Methodenartikel

Op Applast gebaseerde methode om de zuiverheid van plantaardig geproduceerd recombinant eiwit te verbeteren

DOI:

10.3791/66852

⸱

5 juli 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Academy of Medical Sciences, Shandong First Medical University, 2State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 3College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, 4Beijing Life Science Academy

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De zuivering van recombinante eiwitten uit plantensystemen wordt meestal uitgedaagd door plantaardige eiwitten. Dit werk biedt een methode om een uitgescheiden recombinant eiwit effectief te extraheren en te zuiveren uit de apoplast van Nicotiana benthamiana.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Planten zijn een nieuw ontwikkeld eukaryotisch expressiesysteem dat wordt onderzocht om therapeutische eiwitten te produceren. Zuivering van recombinante eiwitten uit planten is een van de meest kritische stappen in het productieproces. Doorgaans werden eiwitten gezuiverd uit totaal oplosbare eiwitten (TSP), en de aanwezigheid van diverse intracellulaire eiwitten en cytochromen vormt een uitdaging voor de volgende eiwitzuiveringsstappen. Bovendien worden de meeste therapeutische eiwitten zoals antigenen en antilichamen uitgescheiden om een goede glycosylering te verkrijgen, en de aanwezigheid van onvolledig gemodificeerde eiwitten leidt tot inconsistente antigeen- of antilichaamstructuren. Dit werk introduceert een effectievere methode om sterk gezuiverde recombinante eiwitten uit de apoplastische ruimte van planten te verkrijgen. Het recombinante groene fluorescerende eiwit (GFP) is ontworpen om te worden uitgescheiden in de apoplast van Nicotiana benthamiana en wordt vervolgens geëxtraheerd met behulp van een infiltratie-centrifugatiemethode. Het GFP-His uit de geëxtraheerde apoplast wordt vervolgens gezuiverd door nikkelaffiniteitschromatografie. In tegenstelling tot de traditionele methoden van TSP, produceert zuivering van de apoplast sterk gezuiverde recombinante eiwitten. Dit betekent een belangrijke technologische verbetering voor plantaardige productiesystemen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tegenwoordig worden verschillende door planten geproduceerde recombinante therapeutische eiwitten bestudeerd, waaronder antilichamen, vaccins, bioactieve eiwitten, enzymen en kleine polypeptiden 1,2,3,4,5,6. Planten worden een steeds meer gebruikt platform voor de productie van therapeutische eiwitten vanwege hun veiligheid, lage kosten en het vermogen om de productie snel op te schalen 7,8. Eiwitexpressie en -modificatie in plantsystemen, samen met eiwitzuivering, zijn kritische factoren die de productiviteit van plantenbioreactoren bepalen 9,10. Het verbeteren van de productiviteit van planten en het verkrijgen van zeer zuivere doeleiwitten zijn de belangrijkste uitdagingen waarmee plantaardige productiesystemen worden geconfronteerd11,12.

De subcellulaire lokalisatie en modificatie van recombinante eiwitten hangt af van het specifieke signaalpeptide dat gecodeerd is aan de N-terminus, dat het eiwit tijdens genexpressie naar zijn uiteindelijke organelbestemming richt. Recombinante eiwitten zijn ontworpen om te lokaliseren in de apoplast, endoplasmatisch reticulum (ER), chloroplast, vacuole of cytoplasma, op basis van hun unieke eigenschappen13. Voor antigenen en antilichamen hebben uitgescheiden eiwitten de voorkeur. Vóór secretie gaan eiwitten door ER en Golgi voor correcte vouwing en post-translationele modificaties 14,15,16.

Na productie in planten moeten recombinante eiwitten worden gezuiverd uit plantenextracten. Doorgaans worden eiwitten gezuiverd uit totaal oplosbare plantenextracten, die overvloedige intracellulaire eiwitten, verkeerd gevouwen en niet-gemodificeerde producten en cytochromen bevatten. Om onzuiverheden te verwijderen, ondergaan plantenextracten uitgebreide fractionering, waaronder ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase/oxygenase (RuBisCO)-specifieke affiniteitschromatografie, fytaatprecipitatie, polyethyleenglycolprecipitatie en aanpassing van temperatuur en pH18,19. Dergelijke stappen voor het verwijderen van onzuiverheden zijn arbeidsintensief en kunnen de eiwitkwaliteit in gevaar brengen.

