnen de overeenkomstige IRF-metingen worden uitgevoerd met behulp van gedoofde of snelle fluorescentie-levenslange fluoroforen (binnen het ps-bereik) met de emissie-eigenschappen van het gemeten spectrale kanaal 57,58,59, door luminescentie van gouden nanodeeltjes ⁶⁰ of door signaal van de tweede harmonische generatie voor multifoton FLIM⁶¹. In de LAS X-software kunnen de eerder geoptimaliseerde beeldvormingsparameters voor een nieuw project worden geladen door met de rechtermuisknop op het gewenste bestand te klikken en Afbeeldingsinstellingen toepassen te kiezen.
15. Wanneer de beeldvormingssessie is voltooid, slaat u het beeldvormingsproject op. Om de beeldvormingssessie af te ronden, verwijdert u het monster uit de microscopiefase en reinigt u het objectief van de immersievloeistof (indien gebruikt) volgens de standaardprocedure die in de beeldvormingsfaciliteit is geïmplementeerd. Sluit het project en de software. Schakel de microscoop, lasers en alle aangesloten apparaten uit.
16. Ga verder met de analyse van beeldvormingsgegevens (stap 2.3).
NAD(P)H/FAD-FLIM fasor-beeldverwerking met LAS X FLIM-module en FIJI
OPMERKING: Het protocol beschrijft een analyse van de fluorescentielevensduur van afgebeelde sferoïden voor frequentiedomeingegevens op voorbeelden van NAD(P)H en FAD/Flavins autofluorescentie FLIM. NAD(P)H-autofluorescentiemeting werd een gouden standaard voor metabole analyse, waarbij componenten voor de korte en langere NAD(P)H-autofluorescentielevensduur worden geassocieerd met respectievelijk glycolyse of oxidatieve fosforylering (OxPhos). Dit kan worden geanalyseerd door de verschuiving op een fasorplot langs het metabole traject naar de gemeten normen van vrije-NAD(P)H of eiwitgebonden NAD(P)H³¹^,⁶². Om het traject van de metabolische verschuiving te analyseren en om de positie van fasorwolken te vergelijken (zie de OPMERKING onder stap 2.3.6) op een plot tussen experimentele groepen, werd een vereenvoudigde analyse van fasorcoördinaten geïmplementeerd, gebaseerd op de berekening van het geometrische middelpunt (centroïde) van de fasorwolk²⁹. Het beschreven protocol demonstreert de berekening van zwaartepuntcoördinaten in FIJI en het meten van de afstand tussen twee punten op een fasorplot met behulp van coördinaten (bijv. de afstand van een zwaartepunt van de sferoïde NAD(P)H autofluorescentiefasorwolk tot een "vrij NAD(P)H" theoretisch punt). Op dezelfde manier kunnen FAD en andere autofluorescentiesignalen worden geanalyseerd. Een dataset 1 met .lif (LAS X-software vereist) of .ptu Bestandsformaten voor het leren van deze procedure wordt verstrekt (Aanvullend dossier 2, aanvullend dossier 3, aanvullend dossier 4, aanvullend dossier 5, aanvullend dossier 6, aanvullend dossier 7, aanvullend dossier 8, aanvullend dossier 9, en Aanvullend bestand 10).
1. Open de FLIM-module in LAS X, selecteer Project openen en laad het sferoïde afbeeldingsbestand (.lif) voor autofluorescentie-NAD(P)H/FAD-analyse.
  OPMERKING: Vanwege mogelijke bugs en tussentijds gegevensverlies in de FLIM-module, gebruik een kopie van het originele sferoïde afbeeldingsbestand (.lif) voor NAD(P)H/FAD-analyse, waarbij het onbewerkte bestand ongewijzigd blijft.
2. Selecteer een enkele afbeelding en navigeer naar de FLIM-analyse-interface. Klik op Phasor om de fasorplot te openen en de fasoranalysemodus te activeren. Pas een filter toe (Mediaan of Wavelet) en stel Drempel in om de ruis te minimaliseren en de zichtbaarheid van de gegevens voor alle faseanalyses te verbeteren. Kies de harmonischen. Voor analyse van de metabole verschuiving op basis van NAD(P)H-gegevens gaat u verder met de stappen 2.3.3-2.3.5. Voor de algemene vergelijking van de fasediagrammen gaat u verder vanaf stap 2.3.6.
  OPMERKING: Pas analyse-instellingen (filtertype, harmonischen, drempelwaarde, binning en fasor-ROI's) gelijk toe op alle afbeeldingen in een vergeleken gegevensset.
3. (Optioneel voor NAD(P)H-analyse) Kies een afbeelding die betrekking heeft op een gegevensset en gebruik de optie Draw Ratio Cursor for Two Components om de positie van 0,45 ns op een universele cirkel van een standaard fasorplotruimte nauwkeurig te bepalen. Deze positie zal worden toegekend aan een gemiddelde fluorescentielevensduur van een zuivere homogene oplossing van vrije-NAD(P)H, die normaal gesproken dicht bij het mono-exponentiële verval⁶² ligt.
  OPMERKING: Free-NADH en free-NAD(P)H hebben vergelijkbare spectrale eigenschappen en vergelijkbare waarden van de fluorescentielevensduur in wateroplossing, met twee componenten met een korte levensduur, 0.3 ns en 0.7 ns⁶³. Dus, voor de eenvoud van de op fasor gebaseerde analyse en vanwege een klein verschil tussen levensduurcomponenten, wordt hun fluorescentieverval geaccepteerd als mono-exponentieel, wat toewijzing van de fasorwolk op een universele cirkel mogelijk maakt. De referentiegemiddelde levensduur van een vrije-NAD(P)H-vorm kan ook worden gemeten en uitgezet in een fasorruimte voor een vergelijkbare analyse. De referentielevensduur is gekozen op basis van de literatuur⁶²; merk op dat in andere bronnen een iets andere waarde van een vrije-NAD(P)H in oplossing kan worden gevonden (0,4 ns⁶⁴).
4. (Optioneel voor NAD(P)H-analyse) Exporteer de fasediagram met de toegewezen vrije NAD(P)H-levensduur (zie stap 2.3.3) door met de rechtermuisknop op de grafiek te klikken en Gegevens exporteren te selecteren. Exporteer de faseplot als een bestand in .tiff-indeling naar een aangewezen opslagmap.
  OPMERKING: De oorspronkelijke pixelgrootte van de geëxporteerde faseplotafbeelding van de LAS X FLIM-module is altijd 1024 x 600 pixels. Als er andere software wordt gebruikt voor het exporteren van gegevens en pre-analyse, zorg er dan voor dat alle fasediagramafbeeldingen worden geëxporteerd met dezelfde grootte en resolutie.
5. Als u sferoïde-gerelateerde fasewolken wilt exporteren, gebruikt u de tool Cursor-teken in de LAS X FLIM-module om de sferoïde ROI op de afbeelding te kiezen. Exporteer gegenereerde fasediagram zoals beschreven in stap 2.3.4.
  OPMERKING: De overeenkomstige g en s (vergelijkbaar met x en y) coördinaten van de fasorruimte worden toegewezen aan elke pixel van de gekozen ROI, volgens hun levensduur, getransformeerd in een frequentiedomeindataset^64,65. Het cluster van pixels met vergelijkbare waarden van t_f(faselevensduur) en t_m (modulatielevensduur) vormt een wolkenpatroon (fasewolk) op een plot, waarbij kleurcodering (met een bereik van diepblauw tot rood) de overvloed aan levensduurwaarden weerspiegelt. Door de positie van de wolk op een universele cirkel of binnenin kunnen de mono- of multi-exponentiële vervalsen worden onderscheiden. Sommige meetmedia vertonen een sterke (auto)fluorescentie, wat leidt tot het verschijnen van een overeenkomstige wolk op een fasediagram, die niet eenvoudig kan worden verwijderd met de intensiteitsdrempel. Dit patroon is van invloed op de berekening van de zwaartepuntcoördinaten en moet worden uitgesloten van de geëxporteerde fasediagram. Door te werken met de sferoïde ROI kunnen de niet-gerelateerde pixels worden uitgesloten van verdere fase-analyse.
6. Herhaal de exportprocedure voor de fasediagram voor alle sferoïde ROI's in een gegevensset (zie stappen 2.3.4 en 2.3.6). Controleer bovendien de geëxporteerde set van .tiff afbeeldingen om de volledige set gegevens voor verdere vergelijkende analyse te garanderen en zorg ervoor dat alle geëxporteerde afbeeldingen dezelfde pixelgrootte hebben (zie OPMERKING in stap 2.3.4).
  OPMERKING: In dit stadium van het protocol moet de beeldset een faseor bevatten met de vrije-NAD(P)H-locatie (op basis van literatuur of empirisch verkregen gegevens) en alle sferoïde ROI (of alternatieve ROI-patronen indien nodig voor de specifieke analyse) fasorplots. Vanaf deze stap wordt verdere analyse gedaan in FIJI en daarna in een spreadsheet. Gebruik het venster Analysetool om de optie Schaal in FIJI in te stellen en ervoor te zorgen dat alle faseplotafbeeldingen zijn gekalibreerd met hetzelfde eenheidstype, bijvoorbeeld alleen in pixels. Als dit niet het geval is, stelt u de eenheidslengte in in het venster Schaal instellen voor de gekozen (bijv. voor een op pixels gebaseerde schaal, plaatst u 1 in het veld Afstand in pixels en stelt u de lengte-eenheid in op Pixel). Meet voor verdere vergelijking alle geëxporteerde gegevens met behulp van hetzelfde eenheidstype.
7. (Optioneel voor NAD(P)H-analyse) Bepaal de pixelpuntpositie van een gemiddelde fluorescentielevensduur van een vrije NAD(P)H op de bijbehorende geëxporteerde fasorplotafbeelding (zie stap 2.3.3): Open de fasorafbeelding met FIJI, vergroot de afbeelding om met een pixelresolutie duidelijk het snijpunt tussen de universele halve cirkel en de lijn Ratiocursor voor twee componenten te visualiseren; gebruik de tool Rechthoek ROI om het snijpunt te selecteren.
  OPMERKING: Zorg ervoor dat de rechthoekige selectie een klein gebied rond het snijpunt is voor een nauwkeurige bepaling van de coördinaten in de volgende stap (stap 2.3.9).
8. (Optioneel voor NAD(P)H-analyse) Open de tool Analyseren , kies het venster Metingen instellen en selecteer Zwaartepunt als meetparameter. Klik op Meten in het venster van de analysetool om de zwaartepuntcoördinaten van het vrije-NAD(P)H-referentiepunt te bepalen. Exporteer deze coördinaten naar een spreadsheet.
  OPMERKING: Vrije NAD(P)H-coördinaten zullen worden gebruikt als referentiepunt om de afstanden van dit punt te vergelijken met de positie van de sferoïde fasorwolk in een dataset (de manier om de metabole verschuiving tussen glycolyse en OxPhos te karakteriseren in NAD(P)H FLIM autofluorescentieanalyse)
9. Open met FIJI de afbeelding van de sferoïde fasorwolk. Open de tool Afbeeldingsvenster , kies Aanpassen en selecteer Kleurdrempel in de werkbalk. Selecteer de drempelmethode van uw keuze (bijv. Otsu) en stel de Tintwaarde en Helderheidswaarde in om de parameters voor de selectie van een fasewolkonderdeel met de meest voorkomende pixelcoördinaten te verfijnen. Klik op Selecteren om het clustergebied te definiëren.
  OPMERKING: Houd dezelfde drempelparameters aan voor alle faseplotafbeeldingen, die moeten worden geanalyseerd. Voor de gepresenteerde NAD(P)H-FLIM-gegevens is de drempelmethode Otsu met ingestelde Hue-waarde 9 en helderheidswaarde 160 gekozen en toegepast op alle fase-afbeeldingen. Als alternatief kan het geselecteerde gebied worden gekopieerd naar ROI Manager (volg het pad Bewerken > Selectie > Toevoegen aan Manager) om een bibliotheek met fase-ROI's te maken voor verdere analyse.
10. Bereken de zwaartepuntcoördinaten van het geselecteerde gebied volgens de procedure die is beschreven in stap 2.3.9 terwijl u de selectie behoudt. Exporteer deze coördinaten naar het spreadsheetbestand.
11. Herhaal stap 2.3.9 en 2.3.10 om de coördinaten van het zwaartepunt te bepalen voor alle ROI-faseafbeeldingen om een gegevensset in de spreadsheet te maken.
  OPMERKING: Het gebruik van de ROI Manager-ROI-bibliotheek helpt om de ROI-analyse te vereenvoudigen en te organiseren (zie stap 2.3.10)
12. (Optioneel voor NAD(P)H-analyse) Open de spreadsheet met geëxporteerde referentievrije-NAD(P)H en sferoïde ROI-coördinaten van verschillende vergelijkingsgroepen. Bereken de afstand tussen elk afzonderlijk zwaartepunt van de sferoïde fasor tot de referentiepositie van vrije NAD(P)H met behulp van bepaalde coördinaten en de volgende vergelijking:
  
