Methodenartikel

Inoculeren en observeren van arbusculaire mycorrhizaculturen op superabsorberende autotrofe systemen op basis van polymeren

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66848

⸱

14 juni 2024

 ,  , 
1Centre d’Étude de la Forêt (CEF) and Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes (IBIS), Université Laval, 2Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een eenvoudige en goedkope techniek voor het inoculeren en observeren van arbusculaire mycorrhiza-schimmels in superabsorberende autotrofe systemen op basis van polymeren.

Samenvatting

Arbusculaire mycorrhiza (AM) schimmels zijn moeilijk te manipuleren en te observeren vanwege hun permanente associatie met plantenwortels en voortplanting in de rhizosfeer. Doorgaans worden AM-schimmels gekweekt onder in vivo omstandigheden in potcultuur met een autotrofe gastheer of onder in vitro omstandigheden met Ri Transfer-DNA getransformeerde wortels (heterotrofe gastheer) in een petrischaal. Bovendien vindt de teelt van AM-schimmels in potcultuur plaats in een ondoorzichtige en niet-steriele omgeving. Bij in-vitrocultuur daarentegen gaat het om de vermeerdering van AM-schimmels in een steriele, transparante omgeving. Het superabsorberende autotrofe systeem op basis van polymeren (SAP-AS) is onlangs ontwikkeld en heeft aangetoond dat het de voordelen van beide methoden combineert en tegelijkertijd hun respectieve beperkingen (opaciteit en heterotrofe gastheer, steriliteit) vermijdt. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor eenvoudige bereiding, inoculatie met enkele sporen en observatie van AM-schimmels in SAP-AS. Door de petrischalen aan te passen, waren foto- en video-observaties met hoge resolutie mogelijk op levende exemplaren, wat moeilijk of onmogelijk zou zijn geweest met de huidige in vivo en in vitro technieken.

Inleiding

Arbusculaire mycorrhiza (AM) schimmels (Glomeromycotina) zijn oude plantenwortelsymbionten (~500 Ma 1,2) die mogelijk een essentiële rol hebben gespeeld bij de kolonisatie van terrestrische bodems door tracheofyten. Deze lange co-evolutie tussen AM-schimmels en tracheofyten plaatst arbusculaire mycorrhiza als een meesterwerk van mutualisme tussen koninkrijken. AM-schimmeldraden, verhogen het vermogen van de gastheer om te foerageren naar bodemvoedingsstoffen3, inclusief de overdracht van voedingsstoffen naar nieuwe gastheren via mycorrhiza-netwerken4. Het schimmelnetwerk verbetert de bodemstructuur en de productie van glomaline zou bodemerosie kunnen verminderen5. De overdracht van een deel van de atmosferische koolstof naar de schimmelwortelsymbiont verhoogt de koolstofvastlegging in de bodem6. Over het algemeen verbeteren AM-schimmels de weerbaarheid van planten tegen zowel abiotische als biotische stress en hebben ze daarom veel aandacht gekregen in de agro-ecologie7. AM-schimmelvriendelijke landbouwbeheerpraktijken hebben inderdaad het potentieel om het gebruik van chemische inputs voor de productie van gewassen te verminderen en het organische koolstofgehalte in de bodem te verbeteren, wat belangrijke doelstellingen zijn die landbouwers in hun beheerpraktijken moeten integreren om te voldoen aan nationale en internationale verplichtingen met betrekking tot de overgang naar duurzame landbouwpraktijken en de strijd tegen klimaatverandering.

AM-schimmels zijn echter microscopisch kleine schimmels in de bodem en hun studie is moeilijk vanwege hun obligate biotrofie en verdeling van de rhizosfeer. De bodem is een van de moeilijkste biotopen om te bestuderen vanwege zijn ondoorzichtigheid, de enorme diversiteit aan niches en multitrofische interacties op alle schalen. De isolatie, vermeerdering en karakterisering van AM-schimmels zijn daarom moeilijk. Tot het midden van de 20eeeuw waren alleen AM-schimmelsoorten die sporocarpen vormdengekarakteriseerd 8. De meeste AM-schimmelsoorten produceren echter niet-sporocarpe sporen met een diameter van ~20 μm tot ~500 μm. De beschrijving van de grondzeeftechniek9 opende de weg om deze AM-schimmelsoorten te beschrijven, en de snelheid van soortbeschrijving is sindsdien toegenomen. Toch vertegenwoordigen AM-schimmels een kleine groep soorten in vergelijking met Dikarya.

Trapculturen, d.w.z. de inoculatie met sporen of een omgevingsbodemmonster met AM-schimmelsporen van een pot gevuld met geautoclaveerd materiaal zoals turface en vermiculiet en een gesteriliseerd zaad van een gastheer (prei, weegbree), is een manier om AM-schimmels onder gecontroleerde omstandigheden te vermeerderen10. Het succes van de inoculatie kan echter alleen worden beoordeeld door te zoeken naar de aanwezigheid van arbuscules in wortelfragmenten na het kleuren of door een deelmonster of de hele pot nat te zeven om sporen te isoleren. Het wordt meestal aanbevolen om het systeem gedurende ten minste 6-12 weken vóór de analyse van de potcultuur niet te verstoren. Deze kweektechniek is geschikt voor het vermeerderen van de meeste bekende AM-schimmelsoorten, maar live observatie van de schimmelsymbiont is niet mogelijk en het succes van inoculatie is onzeker, vooral wanneer enkele sporenculturen worden geprobeerd.