Het plantencelcompartiment voorbij het plasmamembraan wordt gedefinieerd als de apoplast, die de celwand, intercellulaire ruimtes en xyleem20 omvat. De waterige fase wordt gewoonlijk apoplast wasvloeistof (AWF) genoemd. AWF bevat moleculen die door cellen worden uitgescheiden om tal van biologische ontwikkelingen te reguleren, zoals transport, celwandmetabolisme en stressreacties21,22. In tegenstelling tot TSP zijn de moleculaire bestanddelen van AWF minder complex. Het extraheren van recombinante eiwitten uit AWF kan besmetting door intracellulaire eiwitten, verkeerd gevouwen producten en cytoplasmatische resten voorkomen. In het kort komt extractielipide de bladeren binnen via de huidmondjes onder negatieve druk, en de AWF wordt verzameld door zachte centrifugatie23. Hoewel isolatie van AWF op grote schaal wordt gebruikt om de biologische vooruitgang in apoplast 24,25,26,27 te bestuderen, is het niet benut in plantaardige productiesystemen.

Het verbeteren van de productiviteit van planten en het verkrijgen van zeer zuivere doeleiwitten zijn centrale uitdagingen voor plantaardige productiesystemen28. Doorgaans worden eiwitten gezuiverd uit totaal oplosbare plantenextracten die grote hoeveelheden intracellulaire eiwitten, verkeerd gevouwen en niet-gemodificeerde producten en cytochromenbevatten 29, die hoge kosten met zich meebrengen voor de daaropvolgende zuivering30. Het gebruik van AWF-eiwitextractiemethoden voor de extractie van exogene recombinante eiwitten die in apoplast worden uitgescheiden, kan de homogeniteit van recombinante eiwitten effectief verbeteren en de kosten van eiwitzuivering verlagen. Hier gebruiken we een signaalpeptide PR1a om exogene eiwitsecretie in de apoplastruimte mogelijk te maken en introduceren we een gedetailleerde methode voor recombinante eiwitzuivering uit de AWF van N. benthamiana.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van N. benthamiana planten

  1. Leg de zaailingenblokken in een bakje, voeg 1 L water toe en laat ongeveer 2 uur weken tot ze volledig verzadigd zijn.
  2. Strooi gelijkmatig wildtype N. benthamiana zaden op de zaailingenblokken, dek af met een deksel en ontkiem gedurende 1 week. Kweek N. benthamiana in een kas met 18 uur fotoperiode, 24 °C, 45% relatieve vochtigheid en bemest elke 2 weken.
  3. Zodra de zaden zijn ontkiemd, gebruikt u een pincet om een zaailing voorzichtig te verwijderen en zorgt u ervoor dat u de wortels niet beschadigt. Graaf een kleine kuil in het midden van een nieuwe bak, plaats de zaailing erin en bedek de wortels lichtjes met aarde. Dek af met een deksel en groei verder.
  4. Groei tot de zaailingen drie bladeren hebben, met het deksel erop. Verwijder het deksel als het4e echte blad tevoorschijn komt.
  5. Laat de planten nog twee weken doorgroeien voordat ze agro-infiltreren.

2. Opbouw van de recombinant GFP-His

  1. Voer optimalisatie en synthese van het N. benthamiana codon uit van GFP en PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) op basis van de gensequenties.
  2. Voer een dubbele vergisting van de pCAMBIA1300-vector uit met behulp van Xba I- en Sac I-enzymen (zie materiaaltabel).
  3. Voer versterking van PR1a uit met behulp van stroomopwaartse primers (TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT
    TGTTCTCTTTTC) en downstream primers (TCCTCG
    CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
    GTGGG), versterking van GFP met behulp van upstream-primers (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG
    CAAGGGCGAGGA) en downstream primers (GGGGAAATTCGAGCTCAGTGGTGATGGTGGTG
    GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
  4. Met behulp van homologe recombinatie, kloon PR1a en GFP in de pCAMBIA1300 plantexpressievector. Nadat je bent overgestapt op E. coli, selecteer je enkele klonen en stuur je ze naar het bedrijf voor sequencing. Vergelijking van sequentieresultaten en het juiste plasmide is het recombinante plasmide pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, aangeduid als p35s-PR1a-GFP-His.