  Waarbij X_c en Y_c zwaartepuntcoördinaten zijn, zijn X_f en Y_fde referentiecoördinaten.
  OPMERKING: Toepassing van de zwaartepuntparameter voor het bepalen van de verschuiving naar de referentielevensduur is alleen geschikt als alle zwaartepunten uit een dataset op dezelfde lineaire baan naar het referentiepunt liggen. Om dit te controleren, moeten alle zwaartepuntpunten uit de dataset samen met het referentiepunt in dezelfde coördinatenruimte worden uitgezet en moet de lineaire trenduitlijning worden uitgevoerd. Als de R 2-coëfficiënt van de lineaire trendlijn die door alle punten wordt getrokken dicht bij 1 ligt (bijv. R² is 0,8-0,99), wordt aangenomen dat de afstandsanalyse geschikt is.
13. Organiseer alle gegevens dienovereenkomstig voor vergelijking en voer statistische analyses uit met behulp van overeenkomstige software (bijv. Origin, MatLab). Kies de juiste statistische test op basis van de kenmerken van de dataset (normaliteit van de verdeling, aantal statistische eenheden, enz.).
  OPMERKING: Vergelijk voor NAD(P)H-analyse de afstandswaarden om de metabolische verschuiving te karakteriseren, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Voor vergelijking van eventuele fasorplots tussen experimentele groepen, voert u de vergelijking uit van de coördinaten van de ROI-fasorwolkenzwaartepunten.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De juiste sferoïde vormingsmethode kiezen
De geselecteerde sferoïde vormingsmethode kan een grote invloed hebben op de grootte, vorm, celdichtheid, levensvatbaarheid en gevoeligheid voor geneesmiddelen van sferoïden (Figuur 2). Eerder werden de effecten van meerdere high-throughput (SphericalPlate 5D, in het lab gemaakte micromallen en MicroTissue malls) en de 'medium throughput' lage hechtingsmethoden (Biofloat en met lipide gecoate 96-well platen) vergeleken op de levensvatbaarheid en oxygenatie van sferoïden²⁹.