Integendeel, de in vitro vermeerdering van AM-schimmels kan live worden gevolgd dankzij de transparantie van het kweekmedium11, maar deze kweektechniek vereist de beschikbaarheid van getransformeerde wortels en de aanwezigheid van koolstof in het kweekmedium om in een steriele omgeving te kunnen werken. De sporen moeten worden gesteriliseerd en samen met de associatie met een heterotrofe gastheer worden de meeste bekende AM-schimmelsoorten niet met succes vermeerderd met deze techniek.

Daarom heeft de vermeerdering van AM-schimmels met behulp van de huidige technieken, hoewel gevestigd en op grote schaal gebruikt in de meeste laboratoria, enkele beperkingen voor de studie van AM-schimmels. Paré et al. (2022)12 ontwikkelden een in vivo techniek waarbij gebruik wordt gemaakt van een transparant superabsorberend polymeer (SAP) in combinatie met hele planten om AM-schimmels te vermeerderen. De techniek, ontworpen als een SAP-gebaseerd autotroof systeem (SAP-AS), is eenvoudig en goedkoop en combineert de voordelen van potcultuur (associatie met een autotrofe gastheer, niet-steriele omstandigheden) en in vitro culturen (transparant medium, live monitoring van de symbioseontwikkeling). Hier presenteren we een protocol waarin wordt uitgelegd hoe de culturen kunnen worden opgezet met enkelvoudige sporeninoculatie en hoe de SAP-AS kan worden gebruikt voor sterk vergrote observatie van het extraradicale mycelium. Concreet beschrijven we hoe je petrischalen met twee compartimenten kunt modificeren, de voedingsoplossing kunt bereiden, het superabsorberende polymeer (SAP) kunt bereiden, de zaailingen kunt voorbereiden, de SAP-AS kunt monteren en kunt inoculeren met een enkele spore, de sporen kunt voorkiemen en de ontwikkeling van de symbiose live kunt volgen.

Protocol

1. Modificatie van petrischalen met twee compartimenten

OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen.

  1. Wijzig het deksel van de petrischaal.
    1. Boor met behulp van het roterende gereedschap en de bijbehorende snijbit twee gaten (~7 mm in diameter) in de bovenkant van het deksel en een opening van 1 cm in de zijkant. Het ene gat wordt gebruikt om het wortelcompartiment (vermiculiet) te irrigeren en het andere voor het hyfen (SAP) compartiment.
  2. Wijzig de bodem van de petrischaal.
    1. Boor een inkeping in de zijkant van de bodem van de petrischaal voor de stengel van de plant met behulp van het elektrische roterende gereedschap. Zorg ervoor dat de inkeping niet te diep is om te voorkomen dat de vloeistof wegloopt. Deze inkeping wordt uitgelijnd met de opening van 1 cm in het deksel (stap 1.1).
    2. Om de plastic barrière van de petrischaal met twee compartimenten te vervangen door het nylon gaasfiltermembraan, gebruikt u het elektrische roterende gereedschap om een rechthoekige inkeping van 30 mm naar de bodem van de petrischaal te boren.
    3. Voor observatie met hoge resolutie boort u ronde gaten met een diameter van ~25 mm in de bodem van de petrischaal. Maak afhankelijk van de vereisten een enkel gat (of meerdere gaten) aan de SAP-zijde of één in elk compartiment. Zorg ervoor dat de gaten niet direct onder de irrigatiegaten van het deksel worden geboord.
  3. Installeer het membraan van het nylon gaasfilter.
    1. Gebruik de metalen geleider en paperclip om het stuk van het nylon gaasfiltermembraan op zijn plaats te klemmen en stevig op de plastic barrière te drukken. Lijn de bovenkant van het membraan uit met de bovenkant van de plastic barrière. Zorg ervoor dat het membraan uit de onderkant van de geleider steekt.
    2. Snijd met behulp van de pyrografieset langs de rand van de metalen geleider om het membraan te smelten en af te dichten aan de bodem van de petrischaal en de plastic barrière die de twee compartimenten scheidt.
    3. Terwijl de metalen geleider en paperclip nog op hun plaats zitten, verwijdert u voorzichtig het overtollige nylon gaasfiltermembraan met een pincet.
    4. Controleer onder de ontleedmicroscoop of het nylon gaasfiltermembraan goed is afgedicht op het plastic om te voorkomen dat wortels in het hyfale (SAP) compartiment binnendringen.
  4. Installeer het dekglaasje.
    LET OP: Het dekglaasje wordt onder de petrischaal geplaatst. Hierdoor kan de immersieolie worden gebruikt en kan het dekglaasje worden gereinigd.
    1. Breng de siliconenkit aan langs de rand van de ronde gaten (buiten de bodem van de petrischaal).
    2. Plaats het dekglaasje op de buitenkant van de bodem van de petrischaal en druk voorzichtig aan om een perfecte hechting te garanderen.
    3. Laat drogen en verwijder overtollige kit met een scheermesje.
  5. Inspecteren en schoonmaken.
    1. Gebruik een luchtstoot om stof of stukjes plastic te verwijderen die zich aan de petrischaal hebben gehecht.
    2. Inspecteer onder een ontleedmicroscoop om eventuele defecten op te sporen en te corrigeren.
      OPMERKING: Draag handschoenen om vingerafdrukken op de petrischaaltjes te voorkomen