3. Productie van GFP-His in N. benthamiana

  1. Voeg 1 μL GFP-plasmide toe aan 50 μL Agrobacterium-receptorcellen GV3101, meng voorzichtig en voeg toe aan de elektrodebeker, verwijder na elektrocutie op de elektroshocker.
  2. Verspreid getransformeerde Agrobacterium tumefaciens op een LB vaste mediumplaat met 50 μg/ml kanamycine (Kan) en 50 μg/ml rifampicine (Rif). Geïncubeerd omgekeerd bij 28 °C gedurende 48 uur. De pCAMBIA1300-vector is kan-resistent en Agrobacterium is rif-resistent; alleen de juiste Agrobacterium kan groeien op platen met kan en rif. De monoklonale klonen waren de positieve transformanten, genaamd A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).
  3. Gebruik een gesteriliseerde tandenstoker om een geschikte hoeveelheid AtGPG op te nemen en inoculeer deze in 4 ml vloeibare LB met Kan en Rif. Cultuur bij 28 °C, 220-300 rpm gedurende 24 uur.
  4. Subcultuurbacteriën 1:50 tot verse LB (50 μg/ml Kan, 10 mM 2-(N-Morpholino) ethaansulfonzuur (MES), 20 μM acetosyringon (AS)) en incuberen bij 28 °C, 220-300 rpm gedurende 10-12 uur.
  5. Oogst bacteriën door centrifugeren bij 1500 x g gedurende 10 minuten en resuspendeer de pellet met 1 ml MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 100 μM AS).
  6. Meet en pas de optische dichtheid (OD) van AtGPG aan tot OD600=0.8 met behulp van MMA. Incubeer de bacteriën nog 2-4 uur bij kamertemperatuur. Zuig de bacteriële oplossing op met een naaldloze spuit, druk deze lichtjes tegen de achterkant van de bladeren en oefen druk uit om de oplossing in de bladeren te laten doordringen. Injecteer alleen de middelste 3-4 bladeren per plant.
  7. Ga door met het kweken van N. benthamiana in de kas gedurende 3-4 dagen voordat u bladeren oogst voor eiwitextractie.

4. Observeren van subcellulaire lokalisatie van GFP

  1. Selecteer na 48 uur agro-infiltratie een plat blad en gebruik een perforator van 6 mm om het mes vast te klemmen voor het ponsen.
  2. Druppel 30% sucrose-oplossing op een glasplaatje, plaats het bladmonster met de achterkant naar boven en dek het af met een afdekglas.
  3. Stel de excitatiegolflengte in op 488 nm en detecteer de groene fluorescentie bij 490-550 nm na een vergroting van 400x. Maak de eerste foto zodra de dia is voorbereid en 10 minuten later nog een.

5. GFP extraheren uit plant

  1. AWF-extractie
    1. Verzamel de intacte verse N. benthamiana bladeren die recombinant GFP tot expressie brengen 3 dagen na agro-infiltratie. Behandel het blad voorzichtig en behoud de integriteit van het blad om intracellulaire eiwituitstroom te voorkomen. Gebruik verzamelde bladeren direct voor de volgende stap om eiwitafbraak te voorkomen.
    2. Spoel het bladmes af met voorgekoelde gesteriliseerde ddH2O om vuil te verwijderen.
    3. Weeg verse bladeren af en dompel 20 g bladeren (met de abaxiale kant naar beneden) onder in 100 ml voorgekoelde fosfaatbuffer van 100 mM (PB 100 mM Na2, HPO4 en 100 mM NaH2PO4 werden afzonderlijk geconfigureerd en gemengd in een verhouding van 2,2:1, pH 7,0) in een bekerglas van 200 ml met wijde mond. Bedek de bladeren met 100 mesh nylon fijnmazig garen (zie Materiaaltabel) en een plastic plaat.
      OPMERKING: Voorkoeling voorkomt eiwitafbraak. Buffervolumes kunnen worden aangepast op basis van de experimentele schaal. Zorg ervoor dat alle bladeren ondergedompeld zijn.
    4. Plaats het bekerglas in een vacuümpomp. Pas een vacuüm van 0.8 MPa toe gedurende 1 minuut en herstel vervolgens snel naar atmosferische druk.
    5. Haal de bladeren uit de buffer en dep ze voorzichtig droog met absorberend papier. Rol de bladeren op, wikkel ze in gaasgaren en doe 5 g bladeren in elke centrifugebuis van 50 ml. Om AWF te verzamelen, plaatst u de opgerolde bladeren met de kop naar boven in buizen met gaasgaren dat is vastgemaakt aan de buisdoppen.
    6. Centrifugeer bij 4 °C, 500 x g gedurende 5 min. Verwijder de bladeren en verzamel de AWF op de bodem van de buis met behulp van een pipet. Uit elke buis kan ongeveer 5 ml AWF worden gehaald.
      OPMERKING: Om interferentie van intracellulaire eiwitten te minimaliseren en om de maximale hoeveelheid AWF-eiwitten te extraheren, kan de extractie 2x-3x worden herhaald, maar niet meer dan 3x.
  2. Extractie van totaal oplosbaar eiwit
    1. Maal 20 g bladeren tot fijn poeder in vloeibare stikstof. Voeg extractiebuffer toe (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 0,034% β-mercaptoethanol (zie materiaaltabel)) in een verhouding van 1:2.
    2. Schud homogenaat in een verticale menger gedurende 30 minuten bij 4 °C. Centrifugeer homogene bij 13.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
    3. Breng het supernatans over in een nieuwe buis en herhaal het centrifugeren gedurende 15 minuten. Breng het geklaarde supernatans over in een andere buis.
    4. Filtreer het supernatans door een filter van 0,22 μm (zie materiaaltabel) om totaal oplosbaar eiwitextract te verkrijgen.