Hier resulteren verschillende vormingsmethoden in sferoïden van verschillende groottes, zelfs met dezelfde beginconcentratie van 500 cellen/sferoïde. HCT116-sferoïden gevormd in platen met 96 putjes met een lage aanhechting waren significant groter in vergelijking met methoden met een hoge doorvoer na 5 dagen na vorming (Figuur 2 en Tabel 2). Bovendien leidden methoden met een lage hechting tot de duidelijke ontwikkeling van een necrotische kern die werd gedetecteerd door de propidiumjodidekleuring (rood), terwijl sferoïden gegenereerd met andere methoden (MicroTissue, in het laboratorium gemaakte mallen en sferische plaat 5D) de diffuse verdeling van dode cellen over het sferoïde lichaam aantoonden (Figuur 2A). Dit verschil in cellevensvatbaarheid over het volume van de sferoïde kan ook van invloed zijn op de zuurstofdiffusie door de media, die op zijn beurt kan worden beïnvloed door O₂ partiële druk, verbruikssnelheid, temperatuur en O₂ oplosbaarheid. Bovendien raken bij methoden met een hoge doorvoer voedingsstoffen uitgeput en hopen afvalproducten zich sneller op omdat een groter aantal sferoïden zich binnen hetzelfde volume bevindt en daarom frequentere media-uitwisseling vereist (Figuur 2A).

De algehele sferoïde oxygenatie werd gemeten met behulp van de onlangs gekarakteriseerde en gevalideerde MMIR1-sonde²⁹, met een gedetailleerd protocol dat eerder werd gerapporteerd²⁵. Oxygenatie kon alleen afzonderlijk worden vergeleken tussen de high-throughput-methode en de low-attachment-methode (figuur 2B), omdat de signaal-ruisverhouding bij alle vergeleken sferoïde vormingsmethoden anders is. De sferische plaat 5D-sferoïden vertoonden een lagere algehele oxygenatie in vergelijking met de MicroTissue (P-waarde = 0,0697) en de in het laboratorium gemaakte micromalls (P-waarde = 0,0005) (Figuur 2C). Sferoïden geproduceerd met de sferische plaat 5D worden gekweekt op een grotere afstand van het oppervlak van de media-luchtinterface in vergelijking met de agarose-vormmethoden, waardoor een langzamere_O2-afgifte in de statische cultuur wordt veroorzaakt. Deze hypothese is geldig omdat de oxygenatiewaarden tussen beide lage aanhechtingsplaten en, bovendien, tussen beide agaroseschimmelmethoden statistisch vergelijkbaar zijn (Figuur 2D).

figure-results-1
Figuur 2: Sferoïde vormingsmethoden beïnvloeden de morfologie, grootte, levensvatbaarheid en oxygenatie. (A) HCT116-sferoïden (initiële zaaidichtheid 500 cellen) werden gedurende 5 dagen voorafgaand aan 1 uur lange kleuring gekweekt met propidiumjodide (celnecrose, rood, 1 μg/ml) en Calceïne Green-AM (levensvatbare cellen, groen, 1 μg/ml). Methoden voor het vormen van lage hechtingen produceren grotere sferoïden met een necrotische kern (rood). De schaalbalk is 100 μm. (B) Oxygenatie in HCT116-sferoïden (initiële zaaiing van 500 cellen met toevoeging van 20 μg/ml MMIR1 tijdens sferoïde vorming, 6 dagen) geproduceerd door verschillende methoden toonde meer zuurstofrijke sferoïden met de MicroTissue en in het laboratorium gemaakte micromallen dan de SphericalPlate 5D. (C) Totale sferoïde oxygenatie berekend door de verhoudingsmetingen. (D) Sferoïden grootte in oppervlakte vierkant na 5 dagen. De resultaten tonen het gemiddelde ± SEM van 6-16 sferoïden. 5D = SphericalPlate 5D, MM = Micromold methode, MT = MicroTissue methode. P-waarde < 0,001 en ****P-waarde <0,0001 Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Vorming methode	Aantal sferoïden per putje	Totale hoeveelheid cellen gezaaid per putje	Oppervlakte vierkant (μm²)
Microweefsel	81	40.500 cellen/190 μl	112.558 ± 15.702
In het laboratorium gemaakte microwells	1859	794.500 cellen / ml	53.460 ± 8.332
Bolvormige plaat 5D	750	375.000 cellen / ml	44.048 ± 7.259
Lipiduur	1	500 / 200 μL	257.148 ± 28.132
Bio drijven	1	500 / 200 μL	254.475 ± 21365

Tabel 2: Verschillende methoden voor de vorming van sferoïden leiden tot verschillen in de grootte van de sferoïde, gemeten per vierkant gebied.

Bij het selecteren van een specifieke sferoïde vormingsmethode voor de experimenten, moet er rekening mee worden gehouden dat de toevoeging van nanodeeltjes de vorm van de sferoïde kan beïnvloeden. Bij gebruik van de op lipiden gebaseerde coating met microwells met ronde bodem kan sondeprecipitatie optreden, wat leidt tot de vorming van "satellietsferoïden" of niet-cirkelvormige sferoïden (Figuur 3). De toevoeging van de O_2-sonde aan de commerciële Biofloat-plaat resulteert in een niet-compacte sferoïde periferie, wat de mogelijke interferentie van de nanodeeltjes met de microplaatcoating suggereert. De morfologie van de sferoïden kan ook worden beïnvloed door het stof dat aan de pipetpunten vastzit. Cellen in suspensie kunnen aan het stof blijven kleven, waardoor de vorm wordt beïnvloed. Daarom wordt aanbevolen om hervulbare pipetpunten te gebruiken die al in een rekje zijn meegeleverd.

figure-results-2
Figuur 3: Transmissie lichtmicroscopie beelden met voorbeelden van niet-ideale sferoïde vorming. Onjuiste opslag van nanodeeltjes kan sondeprecipitatie veroorzaken, waardoor de vorming van sferoïde deeltjes wordt verstoord. Voorbeelden van interferentie van sonde en stof. De schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het is duidelijk dat sferoïde vormingsmethoden de grootte, morfologie en levensvatbaarheid van de sferoïde beïnvloeden en leiden tot verschillen in hun oxygenatie. De methode met hoge doorvoer met agarose-mallen (bijv. in de handel verkrijgbaar, zoals MicroTissue-mal) is compatibel met de meeste experimenten. Het resulteert in een meer reproduceerbare vorm, induceert geen neerslag van nanodeeltjes, is herbruikbaar en kan compatibel zijn met directe vervolgmicroscopie. Voor grote sferoïden (>800 μm) en langdurig kweken wordt echter de methode met lage hechting aanbevolen, omdat methoden met een hoge doorvoer frequente media-uitwisseling vereisen. In zo'n geval kan het probleem van de neerslag van nanodeeltjes en de invloed ervan op de vorming van sferoïden worden vermeden door de 2D-monolaagcultuur 's nachts vóór de vorming van sferoïde stoffen 's nachts voor te gaan (Figuur 4).