2. Bereiding van 1 L voedingsoplossing mMS-1

  1. Bereid voorraadoplossingen voor.
    1. Macronutriënten: Weeg en los het volgende op in 1 L gedestilleerd water:
      7,31 g MgSO4·7 H2O, 0,80 g KNO3, 0,65 g KCl en 0,048 g KH2PO4.
    2. Weeg 2,88 g Ca(NO3)2 af.4H2O en oplossen in 1 L gedestilleerd water.
    3. Weeg 0,80 g NaFeEDTA af en los op in 0,5 l gedestilleerd water.
    4. Weeg 0,375 g KI af en los op in 0,5 l gedestilleerd water.
    5. Micronutriënten
      1. Los 3 g MnCl2 op.4H2O in 100 ml gedestilleerd water.
      2. Los 1.325 g ZnSO4 op7H2O in 100 ml gedestilleerd water.
      3. Los 0,75 g H3BO3 op in 100 ml gedestilleerd water.
      4. Als ze zijn opgelost, meng dan de in de stappen 2.1.5.1-2.1.5.3 bereide oplossingen.
      5. Weeg 0,65 g CuSO4 af.5H2O en oplossen in 50 ml gedestilleerd water.
      6. Los 0,12 g Na2MoO4 op·2H2O in 100 ml gedestilleerd water.
      7. Voeg 5 ml van de oplossing uit stap 2.1.5.5 en 1 ml uit stap 2.1.5.6 toe aan de oplossing uit stap 2.1.5.4.
      8. Stel het volume van de in stap 2.1.5.7 verkregen oplossing in op 500 ml met gedestilleerd water.
  2. Bereid 1 L mMS-1 media voor.
    1. Voeg 700 ml gedestilleerd water toe aan een glazen fles van 2 liter.
    2. Voeg onder voortdurend roeren met een magnetische staaf 100 ml oplossing van macronutriënten toe (stap 2.1.1), 100 ml calciumnitraatoplossing (stap 2.1.2), 5 ml ijzer-EDTA-oplossing (stap 2.1.3), 1 ml KI-oplossing (stap 2.1.4) en 1 ml oplossing van micronutriënten (stap 2.1.5).
    3. Stel het volume van de oplossing in op 1000 ml.
      OPMERKING: mMS-1 is een bewerking van Bécard en Fortin (1988)14. Sterilisatie bij 121 °C gedurende 15 minuten is optioneel omdat de SAP-AS niet steriel is. De pH wordt niet aangepast omdat de SAP een sterk bufferend effect heeft, en Paré et al. (2022)12 toonden aan dat de omstandigheden op SAP relatief neutraal waren (6,7 tot 7,4).

3. Voorbereiding van SAP

OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen.

  1. Hydrateer SAP: meng 5 g droge SAP met 500 ml mMS-1 voedingsoplossing (stap 2.2).
  2. Laat 12 uur (een nacht) hydrateren bij kamertemperatuur (RT).
  3. Giet af en verzamel de gehydrateerde SAP-korrels.
    1. Wanneer gehydrateerde SAP wordt gebruikt om de plaat met 12 putjes te vullen (sectie 7), laat de gehydrateerde SAP dan niet uitlekken en meng het gehydrateerde graan en de restanten van de mMS-1-voedingsoplossing.
      OPMERKING: Er zijn drie granulometrieën van de droge SAP beschikbaar: klein, middelgroot en groot. De gemiddelde granulometrie (1-2 mm) is het meest geschikt. De SAP van grote granulometrie slikt te veel wanneer het gehydrateerd is en het deksel van de petrischaal kan niet worden gesloten, terwijl de kleine granulometrie SAP weinig ruimte tussen hen laat, wat een beperking is voor de waarnemingen van de schimmelstructuur tussen de korrels.

4. Voorbereiding van zaailingen

OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen.

  1. Ontkiem de zaden van P. lanceolata op vloeipapier bevochtigd met mMS-1 voedingsoplossing in een petrischaaltje.
  2. Incubeer in het donker bij RT.
  3. Rehydrateer indien nodig tot de worteltjes minstens 2 cm lang zijn.

5. Assemblage en beheer van SAP-AS

OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen.