  

6. Zuivering van GFP-His met nikkel (Ni) affiniteitschromatografie

OPMERKING: Voer alle stappen uit bij 4 °C.

  1. Voeg Ni sepharose excel hars (zie Materiaaltabel) toe aan een tube in een verhouding van 1:1000 ten opzichte van het eiwitextractvolume uit stap 5.1.6. Het harsvolume is gelijk aan 1/1000ste van het volume van het eiwitextract.
  2. Was Ni-hars 3x met 10x harsvolume van ddH2O en PB (pH 7,0) om de beurt afzonderlijk en verwijder het supernatant.
  3. Incubeer eiwitextract met Ni-hars gedurende 2 uur om volledige binding mogelijk te maken. Centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten om ongebonden eiwitten in het supernatant te verwijderen. 3x wassen met 20x harsvolume PB. Centrifugeer op 500 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
  4. Elute GFP-His door 10x harsvolume van 250 mM imidazol (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 250 mM imidazool) toe te voegen en het supernatant te verzamelen.

7. Coomassie blauwe kleuring van eiwitten

  1. Voeg 10 μL 5x SDS-laadbuffer toe aan 40 μL eiwitmonsters, kook gedurende 10 minuten en laat vervolgens 60 minuten draaien op 15% SDS-PAGE op 110 V.
  2. Kleuring eiwitgels met Coomassie blauwe oplossing (0,1% R-250, 25% isopropanol, 10% ijsazijn) gedurende 2 uur.
  3. Giet de oplossing af en was met ontkleuringsoplossing gedurende 2 uur. Observeer de gel; Eiwitten op de gel worden blauw gekleurd.

8. Western blotting van eiwitten

  1. Voeg 10 μL 5x SDS-laadbuffer toe aan 40 μL eiwitmonsters, kook gedurende 10 minuten en laat vervolgens 60 minuten draaien op 15% SDS-PAGE op 110 V.
  2. Breng eiwitten over naar een nitrocellulosemembraan van 0,45 μm bij 280 mA. Blokkeer het membraan met 5% magere melk gedurende 1 uur.
  3. Verdun de anti-His-tag antilichamen bij 1:5000 en incubeer het membraan met de antilichamen gedurende 1 uur. Gebruik de tris-gebufferde zoutoplossing en tween 20 (TBST) om het membraan 4x gedurende 5 minuten te wassen.
  4. Verdun de anti-muisantilichamen tot 1:10000 en incubeer het membraan met de antilichamen gedurende 1 uur. Gebruik TBST om het membraan 4x gedurende 5 minuten te wassen.
  5. Meng de ontwikkelaar (zie Tabel met materialen) in de verhouding 1:1. Voeg 400 μL toe aan het membraan en laat 1 minuut inwerken. Maak foto's na 1 minuut belichting met een visualizer.

