Methodenartikel

Het oogsten, inbedden en cultiveren van dorsale wortelganglia in apparaten met meerdere compartimenten om perifere neuronale kenmerken te bestuderen

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66854

⸱

28 juni 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een techniek om geëxplanteerd dorsaal wortelganglion (DRG) van volwassen Sprague Dawley-ratten te oogsten en te kweken in een apparaat met meerdere compartimenten (MC).

Samenvatting

Het meest voorkomende perifere neuronale kenmerk van pijn is een verlaagde stimulatiedrempel of overgevoeligheid van terminale zenuwen van de dorsale wortelganglia (DRG). Een mogelijke oorzaak van deze overgevoeligheid houdt verband met de interactie tussen immuuncellen in het perifere weefsel en neuronen. In vitro modellen hebben fundamentele kennis opgeleverd om te begrijpen hoe deze mechanismen leiden tot overgevoeligheid van de nociceptoren. In vitro modellen staan echter voor de uitdaging om de werkzaamheid te vertalen naar mensen. Om deze uitdaging aan te gaan, is een fysiologisch en anatomisch relevant in vitro model ontwikkeld voor de kweek van intacte dorsale wortelganglia (DRG's) in drie geïsoleerde compartimenten in een plaat met 48 putjes. Primaire DRG's worden geoogst van volwassen Sprague Dawley-ratten na humane euthanasie. Overtollige zenuwwortels worden bijgesneden en de DRG wordt in de juiste maten gesneden voor kweek. DRG's worden vervolgens gekweekt in natuurlijke hydrogels, waardoor een robuuste groei in alle compartimenten mogelijk is. Dit systeem met meerdere compartimenten biedt anatomisch relevante isolatie van de DRG-cellichamen uit neurieten, fysiologisch relevante celtypen en mechanische eigenschappen om de interacties tussen neurale en immuuncellen te bestuderen. Dit cultuurplatform biedt dus een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van isolatiestrategieën voor behandelingen, wat uiteindelijk leidt tot een verbeterde screeningsaanpak voor het voorspellen van pijn.

Inleiding

Chronische pijn is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van arbeidsongeschiktheid en verlies van werk1. Chronische pijn treft ongeveer 20% van de volwassenen wereldwijd en legt een aanzienlijke maatschappelijke en economische lastop 2, met totale kosten die in de Verenigde Staten elk jaar tussen $ 560 en $ 635 miljard worden geschat3.

Het belangrijkste perifere kenmerk van chronische pijnpatiënten is een verlaagde stimulatiedrempel van zenuwen, wat ertoe leidt dat het zenuwstelsel beter reageert op stimuli 4,5. De verlaagde stimulatiedrempel kan resulteren in een pijnlijke reactie op een voorheen niet-pijnlijke stimulus (allodynie) of een verhoogde respons op een pijnlijke stimulus (hyperalgesie)6. De huidige behandelingen voor chronische pijn hebben een beperkte werkzaamheid, en behandelingen die slagen in diermodellen falen vaak in proeven bij mensen vanwege mechanistische verschillen in pijnmanifestatie7. In vitro modellen die perifere sensibilisatiemechanismen nauwkeuriger kunnen nabootsen, hebben het potentieel om de vertaling van nieuwe therapieën te verhogen 8,9. Verder, door het modelleren van belangrijke aspecten van gesensibiliseerde zenuwen in een kweeksysteem, zouden onderzoekers een dieper begrip kunnen ontwikkelen van de mechanismen die verlaagde drempels veroorzaken en nieuwe therapeutische doelen kunnen identificeren die deze omkeren10.

De ideale in vitro platforms of microfysiologische systemen zouden de fysieke scheiding van distale neurieten en dorsale wortelganglia (DRG) cellichaam, een driedimensionale (3D) cellulaire omgeving en de aanwezigheid van native ondersteunende cellen omvatten om in vivo omstandigheden nauwkeurig na te bootsen. Een recent artikel van Caparaso et al.11 toont echter aan dat de huidige DRG-cultuurplatforms een of meer van deze belangrijke kenmerken missen, waardoor ze onvoldoende zijn om in vivo omstandigheden te repliceren. Hoewel deze platforms eenvoudig in te stellen zijn, bootsen ze de biologische basis van perifere sensibilisatie niet na en vertalen ze zich dus mogelijk niet naar in vivo werkzaamheid. Om deze beperking aan te pakken, is een fysiologisch relevant in vitro model ontwikkeld voor de kweek van dorsale wortelganglia (DRG) binnen een hydrogelmatrix met drie geïsoleerde compartimenten om temporele vloeistofisolatie van neurieten en DRG-cellichamen mogelijk te maken11. Dit model biedt zowel fysiologische als anatomische relevantie, wat het potentieel heeft om perifere sensibilisatie van neuronen in vitro te bestuderen.