  1. SAP-AS monteren (stap 1 + stap 2 + stap 3 + stap 4)
    1. Plaats de stengel van de zaailing in de inkeping aan de zijkant van de petrischaal met de wortel naar binnen en de zaadlobben/bladeren en stengels naar buiten.
    2. Bedek de wortels met ongeveer 1,5-2 g vermiculiet.
    3. Hydrateer het wortelcompartiment met 8 ml mMS-1 voedingsoplossing. Dit zal helpen de wortel en vermiculiet te stabiliseren.
    4. Voeg 5 g gehydrateerd SAP toe langs het nylon gaasfiltermembraan aan de zijkant van het wortelcompartiment.
    5. Voeg 15 g gehydrateerde SAP toe aan het hyfhalcompartiment. Het hyfhalcompartiment is het compartiment zonder inkeping aan de zijkant van de bodem van de petrischaal.
    6. Voordat u de petrischaal met het deksel sluit, moet u ervoor zorgen dat de zij-inkepingen van het deksel en de bodem van de petrischaal op één lijn liggen om de steel niet te beschadigen.
    7. Sluit de petrischaal af met een strook paraffine die de bodem en het deksel verbindt, zorg ervoor dat de jonge stengel niet wordt geplet.
    8. Weeg en noteer het gemiddelde gewicht van de petrischaal om te bepalen wanneer de SAP-AS opnieuw moet worden gehydrateerd.
    9. Stapel de petrischaaltjes op elkaar om de ruimte te optimaliseren. Houd de petrischaal in het donker met behulp van een ondoorzichtig deksel met een opening aan de zijkant voor de zaailingen.
  2. SAP-AS beheren.
    1. Hydrateer de petrischaaltjes alleen met mMS-1 voedingsoplossing.
    2. Gebruik het gemiddelde gewicht als referentie. Wanneer de petrischaal 5-6 g lichter is geworden, voeg dan mMS-1 voedingsoplossing toe om deze terug te brengen naar het oorspronkelijke gewicht. Zorg ervoor dat het vermiculiet en SAP gehydrateerd blijven, maar niet overstroomd. Wortels moeten toegang hebben tot zuurstof.
    3. Naarmate de zaailing en zijn schimmelpartner zich ontwikkelen, moet u ze vaker irrigeren. Het is niet nodig om beide compartimenten tegelijkertijd water te geven. De irrigatievereisten variëren afhankelijk van de ontwikkeling van de zaailingen, maar ook afhankelijk van de omgevingsomstandigheden waarin SAP-AS wordt geïncubeerd.
    4. Verminder de irrigatiebehoefte door oude bladeren te verwijderen als de plant meer dan drie gezonde bladeren heeft. Verwijder dode bladeren.
      OPMERKING: De aanwezigheid van kationen zoals K+, Mg2+ en Ca2+ in de mMS-1-voedingsoplossing heeft de neiging om de uitbreiding van het SAP-netwerk13 in de loop van de tijd te verminderen.

6. Inoculatie van de SAP-AS met een enkele spore

OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen.

  1. Inoculeer met een enkele spore.
    1. Verwarm de glazen pipet met een vlamkaars of bunsenbrander. Trek terwijl het glas smelt om de glazen buis uit te rekken totdat deze loskomt.
    2. Breek onder een stereomicroscoop de punt van de glazen pipet om de inwendige diameter te verkleinen (meestal 100-300 μm). Dit zal de manipulatie van individuele sporen aanzienlijk vergemakkelijken.
    3. Open de petrischaal, zoek de plek waar de spore moet worden geplaatst en maak een ruimte vrij tussen de 5 g gehydrateerde SAP langs het nylon gaasfiltermembraan om een deel van een wortel bloot te leggen.
    4. Pak onder de ontleedmicroscoop een spore op met de geëxtrudeerde pipet. Pipeteer wat vloeistof voordat u de spore pipetteert. Vermijd pipetteervloeistof na het verzamelen van de spore.
    5. Breng de spore onder de ontleedmicroscoop voorzichtig aan op de wortel. De vloeistof die voor het pipetteren van de spore wordt gepipetteerd, helpt de spore te verdrijven. Als de spore niet op een optimale plaats wordt afgezet, gebruik dan een acupunctuurnaald of borstelhaar om de spore weer in contact te brengen met de wortel. Maak indien nodig een foto van de spore die op de wortel is afgezet ter referentie en gebruik een marker om de inoculatieplaats te lokaliseren.
    6. Vervang de SAP over het wortelfragment om een vochtige micro-omgeving voor de wortel en spore te bieden. Wacht minstens 24 uur voordat je het wortelcompartiment bevloeit en pas op dat je de sporen niet van de wortel afspoelt.
    7. Voordat u de petrischaal met het deksel sluit, moet u ervoor zorgen dat de zij-inkepingen van het deksel en de bodem van de petrischaal op één lijn liggen om de stengel van de zaailing niet te beschadigen.
      OPMERKING: De SAP-AS is klaar voor inoculatie wanneer de wortels het nylon gaasfiltermembraan bereiken, idealiter een paar dagen na irrigatie, dus er is geen vrije vloeistof.

7. Sporenontkieming op SAP (optioneel)

OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen.

  1. Ontkieming van sporen.
    1. Meng het gehydrateerde SAP om een gladde textuur te verkrijgen (zie stap 3.3.1). Luchtbellen verdwijnen meestal binnen 24 uur of door het mengen van het gemengde SAP (optioneel) te autoclaveren.
    2. Gebruik een spuit van 20 ml zonder naald om ongeveer 2 g (overeenkomend met 2 ml) gemengd SAP in elk putje van de plaat met 12 putjes te pipetteren.
    3. Selecteer een spore onder de ontleedmicroscoop en gebruik de geëxtrudeerde pipet zoals beschreven in sectie 6.
    4. Plaats onder de ontleedmicroscoop een spore in het midden van elk putje.
    5. Incubeer de plaat met 12 putjes in het donker bij RT en controleer regelmatig de kieming.
    6. Selecteer onder de ontleedmicroscoop een spore met een groeiende hyfen (minstens enkele millimeters lang).
    7. Voeg 1 ml mMS-1 voedingsoplossing toe aan het putje en wacht een paar minuten totdat het medium vloeibaarder is geworden.
    8. Gebruik indien nodig de acupunctuurnaald om de sporen en hyfen voorzichtig uit het substraat te verwijderen.
    9. Verzamel de sporen met een pipet of door de wortels van een zaailing naar het oppervlak van het medium te brengen om de sporen en hyfen aan de wortels te plakken. Plaats de zaailing vervolgens in de petrischaal zoals beschreven in stap 5.1.3.
      OPMERKING: Coördineer het ontkiemen van sporen en de groei van zaailingen. Deze methode is alleen getest met R . irregularis sporen.