9. Analyse van de eiwitconcentratie

  1. Voeg 5 μL eiwit toe aan 1 ml Bradford 1x kleurstofreagens en reageer gedurende 5 minuten.
  2. Bepaal de OD595-waarde na nulstelling en bereken de eiwitconcentratie op basis van de standaardcurve.

10. Kwantificering van eiwitten 31

  1. Voer Western blotting van eiwitmonsters uit samen met standaarden.
  2. Voer kwantificering van GFP uit in verhouding tot standaarden met behulp van ImageJ 1.5.0 grijswaardenanalyse.

  

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GFP-His is het doelwit van secretie in de apoplastische ruimte van N. benthamiana
GFP werd gekloond in het pCAMBIA1300-plasmide met een N-terminaal PR1a-signaalpeptide voor secretie en een C-terminale His-tag voor zuivering, waarbij p35s-PR1a-GFP-His werd gegenereerd (Figuur 1A). Het recombinante eiwit werd tijdelijk tot expressie gebracht in N. benthamiana en een 30 kDa-band werd gedetecteerd door western blot met behulp van anti-His-antilichaam 3 dagen na agro-infiltratie (Figuur 1B). Plasmolyse is de behandeling van bladeren met behulp van een hypertone oplossing om de celwand van het celmembraan te scheiden32. Om te bepalen of GFP zich in de applast bevindt, gebruikten we 30% sucrose om de bladeren plasmolyse te maken. Fluorescentiemicroscopie illustreerde de aanwezigheid van GFP-His in de apoplast (Figuur 1C). AWF-eiwitten geëxtraheerd door vacuüminfiltratie-centrifugatie bevatten ook GFP-His (Figuur 1D). Deze resultaten tonen de afscheiding van GFP-His aan in de AWF van N. benthamiana bladeren, waaruit het kan worden geëxtraheerd voor stroomafwaartse zuivering.

Eiwitzuivering uit AWF
De werkzaamheid van AWF-extractie heeft een sterke invloed op de uiteindelijke GFP-opbrengst. Voortbouwend op de gepubliceerde AWF-extractieprotocollen 24,25,26,27 hebben we verschillende oplossingen getest om het herstel van uitgescheiden GFP-His te optimaliseren. Hier werden acht extractieoplossingen onderzocht: 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4,5), 50 mM NaCl (pH 7,1), 40 mM KCl (pH 7,0), 20 mM CaCl2 (pH 5,7), 100 mM PB (pH 7,0), 10 mM MES (pH 5,6) en ddH2O (pH 7,0). PB extraheerde de grootste hoeveelheid AWF en GFP-His, meer dan 4x meer dan andere oplossingen (Figuur 2A,B). Vergelijking van PB bij variërende pH onthulde verbeterde AWF- en GFP-He-extractie bij neutrale tot licht alkalische omstandigheden (pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 en 8.0; Figuur 2C,D). Bovendien werden PB met concentraties van 50 mM, 100 mM en 150 mM vergeleken voor de extractie-efficiëntie. De resultaten gaven aan dat 100 mM PB maximale werkzaamheid vertoonde voor het herstellen van zowel AWF als GFP-His (Figuur 2E,F).

Op basis van deze optimalisatie-experimenten werd 100 mM PB, pH 7,0, geselecteerd voor grootschalige AWF-extractie uit N. benthamiana. Met behulp van deze buffer werd 495 μg totaal AWF-eiwitten per gram vers bladmateriaal uit de apoplast teruggewonnen (Figuur 2G). De geëxtraheerde AWF bevatte 10 μg GFP-His (figuur 2H), wat overeenkwam met ongeveer 18% van de totale GFP-his in de TSP (figuur 2I). Na Ni-affiniteitschromatografie bereikte de GFP-He-zuiverheid 84,3% bij AWF-extractie, aanzienlijk hoger dan de zuiverheid van 44,9% die werd bereikt door extractie van totaal oplosbaar eiwit (Figuur 2J).