De groeiende belangstelling voor het gebruik van DRG-explantaten in een 3D-cultuur is te danken aan hun vermogen om robuuste neurietgroei te bevorderen, wat dient als een indirecte indicator van de levensvatbaarheid van DRG12. Hoewel primaire neonatale of embryonale DRG-explantaten voornamelijk worden gebruikt in de huidige in-vitrokweekplatforms 13,14, biedt het gebruik van explantaten van volwassen knaagdieren een beter model van volwassen neuronale fysiologie, die de menselijke DRG-fysiologie nauw nabootst in vergelijking met explantaten van neonatale of embryonale knaagdieren15. Explantatie DRG's verwijzen naar het behoud van het cellulaire en moleculaire weefsel van native DRG-weefsel, voornamelijk door het behoud van native niet-neuronale steuncellen. Hierin beschrijft dit protocol de methodologie om DRG-explantaten van volwassen Sprague Dawley-ratten te oogsten en te kweken in een apparaat met meerdere compartimenten (MC) (Figuur 1).

Werkzaamheid is aangetoond bij het kweken van DRG's uit de cervicale, thoracale en lumbale wervelkolom zonder waarneembare verschillen in neurietgroei. Voor deze toepassing was het doel om neurietgroei op te wekken in de buitenste compartimenten van het apparaat; daarom werd in dit artikel geen onderscheid gemaakt tussen DRG-niveaus. Indien nodig voor een specifiek experiment kan het DRG-niveau echter worden aangepast aan de behoeften van de onderzoekers. Er zijn momenteel andere gecompartimenteerde kweekmodellen voor de 3D-cultuur van DRG's16, maar deze apparaten bevatten geen geconserveerde native niet-neuronale steuncellen, wat de translatie kan beperken. Het behoud van de oorspronkelijke structuur van geoogste DRG's is belangrijk omdat het zorgt voor het behoud van niet-neuronale steuncellen, waarvan de interacties met DRG-neuronen essentieel zijn voor het behoud van de functionele eigenschappen van deze neuronen. Verschillende studies hebben gedissocieerde DRG's samen gekweekt met niet-inheemse neuronale cellen zoals Schwann-cellen om myelinisatie van neuronen te bevorderen 17,18,19.

Protocol

De DRG-oogst werd uitgevoerd in overeenstemming met het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Nebraska-Lincoln. Vrouwelijke Sprague Dawley-ratten van 12 weken (~250 g) werden gebruikt voor het onderzoek. De details van de dieren, reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Fabricage en assemblage van apparaten met meerdere compartimenten

  1. Computerondersteund ontwerp en 3D-printen van het apparaat met meerdere compartimenten
    OPMERKING: Het MC-apparaat bestaat uit drie compartimenten voor de isolatie van DRG-cellichamen en neurieten (Figuur 2A). Het MC-apparaat is niet in de handel verkrijgbaar; het STL-bestand wordt hierin echter geleverd (aanvullend coderingsbestand 1) om 3D-printen mogelijk te maken. Het afdrukken van de MC duurt één (1) dag.
  2. Upload het STL-bestand van de MC naar een Resin 3D-printer met behulp van compatibele software.
    OPMERKING: Het materiaal dat ideaal is om te printen is een hars op hoge temperatuur. Een belangrijk voordeel van het gebruik van hars op hoge temperatuur is dat het biocompatibel is en kan worden geautoclaveerd en hergebruikt. Een Digital Light Processing (DLP) 3D-printer of andere 3D-printers kunnen ook worden gebruikt om het apparaat te printen.
  3. Breng de geprinte apparaten gedurende 30 minuten over in een wasoplossing in isopropanol (>96%) om achtergebleven hars van het oppervlak van het geprinte MC-apparaat te verwijderen.
  4. Laat de apparaten na 120 minuten uitharden bij 80 °C met behulp van een in de handel verkrijgbaar uithardingsmiddel (zie Materiaaltabel). Het uithardingsmiddel verbetert de mechanische eigenschappen van het geprinte MC-apparaat door het bloot te stellen aan temperatuur en UV.
  5. Hard de MC-apparaten thermisch uit in een oven op 160 °C gedurende 180 min.
  6. Steriliseer de apparaten met behulp van een autoclaaf gedurende 45 minuten op een zwaartekrachtcyclus.

2. Hydrogel voorbereiding

  1. Methacrylated hyaluronzuur (MAHA, 85%-115% methacrylatie) synthetiseren en karakteriseren met behulp van een protocol beschreven door Seidlits et al.20.
    OPMERKING: Om de groei van DRG's te ondersteunen, worden vaak drievoudige hydrogels gebruikt die zijn samengesteld uit methacrylated hyaluronzuur, type I collageen en laminine. Bevindingen geven aan dat DRG's vaak groeien in MAHA, variërend van 1,25-2,5 mg/ml en collageen van 2,0-4,5 mg/ml. Voor laminine blijkt dat 0,75 mg/ml voldoende is om een robuuste groei van DRG's te garanderen. Hierin worden methoden beschreven om een drievoudige gel te maken met 1,25 mg/ml MAHA, 4,5 mg/ml collageen en 0,75 mg/ml laminine. De voorbereiding van hydrogel moet worden gedaan in een laminaire stroomkast om een aseptische werkruimte te bieden.

3. Voorbereiding van de foto-initiatoroplossing

OPMERKING: Een foto-initiator is nodig om de MAHA onder UV-licht te verknopen. Het wordt vaak gebruikt bij percentages van 0,3% tot 0,6%.