8. Live monitoring van de ontwikkeling van de symbiose

OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen.

  1. Observeer routinematig met een ontleed-, rechtopstaande of omgekeerde microscoop.
    1. Bekijk de bovenkant van elk compartiment 20x – 40x met behulp van een ontleedmicroscoop met witte verlichting en donker veld.
    2. Als er geen omgekeerde microscoop beschikbaar is, observeer dan de bodem van elk compartiment met een ontleed- of rechtopstaande microscoop door de petrischaal om te keren. Voordat u de petrischaal omkeert, laat u de SAP-AS 2 dagen drogen zodat de SAP iets aan de bodem van de petrischaal hecht.
    3. Maak gedetailleerde waarnemingen op 40x door de bodem van de petrischaal en tot 100x (olie-onderdompeling) door het dekglaasje.
  2. Observeer sporen en hyfale netwerken.
    OPMERKING: De schimmelstructuren die zich in de SAP-korrels ontwikkelen, kunnen worden gekleurd.
    1. Bereid een inkt- en azijnoplossing voor volgens Vierheilig et al. (1998)15. Niet verwarmen.
    2. Extraheer een SAP-korrel met hyfen en sporen en plaats deze in de inkt bij RT. De inkt dringt door in de SAP-korrel en kleurt de schimmeldraden en sporen binnen enkele minuten.
    3. Verwijder de SAP-korrel en doe deze in mMS-1 voedingsoplossing of kraanwater. De inkt komt binnen 12 uur uit de korrel, maar de sporen en schimmeldraden blijven bevlekt.
    4. Druk de SAP-korrel tussen twee microscoopglaasjes om deze plat te maken voor fotografie en sporentelling.
  3. Observeer arbuscules.
    1. Haal een paar wortels uit het wortelcompartiment en beits met behulp van het inkt- en azijnprotocol volgens Vierheilig et al. (1998)15. Zorg ervoor dat u de wortels niet langer dan 2-3 minuten in de KOH-oplossing onderdompelt; Anders worden de wortels te kwetsbaar voor de volgende stappen en vallen ze uiteen in onbruikbaar puin.
    2. Selecteer onder een ontleedmicroscoop een wortelfragment van ongeveer 5 mm lang dat arbuscules kan bevatten en leg het op een objectglaasje in een druppel water.
    3. Scheur met acupunctuurnaalden of een extreem dun pincet de wortels af in lagen van een paar cellen dik.
    4. Absorbeer het water en controleer onder de microscoop of de segmenten met arbuscules nog aanwezig zijn en van voldoende kwaliteit zijn, en correct op het objectglaasje zijn geplaatst. Op dit punt moeten de arbuscules goed zichtbaar zijn in de wortelcellagen.
    5. Laat 2-3 minuten drogen zodat de wortellagen aan het glaasje hechten. Voeg een druppel polyvinylalcohol-melkzuurglycerol (PVLG)-buffer toe en voeg het dekglaasje toe. Observeer met standaard microscopiemethoden.

Resultaten

De SAP-AS is een eenvoudige en goedkope techniek voor het kweken van AM-schimmels en het observeren van de ontwikkeling van intraradicale en extraradicale schimmelstructuren. Hier hebben we een gedetailleerd protocol verstrekt om gebruikers te helpen bij het instellen van SAP-AS en hebben we twee wijzigingen geïntroduceerd ten opzichte van de oorspronkelijke beschrijving van de SAP-AS.

Ten eerste vergemakkelijkt de aanwezigheid van SAP op het wortelcompartiment langs het Nitex-membraan de inoculatie van het systeem met een enkele spore (Figuur 1).

figure-results-1
Figuur 1: Enkelvoudige sporeninoculatie van de SAP-AS. (A) Inoculatie met een enkele spore van Rhizophagus irregularis. (B) Inoculatie met een enkele spore van Funneliformis mosseae. De witte pijlen geven het punt van inoculatie aan. Schaal balken: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het is gemakkelijk om een gebied met een paar wortels te identificeren waar de spore kan worden afgezet. De exacte locatie van de spore kan op het oppervlak van het deksel van de petrischaal worden gemarkeerd en periodiek worden gecontroleerd op ontkieming en kolonisatie van de wortels. De aanwezigheid van gehydrateerde SAP-korrels zorgt voor een vochtige omgeving die bevorderlijk is voor het ontkiemen van sporen. De inoculatie op de wortels naast het Nitex-membraan zorgt voor een snelle ontwikkeling van de symbiose met het extraradicale mycelium om snel toegang te krijgen tot het hyf-compartiment en te foerageren naar voedingsstoffen (Figuur 2). Het vermogen om te observeren of de enkele spore die op het inoculatiepunt is geplaatst, ontkiemt of niet, stelt ons ook in staat om niet-succesvolle culturen te identificeren en te verwijderen en te vervangen.