figure-results-1
Figuur 1: GFP-His is gericht op secretie in de apoplast van N. benthamiana. (A) Schema van de constructie van PR1a-GFP-His in de pCAMBIA1300 plantexpressievector. (B) Western blot voor de detectie van GFP-His-productie in N. benthamiana. Hier werden 10 μL eiwitmonsters geladen en gedetecteerd. De N. benthamiana bladeren die gelijktijdig met MMA werden geïnjecteerd, werden gebruikt als negatieve controle. Hetzelfde volume monsters werd onderzocht en gekleurd met behulp van grote subeenheden van de plant als belastingscontrole (C) Confocale microscopie die de subcellulaire lokalisatie van GFP-His (groen) aantoont. De bladeren van N. benthamiana werden geplasmolyseerd met 30% sucrose. Witte stippellijnen geven het plasmamembraan aan. Rode pijlen geven GFP-Zijn accumulatie in de applast aan. (D) Western blot die de aanwezigheid van GFP-His in de geëxtraheerde apoplastische vloeistof aantoont. Hier werden 10 μL eiwitmonsters geladen en gedetecteerd. De N. benthamiana bladeren die gelijktijdig met MMA werden geïnjecteerd, werden gebruikt als negatieve controle. Afkortingen: 35s = 2x Bloemkool mozaïekvirus 35s promotor; PR1a = tabak pathogenese-gerelateerd eiwit 1a signaal peptide; Zijn = 6x Zijn tag; Nos = nopaline synthase terminator. BS = vóór plasmolyse; PS = post-plasmolyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Optimalisatie van de eiwitextractiemethode uit AWF. (A-B) Extractie van eiwitten uit AWF met behulp van verschillende buffers. Acht oplossingen werden getest voor eiwitextractie uit AWF: 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaH2PO4 (pH 4,5), 50 mM NaCl (pH 7,0), 40 mM KCl (pH 7,0), 20 mM CaCl2 (pH 5,7), 100 mM PB (pH 7,0), 10 mM MES (pH 5,6) en ddH2O (pH 7,0). De extractie-efficiëntie werd geanalyseerd door SDS-PAGE (A) en GFP-His werd gedetecteerd door western blotting met behulp van anti-His-antilichaam (B). (C-D) Extractie met behulp van PB bij verschillende pH-waarden. PB met pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 en 8.0 werd gebruikt voor extractie uit AWF. De extractie-efficiëntie werd gedetecteerd door SDS-PAGE (C) en GFP-His werd gedetecteerd door western blotting met anti-He-antilichaam (D). (E-F) Extractie met behulp van PB in verschillende concentraties. PB bij 50 mM, 100 mM en 150 mM werden gebruikt voor extractie uit AWF. De extractie-efficiëntie werd geanalyseerd door SDS-PAGE (E) en GFP-His werd gedetecteerd door western blotting met anti-His-antilichaam (F). (G-H) Kwantitatieve analyse van geëxtraheerde eiwitten. Eiwitten werden geëxtraheerd met behulp van 100 mM PB (pH 7,0). Het totaal oplosbare eiwit (G) en GFP-His (H) werden gekwantificeerd voor statistische analyse. (I) Statistische analyse van het aandeel van de AWF GFP in de totale GFP. (J) Zuivering van GFP-His uit totaal oplosbare eiwitten van N. benthamiana of AWF. Eiwitten werden geëxtraheerd met behulp van 100 mM PB (pH 7,0) en GFP-His werd gezuiverd door Ni-affiniteitschromatografie. De zuivering werd geanalyseerd door SDS-PAGE. De meest rechtse rijstrook is de BSA-norm van 1 μg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van planten om therapeutische eiwitten te produceren is de afgelopen jaren snel uitgebreid 1,2,3,4,5,6. Eiwitcoderende genen worden gekloond tot expressievectoren en via agro-infiltratie in plantenweefsels afgeleverd. Na productie door plantencellen worden eiwitten gezuiverd voor stroomafwaartse toepassingen. Doorgaans worden recombinante eiwitten gezuiverd uit TSP-extracten. Overvloedige plantaardige eiwitten en cytochromen die tijdens de extractie uit plantencellen vrijkomen, kunnen echter de zuivering belemmeren33. Aan de ene kant kunnen plantaardige cytochromen scheidingskolommen verstoppen, waardoor de verwerking wordt vertraagd17; aan de andere kant zijn zeer overvloedige eiwitten zoals RuBisCO moeilijk te verwijderen, waardoor de zuiverheid afneemt18,19. Deze problemen worden problematischer wanneer de doeleiwitten op lage niveaus tot expressie worden gebracht. Zuiveren van AWF omzeilt deze problemen, waardoor een hogere zuiverheid mogelijk is (Figuur 2J).