figure-results-3
Figuur 4: Voorgesteld algoritme voor het selecteren van de sferoïde vormingsmethode voor live fluorescentiemicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Multi-parameter FLIM van sferoïden NAD(P)H-beeldvorming via twee-foton FLIM-microscopie onthult metabole heterogeniteit in HCT116-sferoïden
NAD(P)H, een prominente autofluorescentiemarker in labelvrije metabole beeldvorming, toont een kortere levensduur voor glycolyse en een langere levensduur voor OxPhos, waardoor de ruimtelijke verdeling van metabole activiteit in 3D-modellen zoals sferoïden en organoïden kan worden ontcijferd³¹. Om de NAD(P)H-verdeling in HCT116-sferoïden gemakkelijk te analyseren, werd een op fasor gebaseerde kwantitatieve methode voor autofluorescentie NAD(P)H-analyse gebruikt, die glycolyse en oxidatieve fosforylering (OxPhos)-gekoppelde toestanden onthulde. Hoewel fluorescentie-intensiteitsbeelden van HCT116-sferoïden geen significante verschillen tussen sferoïden lieten zien, onthulde snelle FLIM-beeldvorming van NAD(P)H een duidelijk verschil binnen de sferoïde optische secties. In snelle FLIM-beelden werden sferoïden met een inwendig gebied met een kortere fluorescentielevensduur gemarkeerd met een witte cirkel, die dit identificeerde als een glycolytische kern (Figuur 5A). Bijgevolg werden de sferoïden verdeeld in twee groepen, de glycolytische kerngroep en de niet-glycolytische kerngroep, op basis van de aan- of afwezigheid van een glycolytische kern. Een op centroid gebaseerde fasoranalyse werd gebruikt om de verschillen tussen twee verschillende groepen statistisch te analyseren en de afstand te meten van het zwaartepunt van het pixelcluster tot het vrije NAD(P)H-punt. Zoals geïllustreerd in figuur 5B, was er een duidelijk verschil in pixelcluster tussen de glycolytische groep en de niet-glycolytische groep op de fasorplot. Om de afstand nauwkeurig te meten, werd het vrije NAD(P)H-punt op de fasediagram nauwkeurig gemarkeerd met behulp van de FLIM-module in de LAS X-software en vervolgens geëxporteerd naar de FIJI-software voor de bepaling van de exacte coördinaten. Vervolgens, volgens protocol 2.3, werden zwaartepuntcoördinaten gemeten in de faseplot van elke groep met behulp van FIJI-software. De afstand (D) van het zwaartepunt tot het vrije NAD(P)H-punt, met behulp van de stelling van Pythagoras, werd hierbij berekend door de analyse van NAD(P)H-profielen te vergemakkelijken om OxPhos-sferoïden en sferoïden met een glycolytische kern te onderscheiden. De resultaten, zoals weergegeven in de boxplot, tonen de significante afstandsverschillen tussen de glycolytische kernsferoïden en de niet-glycolytische kerngroep (***P-waarde < 0,001) (Figuur 5C). Dit resultaat kwam overeen met snelle FLIM-beeldvorming, wat aantoont dat deze fasoranalysemethode geschikt is voor kwantitatieve analyse van de NAD(P)H-divergentie van sferoïde populaties. Om te valideren of deze benadering van toepassing was om de afstand tussen de twee sferoïde groepen te vergelijken, werd bovendien een lineaire regressieanalyse uitgevoerd voor zwaartepunten van beide groepen en het vrije NAD(P)H-punt (Figuur 5D). Het resultaat toonde aan dat de zwaartepunten zijn uitgelijnd met vrije NAD(P)H, met een hoge correlatiecoëfficiënt (R² = 0,997), wat de haalbaarheid valideert van het vergelijken van de afstand om het NAD(P)H-verschil tussen sferoïde groepen af te leiden.

figure-results-4
Figuur 5: Fasoranalyse van HCT116-sferoïden gemaakt met behulp van laag-aanhechtingsplaten: glycolytische en niet-glycolytische kernen vergelijking van de NAD(P)H-verdeling via twee-foton FLIM. Acquisitieparameters: laserintensiteit: 15%, resolutie: 512 x 512 pixels, ex. 741 nm/em. 411-491 Nm. (A) De fluorescentie-intensiteit en snelle FLIM-beelden vertonen een NAD(P)H-verdeling in HCT116-sferoïden, waarbij sferoïden met glycolytische kern (links) worden onderscheiden van sferoïden zonder (rechts). De witte cirkel in het snelle FLIM-beeld toonde een korter levensduurgebied, wat een glycolytische kern definieerde. Initiële zaaidichtheid: 50 cellen (links) en 500 (rechts), incubatietijd: 6 dagen, schaalbalk: 50 μm. (B) De methodologie voor het meten van de afstand van het zwaartepunt van HCT116-sferoïden tot het vrije NAD(P)H-punt op fasorplots, met behulp van de LAS X FLIM-module en FIJI-software over twee verschillende sferoïde groepen (D: afstand). Voor HCT116-sferoïden werden een waveletfilter en drempelwaarde 10 gebruikt voor de fasorplot. (C) Boxplot met het verschil in afstand van het zwaartepunt tot het vrije NAD(P)H-punt, waarbij glycolytische kerngroepen en niet-glycolytische kerngroepen worden vergeleken (***P < 0,001). (D) Lineaire aanpassing van zwaartepunten van de fasorplot uit de glycolytische kern, niet-glycolytische kerngroepen en vrije NAD(P)H theoretische coördinaten toonde een nauwkeurige lineaire uitlijning aan met R² = 0,997, waardoor een directe vergelijking van het afstandsverschil tussen glycolytische kern en niet-glycolytische kernsferoïden mogelijk is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Meervoudige analyse van FAD-autofluorescentie en hypoxie in sferoïden van menselijke tandpulpstamcellen (DPSC)
Tandpulp stamcelsferoïden zijn een aantrekkelijk experimenteel hulpmiddel voor de biofabricage van verschillende weefsels, waaronder osteoblasten 25,66,67. Hun levensvatbaarheid en metabolisme worden echter zelden bestudeerd. Deze van stamcellen afgeleide sferoïden vertonen vrij kleine afmetingen (<200 μm), heldergroene autofluorescentie van FAD/Flavins (later aangeduid als FAD) (bijv. 460 nm, em. 550 nm) en de aanwezigheid van 'directe' en 'omgekeerde' hypoxische gradiënten²⁹. Figuur 6 toont de resultaten van gecombineerde confocale ratiometrische beeldvorming van sferoïdenoxygenatie (met behulp van O_2-sensing nanodeeltjes MMIR) en autofluorescentie FLIM van FAD. De 'klassieke' directe oxygenatiegradiënt werd waargenomen bij sferoïden met een diameter van 69 mm, terwijl grotere (141 μm) sferoïde een 'omgekeerde' gradiënt vertoonden. Het toevoegen van FAD-FLIM aan deze metingen helpt bij het valideren van verschillen in oxidatief metabolisme, zoals de snelle FLIM- en phasorgrafieken aantonen: kleine sferoïden vertoonden een prominentere fractie van langere FAD-levensduur, wat mogelijk wijst op een hogere glycolytische activiteit in de kleinere sferoïden.