Ten tweede maken de dekglaasjes aan de onderkant van de petrischaal een hoge resolutie live beeldvorming mogelijk van de AM-schimmelsymbiose (Figuur 2B,C) en, in het bijzonder, van de cytoplasmatische stroom in het extraradicale mycelium (Figuur 2D).

figure-results-2
Figuur 2: Geënt SAP-AS. (A) SAP-AS geënt met een enkele spore van Rhizophagus irregularis (DAOM 197198). De waardplant is Plantago lanceolata. (B) Cluster van sporen waargenomen door het dekglaasje in het hyfale compartiment onder een stereomicroscoop. Schaalbalk: 500 μm. (C) Foto met hoge resolutie van de sporencluster waargenomen door het dekglaasje onder een lichtmicroscoop met een vergroting van 10x. Schaalbalk: 100 μm (D) Foto met hoge resolutie van hyfen waargenomen door het dekglaasje onder een lichtmicroscoop met een vergroting van 100x. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gebruikers kunnen proberen AM-schimmelsporen te ontkiemen op SAP gehydrateerd met mMS-1 voedingsoplossing om te garanderen dat de SAP-AS alleen wordt geïnoculeerd met levensvatbare sporen (Figuur 3). Dit werd echter alleen getest met commerciële sporen van R. irregularis, en het succes van het ontkiemen van sporen op SAP gehydrateerd met mMS-1 voedingsoplossing kan aanzienlijk variëren met andere AM-schimmelsoorten.

figure-results-3
Figuur 3: Ontkieming van R. irregularis sporen in een plaat met 12 putjes. Schaalbalk: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ten slotte, omdat SAP-AS een in vivo, niet-steriele techniek is voor het vermeerderen van AMF, kan de petrischaal op de bank worden gemanipuleerd en geopend om gekoloniseerde wortels, vrije sporen of gekoloniseerde SAP-korrels te bemonsteren (Figuur 4). Intraradicale en extraradicale schimmelstructuren kunnen worden gekleurd op een manier die vergelijkbaar is met AMF die wordt gepropageerd in pot- of wortelorgaanculturen (Figuur 4C).

figure-results-4
Figuur 4: Extraradicale en intraradicale AM-schimmelstructuren geëxtraheerd uit de SAP-AS. (A) Vrije sporen van R. irregularis waargenomen in het wortelcompartiment. Schaalbalk: 200 μm. (B) Sporen van R. irregularis gekleurd in SAP. Schaalbalk: 500 μm. (C) Gekleurd wortelfragmenten met de intraradicale hyfen en arbuscules. Schaalbalken: 50 μm, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Vergelijking van de dikte van de verschillende instrumenten die beschikbaar zijn om AM-schimmelsporen te manipuleren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: SAP-AS gestapeld. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Inoculatie is de meest kritische stap in het protocol en de geëxtrudeerde glazen Pasteur-pipetten bleken een uitstekend hulpmiddel te zijn voor het nauwkeurig manipuleren van afzonderlijke sporen van AM-schimmels met behoud van hun integriteit. De geëxtrudeerde glazen pasteurpipetten kunnen eenvoudig worden gevormd met behulp van de vlam van een kaars of bunsenbrander, en de opening kan onder de stereomicroscoop worden aangepast aan de grootte van de spore die wordt gepipeteerd. Het is belangrijk om de sporen te manipuleren met gereedschap dat is aangepast aan de grootte van AM-schimmelsporen (aanvullende figuur 1) en om de SAP-AS te inoculeren wanneer de wortels van de waardplant lang genoeg zijn om het Nitex-membraan te bereiken waar de spore wordt afgezet.

De SAP-AS zijn eenvoudig aan te passen aan de eisen van het experiment. Grotere petrischaaltjes kunnen worden gebruikt, met meerdere compartimenten, om bijvoorbeeld de interactie tussen nauw verwante stammen of tussen verschillende soorten AMF te monitoren of om de chemische (pH) of biologische omgeving (introductie van nematoden, bacteriën, schimmels) te wijzigen. Verschillende mycotrofe waardplanten kunnen ook worden gebruikt om de AM-schimmels te voorzien van fotodynamieten. De voedingsoplossing mMS-1 is afgeleid van het minimale (M) medium recept beschreven door Bécard en Fortin (1988)15 minus de sucrose, vitaminen en bacto-agar om koolstofbronnen te beperken. De SAP-AS kan echter worden aangevuld met verschillende voedingsoplossingen, afhankelijk van de doelstellingen van het experiment.

De vermeerdering van AM-schimmels in SAP-AS vereist regelmatig water geven. Het beperkte volume vermiculiet en SAP stelt de wortels en de AM-schimmel bloot aan schommelingen in de luchtvochtigheid, vooral in standaard petrischalen met twee compartimenten (diameter 10 cm). Het vermogen om uit te breiden en daarmee de transparantie van de SAP-korrels neemt in de loop van de tijd af. In feite beperkt de aanwezigheid van kationen uit de voedingsoplossing geleidelijk de uitbreiding van het acrylaatnetwerk en vereist het noodzakelijk dat het SAP na maanden wordt vervangen. Bovendien kunnen groene algen en schimmels na verloop van tijd groeien als petrischalen niet goed worden beschermd tegen licht of te veel water krijgen.