Hoewel AWF-extractie op grote schaal wordt gebruikt in de plantenbiologie 24,25,26,27, wordt het zelden gebruikt in moleculaire landbouwpijplijnen. Hier gebruiken we een plantaardig GFP-model om AWF-gebaseerde eiwitzuivering te demonstreren. Extractie van GFP uit de AWF werd uitgevoerd door een signaalpeptide toe te voegen om GFP-secretie in de apoplastruimte mogelijk te maken. Deze methode extraheert eiwitten met een hogere homogeniteit en verlaagt de verwerkingskosten van eiwitten stroomafwaarts. Verschillende overwegingen verdienen toekomstig onderzoek voor de implementatie van AWF-zuivering in bioreactoren van fabrieken. Ten eerste vereist efficiënte secretie de fusie van specifieke N-terminale signaalpeptiden. Ten tweede, om de AWF-kwaliteit te behouden, moeten intacte bladeren na de oogst snel worden verwerkt zonder bevriezing, waardoor intracellulaire inhoud vrijkomt. Ten derde extraheert PB effectief AWF-eiwitten34, maar de buffer-pH en zoutconcentratie moeten worden afgestemd op individuele recombinante eiwitten (Figuur 2C-D). Ten vierde hebben we vele malen gezuiverd eiwit uit 200 g N. benthamiana bereikt in laboratoriumomstandigheden met een stabiele zuiverheid en opbrengst. Om te kunnen worden opgeschaald voor gebruik in de fabriek, worden grotere vaten en vacuümpompen en een effectievere zuiveringsmethode gevraagd, en moeten omstandigheden zoals vacuümduur, aantal terugwinningen, enz. mogelijk worden geoptimaliseerd.

Deze methode wordt beperkt door het feit dat exogene eiwitten worden uitgescheiden in de AWF en eiwitten in het plasmamembraan worden verlaten (Figuur 2H-I). Het heeft het voordeel dat het hoger gezuiverde eiwitten krijgt met de juiste modificatie, maar tegen hogere opbrengstkosten. Het belangrijkste technische knelpunt voor zuivering op basis van AWF is de verbetering van het doeleiwitniveau binnen AWF. Koppeling met sterke promotors en geoptimaliseerde secretiesystemen zal de plantexpressieplatforms verbeteren voor zowel een hoge zuiverheid als een grotere opbrengst. Om dit knelpunt te overwinnen, wordt in toekomstige werkzaamheden gevraagd om een hoger productiesysteem en een effectiever secretiesysteem.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door de Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084) en het Key Deployment Project Support Fund van het driejarige actieplan van het Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mesh nylon fine mesh yarnGuangzhou Huayu Trading limited companyhy-230724-2Voor AWF eiwit extractie
50 ml centrifuge tubesVazymeTCF00150Voor centrifuge
ClonExpress II one step cloning kitVazymeC112-02Voor cloneren
FastDigest Sac1NEBR3156SVoor cloneren
FastDigest XbaINEBFD0685Voor cloneren
ImageJ 1.5.0//Voor grijstinten analyse
Large filterThermo FisherNESTVoor filteren
Laser scanning confocal microscopyLeica SP8Voor subcellulaire lokalisatie
Ni sepharose excelCytiva10339806Voor eiwit zuivering
Precast protein plus gelYEASEN36246ES10Voor SDS-PAGE
Small filterNalgene1660045Voor filteren
SuperSignal West Femto Substrate Trial KitThermo Fisher34076Voor western blotting
Triton X-100SCR30188928Om de extractie buffer te configureren
Type rotaryvang vacuum pumpZhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company2XZ-2Voor vacuüm infiltratie
Vertical mixerHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited companyBE-1200Voor mengen
β-mercaptoethanolSIGMABCBK8223VOm de extractie buffer te configureren