  1. Bereid de foto-initiatoroplossing 3 dagen voor de DRG-oogst voor.
  2. Verwarm het sonicatiewaterbad voor op 37 °C voordat u de foto-initiatoroplossing bereidt.
  3. Werk met de steriele techniek in een flowkap en bereid 23.125 mg/ml natriumbicarbonaat (NaHCO3) oplossing door NaHCO3 op te lossen in 5x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)-HEPES-oplossing.
  4. Meng in een glazen injectieflacon 0,6% gewicht/volume (w/v) foto-initiator in een 20% vol/vol 1x steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 80% vol/vol 5X DMEM/HEPES-oplossing.
  5. Wikkel de glazen injectieflacon in aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen. Zorg er echter voor dat u de aluminiumfolie verwijdert voordat u de injectieflacon overbrengt naar het tot 37 °C verwarmde sonicatiewaterbad met sonicatie tussen 30-40 min.
    OPMERKING: Foto-initiatoroplossing moet worden beschermd tegen licht, omdat het bij blootstelling aan licht kan uiteenvallen in radicalen en het polymerisatieproces kan starten21.
  6. Filtreer de oplossing steriel met een spuitfilter van 0,22 μm in een nieuwe steriele glazen injectieflacon.

4. Methacrylated hyaluronzuur oplossen

  1. Los het methacrylhoudende hyaluronzuur (bereid in stap 2) op op dezelfde dag dat de foto-initiatoroplossing wordt bereid (stap 3).
  2. Plaats de bevroren gevriesdroogde MAHA 15 minuten in een exsiccator om op kamertemperatuur te komen.
  3. Werk in een laminaire stromingskap en weeg met behulp van de steriele weegtechniek de gevriesdroogde MAHA in een glazen flacon.
  4. Voeg het benodigde volume gefilterde foto-initiatoroplossing toe aan MAHA om de gewenste MAHA-concentratie te bereiken. De gebruikelijke uiteindelijke gelconcentratie is 1,25 mg/ml MAHA en 4,5 mg/ml collageen.
  5. Sluit de dop af met laboratoriumafdichtingsfolie, wikkel de glazen injectieflacon in aluminiumfolie en plaats deze op een orbitale schudplaat bij kamertemperatuur tot deze volledig is opgelost (meestal 3 dagen). Af en toe, draai de oplossing om grote klonten MAHA uit elkaar te breken om een uniforme oplossing van MAHA te garanderen.

5. Montage van het apparaat

  1. Plaats het MC-apparaat een dag voor de DRG-oogst op een bord met 48 putjes.
  2. Breng een dun lijntje siliconengel aan in de groef onder het MC-apparaat (Figuur 2B) met behulp van een spuit van 3 ml. Dit zal helpen om het apparaat stevig aan de putplaat te bevestigen.
  3. Plaats het MC-apparaat met behulp van een #3-pincet voorzichtig in de put van een plaat met 48 putjes, zoals weergegeven in afbeelding 2C.
    NOTITIE: De grootte van het apparaat kan worden aangepast aan de beoogde toepassing en indien gewenst kan een plaat van een andere maat worden gebruikt. De apparaten kunnen worden hergebruikt. Om opnieuw te gebruiken, moet de hydrogel voorzichtig uit alle tunnels worden gewassen en moet de laadgroef onder het apparaat worden gebruikt met 70% ethanol met zachte beweging. Nadat dit is voltooid, kunnen apparaten opnieuw worden geautoclaveerd om ze voor gebruik te steriliseren.

6. Voorbereiding van dieren

  1. Autoclaaf alle benodigde dissectiegereedschappen voor het begin van de oogst.
  2. Zorg voor een volwassen mannelijke of vrouwelijke Sprague Dawley-rat in de leeftijd van 12-20 weken. Het geslacht van de rat heeft geen invloed op de groei van DRG.
  3. Euthanaseer de rat volgens het goedgekeurde IACUC-protocol met behulp van een CO2 -overdosis als de primaire methode van euthanasie en bilaterale pneumothoraxpunctie als secundaire methode van euthanasie volgens de richtlijnen van de American Veterinary Medical Association22.
  4. Leg de rat op een steriel onderkussen op een snijtafel met de buikzijde naar beneden. Spuit de vacht in met 70% ethanol.