Tot op heden zijn zeven AM-schimmelsoorten met succes gekweekt in SAP-AS, wat ver onder het aantal AM-schimmelsoorten ligt dat in potculturen kan worden vermeerderd. Zowel de biotische als de abiotische omstandigheden in SAP-AS lijken echter sterk op die in potculturen, en het is waarschijnlijk dat andere AM-schimmelsoorten zich in SAP-AS zouden moeten kunnen voortplanten. Directe inoculatie van sporen in SAP-AS zorgt waarschijnlijk voor milieuomstandigheden die dichter bij die van de rhizosfeer in een natuurlijke bodem liggen vanwege de aanwezigheid van wortelexudaten en/of bacteriën, als niet-steriele sporen/zaden worden gebruikt voor inoculatie. Dit verdient de voorkeur boven inoculatie met ontkiemde sporen. Bovendien zijn de omstandigheden die sporen ontkiemen binnen AMF nog steeds slecht begrepen, daarom is SAP gehydrateerd met mMS-1 voedingsoplossing mogelijk niet aangepast om sporen van andere AM-schimmelsoorten te laten ontkiemen. Sporenkieming op SAP gehydrateerd met mMS-1 voedingsoplossing werd getest om specifiek levensvatbare sporen te selecteren voor de inoculatiestap met alleen R. irregularis inoculum.

Inenting en monitoring van de ontwikkeling van de AM-symbiose kunnen eenvoudig worden uitgevoerd in SAP-AS. De gemodificeerde petrischaaltjes met twee compartimenten maken het mogelijk om verschillende AM-schimmelsoorten te kweken. Paré et al.12 hebben zeven verschillende AMF-soorten uit zes geslachten en drie families vermeerderd. Het aanpassen van petrischalen met twee compartimenten is eenvoudig te doen met goedkoop gereedschap. De kosten en de hoeveelheid materialen (vermiculiet, SAP, pasteurpipet, enz.) en reagentia (mMS-1) die nodig zijn om de SAP-AS te bereiden en te onderhouden, zijn beperkt, waardoor een groot aantal SAP-AS tegen minimale kosten kan worden beheerd. De mogelijkheid om de SAP-AS te stapelen vermindert ook aanzienlijk de voetafdruk van AM-schimmelculturen in vergelijking met potculturen. Er passen bijvoorbeeld 50 SAP-AS (5 stapels van tien) op een plank van 1 m lang (aanvullende figuur 2). Deze eigenschappen maken de SAP-AS tot een eenvoudige en goedkope techniek die compatibel is met het onderwijzen van AM-symbiose in laboratoriumcursussen op de middelbare school of op bachelorniveau aan universiteiten. Gekoloniseerde SAP-korrels kunnen worden gebruikt om nieuwe SAP-AS- of potculturen te inoculeren.

De aanwezigheid van een dekglaasje aan de achterkant van de bodem van de petrischaal maakt fotografie en video met hoge resolutie van de extraradicale schimmelstructuren mogelijk. De cytoplasmatische stroom kan gemakkelijk worden bestudeerd onder levensomstandigheden die zeer dicht bij natuurlijke omstandigheden liggen. Dit is van groot belang voor studies van AM-schimmelfuncties die verband houden met hun mycelia (voedingsstoffen, watertransport, bodemstructuur, enz.) en voor studies van hyphale morfogenese.

AMF voltooien hun biologische cyclus in plantenwortels en in de rhizosfeer. De studie van bodemmicro-organismen is complex vanwege de inherente moeilijkheid om het bodemmilieu te observeren. Het belangrijkste doel van de SAP-AS is om een omgeving te creëren die zo veel mogelijk lijkt op de rhizosfeer voor de voortplanting van AM-schimmels, terwijl het vermogen behouden blijft om de ontwikkeling van AM-schimmels tot in detail te observeren. Omdat dit niet-steriele omstandigheden impliceert, moet de hoeveelheid beschikbare koolstof worden beperkt om de proliferatie van saprotrofe micro-organismen te voorkomen. De kennis van het gedrag van AM-schimmels in de rhizosfeer is nog uiterst beperkt en de SAP-AS biedt de mogelijkheid om gedetailleerde vergelijkingen te maken tussen soorten met betrekking tot hun vermogen om te foerageren in de extraradicale omgeving, hun sporenproductie en hun wortelkolonisatie. Dit kan verder worden gecompliceerd door interacties met andere bodemsoorten zoals bacteriën, nematoden, protisten en wortelschimmelpathogenen toe te voegen, en de kennis van interacties van bodemmicrobiota kan worden verbeterd dankzij de SAP-AS.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen de twee anonieme recensenten bedanken voor hun suggesties. Financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door Agriculture and Agri-Food Canada (AAFC) in het kader van project J-002295 (Beheer en verbetering van de biologische collecties van AAFC).

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 x 15 mm Stackable Bi-PlateKord Valmark1204U09https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate
12-well plate Greiner Bio-one665180https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html
18 mm ronde glazen dekglasjesFisher Scientific12-545-100https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100
20 mL SPuit PP/PE zonder naaldMillipore SigmaZ683620-100EAhttps://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium=
cpc&utm_campaign=20674735406
&utm_content=157607444391&gc
lid=Cj0KCQiA5rGuBhCnARIsAN11
vgQOT_WPRg9WFyBEyoO4b0x1
-F7Tks4houU7VTRS5EiYM9l0F-B
oL7saAmFoEALw_wcB
Naald voor acupunctuur LierreA143-LP1-3075https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad
_source=1&gclid=Cj0KCQiA5rGuBh
CnARIsAN11vgTwupmw51UTdR
k9cKr4ewi12W3dyVikenzH3sjdUB4
g41G-_KnvppoaAkbTEALw_wcB&
utm_campaign=PMax-needles&utm_content=shopify_CA_
5213169090694_35001500991622
&utm_medium=cpc&utm_source=
google&variant=35001500991622
BlotpapierFLINN FB0678https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/
Commerciële of wetenschappelijke blender of keukenstaafmixerkitchenaidKHBV53DGhttps://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html 
Dremel 199 Carving BitDremel2615000199https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199
Dry SAP medium granulometrie 1–2 mmHORTA-SORB MD00810085242789https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/
Feather roestvrijstalen mesjes voor dissecerneermes-handgrepen Fisher Scientific08-916-5Bhttps://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b
Glazen Pasteur-pipetten 230 mmKimbleRK-25554-14https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414
InktSheaffer94321https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU
Smeltgids: gemodificeerde schilderskrabbelaar, 2-inchMastercraft#049-7335-8https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp
MicroscoopglasplaatjeFisher Scientific12-552-5https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525
Nitex nylon gaasfilterscherm Dynamic Aqua-Supply Ltd.NTX30-108https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r&
variant=6945749106731
PaperclipMakanu‎Clips-BK-41mm-24https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes
ParafilmAvantor/vwr470201-930https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm
Plantago lanceolata zadenecoumeneNAhttps://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/
Polyvinylalcohol-melkzuur-glycerol (PVLG).NANAhttps://invam.ku.edu/recipes
Pyrografieset met fijne puntWalnut Hollow483103https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool
Siliconen afdichtmiddelAqueon100165003https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant
Chirurgisch scalpelhandvatFisher Scientific22-079657https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel
Tweesnelheids roterend gereedschapssetDremel200-1/21https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah
VermiculietPRO-MIX4981110https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l

Referenties

  1. Dotzler, N., Krings, M., Taylor, T. N., Agerer, R. Germination shields in Scutellospora (Glomeromycota: Diversisporales, Gigasporaceae) from the 400 million-year-old Rhynie chert. Mycol Prog. 5 (3), 178-184 (2006).
  2. Redecker, D. Glomalean fungi from the ordovician. Science. 289 (5486), 1920-1921 (2000).
  3. Olsson, P. A., Jakobsen, I., Wallander, H. Foraging and Resource Allocation Strategies of Mycorrhizal Fungi in a Patchy Environment. Mycorrhizal Ecology. Ecological Studies. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2003).
  4. Zheng, C., Chai, M., Jiang, S., Zhang, S., Christie, P., Zhang, J. Foraging capability of extraradical mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi to soil phosphorus patches and evidence of carry-over effect on new host plant. Plant Soil. 387 (1-2), 201-217 (2015).
  5. Singh, A. K., et al. The role of glomalin in mitigation of multiple soil degradation problems. Crit Rev Environ Sci Technol. 52 (9), 1604-1638 (2022).
  6. Wilson, G. W. T., Rice, C. W., Rillig, M. C., Springer, A., Hartnett, D. C. Soil aggregation and carbon sequestration are tightly correlated with the abundance of arbuscular mycorrhizal fungi: results from long-term field experiments. Ecol Lett. 12 (5), 452-461 (2009).
  7. Gianinazzi, S., Gollotte, A., Binet, M. -N., van Tuinen, D., Redecker, D., Wipf, D. Agroecology: the key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
  8. Stürmer, S. L. A history of the taxonomy and systematics of arbuscular mycorrhizal fungi belonging to the phylum Glomeromycota. Mycorrhiza. 22 (4), 247-258 (2012).
  9. Gerdemann, J. W., Nicolson, T. H. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Trans Br Mycol Soc. 46 (2), 235-244 (1963).
  10. Walker, C., Vestberg, M. A simple and inexpensive method for producing and maintaining closed pot cultures of arbuscular mycorrhizal fungi. Agr Sci Finland. 3, 233-240 (1994).
  11. Fortin, J. A., et al. Arbuscular mycorrhiza on root-organ cultures. Can J Bot. 80 (1), 1-20 (2002).
  12. Paré, L., Banchini, C., Hamel, C., Bernier, L., Stefani, F. A simple and low-cost technique to initiate single-spore cultures of arbuscular mycorrhizal fungi using a superabsorbent polymer. Symbiosis. 88, 61-73 (2022).
  13. Saha, A., Sekharan, S., Manna, U. Superabsorbent hydrogel (SAH) as a soil amendment for drought management: A review. Soil Tillage Res. 204, 104736(2020).
  14. Bécard, G., Fortin, J. A. Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots. New Phytol. 108 (2), 211-218 (1988).
  15. Vierheilig, H., Coughlan, A. P., Wyss, U., Piché, Y. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl Environ Microbiol. 64 (12), 5004-5007 (1998).

Herprints en machtigingen

Tags

Arbusculaire mycorrhizaschimmelssuperabsorberend polymeersysteeminoculatie met enkele sporenmodificatie van petrischaalwortelcompartimenthyfencompartimentin vitro cultuurnutri ntenopnamedigitale observatiestereomicroscoop
Inoculeren en observeren van arbusculaire mycorrhizaculturen op superabsorberende autotrofe systemen op basis van polymeren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.