figure-results-5
Figuur 6: Voorbeeld van multiparametrische beeldvorming van flavine autofluorescentie (bijv. 460 nm/em. 510-590 nm) en oxygenatie (intensiteitsverhoudingsanalyse met MMIR O₂ gevoelige nanodeeltjes: ex. 614 nm/referentie em. 631-690 nm / gevoelig em. 724-800 nm) in hDPSC-sferoïden van verschillende grootte (klein: 188 cellen/sferoïde, groot: 820 cellen/sferoïde), geproduceerd door middel van zelfgeproduceerde agarose-micromolds-methode met hoge doorvoer (confocale FLIM). (EEN, B) Representatief voorbeeld van oxygenatie-intensiteitsverhouding en beeldvorming gedurende de levensduur van flavine en autofluorescentie in grote (A, "B Sphs") en kleine (B, "S Sphs") hDPSC-sferoïden. (C,D) Vergelijkende analyse van de levensduur van flavine-autofluorescentie met behulp van fasekaartwolkanalyse, gebaseerd op de vergelijking van geometrische centra van fasorwolken. (E) De pixelzwaartepunten (geometrische centra) coördinaten van flavine autofluorescentie van grote hDPSC sferoïde (B Sphs) en kleine hDPSC sferoïde (S Sphs) op fasorplot. Er worden twee verschillende kleurcodes toegepast voor verschillende FLIM-analysebenaderingen, waarbij kleurcodering met τ de gemiddelde verdeling van de fotonaankomsttijd (FAST-FLIM-beelden) aangeeft, terwijl kleurcodering met τ φ - tau-fase overeenkomt met phasor-FLIM-analyse van de fluorescentielevensduur in dezelfde sferoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Meervoudige analyse van FAD-autofluorescentie en celdood in humane iPSC-sferoïden
Sferoïden van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) worden vaak gebruikt als eerste stap tijdens de inductie van weefselspecifieke differentiatie en de productie van organoïden, bijvoorbeeld in het geval van neurale organoïdencultuur. Afhankelijk van hun behandeling en het specifieke generatieprotocol kunnen de levensvatbaarheid en daaropvolgende reproduceerbaarheid van organoïden ernstig worden aangetast. Niet-destructief onderzoek van organoïden en sferoïden die neurale voorlopercellen bevatten, is cruciaal voor de structurele beoordeling, monitoring en voorspelling van de kwaliteit van groeiende en geassembleerde neurale weefsels tijdens hun ontwikkeling^68,69. Figuur 7A laat zien dat de niet-destructieve FLIM van autofluorescerende Flavin/FAD-moleculen ons informatie kan geven over de levensvatbaarheid van iPSC-sferoïden. Beeldvorming werd uitgevoerd 4 dagen na het zaaien van 9.000 iPSC's in commerciële ultra-lage bevestigingsplaatputten (Corning). Vóór de beeldvorming werden sferoïden gedurende 1 uur gekleurd met 0,5 μg/ml propidiumjodide (PI) om dode cellen te visualiseren. Er werden geen necrotische kernen waargenomen in deze iPSC-sferoïden met een zaaidichtheid van 9.000 cellen na 4 dagen. Op de overeenkomstige fasediagram van flavine/FAD-autofluorescentie (figuur 7B linkerpaneel) kunnen drie hoofdpatronen worden onderscheiden: patroon van media-autofluorescentie (magenta kleur), patroon (met gemiddelde τ φ - tau-fase, ~2,6 ns) dat overeenkomt met geen PI-gebieden (ROI1) en patroon (met gemiddelde τ φ ~3,1 ns) van regio's die correleren met de celdoodmarker - kleuring (ROI2). Een aanvullende vergelijking van met PI behandelde en niet-behandelde 2D-culturen van iPSC's toonde geen impact van PI op het verschijnen van flavine / FAD-fasorpatronen met een lange levensduur (Figuur 7C), wat aangeeft dat deze toename van de levensduur van flavines / FAD een onafhankelijke marker kan zijn van gecompromitteerde levensvatbaarheid van iPSC's en hun afgeleide cellen. Hoewel deze waarneming in lijn is met het recente rapport over op intensiteit gebaseerde beeldvorming⁷⁰, kunnen we de aanwezigheid van propidiumjodide-intensiteit met FAD-emissiekanaal (506-582 nm) niet volledig uitsluiten. Verder onderzoek is nodig om het verband aan te tonen tussen veranderingen in de levensduur van flavine / FAD en mogelijke gevallen van celdood. De eenvoudige, multiparametrische analyse op basis van fasor van ROI-regio's demonstreert een elegante manier voor snelle screening en gegevensanalyse.

figure-results-6
Figuur 7: Flavin autofluorescentie confocale FLIM en propidiumjodide kleuring in iPSC-sferoïden om de levensvatbaarheid van cellen te beoordelen. (A) Flavin autofluorescentie (links) en Propidiumjodide - PI (rechts) FLIM van een iPSC-sferoïde 4 dagen na het zaaien van 9.000 cellen in een ultralage bevestigingsplaat (Corning) en PI-kleuring (0,5 μg/ml, 1 uur) voorafgaand aan beeldvorming. (B) Phasor-plotanalyse van flavine autofluorescentie (links) en propidiumjodide (rechts) algemene beelden en bijbehorende ROI's (ROI1 - groen en ROI2 - rood, media autofluorescentie - magenta). ROI's werden geselecteerd op basis van de aanwezigheid van propidiumjodide-etikettering. (C) snelle FLIM en phasor plot analyse van flavines autofluorescentie in 2D-cultuur van iPSC behandeld en niet-behandeld met PI (0,5 μg/ml, 1 uur). Er werd geen impact van PI-kleuring op het uiterlijk van de lange fluorescentielevensduur van flavines (komt overeen met een fasorpatroon binnen een roze cirkel) gedetecteerd bij het verzamelen van de Flavin-excitatie binnen een bereik van 469-542 nm. Dit detectorbereik overlapt niet met het excitatiespectrum van PI (550-720 nm). Wanneer een breder excitatiebereik voor FAD wordt verzameld (469-590 nm) kan een impact van PI worden opgemerkt. De kleurcodering van het beeld komt overeen met de gemiddelde waarden van de aankomsttijd van fotonen (fast-FLIM). Beeldvormingsparameters waren T = 35 °C, 25X/0,95 wateronderdompelingsobjectief (A-B), 40X/1,25 Glycerolobjectief (C). Flavins: ex. 460 nm, em. 506-582nm (A-B), gaatje 4 AE. PI: ex. 535 nm, em. 584-667 nm, gaatje 1 AE. Kanalen: Intensiteit en Tau. De herhalingsfrequentie van 40 MHz om volledig verval van Flavin-autofluorescentie te verzamelen. Instellingen voor fasoranalyse; Harmonische 1, Drempel 1 (A-B), 47 (C), Mediaanfilter 17 (A-B), 11 (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Aanvullende protocollen over sferoïde vorming. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: FLIM-gegevens van glycolytische kern en niet-glycolytische kern.lif. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: FLIM-gegevens van glycolytic core.ptu. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: FLIM-gegevens van niet-glycolytische core.ptu. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: Glycolytische kern snel FLIM.tif Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: Snelle FLIM.tif met niet-glycolytische kern Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 7: Glycolytische kernvrije NAD(P)H point.tif Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 8: Glycolytische kernfasor plot.tif Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 9: Niet-glycolytische kernvrije NAD(P)H-point.tif Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 10: Niet-glycolytische kernfasor plot.tif Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meercellige sferoïden worden een voorkeursmethode bij de studies van tumor- en stamcelniche-micro-omgevingen, de ontdekking van geneesmiddelen en de ontwikkeling van de 'weefselbouwstenen' voor biofabricage. De heterogene interne architectuur, gradiënten van voedingsstoffen en oxygenatie van sferoïden kunnen die van in vivo weefsels en tumoren nabootsen in een relatief vereenvoudigde en toegankelijke omgeving. Met de behoefte aan meer methodologische transparantie ^26,28 en standaardisatie⁷¹, wordt verwacht dat deze protocollen onderzoekers zullen helpen bij het kiezen van de beste sferoïde vormingsmethode voor de live kwantitatieve fluorescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie-experimenten. De gepresenteerde methoden maken gebruik van nanodeeltjessensoren voor celkleuring en intrinsieke cellulaire autofluorescentie, die gemakkelijk kunnen worden gecombineerd met celdood kleuren.