7. Oogst van dorsale wortelganglia (DRG)

  1. Bereid trimmedia voor die 86% neurobasaal A-medium, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine (PS), 1% glutamine en 2% B27 plus 50x bevatten en breng over in een plaat met 24 putjes. Dit medium en de putplaat zullen worden gebruikt voor tijdelijke opslag van geoogste DRG's voordat ze in de hydrogel worden ingebed.
  2. Draag een laboratoriumjas, chirurgisch masker, muts, veiligheidsbril en handschoenen.
  3. Knip met een grote stompe neus door de huid aan de basis van de cervicale wervelkolom en vervolgens over de lengte van de wervelkolom.
  4. Om het bloed verder weg te laten lopen van het wervelkanaal, snijdt u onder de schouderbladen en naar beneden door de spier om de belangrijkste bloedvaten door te snijden.
  5. Gebruik een grote schaar met een scherpe neus om de spier weg te knippen van de wervelkolom. Maak zoveel mogelijk spieren vrij om de wervelkolom te visualiseren.
  6. Verwijder de dorsale en laterale segmenten van de wervels. Gebruik een rechte Rongeur en een schaar met een scherpe neus om de doornuitsteeksels en dwarsuitsteeksels van de wervels te verwijderen, beginnend bij het cervicale uiteinde en in de richting van het lumbale uiteinde.
  7. Verwijder het ruggenmerg. Gebruik een kleine schaar met een scherpe neus om voorzichtig door de zenuwwortels te knippen die verbonden zijn met de DRG's langs beide zijden van het ruggenmerg. Knip het cervicale uiteinde van het ruggenmerg af en til het voorzichtig geleidelijk uit het wervelkanaal, waarbij u eventuele resterende zenuwwortels die verbonden zijn met de DRG's doorsnijdt.
    OPMERKING: Fijne motoriek is essentieel om ervoor te zorgen dat het DRG-lichaam tijdens het proces niet wordt afgesneden.
  8. Om DRG's bloot te leggen, gebruik je de gebogen Rongeur om meer van de laterale delen van de wervels te verwijderen. Trek vanaf de middellijn naar buiten, afwisselend aan de zijkanten. Pas op dat u niet door het DRG-lichaam snijdt, omdat dit schade aan de cellichamen en axonen kan veroorzaken.
  9. Gebruik de #3 pincet en de rechte veerschaar om DRG's tussen elk niveau van de wervels te verwijderen. Pak de spinale zenuwwortels van de DRG vast, trek ze voorzichtig uit de zak en snijd het andere uiteinde van de ruggenmergzenuw door. Zorg ervoor dat u de DRG-body niet rechtstreeks vastpakt.
  10. Plaats de DRG's in kuiltjes van een plaat met 24 putjes (met afsnijmiddelen, stap 7.1) op ijs.
  11. Nadat u alle DRG's hebt verzameld, ruimt u de werkruimte op, plaatst u het karkas in een autoclaafzak en bewaart/gooit u het op de juiste manier weg volgens het IACUC-protocol.

8. DRG trimmen en snijden

  1. Vul een petrischaaltje van 60 mm op een schone werkbank met afsnijmiddelen (stap 7.1). Plaats de ontleedscoop en de glaskralensterilisator en plaats een geautoclaveerde gereedschapskist met trimgereedschap (#3 pincet en rechte veerschaar) bij de scoop.
  2. Verwijder onder de ontleedscoop overtollig weefsel rond de DRG en snijd de zenuwwortels dicht bij het DRG-lichaam af (meestal iets donkerder dan de omliggende zenuwen).
  3. Vul een tweede petrischaaltje van 60 mm met vers medium. Snijd onder de snijscoop de bijgesneden DRG's tot ongeveer 0,5 mm (of tussen 0,5 mm en 0,8 mm). Tijdens het snijden wordt een liniaal onder de petrischaal geplaatst om de juiste geschatte grootte van de gesneden DRG's te hebben.
  4. Breng gesneden DRG's over in een verse plaat met 24 putjes en de media op ijs.
    OPMERKING: DRG-trimmen, snijden en inbedden moet worden gedaan in een laminaire stroomkast om een aseptische werkruimte te bieden. Bij afwezigheid van een laminaire stromingskast moeten aseptische technieken in acht worden genomen, waarbij minimaal passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) worden aanbevolen (laboratoriumjas, maskers, veiligheidsbril en handschoenen) en alle gereedschappen tijdens het proces worden gesteriliseerd om mogelijke besmetting te beperken.

9. Neutralisatie van collageen

  1. Neutraliseer het collageen op dezelfde dag als de DRG-oogst na het trimmen en knippen van de DRG's.
  2. Werken op ijs, pipette ~8,16 % ultrazuiver water, ~1,84% 1 M natriumhydroxide (NaOH), ~10% 10x PBS en ~80% collageen van het totale volume oplossing in een glazen injectieflacon.
  3. Meng langzaam met behulp van een steriele pipetpunt met een lage retentie om collageen (meestal als laatste toegevoegd) door het mengsel te pipetteren. Zorg ervoor dat de pipetpunt tijdens het mengen in de oplossing blijft om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Controleer de pH van het geneutraliseerde collageen met behulp van pH-strips om er zeker van te zijn dat deze ~7 is.
    OPMERKING: Geneutraliseerd collageen kan 2-3 uur op ijs worden bewaard zonder te geleren; Daarom moet de fabricage van hydrogel snel worden uitgevoerd zodra collageen is geneutraliseerd.

10. Hydrogel fabricage

  1. Werken op ijs, pipetlamine (tot een eindconcentratie van 0,75 mg/ml) en 1x PBS in een glazen flacon.
  2. Met behulp van steriele pipetpunten met lage retentie wordt het collageen en de MAHA-oplossing in het mengsel geneutraliseerd om tot de gewenste concentratie te komen.
  3. Meng langzaam en controleer de pH van de resulterende hydrogel (moet ~7 zijn).