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zahmanova, G., et al. Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (24), 1757(2023).
  2. PREVAIL II Writing Group. A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection. N Engl J Med. 375 (15), 1448-1456 (2016).
  3. Ma, J. K. C., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol J. 13 (8), 1106-1120 (2015).
  4. Shanmugaraj, B., Rattanapisit, K., Manopwisedjaroen, S., Thitithanyanont, A., Phoolcharoen, W. Monoclonal antibodies B38 and H4 produced in Nicotiana benthamiana neutralize SARS-CoV-2 in vitro. Front Plant Sci. 11, 589995(2020).
  5. Takeyama, N., Kiyono, H., Yuki, Y. Plant-based vaccines for animals and humans: Recent advances in technology and clinical trials. Ther Adv Vaccines. 3 (5-6), 139-154 (2015).
  6. Ward, B. J., Séguin, A., Couillard, J., Trépanier, S., Landry, N. Phase III: Randomized observer-blind trial to evaluate lot-to-lot consistency of a new plant-derived quadrivalent virus like particle influenza vaccine in adults 18-49 years of age. Vaccine. 39 (10), 1528-1533 (2021).
  7. Siriwattananon, K., et al. Plant-produced receptor-binding domain of SARS-CoV-2 elicits potent neutralizing responses in mice and non-human primates. Front Plant Sci. 12, 682953(2021).
  8. Leblanc, Z., Waterhouse, P., Bally, J. Plant-based vaccines: The way ahead. Viruses. 13 (1), 5(2020).
  9. Sethi, L., Kumari, K., Dey, N. Engineering of plants for efficient production of therapeutics. Mol Biotechnol. 63 (12), 1125-1137 (2021).
  10. Webster, D. E., Thomas, M. C. Post-translational modification of plant-made foreign proteins; glycosylation and beyond. Biotechnol Adv. 30 (2), 410-418 (2012).
  11. Streatfield, S. J. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  12. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  13. Ullrich, K. K., Hiss, M., Rensing, S. A. Means to optimize protein expression in transgenic plants. Curr Opin Biotechnol. 32, 61-67 (2015).
  14. Su, H., et al. Plant-made vaccines against viral diseases in humans and farm animals. Front Plant Sci. 14, 1170815(2023).
  15. Agrawal, G. K., Jwa, N. S., Lebrun, M. H., Job, D., Rakwal, R. Plant secretome: Unlocking secrets of the secreted proteins. Proteomics. 10 (4), 799-827 (2010).
  16. Kim, T., Gondré-Lewis, M. C., Arnaoutova, I., Loh, Y. P. Dense-core secretory granule biogenesis. Physiology. 21, 124-133 (2006).
  17. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  18. Kim, S. T., Cho, K. S., Jang, Y. S., Kang, K. Y. Two-dimensional electrophoretic analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays. Electrophoresis. 22 (10), 2103-2109 (2001).
  19. Xi, J., et al. Polyethylene glycol fractionation improved detection of low-abundant proteins by two-dimensional electrophoresis analysis of plant proteome. Phytochemistry. 67 (21), 2341-2348 (2006).
  20. Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
  21. Delaunois, B., et al. Uncovering plant-pathogen crosstalk through apoplastic proteomic studies. Front Plant Sci. 5, 249(2014).
  22. Andreasson, E., Abreha, K. B., Resjö, S. Isolation of apoplast. Methods Mol. Biol. 1511, 233-240 (2017).
  23. Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann, M. K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiol Plant. 111 (4), 457-465 (2001).
  24. Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant Cell Physiol. 53 (9), 1659-1668 (2012).
  25. Rumyantseva, N. I., Valieva, A. I., Kostyukova, Y. A., Ageeva, M. V. The effect of leaf plasticity on the isolation of apoplastic fluid from leaves of tartary buckwheat plants grown in vivo and in vitro. Plants. 12 (23), 4048(2023).
  26. Ekanayake, G., Gohmann, R., Mackey, D. A method for quantitation of apoplast hydration in Arabidopsis leaves reveals water-soaking activity of effectors of Pseudomonas syringae during biotrophy. Sci Rep. 12 (1), 18363(2022).
  27. Preston, G. M., Fones, H. N., Mccraw, S., Rico, A., O'leary, B. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example. J Vis Exp. (94), e52113(2014).
  28. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  29. Menkhaus, T., et al. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  30. Streatfield, S. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  31. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Sci Rep. 8 (1), 4755(2018).
  32. Zhao, J., et al. Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina. Front Plant Sci. 12, 771806(2021).
  33. Venkataraman, S., et al. Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines. Front Plant Sci. 14, 1273958(2023).
  34. Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., Mühling, K. H. Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves. Plant Meth. 7, 48(2011).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Zuivering van recombinant eiwitplantexpressiesysteemNicotiana benthamianavacuuminfiltratieaffiniteitschromatografiegroen fluorescent eiwitapoplastische wasvloeistofeiwitsecretieWestern blot

Gerelateerde artikelen