De meest kritieke stappen bevinden zich in het protocol voor de vorming van sferoïden; Voor de op agarose gebaseerde methode met hoge doorvoer is het dus essentieel om de agarosemallen voor de kweekmedia voldoende in evenwicht te brengen. Onvoldoende evenwichtstijd zal leiden tot de verdunning van voedingsstoffen in de resterende PBS en extra factoren met zich meebrengen voor sferoïde heterogeniteit 21,26,72,73. De vers gemaakte agarosevorm moet ook visueel worden gecontroleerd op de aanwezigheid van luchtbellen, microscheurtjes en andere defecten.

Hoewel efficiënt voor beeldvorming, kan de suspensie van nanodeeltjes zelfaggregatie vertonen en de vorming van onregelmatig gevormde sferoïden veroorzaken bij methoden voor de vorming van lage gehechtheid. Dit kan vaak worden verzacht door serum toe te voegen aan de kweekmedia of door de monolaagse celcultuur vooraf te kleuren voordat sferoïde wordt gevormd. Vaak kan tijdens sferoïde verdichting een toevoeging van een kleine hoeveelheid nanodeeltjes (bijv. 10% van de initiële kleuringsconcentratie) ook helpen bij het kleuren van de prolifererende zone van de sferoïden. Ten slotte is het belangrijk om bij alle vormingsmethoden "stofvrije" steriele pipetpunten te gebruiken.

Tijdens beeldvormingsexperimenten moet altijd rekening worden gehouden met de mogelijke impact van verlichting op de levensvatbaarheid van cellen. Het is dus belangrijk om de risicofactoren te kennen die een negatieve invloed hebben op elk live beeldvormingsexperiment. Over het algemeen omvat fotoschade verschillende mechanismen: (1) hoge lokale temperatuurstijging, (2) mechanische stress en (3) fotochemische stress (oxidatieve en vrije radicalenreactie)⁷⁴. Afhankelijk van de beeldvormingsmodaliteit (bijv. confocale beeldvorming met één foton versus beeldvorming met meerdere fotonen, continue versus pulsverlichtingsmodi, de gevoeligheid van detectoren en het vermogen van de lichtbron op verschillende golflengten als de excitatieafstemming mogelijk is), cel- en weefseltype (bijv. weefseltype-afhankelijke accumulatie van efficiënt lichtabsorberende pigmenten of andere autofluorescentiemoleculen, 3D- versus 2D-organisatie, groei en samenstelling van beeldvormingsmedia), de oorsprong van de fluorescerende sonde (bijv. fotosensibiliserende eigenschappen) verschillende combinaties van risicofactoren kunnen fototoxiciteit veroorzaken tijdens beeldvorming. Bovendien, zelfs als er geen toename van celdood wordt waargenomen na verlichting, kunnen lichtkrachtafhankelijke eerdere pre-death effecten op mitochondriën en metabolisme mogelijk interfereren met experimentanalyse en -interpretatie⁵⁵.

Om de fototoxische impact op experimentele resultaten uit te sluiten, moet de onderzoeker algemene monitoring uitvoeren van de levensvatbaarheid van cellen en veranderingen in de celmorfologie in vergelijking met intacte controle, of met behulp van celdoodsondes om de toename van het celsterftecijfer na verlichting te schatten. Als de metabole experimenten worden uitgevoerd, moet de optimalisatie van de beeldvormingsparameters dienovereenkomstig worden uitgevoerd in de pilootexperimenten om de beeldvormingsimpact op de gemeten metabole parameters te schatten en te minimaliseren. In het geval van zuurstofgevoelige sondes kan de overdosis licht gemakkelijk worden gevolgd door een plotselinge toename van de levensduur en intensiteit van de O_2-gevoelige kleurstoffosforescentie (overeenkomstige veranderingen in de intensiteitsverhouding van de referentie ten opzichte van de_O2-gevoelige kleurstof) als gevolg van het zogenaamde "foto-geïnduceerde O_2-verbruik"^53,75. Dit kan eenvoudig worden gedaan door kinetische curve-analyse van time-lapse-experimenten met verschillende lichtvermogensparameters, bijvoorbeeld met behulp van het volgende gepubliceerde protocol²⁵. Ter 'verdediging' van de pulsverlichting (bijv. gebruikt in TCSPC-F(P)LIM-microscopie), toonden de recente studies de minimale impact ervan aan op de ROS-productie en het fotobleken van de sonde in vergelijking met steady-state verlichtingsmetingen^76,77, wat wijst op een bijkomend voordeel van TCSPC-FLIM versus conventionele op intensiteit gebaseerde beeldvormingsbenadering.

De belangrijkste beperking van de gepresenteerde sferoïde vormingsmethoden ligt in directe en langdurige monitoringtoepassingen. De agarosemallen vereisen een objectief met een lange werkafstand (of een extra rechtopstaande microscoop of fluorescentie-stereomicroscoop) vanwege de dikke laag agarose en het materiaal van de 5D Spheriplate kan de metingen in rode fluorescerende kanalen (O 2-sonde) verstoren. De sferoïde grootte die wordt geproduceerd door methoden met een hoge doorvoer wordt beperkt door de diameter van de microwell en vereist frequente media-uitwisseling om uitputting en verzuring van media te voorkomen. Met al deze beperkingen raden we de 3D-petrischaaltjes (MicroTissue) aan voor experimenten die een hoge doorvoer vereisen (bijv. voor 3D-bioprinttoepassingen) en methoden met een lage hechting voor basisstudies met een "gemiddelde doorvoer", die ook een lager aantal cellen vereisen.

Ratiometrische oxygenatiemonitoring en conventionele experimenten met fluorescentiekleurstof op basis van levende cellen zijn betaalbaar op algemeen verkrijgbare omgekeerde microscopen als ze zijn uitgerust met een nabij-infrarood (NIR)-gevoelige camera, op lichtgevende diode (LED) gebaseerde excitatie en geschikt objectief²⁵. Voor meer geschikte optische doorsnede en FLIM worden kant-en-klare commerciële confocale microscoopsystemen (zoals hier beschreven) aanbevolen. Hoewel we ook een methode beschrijven voor het detecteren van NAD(P)H-autofluorescentie, waarvoor een duurdere twee-foton FLIM-microscoop nodig is, zijn er veel verschillende benaderingen, compatibel en nuttig voor confocale FLIM-systemen, idealiter uitgerust met witlichtlaser en hybride of SPAD-detectoren. Deze omvatten beoordeling van het celmetabolisme, FRET-FLIM biosensoreiwitten, beeldvorming van cel- en weefselmechanica, autofluorescentie van specifieke cel- en weefseltypes, en receptor-geneesmiddelinteracties gevisualiseerd via FLIM-FRET³¹.