11. DRG-inbedding

  1. Voer inbedding in meerdere compartimenten uit.
    1. Pipetteer 65,1 μl en 52,8 μl van de voorgemengde hydrogel in respectievelijk de soma- en neurietcompartimenten.
      OPMERKING: Hierbij wordt uitgegaan van het gebruik van MC-apparaten in een plaat met 48 putjes. Deze volumes kunnen worden gewijzigd op basis van de grootte van het gebruikte MC-apparaat.
    2. Plaats de gesneden DRG's voorzichtig in het soma-compartiment (Figuur 2A) en zorg ervoor dat ze geen krassen maken op de bodem van de putplaat. Plaats de DRG in het midden zodat de neurieten via de tunnels in de aangrenzende compartimenten kunnen groeien.
    3. Thermische crosslink van de hydrogel in de incubator bij 37 °C gedurende 30 min. Terwijl dit gebeurt, zet u de UV-lamp aan om op te warmen.
    4. Na thermische vernetting verknoopt u de hydrogel gedurende 90 s door UV-vernetting.
    5. Voeg DRG-groeimedia toe aan de hydrogel en DRG en voer na een uur een volledige mediawissel uit om niet-gereageerde of resterende sporen van foto-initiator die in de media aanwezig zijn, te verwijderen.
    6. Voer elke 3 dagen een halve mediawissel uit en controleer de groei van de DRG's door ze onder de microscoop te bekijken.
    7. Na ~4 weken, wanneer DRG-neurieten beginnen te groeien (Figuur 3A), maakt u beelden met de fluorescerende plaatimager en kwantificeert u de lengte van neurieten met behulp van FIJI (ImageJ).

12. DRG-inbedding beheren

  1. Pipetteer 250 μL hydrogel in een plaat met 48 putjes (zonder MC).
  2. Plaats de gesneden DRG voorzichtig in het midden van het putje en halverwege in de hydrogel, zorg ervoor dat het geen krassen maakt op de bodem van de putplaat.
  3. Thermische crosslink van de hydrogel in de incubator bij 37 °C gedurende 30 min.
  4. UV-crosslink van de hydrogel gedurende 90 s.
  5. Voeg DRG-groeimedia toe aan de hydrogel en DRG en voer na een uur een volledige mediawissel uit.
  6. Voer elke 3 dagen een halve mediawissel uit en controleer de groei van de DRG door deze onder de microscoop te bekijken.
  7. Na ~4 weken, wanneer DRG-neurieten beginnen te groeien (Figuur 3B), maakt u beelden met de fluorescerende plaatimager.
    OPMERKING: Elke helderveldmicroscoop werkt voor beeldvorming. Een geautomatiseerde microscoop op basis van platen maakt dit proces sneller. Controle-inbedding in gewone gels zonder het apparaat wordt gedaan om de groei van DRG-neurieten in meerdere compartimenten te vergelijken. Zodra gebruikers valideren dat DRG's op dezelfde manier groeien in MC- en controlegels, hoeven ze de controlegels mogelijk niet elke keer te herhalen.

13. DRG-beeldvorming

  1. Leg helderveldbeelden vast met een vergroting van 4x met behulp van een fluorescerende plaatimager bij verschillende brandpuntsafstanden om het hele DRG- en MC-apparaat te visualiseren.
  2. Pas de helderheid en het contrast van het beeld aan om het gemakkelijker te maken om de neurieten te bekijken.
  3. Sla de afbeelding op als een .tiff bestand.

14. Kwantificering van DRG-neuriet

  1. Download en installeer FIJI (ImageJ).
  2. Open afbeeldingJ. Open het afbeeldingsbestand en zorg ervoor dat het bestand monochroom is.
  3. Verbeter het contrast zodat de kleinste neurieten zichtbaar zijn. Doe dit door de helderheids- en contrastoptie te openen met de sneltoets Ctrl+Shift+C.
  4. Pas de schuifregelaars van de controller naar wens aan om de neurieten te visualiseren en klik op Toepassen voor de gewenste helderheid en contrast.
  5. Open de neuriettracer door het menu Plug-ins te openen, Segmentatie te selecteren en op Simple Neurite Tracer te klikken.
  6. Start een nieuw spoor door op het ene uiteinde van de neuriet tegen het DRG-lichaam te klikken.
  7. Klik op een ander punt langs de neuriet om een spoor toe te voegen totdat de neuriet van begin tot eind is getraceerd. Klik op Pad voltooien na het traceren van de neuriet.
  8. Converteer de getraceerde lengte naar echte eenheden en sla de resultaten op door ze te kopiëren en te plakken in Excel.
  9. Gebruik het gereedschap voor een rechte lijn in FIJI om een lijn te tekenen van dezelfde lengte als de schaalbalk (zonder het einde van de lijn los te laten) en kijk naar de lengtewaarde die zichtbaar is onder de werkbalk. De lengtewaarde wordt gebruikt voor de conversie.
  10. Meet de lengte van zes lange neurieten die zich aan weerszijden van de DRG uitstrekken (figuur 3C,D) en bereken de gemiddelde lengte van deze neurieten om een representatieve gemiddelde lengte van de DRG te krijgen, zoals weergegeven in figuur 4.
    OPMERKING: Immunokleuring is getest op DRG-explantaten in gewone gels om de aanwezigheid van niet-neuronale steuncellen aan te tonen7. DRG's worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) bij kamertemperatuur, driemaal gewassen met 1x PBS gedurende 15 minuten en bewaard in 1x PBS bij 4 °C tot immunokleuring.
  11. Voor explantaties in MC-apparaten verwijdert u het MC-apparaat en volgt u hetzelfde proces als hierboven beschreven7.

Resultaten

Het huidige protocol beschreef een techniek om DRG te oogsten en te kweken van volwassen Sprague Dawley-ratten in een apparaat met meerdere compartimenten (MC). Zoals te zien is in figuur 1, werd DRG geoogst van volwassen ratten bijgesneden en gesneden in ~0,5 mm. De bijgesneden en gesneden DRG's werden vervolgens ingebed in een hydrogel in het soma-gebied van het MC-apparaat (Figuur 2) en gedurende 27 dagen gekweekt voordat neurietkwantificering plaatsvond. DRG werd gekweekt in gewone gel om als controle te dienen. De concentratie van de hydrogelformulering die voor dit experiment werd gebruikt, was 4,5/1,25 mg/ml collageen: MAHA. Op dag 27 en 21 was er voor respectievelijk multi-compartiment en gewone gels een robuuste groei van neurieten (Figuur 3). De gemiddelde lengte van neurieten in MC (894,22 μm ± 308,75 μm) was vergelijkbaar met de neurietlengte in gewone controlegels (864,26 μm ± 362,84 μm) (Figuur 4). Dit toont het vermogen van het MC-apparaat aan om de DRG-cultuur en de groei van neurieten te ondersteunen. De lengte van de neuriet werd gekwantificeerd met behulp van de ImageJ-software.

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch diagram van de experimentele procedure. (A) Oogst van dorsale wortelganglia (DRG) van volwassen Sprague Dawley-ratten. (B) Trimmen en snijden van geoogste DRG. (C) Hydrogelformulering, DRG-inbedding en cultuur in hydrogel in MC in een plaat met 48 putjes. (D) Groei van DRG-neurieten na 21-30 dagen kweek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Afbeelding 2: Bedrukt multicompartiment met drie geïsoleerde compartimenten en kan worden gebruikt in een plaat met 48 putjes. (A) Een representatieve afbeelding van het bovenaanzicht van het geprinte MC-apparaat toont de DRG- en neurietcompartimenten (rode lijnen) en het DRG-inbeddingsgebied (groen). (B) Zijaanzicht van MC. (C) Een afbeelding van MC in een plaat met 48 putjes. Schaalbalk = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Neurite groei in multi-compartiment (MC) apparaat, en controle gewone gels. (A) Een representatief beeld van getraceerde neurietgroei in een apparaat met meerdere compartimenten (MC) in een helder veld. (Onder) Neurieten die door de tunnels van MC groeiden, worden aangegeven met pijlen. (B) Afbeelding van neurietgroei in gewone controlegels (zonder MC). (C) Een representatief beeld van neuriettracering van twaalf lange neurieten in gewone controlegels (paarse lijnen). Zes lange neurieten aan weerszijden van de DRG werden gekwantificeerd om de gemiddelde neurietlengte te geven. Beelden werden vastgelegd met een fluorescerende plaatimager met een vergroting van 4x en neurieten werden gekwantificeerd met behulp van FIJI (ImageJ). Schaalbalken = 1000 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Neurite lengte in multi-compartiment (MC) vergeleken met die van gewone gel (PG). Spreidingsdiagram met individuele neurietlengtes met gemiddelden en standaarddeviaties weergegeven door foutbalken. De gemiddelde neurietlengte in MC was 1204,40 μm ± 690,43 μm (gemiddelde ± SD) vergeleken met 864,26 μm ± 362,84 μm (gemiddelde ± SD) in de gewone gel, wat wijst op MC-ondersteuning van neurietgroei. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend coderingsbestand 1: STL-bestand van een apparaat met meerdere compartimenten (MC) dat is gegenereerd met behulp van computerondersteunde ontwerpsoftware. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol schetst een methode om volwassen Sprague Dawley DRG's te oogsten en ze te kweken in natuurlijke 3D-hydrogels. In tegenstelling tot deze methode omvatten andere benaderingen voor het oogsten van DRG's van muizen en ratten het isoleren van de wervelkolom. De uitgesneden wervelkolom wordt gehalveerd en het ruggenmerg wordt verwijderd om DRG's 23,24,25 bloot te leggen. Schade aan het ruggenmerg beperkt de bloedtoevoer, wat invloed heeft op DRG's en interne neuronen26. Dit vermindert de activiteit van DRG's, waardoor de chirurgische benaderingen geschikter worden. Verder is een methode geschetst om een robuust MC-apparaat in 3D te printen dat een fysiologisch relevante cultuur van DRG's mogelijk maakt.

Dit protocol schetst een methode om DRG in vitro te kweken, met de nadruk op het bestuderen van perifere sensibilisatie van neuronen in een anatomisch en fysiologisch relevant model. Deze kweekmethode kan een fysieke scheiding van distale neurieten en het DRG-cellichaam in een 3D-omgeving tot stand brengen. Het MC-apparaat bootst de in vivo-omgeving na, aangezien DRG-explantaten met cellen worden bewaard en samen met natuurlijke gliacellen kunnen worden gekweekt. DRG-explantatie bevat niet-inheemse neuronale cellen, die samen met andere cellen kunnen worden gekweekt om fysiologische omstandigheden na te bootsen. Deze fysiologische relevantie bevordert studies naar hoe niet-neuronale cellen de neurietactiviteit reguleren en helpt bij het begrijpen van basismechanismen die betrokken zijn bij nociceptie. Het opnemen van deze niet-neuronale interacties zou nauwkeurigere voorspellingen van celsignaleringsresultaten moeten opleveren in vergelijking met vereenvoudigde kweekmodellen met gedissocieerde DRG's. De aanwezigheid van twee neurietcompartimenten maximaliseert de fysiologische relevantie omdat enkele DRG's verschillende weefsels in vivo innerveren. Dit ontwerp maakt de behandeling van het ene neurietcompartiment mogelijk, terwijl het andere als controle dient. Controle- en behandelingscompartimenten die verbonden zijn met een enkele soma kunnen worden gebruikt om cross-compartiment effecten te bestuderen, waarbij in vivo omstandigheden worden nagebootst waarbij neurieten zich uitstrekken van een enkele soma en verschillende stimuli ervaren terwijl ze verschillende weefsels innerveren, waardoor inzicht wordt verkregen in overspraak tussen neurieten. Als er overspraak optreedt tussen neurieten in aangrenzende compartimenten, kunnen onbehandelde DRG's als een echte controle dienen.

Dit apparaat kan worden gebruikt voor isolatie van de behandeling of om de interactie tussen neuronen en DRG in de context van pijn te bestuderen. Aangezien distale neurieten selectief afzonderlijk van de DRG soma en proximale neurieten kunnen worden behandeld, kan dit systeem worden gebruikt voor perifere behandelingen zoals gerichte gewrichtstherapieën, waarbij het terminale uiteinde van perifere sensorische neuronen direct wordt behandeld.

Een belangrijk voordeel van het MC-apparaat zijn de experimenten met hoge doorvoer over meerdere putjes van dezelfde plaat, aangezien het MC-apparaat is ontworpen om in een plaat met 48 putjes te passen. Een bijkomend voordeel van het in-vitroplatform is het vermogen om de hydrogelstijfheid binnen het MC te veranderen door collageen- en MAHA-concentraties af te stemmen om de eigenschappen van verschillende weefselmicro-omgevingen na te bootsen. Een mogelijke beperking van dit protocol is dat fluïdische isolatie tussen de neuriet- en DRG soma-compartimenten niet ideaal is voor culturen langer dan 72 uur zonder mediaverandering. Een eerdere studie bevestigde dat de vloeistofisolatie in de compartimenten tot 72 uur wordt gehandhaafd zonder mediaveranderingen11. Eerdere studies hebben aangetoond dat het verhogen van de hyaluronzuurconcentratie de dichtheid van collageenverknoping aanzienlijk verbetert, waardoor de diffusiteit van macromoleculen over de hydrogelmatrix wordt beperkt27. Om de fluïdische isolatie voor culturen na 72 uur te verbeteren, kan de concentratie van MAHA worden verhoogd, zoals aangetoond in een studie van Caparaso et al.7, waar een toename van MAHA resulteerde in een verbeterde vloeistofisolatie. Controle-inbedding wordt gedaan om een vergelijkbare groei van DRG-neurieten in MC en gewone gel te garanderen. Dit is om ervoor te zorgen dat MC geen invloed heeft op de groei van DRG. Het wordt niet aanbevolen om de inbedding van de controlegroep bij elk experiment te herhalen zodra de groei van DRG in MC is gevalideerd.

De auteurs erkennen dat menselijke DRG's groter zijn, meer cellen bevatten en verschillende proporties van neuronsubtype hebben in vergelijking met DRG's bij ratten28. Het gebruik van DRG's van knaagdieren is een beperking van deze studie in termen van vertaling naar de kliniek; Dit systeem kan echter waardevol zijn als screeningplatform om verbindingen te identificeren die de neuronale prikkelbaarheid beïnvloeden. Hoewel er verschillen zijn in de samenstelling tussen DRG's bij knaagdieren en mensen, is er ook een grote overlap binnen het proteoom tussen DRG's bij ratten en mensen29. Deze overlap in proteoom - en de aanwezigheid van dezelfde neuronale subtypes - suggereert dat de DRG van de rat kan worden gebruikt om therapieën op een hoog niveau te screenen, en dat verdere tests kunnen worden uitgevoerd om te onderzoeken of veranderingen in de DRG van de rat mechanistisch vertalen naar de menselijke DRG.

Dit platform maakt gerichte farmacologische stimulatie en de studie van neuronen of cellichamen met temporele controle mogelijk. Veranderingen in neuronale prikkelbaarheid en signaaloverdracht kunnen gemakkelijk worden gemeten door neurieten of de DRG te manipuleren. Het vermogen om neuronale prikkelbaarheid te beoordelen met behulp van calciumbeeldvorming in gewone controlehydrogels met explantatie-DRG's is aangetoond7. Vergelijkbare methoden kunnen worden gebruikt in het MC-apparaat om neuronale prikkelbaarheid te beoordelen.

Deze methode kan worden gebruikt om verschillende pijnaandoeningen te bestuderen waarbij stimulatie van perifere primaire sensorische neuronen een drijvende factor is, zoals schijf-geassocieerde lage rugpijn. Het screenen van overgevoeligheid van nociceptoren kan een veelbelovend hulpmiddel zijn voor het ontdekken van nieuwe geneesmiddelen om hyperexcitabiliteit te verminderen. Het verminderen van hyperexcitabiliteit heeft het potentieel om zich klinisch te vertalen in verminderde pijn. Dit platform kan geneesmiddelen met een hoge doorvoer screenen om de meest effectieve kandidaten voor in vivo validatie te identificeren met behulp van pijnachtige gedragstests.

Openbaarmakingen

De auteurs van deze studie verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een NSF Grant (2152065) en een NSF CAREER Award (1846857). De auteurs willen alle huidige en voormalige leden van het Wachs Lab bedanken voor hun bijdrage aan dit protocol. De diagrammen in figuur 1 zijn gemaakt in Biorender.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#5 forcepsFine Science Tools11252-00Voor het trimmen en snijden van DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (geautoclaveerd)Bereidt in lab7.3 - 7.5 pH
24 well platenVWR82050-892Voor het tijdelijk opslaan van geoogste en gesneden DRG's
3 mL Syringe steriele, eenmalig gebruikBD309657
48 well platenGreiner Bio-One677180
60 mm Petri schotelFisher ScientificFB0875713AOm media voor trimmen en snijden vast te houden
AluminiumfolieFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044Voor DRG media
Collageen type IIbidi50205
Gebogen cup Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14Voor dissectie
Dumont #3 forcepsFine Science Tools11293-00Voor dissectie
Fetaal bovien serum (FBS)ThermoFisher16000044Voor DRG media
Form cureForm Labsverhardingsmiddel
Form washForm LabsOm overtollige harsen van MC af te wassen
Glaskralen sterilisatorFisher ScientificNC9531961
Glazen flacons (8 mL)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061Voor DRG media
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
High temp V2 harsFormLabsFLHTAM02
Hyaluronzuur natriumzoutMilliporeSigma53747Gebruikt om MAHA te maken
IrgacureMilliporeSigma410896
LaminineR&D Systems344600501
Grote stompe schaarMilitexEG5-26Voor dissectie
Grote schaar (gekartelde uiteinden)Militex9538797Voor dissectie
Grote scherpe schaarFine Science Tools14010-15Voor dissectie
Laag retentiepipettipsFisher Scientific02-707-017Voor het pipetten van collageen en MAHA
Methacrylated hyaluronzuur (MAHA)Bereidt in labN/A85 - 115 % methacrylatie
Nervoos groeifactor (NGF)R&D Systems556-NG-100Voor DRG media
Neurobasal A MediaThermoFisher10888022Voor DRG media
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicilline/Streptomycine (PS)EMD Millipore516106Voor DRG media
pH test stripsVWR InternationalBDH35309.606
Pipettips (1000 µL)USA Scientific1111-2021
Preform 3.23.1 softwareFormslabOm STL-bestand te uploaden
RattenCharles River
Resin 3D printerForm LabsForm 3L3D afdruk MC apparaat
Kleine scherpe schaarFine Science Tools14094-11Voor dissectie
NatriumbicarbonaatMilliporeSigmaS6014
Rechte schotel rongeurFine Science Tools16004-16Voor dissectie
Rechte schaar met veerFine Science Tools15024-10Voor dissectie
Chirurgische scalpelmes (Nr. 10)Fisher Scientific22-079-690
Syringefilters, PES (0.22 µm)Celltreat229747
Kleine veer schaarWorld Precision Instruments14003Voor het trimmen en snijden van DRG
UV lampAnalytik Jena USOm hydrogel fotocrosslinken (15 - 18 mW/cm2)
```

Referenties

  1. Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
  2. Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. Pain as a global public health priority. BMC Public Health. 11 (1), 770(2011).
  3. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
  4. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  5. Im, H. J., et al. Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model. Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).
  6. Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).
  7. Berge, O. G. Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain. Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).
  8. Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. Use of a capillary alginate gel (capgel™) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium. J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).
  9. Mohammed Izham, N. A., et al. Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies. Neurosci Res Notes. 5, 144(2022).
  10. Park, S. E., et al. A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system. NPG Asia Mater. 13 (1), 2(2021).
  11. Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).
  12. Krug, A. K., et al. Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).
  13. F, M., et al. Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture. J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).
  14. Spearman, B. S., et al. Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).
  15. Zhu, W., Oxford, G. S. Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor. Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).
  16. Van De Wijdeven, R., et al. Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip. Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).
  17. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  18. Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination. J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).
  19. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  20. Seidlits, S. K., et al. The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation. Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).
  21. Tomal, W., Ortyl, J. Water-soluble photoinitiators in biomedical applications. Polymers. 12 (5), 1073(2020).
  22. Leary, S., et al. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Veterinary Medical Association. , Schaumburg, Illinois. (2013).
  23. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9 (1), 82(2016).
  24. Naveed, M., et al. Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition. Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212(2023).
  25. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
  26. Bai, X., et al. A high-resolution anatomical rat atlas. J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).
  27. Bian, L., et al. The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy. Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).
  28. Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Front Cell Neurosci. 13, 271(2019).
  29. Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome. Scientific Rep. 8 (1), 13469(2018).

Herprints en machtigingen

Tags

Multi compartimenttoestelneurietuitgroeichronisch pijnmodelDRG cultuurperifere neuronenhydrogel inbeddingnociceptorhypersensitiviteitImageJ analyseneuriettracing
Het oogsten, inbedden en cultiveren van dorsale wortelganglia in apparaten met meerdere compartimenten om perifere neuronale kenmerken te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.