De door de leverancier geleverde FLIM-acquisitie- en analysesoftware kan het succes van het experiment beïnvloeden, aangezien het niet altijd mogelijk is om de IRF of de afbeeldingen te exporteren in een formaat dat compatibel is met de downstream open-sourceanalyse. Nabewerking is een belangrijk onderdeel van de FLIM-analyseworkflow en is nog steeds niet universeel gestandaardiseerd of geaccepteerd. Curve-aanpassing vereist een hoger aantal fotonen en meer rekenkracht in vergelijking met de fasorbenadering. FLIMfit⁴⁵ (globaal en pixel-voor-pixel passen) en Flimview⁷⁸ behoren tot de open software die wordt gebruikt voor curve-fittinganalyse, terwijl PAM⁷⁹, FLUTE⁶⁴ en AlliGator⁸⁰ worden gebruikt voor fasoranalyse. FLIMJ⁴⁶ is een handige ImageJ-plug-in die met beide benaderingen werkt. Al met al helpen deze opties de nabewerkingsroutine te verbeteren en sneller, veelzijdiger en gebruiksvriendelijker te maken.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de subsidies van het Speciaal Onderzoeksfonds (BOF) van de Universiteit Gent (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO, I001922N) en de Europese Unie, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN nr. 101073507.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Ook verkrijgbaar bij Sigma
10 mL serologische pipetten	VWR	612-3700	Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
12 well cell-cultuur platen, sterieel	Greiner bio-one	665-180	Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning en andere bedrijven.
12 Well Chamber slide, verwijderbaar	Ibidi	81201	Ook verkrijgbaar bij Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific en anderen
15 mL centrifugebuizen	Nerbe plus	02-502-3001	Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
3D Petri Schaal micromalen	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-cultuur platen, sterieel	Greiner bio-one	657160	Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercieel verkrijgbare gecoate 96-well plate voor sfeervorming
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Gebruik in verdunning 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	versie 3
Collageen uit menselijke placenta, type IV	Sigma	C5533	Voor de bereiding van 0,07 mg/mL Collageen en 0,03 mg/mL Poly-D-lysine gecoate microscoopschijven
Confocale FLIM Microscoop	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon geïnverteerde microscoop met wit-licht laser, HyD X detectoren, klimaat / T controlekamer (OkoLab), 25x/0.95 W objectief
D(+)-Glucose	Merck	8342	Bereid 1 M stockoplossing, 1:100 voor bereiding van beeldvormingsmedium (eindconcentratie 10 mM)
Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), fenolrood-, glucose-, pyruvaat- en glutamine-vrij	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	Voor bereiding van beeldvormingsmedium
Foetaal runder serum (FBS)	Gibco	10270-098	Ook verkrijgbaar bij Sigma. Moet voor gebruik warmte-inactivering ondergaan.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Verdunning 1/100 voor bereiding van beeldvormingsmedium (eindconcentratie 10 mM)
Menselijk colonkanker cellen HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	versie 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	versie 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Ook verkrijgbaar bij Sigma. Gebruik in verdunning 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, noodzakelijk om 1 mM Natrium Pyruvaat en 10 mM HEPES toe te voegen	VWR	392-0420	Standaard groeimedium voor HCT116 cellen
Micro-gepattered 3D-geprinte PDMS stempels	N/A	N/A	Verstrekt door het Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Universiteit Gent
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer telkamer	Fisher Scientific	15980396
O2 sondes: MMIR1	N/A	N/A	Volledige karakterisering, validatie en enkele toepassingen zijn te vinden op: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Los PBS tablet op in 500 mL gedistilleerd water.
Pen Strep :Penicilline (10.000 U/mL) / streptomycine (10.000 μg/mL) 100x oplossing	Gibco	15140-122	Ook verkrijgbaar bij Sigma. Gebruik in verdunning 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	Voor de bereiding van 0,07 mg/mL Collageen en 0,03 mg/mL Poly-D-lysine gecoate microscoopschijven
Propidium Jodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Celdoodkleuring, gebruik 1 µg/mL bij 1h incubatie
PVDF spuitfilter 0,22 µm	Novolab	A35149	Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
Natriumpyruvaat (100 mM)	Gibco	11360-070	Verdunning 1/100 voor bereiding van beeldvormingsmedium (eindconcentratie 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
Steriele petrischaal	Greiner bio-one	633181	Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
Weefselcultuur fles (25 cm² )	VWR	734-2311	Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
Weefselcultuur fles (75 cm²)	VWR	734-2313	Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, VWR en andere bedrijven
U-bodem 96-well plaat	VWR	10062-900	Vergelijkbare producten zijn ook verkrijgbaar bij Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one en andere bedrijven
Ultrapuur Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Andere soorten Agarose zoals Agarose met laag smeltpunt

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3d spheroids. J Vis Exp. (51), e2720(2011).
Moskovits, N., et al. Establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs. J Vis Exp. (190), e64564(2022).
Griner, L. M., et al. Generation of high-throughput three-dimensional tumor spheroids for drug screening. J Vis Exp. (139), e57476(2018).
Qian, Y., Wei, X., Chen, K., Xu, M. Three-dimensional acoustic assembly device for mass manufacturing of cell spheroids. J Vis Exp. (200), e66078(2023).
He, H., et al. Dynamic formation of cellular aggregates of chondrocytes and mesenchymal stem cells in spinner flask. Cell Prolif. 52 (4), e12587(2019).
Perez, J. E., Nagle, I., Wilhelm, C. Magnetic molding of tumor spheroids: Emerging model for cancer screening. Biofabrication. 13 (1), 015018(2020).
Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3d bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomater. 95, 357-370 (2019).
Guillaume, O., et al. Hybrid spheroid microscaffolds as modular tissue units to build macro-tissue assemblies for tissue engineering. Acta Biomater. 165, 72-85 (2023).
Danilevicius, P., et al. laser-made 3D microscaffolds for tissue spheroid encagement. Biointerphases. 10 (2), 021011(2015).
Jamieson, L. E., Harrison, D. J., Campbell, C. Chemical analysis of multicellular tumour spheroids. Analyst. 140 (12), 3910-3920 (2015).
Dmitriev, R., Borisov, S., Jenkins, J., Papkovsky, D. Multiparametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. SPIE BiOS. 9328, (2015).
Zushin, P. -J. H., Mukherjee, S., Wu, J. C. FDA Modernization Act 2.0: transitioning beyond animal models with human cells, organoids, and AI/ML-based approaches. J Clin Invest. 133 (21), e175824(2023).
Kim, D. -S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human es and ips cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev Rep. 6 (2), 270-281 (2010).
Hart, D., Gutiérrez, D. R., Biason-Lauber, A. Generation of a human ovarian granulosa cell model from induced pluripotent stem cells. bioRxiv. , 2022(2022).
Chiaradia, I., et al. Tissue morphology influences the temporal program of human brain organoid development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1351-1367 (2023).
Wagstaff, E. L., Ten Asbroek, A. L., Ten Brink, J. B., Jansonius, N. M., Bergen, A. A. An alternative approach to produce versatile retinal organoids with accelerated ganglion cell development. Sci Rep. 11 (1), 1101(2021).
Thavandiran, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (49), E4698-E4707 (2013).
Harrison, S. P., et al. Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human pscs. Exp Mol Med. 55 (9), 2005-2024 (2023).
Noguchi, T. -A. K., Kurisaki, A. Formation of stomach tissue by organoid culture using mouse embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 2017, 217-228 (2017).
Takahashi, J., et al. Suspension culture in a rotating bioreactor for efficient generation of human intestinal organoids. Cell Reports Methods. 2 (11), 100337(2022).
Lagziel, S., Gottlieb, E., Shlomi, T. Mind your media. Nat Metab. 2 (12), 1369-1372 (2020).
Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of uniform spheroid formation in 384-well plates: The effect of medium evaporation. J Biomol Screen. 21 (9), 923-930 (2016).
Bera, K., et al. Extracellular fluid viscosity enhances cell migration and cancer dissemination. Nature. 611 (7935), 365-373 (2022).
Michl, J., Park, K. C., Swietach, P. Evidence-based guidelines for controlling ph in mammalian live-cell culture systems. Commun Biol. 2, 144(2019).
Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable oxygen microscopy-assisted biofabrication of multicellular spheroids. J Vis Exp. (182), e63403(2022).
Peirsman, A., et al. Mispheroid: A knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).
Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: Comparison of different protocols. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
Debruyne, A. C., et al. Live microscopy of multicellular spheroids with the multimodal near-infrared nanoparticles reveals differences in oxygenation gradients. ACS Nano. 18 (19), 12168-12186 (2024).
Debruyne, A. C., Okkelman, I. A., Dmitriev, R. I. Balance between the cell viability and death in 3D. Semin Cell Dev Biol. 144, 55-66 (2023).
Barroso, M., Monaghan, M. G., Niesner, R., Dmitriev, R. I. Probing organoid metabolism using fluorescence lifetime imaging microscopy (flim): The next frontier of drug discovery and disease understanding. Adv Drug Deliv Rev. 201, 115081(2023).
Becker, W. Fluorescence lifetime imaging-techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. J Cell Sci. 134 (9), 1-17 (2021).
Sarder, P., Maji, D., Achilefu, S. Molecular probes for fluorescence lifetime imaging. Bioconjug Chem. 26 (6), 963-974 (2015).
Alfonso-Garcia, A., et al. Mesoscopic fluorescence lifetime imaging: Fundamental principles, clinical applications and future directions. J Biophotonics. 14 (6), e202000472(2021).
Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. J Cell Biol. 217 (7), 2235-2246 (2018).
Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomark Med. 4 (2), 241-263 (2010).
Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of nad (p) h and fad. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
Verma, A., et al. Fluorescence lifetime imaging for quantification of targeted drug delivery in varying tumor microenvironments. bioRxiv. , 2024(2024).
Smith, J. T., et al. In vivo quantitative fret small animal imaging: Intensity versus lifetime-based fret. Biophys Rep. 3 (2), 100110(2023).
Alvarez, L. A., et al. Application Note: SP8 Falcon: A novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal flim. Nat Methods. , (2019).
Roberti, M. J., et al. TauSense: A fluorescence lifetime-based tool set for everyday imaging. Nat. Methods. , https://www.nature.com/articles/d42473-020-00364-w.pdf (2020).
Auer, J. M. T., Murphy, L. C., Xiao, D., Li, D. U., Wheeler, A. P. Non-fitting flim-fret facilitates analysis of protein interactions in live zebrafish embryos. J Microsc. 291 (1), 43-56 (2023).
Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLoS One. 8 (8), e70687(2013).
Gao, D., et al. Flimj: An open-source imagej toolkit for fluorescence lifetime image data analysis. PloS One. 15 (12), e0238327(2020).
Tullis, I. D. C., Ameer-Beg, S. M., Barber, P. R., Rankov, V., Vojnovic, B. Mapping femtosecond pulse front distortion and group velocity dispersion in multiphoton microscopy. Proc. SPIE 6089, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VI. , 60890(2006).
Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio Protoc. 8 (22), e3080(2018).
Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
Badea, M. A., et al. Influence of matrigel on single-and multiple-spheroid cultures in breast cancer research. SLAS Discov. 24 (5), 563-578 (2019).
Lang, S., Sharrard, R., Stark, M., Villette, J., Maitland, N. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional matrigel cultures. Br J Cancer. 85 (4), 590-599 (2001).
Barra, J., et al. DMT1-dependent endosome-mitochondria interactions regulate mitochondrial iron translocation and metastatic outgrowth. Oncogene. 43 (9), 650-667 (2024).
Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Intracellular probes for imaging oxygen concentration: How good are they. Methods Appl Fluoresc. 3 (3), 034001(2015).
Schweikhard, V., et al. Application Note: The power HyD family of detectors for confocal microscopy. Nat Methods. , https://www.nature.com/articles/d42473-020-00398-0 (2020).
Alam, S. R., Wallrabe, H., Christopher, K. G., Siller, K. H., Periasamy, A. Characterization of mitochondrial dysfunction due to laser damage by 2-photon flim microscopy. Sci Rep. 12 (1), 11938(2022).
Bush, P. G., Wokosin, D. L., Hall, A. C. Two-versus one photon excitation laser scanning microscopy: Critical importance of excitation wavelength. Front Biosci. 12, 2646-2657 (2007).
Liu, M., et al. Instrument response standard in time-resolved fluorescence spectroscopy at visible wavelength: Quenched fluorescein sodium. Appl Spectrosc. 68 (5), 577-583 (2014).
Szabelski, M., et al. Collisional quenching of erythrosine b as a potential reference dye for impulse response function evaluation. Appl Spectrosc. 63 (3), 363-368 (2009).
Chib, R., et al. Standard reference for instrument response function in fluorescence lifetime measurements in visible and near infrared. Meas Sci Technol. 27 (2), 027001(2015).
Talbot, C. B., et al. Application of ultrafast gold luminescence to measuring the instrument response function for multispectral multiphoton fluorescence lifetime imaging. Opt Express. 19 (15), 13848-13861 (2011).
Becker, W. Recording the instrument response function of a multiphoton flim system. Becker & Hickl. , Available from: https://www.becker-hickl.com/literature/application-notes/recording-the-instrument-response-function-of-a-multiphoton-flim-system/ (2007).
Leben, R., Köhler, M., Radbruch, H., Hauser, A. E., Niesner, R. A. Systematic enzyme mapping of cellular metabolism by phasor-analyzed label-free nad (p) h fluorescence lifetime imaging. Int J Mol Sci. 20 (22), 5565(2019).
Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using nadh and nadph autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A python gui for interactive phasor analysis of flim data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
Malacrida, L., Ranjit, S., Jameson, D. M., Gratton, E. The phasor plot: A universal circle to advance fluorescence lifetime analysis and interpretation. Annu Rev Biophys. 50, 575-593 (2021).
Okkelman, I., Vandenberghe, W., Dmitriev, R. Role of preconditioning with oxygen and glucose deprivation in promoting differentiation of dental pulp stem cells in 3D culture. Mol Biol Cell. 34 (2), 1212(2022).
Park, J. H., et al. The effect of bmp-mimetic peptide tethering bioinks on the differentiation of dental pulp stem cells (DPSCs) in 3D bioprinted dental constructs. Biofabrication. 12 (3), 035029(2020).
Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
Bryanskaya, E. O., et al. High levels of FAD autofluorescence indicate pathology preceding cell death. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1868 (1), 130520(2024).
Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21 (1), 152(2021).
Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420(2020).
Gstraunthaler, G., Seppi, T., Pfaller, W. Impact of culture conditions, culture media volumes, and glucose content on metabolic properties of renal epithelial cell cultures: Are renal cells in tissue culture hypoxic. Cell Physiol Biochem. 9 (3), 150-172 (1999).
Glickman, R. D. Phototoxicity to the retina: Mechanisms of damage. Int J Toxicol. 21 (6), 473-490 (2002).
Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring Parameters of Oxygen Transport to Cells in the Microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , The Royal Society of Chemistry. (2018).
Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41 (2), 191-197 (2006).
Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of pvp-hypericin: A new strategy using ms pulses of led and the fluorescent dye cfse. J Microsc. 245 (1), 100-108 (2012).
Carrasco Kind, M., et al. flimview: A software framework to handle, visualize and analyze flim data. F1000Research. 9, 574(2020).
Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. Pam: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophys J. 114 (7), 1518-1528 (2018).
Chen, S. -J., Sinsuebphon, N., Barroso, M., Intes, X., Michalet, X. Optical Molecular Probes, Imaging and Drug Delivery. , Optica Publishing Group. (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Productie en multi-parameter live cell fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) van meercellige sferoïden

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles