Methodenartikel

Mitochondriale transformatie bij Baker

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66856

⸱

7 juni 2024

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit werk legt uit hoe gistmitochondriën kunnen worden getransformeerd met behulp van een biolistische methode. We laten ook zien hoe de transformanten kunnen worden geselecteerd en gezuiverd en hoe de gewenste mutatie in de doelpositie binnen het mitochondriale genoom kan worden geïntroduceerd.

Samenvatting

Bakkersgist Saccharomyces cerevisiae wordt al tientallen jaren veel gebruikt om de mitochondriale biologie te begrijpen. Dit model heeft kennis opgeleverd over essentiële, geconserveerde mitochondriale routes tussen eukaryoten en schimmels of gistspecifieke routes. Een van de vele vermogens van S. cerevisiae is het vermogen om het mitochondriale genoom te manipuleren, wat tot nu toe alleen mogelijk is bij S. cerevisiae en de eencellige alg Chlamydomonas reinhardtii. De biolistische transformatie van gistmitochondriën stelt ons in staat om plaatsgerichte mutaties te introduceren, genherschikkingen te maken en verslaggevers te introduceren. Deze benaderingen worden voornamelijk gebruikt om de mechanismen van twee sterk gecoördineerde processen in mitochondriën te begrijpen: translatie door mitoribosomen en assemblage van ademhalingscomplexen en ATP-synthase. Mitochondriale transformatie kan echter mogelijk worden gebruikt om andere routes te bestuderen. In dit werk laten we zien hoe gistmitochondriën kunnen worden getransformeerd door middel van microprojectielbombardementen met hoge snelheid, de beoogde transformator kunnen worden geselecteerd en gezuiverd en de gewenste mutatie in het mitochondriale genoom kunnen worden geïntroduceerd.

Inleiding

De gist Saccharomyces cerevisiae is een algemeen erkend model dat wordt gebruikt om mitochondriale biogenese te bestuderen. Aangezien gist een anaëroob, facultatief organisme is, is het mogelijk om de oorzaken en gevolgen van het introduceren van mutaties die de ademhaling belemmeren uitgebreid te bestuderen. Bovendien beschikt dit organisme over vriendelijke genetische en biochemische hulpmiddelen om mitochondriale routes te bestuderen. Een van de krachtigste bronnen om de mechanismen van de assemblage van respiratoire complexen en mitochondriale eiwitsynthese te onderzoeken, is echter het vermogen om mitochondriën te transformeren en het genoom van de organel te wijzigen. Eerder was het nuttig om in het mitochondriaal DNA (mtDNA) puntmutaties of kleine deleties/inserties 1,2,3,4,5 te introduceren, genen 6,7 te verwijderen, genherschikkingen te maken 7,8, epitopen toe te voegen aan mitochondriale eiwitten 9,10, genen te verplaatsen van de kern naar de mitochondriën11,12, en introduceer reportergenen zoals BarStar13, GFP14,15, luciferase16 en de meest gebruikte ARG8m17,18. Mitochondriale genoommodificaties hebben ons in staat gesteld om mechanismen te ontleden en te identificeren die anders moeilijk te begrijpen zouden zijn geweest. Het ARG8 m-reportergen dat op de COX1-locus in het mitochondriaal DNA werd ingebracht, was bijvoorbeeld cruciaal om te begrijpen dat Mss51 een dubbele rol speelt in de biogenese van Cox1. Ten eerste is het een translationele activator van het COX1-mRNA en ten tweede is het een assemblagechaperonne voor het nieuw gemaakte Cox1-eiwit 7,19. Dit werk presenteert een gedetailleerde methode om S. cerevisiae mitochondriën te transformeren. Hoewel het mitochondriale transformatieprotocol al eerder werd gepubliceerd 16,20,21,22,23, is een visuele benadering door middel van een video essentieel om de verschillende stadia en details van de methode grondig te begrijpen. De methode bestaat uit verschillende stappen en is onderverdeeld in vier algemene fasen:

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzicht van de mitochondriale transformatieprocedure door microprojectielbombardement met hoge snelheid: 1) De wolfraamdeeltjes worden gesteriliseerd en geprepareerd voordat ze worden gecoacht. 2) Twee verschillende plasmiden worden neergeslagen op het oppervlak van de WP's. Een daarvan is een bacterieel plasmide dat het construct bevat dat naar de mitochondriale matrix zal worden geleid. De andere is een nucleaire gistexpressievector met een auxotrofiemarker. 3) Een receptorgiststam zonder mitochondriaal DNA (rho0) wordt gekweekt op een fermentatieve koolstofbron zoals galactose of raffinose, die geen glucoseonderdrukking van mitochondriale genexpressie uitoefent34,35. De cultuur wordt uitgespreid op petrischaaltjes met het medium bombardement. 4) WP's bedekt met plasmiden worden naar de receptorstam geschoten door microprojectielbombardementen met hoge snelheid. 5) Positieve synthetische rho-kolonies die het mitochondriale plasmide bevatten, worden geselecteerd door te paren met een teststam. 6) Het mitochondriale construct wordt op de gewenste locus geïntegreerd in het mitochondriale genoom door de synthetische rho-stam (donor) te paren met de acceptorstam via een proces dat bekend staat als cytoductie. 7) De positieve receptor, haploïde stam die het mitochondriale construct draagt, wordt geselecteerd en gezuiverd in verschillende media. Afkortingen: WPs = wolfraamdeeltjes; mtDNA = mitochondriaal DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Transformatie van cellen met het DNA-construct dat bedoeld is om te integreren in het mitochondriale genoom (Figuur 1, stappen 1-4)
Hoewel het mogelijk is om een gist met een compleet mitochondriaal genoom (rho+) direct te transformeren, is de transformatie 10-20x efficiënter als de cellen mitochondriaal DNA (rho0)24 missen. Wolfraamdeeltjes (WP's) worden gecoat met twee verschillende plasmiden die samen zullen worden getransformeerd. De eerste is een gist 2 μ expressievector met een auxotrofiemarker, zoals LEU2 of URA3 (bijv. YEp351 of YEp352, respectievelijk). Als de biolistische introductie van DNA in de gistcellen succesvol is, zullen de transformanten groeien op het auxotrofiemedium (d.w.z. een medium zonder leucine of uracil). Dit plasmide is nuttig bij het maken van de eerste selectie van de cellen die het nucleaire plasmide hebben verworven; Anders zou het aantal resulterende kolonies de plaat verzadigen. Het tweede plasmide is een bacterieel plasmide (zoals pBluescript of iets dergelijks) dat de mitochondriale constructie bevat die bedoeld is om te worden geïntegreerd in het mitochondriale genoom. Het construct moet ten minste 100 nt flankerende mitochondriale sequenties van 5' en 3' bevatten voor recombinatie met het mitochondriale gebied van belang. In onze ervaring is de kans groter dat grotere flankerende sequenties met succes recombineren met de doellocus in het mitochondriale genoom.

Een specifiek voorbeeld is weergegeven in figuur 225. In dit voorbeeld was het doel om het gebied van het mitochondriale COX1-gen te verwijderen dat codeert voor de laatste 15 aminozuren van het overeenkomstige eiwit (Cox1ΔC15) (Figuur 2A). Het bacteriële plasmide met de COX1ΔC15-mutatie bevatte respectievelijk 395 nt en 990 nt van de 5' en 3' niet-vertaalde regio's van het gen. Het plasmide was afgeleid van pBluescript (pXPM61) en samen met het 2 μ plasmide YEp352 werden ze gecoprecipiteerd op het oppervlak van WP's (Figuur 2B). De WP's werden vervolgens door middel van een microprojectielbombardement in de geselecteerde ontvangende stam geïntroduceerd (Figuur 2C). Deze stam, NAB6926 genaamd, is een MATa, rho 0-stam met de allelen kar1-1 en ade2 (het belang van deze kenmerken wordt hieronder besproken). De cellen werden geplateerd op bombardementsmedia zonder uracil om die cellen te selecteren die het 2 μ plasmide hadden verworven (Figuur 2C). De cellen werden gedurende 5-7 nachten bij 30 °C gekweekt.

Selectie van de cellen die het bacteriële plasmide met het mitochondriale construct en het nucleaire 2 μ plasmide met de auxotrofiemarker hebben verworven (Figuur 1, stap 5)
De positieve kolonies zullen veel kopieën van het bacteriële plasmide in hun mitochondriën behouden22. Aangezien de getransformeerde cellen oorspronkelijk rho0 zijn, ondersteunen geen mitochondriale sequenties de translatie van het mitochondriale construct dat aanwezig is in het plasmide; Daarom zal het getransformeerde mitochondriale gen niet tot expressie worden gebracht. Het is noodzakelijk om de transformatoren te paren met een teststam om de gistkolonies te detecteren die het mitochondriale plasmide hebben verworven. Het mitochondriale genoom van de teststam bevat een niet-functionele gemuteerde versie van het gen in kwestie. Na de paring zullen de mitochondriën samensmelten en zal de mitochondriale sequentie die in het getransformeerde plasmimide is opgenomen, recombineren met het gemuteerde mitochondriale gen van de testerstam; bijgevolg zal het herstel van het WT-gen de functie herstellen. De resulterende diploïde zal een detecteerbaar positief fenotype hebben (meestal het vermogen om te groeien in een respiratoir medium of een medium zonder arginine). De positieve cellen die het bacteriële plasmide in mitochondriën dragen, worden "synthetische rho-cellen " genoemd. In het specifieke voorbeeld van figuur 2D werden synthetische rho-cellen met het COX1ΔC15-construct (XPM199 genaamd) gerepliceerd op een medium zonder uracil (dit is de hoofdplaat waaruit positieve kolonies werden gezuiverd). Ze werden ook gerepliceerd op een tester stam L4527 gazon, dat de niet-functionele mutatie cox1D369N bevat. Na twee nachten paren recombineerde het mitochondriale genoom van L45 en XPM199, wat resulteerde in een functioneel COX1-gen ; Daarom herstelden de diploïden het vermogen om te groeien op respiratoire media. Van de moederplaat hebben we de positieve kolonies geplukt. Ze werden gestreept op platen zonder uracil en de selectieve tests werden herhaald om zuivere synthetische rho-cellen te verkrijgen (Figuur 2E). Het is belangrijk op te merken dat de testplaat alleen bedoeld is voor de identificatie van synthetische rho-kolonies en dat mutanten niet uit deze platen kunnen worden gehaald.

Integratie van het construct in het mitochondriale genoom van de beoogde stam
Deze stap wordt bereikt door een proces dat cytoductie28,29 wordt genoemd (Figuur 1, stap 6). Bij deze benadering wordt de synthetische rho-stam (donorstam) gekoppeld aan de beoogde acceptorstam van het tegenovergestelde paringstype. Een essentiële vereiste is dat ten minste één van de twee parende stammen de kar1-1-mutatie draagt om kernfusie te belemmeren30. Vandaar dat de paring van de twee cellen een tweekernige zygote produceert (Figuur 3). Het mitochondriale netwerk van de oudercellen (donor en acceptor) versmelt en de mitochondriale DNA-moleculen recombineren. De tweekernige zygoten worden geïncubeerd/hersteld om knopvorming mogelijk te maken, die haploïde cellen zullen produceren. Deze haploïden dragen de nucleaire achtergrond van een van de oudercellen. Evenzo kunnen haploïden het mitochondriale DNA van de ouderlijke cel of het gerecombineerde mitochondriale DNA van belang dragen. De kar1-1-mutatie is echter niet 100% effectief en tijdens de paring zullen enkele echte diploïden worden gevormd28,29. De synthetische rho-stam (donor, XPM199) droeg in het voorbeeld het kar1-1 allel. Als selectieve marker had het het ade2-allel, waardoor het een auxotroof voor adenine is (Figuur 4). De acceptorstam was XPM10, een rho+-stam met de cox1Δ::ARG8m-constructie, waarbij de verslaggever ARG8m de COX1-codons in het mitochondriale genoom7 verving. Het mengsel van beide celculturen werd als druppel aan een YPD-plaat toegevoegd om paring mogelijk te maken. Na 3-5 uur werden de cellen onder een lichtmicroscoop geobserveerd om de vorming van shmoos te detecteren (Figuur 3B), een celvorm die verband houdt met paring. Na de incubatie-/hersteltijd werden de binucleaire zygoten uitgeplateerd op een medium zonder adenine om de groei van de donorcellen te voorkomen.

Selectie van de haploïde stam die het mitochondriale genoom van belang draagt (Figuur 1, stap 7)
Een mengsel van donor-, acceptor- en diploïde cellen is aanwezig na cytoductie. Daarom moeten na de incubatie/herstel van de tweekernige zygoten cellen worden gekweekt in verschillende selectieve media om de haploïden van belang te identificeren en te zuiveren. De selectieve media zijn afhankelijk van de genotypen van de donor, acceptorstammen en de beoogde mitochondriale constructie. Over het algemeen is de redenering voor het kiezen van de selectieve media echter: i) na incubatie/herstel wordt de cytoductiemix gekweekt op een selectief medium waar de donorouderstam niet kan groeien. In het specifieke voorbeeld in figuur 4A,B draagt de donor (synthetische rho-stam) het niet-functionele ade2-allel. Het cytoductiemengsel moet dus worden geïncubeerd op een middelgrote plaat zonder adenine. Dit is de moederplaat. ii) Zodra de kolonies groeien, wordt de hoofdplaat opnieuw gerepliceerd op een medium zonder adenine (om een nieuwe hoofdplaat te genereren van waaruit de positieve kolonies van belang zullen worden gezuiverd), en vervolgens op een medium waar alleen diploïden kunnen groeien. Dit is nodig om verdere onbedoelde zuivering van diploïde kolonies te voorkomen. In het geval van het voorbeeld uit figuur 4C kunnen alleen diploïden groeien op media zonder leucine. iii) De hoofdplaat wordt ook gerepliceerd op media waar alleen die acceptor-haploïden zullen groeien die het mitochondriale DNA van belang hebben opgenomen. In het voorbeeld van figuur 4C groeien haploïden op respiratoire media die ethanol/glycerol als koolstofbron bevatten, aangezien het Cox1ΔC15-eiwit functioneel is. De resulterende rho+-stam met het mtDNA van belang kreeg de naam XPM20925. De in figuur 2 en figuur 4 gebruikte stammen zijn vermeld in tabel 1.

figure-introduction-2
Figuur 2: Diagram met een specifiek voorbeeld van mitochondriale transformatie en selectie van positieve rho-cellen. (A) De beoogde wijziging van het mitochondriale genoom was een deletie van het gebied dat codeert voor de laatste 15 aminozuren van de Cox1-subeenheid (Cox1ΔC15). (B) WP's werden gecoat met twee plasmiden om gistcellen te transformeren. Een daarvan was het 2 μ plasmide Yep352 dat werd gericht en tot expressie werd gebracht in de kern. De andere was plasmide pXPM61, dat het COX1ΔC15-allel bevat plus respectievelijk 395 nt en 990 nt van de COX1 5'- en 3'-UTR's. (C) De WP's werden geïntroduceerd in cellen van de stam NAB69, die mitochondriaal DNA mist (rho0-stam). Transformatiekolonies verkregen uit de bombardementsplaten werden gerepliceerd op een medium zonder uracil, de auxotrofe marker van het nucleaire plasmide YEp352. (D) Om de positieve rho-kolonies te selecteren, werd de -URA-plaat gerepliceerd op een medium zonder uracil. Dit was de hoofdplaat waaruit de positieve kolonies werden geplukt en geïsoleerd. Het werd ook gerepliceerd op platen met rich media (YPD) en een gazon van een testerstam. Tijdens de paring werd het synthetische rho-mitochondriaal DNA gerecombineerd met het mitochondriaal DNA van de testerstam, L4527, die een mutatie in het COX1-gen (D369N) draagt. De diploïden die op respiratoire media groeiden, bevatten het getransformeerde DNA. De bijbehorende kolonies werden van de moederplaat geplukt om te herscheppen en te zuiveren. Om te helpen bij het identificeren van de positieve kolonies in de hoofdplaat tijdens alle replicabeplating, werden markeringen gemaakt met een permanente marker op de randen van de platen (groene lijnen). (E) De geselecteerde positieve kolonies werden gestalte op een medium zonder uracil. Dit was de nieuwe moederplaat. Evenals in D werden nog twee testrondes uitgevoerd om de synthetische rho-kolonies te zuiveren. Afkortingen: WPs = wolfraamdeeltjes; mtDNA = mitochondriaal DNA; -URA/Sorb = zonder uracil/ bevattend Sorbitol; WT = wild type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-introduction-3
Figuur 3: Diagram van de cytoductieprocedure. (A) Algemeen overzicht van hoe cellen paren tijdens cytoductie. Tijdens cytoductie smelten mitochondriën van de donor- en acceptorstammen samen, zodat mitochondriaal DNA van beide stammen recombineert. Omdat kernfusie wordt verminderd als gevolg van de kar1-1-mutatie 30, worden binucleaire zygoten gevormd. Na enige incubatie-/hersteltijd worden de binucleaire zygoten knop- en haploïde acceptoren die de beoogde mitochondriale mutatie bevatten, geselecteerd. (B) Paring van de synthetische rho-stam (donor) en de acceptorstam door middel van cytoductie maakt de vorming van shmoos (rode pijlen) mogelijk, een karakteristieke vorm van paringsgist. De foto is gemaakt onder een lichtmicroscoop met een 100x objectief. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-introduction-4
Figuur 4: Diagram met een specifiek voorbeeld van cytoductie om de mutatie COX1ΔC15 in het mitochondriale genoom te integreren. (A) Vloeibare culturen van de synthetische rho-stam (donor, XPM199) en de betreffende stam (acceptor, XPM10) werden gemengd om te paren. Na shmoo-vorming werd het mengsel gedurende 2-4 uur teruggewonnen in een vloeibare cultuur. Vervolgens werd de cytoductiemix uitgespreid op een plaat met een medium zonder adenine om de groei van de donorcellen te voorkomen. (B) Schematische weergave van de recombinatiegebeurtenissen van het mitochondriaal DNA van de donor (XPM199) en de acceptor (XPM10) tijdens cytoductie. (C) De hoofdplaat werd gerepliceerd op verschillende selectieve media om die haploïden te identificeren en te zuiveren die het beoogde mitochondriale gen in het DNA van de organel integreerden (XPM209)25. Afkortingen: -ADE = zonder adenine; -LEU = gebrek aan leucine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

OPMERKING: We raden aan om voor elk construct zes transformaties uit te voeren, aangezien de mitochondriale transformatie-efficiëntie meestal laag is. De samenstelling van de verschillende groeimedia is weergegeven in Tabel 2.

1. Bereiding van wolfraamdeeltjes

  1. Weeg 30 mg wolfraamdeeltjes van 0,7 μm (WP's, microcarriers) af in een microbuisje. Voeg 1,5 ml 70% ethanol (EtOH) toe om te steriliseren. Draai de WP's en laat ze 10 minuten rusten op kamertemperatuur.
  2. Centrifugeer op 13.200 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was de WP's door 1,5 ml steriel water aan de deeltjes toe te voegen, ze te vortexen en 15 minuten bij kamertemperatuur te centrifugeren bij 13.200 × g . Gooi het supernatant weg.
  3. Voeg 500 μL steriele 50% glycerol toe (eindconcentratie is 60 μg WPs/μL).
    OPMERKING: WP's kunnen minimaal 6 maanden bij -20 °C worden bewaard. Neem uit deze voorraad de benodigde hoeveelheid voor zes transformaties (100 μL).

2. WP's DNA-coating

  1. Voeg 5 μg van het 2 μ plasmide en 15 μg van het bacteriële plasmide met de mitochondriale sequentie toe aan een microbuisje op ijs.
    OPMERKING: Het uiteindelijke volume mag niet groter zijn dan 50 μl om verdere verdunning van de reagentia die nodig zijn voor DNA-coating te voorkomen.
  2. Voeg 100 μL van de WP-suspensie en vortex toe gedurende 5 s (6 mg WP's).
  3. Voeg 4 μL 1 M spermidine toe. Kort draaikolk.
  4. Voeg 100 μL ijskoude 2,5 M CaCl2 toe, kort vortex. Incubeer 10 minuten op ijs; Draai de mix elke 3 minuten kort rond.
    OPMERKING: De CaCl2-oplossing is gefilterd gesteriliseerd en mag niet worden geautoclaveerd.
  5. Centrifugeer de WP's gedurende 30 s bij 13.200 × g bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Was de deeltjes door ze voorzichtig te resuspenderen in 200 μL 100% EtOH bij -20 °C.
  6. Centrifugeer de WP's gedurende 30 s bij 13.200 × g bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Herhaal de wasbeurt.
  7. Resuspendeer de WP's in 60-70 μL 100% EtOH op kamertemperatuur met behulp van een pipetpunt; Niet vortex.
    OPMERKING: Om de kwaliteit van de plasmiden te garanderen, moet DNA-coating op dezelfde dag worden uitgevoerd als de biolistische transformatie.

3. Biolistische materiaalvoorbereiding

  1. Steriliseer vóór het bombardement zes houders van macrocarriers (Figuur 5) in een autoclaaf en droog ze grondig af. U kunt ze ook weken in EtOH en ze steriliseren met een vlam met behulp van een tang. Leg ze op een steriele glasplaat.
  2. Tijdens DNA-precipitatie (10 minuten incubatie op ijs in stap 2.4) plaatst u met behulp van een steriele pincet zes macrodragers (of vliegende schijven) in elk van de zes macrodragerhouders.
    OPMERKING: Steriliseer de macrodragers niet.
  3. Meng de DNA-gecoate WP's met de pipet. Voeg 10 μL van de WP's toe aan elk oppervlak van de macrodrager en verdeel met de pipetpunt over het hele oppervlak. Voeg indien nodig een paar extra microliters 100% EtOH toe aan het oppervlak van de macrodrager om een gelijkmatige spreiding van de WP's te maken. Laat de suspensie ~20 minuten drogen bij kamertemperatuur.

4. Bereiding van gistcellen en bombardementsplaten

  1. Inoculeer de rho0-receptorstam op 2 ml YPR-medium (tabel 2). Groei gedurende één nacht bij 30 °C in een draaiend wiel.
  2. Verdun 300 μL van de cultuur in 30 ml vers YPR-medium. Groei bij 30 °C en 200 rpm op een roterende schudder gedurende twee nachten tot de cultuur verzadigd is.
  3. Centrifugeer de gistcellen bij 600 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de gistcellen in 600 μl YPD-medium (tabel 2).
  4. Verdeel met een steriel glazen handvat 100 μl van de gistcelsuspensie op een stevige plaat met bombardementsmedium.
    OPMERKING: Het bombardementsmedium moet de selectiemarkering missen van het 2 μ plasmide dat voor de transformatie zal worden gebruikt.
  5. Herhaal stap 4.4 voor de andere vijf platen.
  6. Incubeer gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur voordat u het bombardeert om ervoor te zorgen dat het vloeibare medium volledig wordt geabsorbeerd op het oppervlak van de plaat.

5. Ontstaan van een synthetische rho-stam door biolistische transformatie

NOTITIE: Voordat u begint, moet u de gebruikershandleiding van de biolistische apparatuur lezen. We zullen het protocol van de gerefereerde apparatuur beschrijven (Materiaaltabel en Figuur 5).

  1. Reinig de kamer van het biolistische deeltjesafgiftesysteem met 70% ethanol om verontreiniging te voorkomen en laat deze minstens 10 minuten staan. Veeg het oppervlak vlak voor het bombardement af met een schone papieren handdoek.
  2. Open de kleppen van de heliumtank om ongeveer 2,000 psi in te stellen.
  3. Schakel de apparatuur in en schakel de vacuümbron in.
  4. Plaats de macrodrager met een pincet naar beneden op de houder van de macrodrager.
    NOTITIE: Gebruik niet het stopscherm dat bij de apparatuur wordt geleverd.
  5. Schroef het deksel van de macrocarrier op de macrocarrier. Alle onderdelen samen vormen het lanceersysteem voor microcarriers (figuur 5).
  6. Plaats het microcarrier-lanceersysteem in de vacuümkamer op het vijfde niveau van onderaf.
  7. Plaats een van de platen met het gazon met de rho0-spanning op het tweede niveau vanaf de bodem van de kamer. Zorg ervoor dat de plaat naar boven wijst en zonder deksel is.
  8. Plaats met een steriele tang een breekplaat op de borgdop. Schroef de borgdop op de acceleratiebuis; Zorg ervoor dat de borgdop goed vastzit.
    OPMERKING: Behandel de gescheurde schijven niet met isopropanol zoals voorgesteld in de handleiding, aangezien we hebben vastgesteld dat de transformatie-efficiëntie afneemt.
  9. Sluit de deur van de vacuümkamer.
  10. Zet de VAC/VENT/HOLD-schakelaar in de VAC-stand . Wanneer het vacuüm van 25-28 inHg is bereikt, zet u de VAC/VENT/HOLD-schakelaar in de HOLD-stand .
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat het haalbare vacuüm kan variëren afhankelijk van het zeeniveau. We vonden succes bij het bereiken van 25 inHg.
  11. Druk op de FIRE-schakelaar om de WP's te schieten. Wacht tot de druk in de versnellingsbuis is opgebouwd tot deze 1,300 psi bereikt wanneer de breekplaat zal breken en een plopgeluid maakt.
  12. Direct nadat de breekplaat breekt, worden de FIRE-schakelaar en het vacuüm losgelaten door de VAC/VENT/HOLD-schakelaar in de VENT-stand te zetten.
  13. Verwijder voorzichtig, met een steriele tang, al het vuil van de breekplaat dat op het oppervlak van de plaat aanwezig is en bedek de plaat met het deksel.
  14. Herhaal de procedure voor de resterende vijf platen en plaats in elke ronde een nieuwe breekplaat en macrodrager.
  15. Sluit aan het einde de hoofdklep van de heliumtank.
  16. Sluit de kamer en bouw een vacuüm op door de VAC/VENT/HOLD-schakelaar in de VAC-stand te zetten. Bevrijd het systeem van elke heliumdruk door de FIRE-schakelaar een paar keer in te drukken en weer los te laten. Herhaal dit met de deur open.
  17. Schakel de vacuümpomp en de bombardementsapparatuur uit.
  18. Reinig het afgiftesysteem met 70% EtOH. Was de macrocarrier-steunen met een 0,1% SDS-oplossing; spoel af met steriel gedestilleerd water en 100% EtOH.

6. Selectie van synthetische rho-kolonies

  1. Incubeer de bombardementsplaten gedurende 5-7 nachten bij 30 °C.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de platen dagelijks te controleren op vervuiling. Indien nodig kan het besmette gebied met een steriele spatel worden weggesneden om verdere besmetting te voorkomen.
  2. Inoculeer de testerstam van het tegenovergestelde paringstype 's nachts in 2 ml YPD-medium (zie het specifieke voorbeeld in figuur 2D,E).
  3. Inoculeer 150 μl van de teststamcultuur op een YPD-plaat. Verdeel de tester met behulp van een steriel glazen handvat gelijkmatig over het plaatoppervlak. Laat de plaat minimaal 5 minuten drogen.
  4. Maak replica's van de bombardementsplaten met behulp van fluwelen replicatingpads en een replicatorstempel.
    1. Repliceer op een drop-out mediumplaat die overeenkomt met de getransformeerde 2 μ plasmide-auxotrofiemarker. De groei duurt één nacht incubatie bij 30 °C. Daarna bewaren bij 4 °C tot verder gebruik. Deze plaat is de hoofdplaat.
    2. Repliceer op de YPD-plaat met het gazon van de tester uit stap 6.3. Incubeer gedurende twee nachten bij 30 °C. Repliceer deze plaat vervolgens op het selectieve medium om de aanwezigheid van het mitochondriale gen van belang te detecteren, bijvoorbeeld een ademhalingsmedium of een medium zonder arginine, en incubeer een nacht bij 30 °C. Alleen de cellen die het synthetische bacteriële plasmide in mitochondriën herbergden, zullen na paring met de teststam op het selectieve medium groeien.
  5. Identificeer op de moederplaat (stap 6.4.1) de overeenkomstige kolonies die in stap 6.4.2 zijn gegroeid.
    OPMERKING: Aangezien de bombardementsplaat (en dus de hoofdplaat) vol zit met transformatiekolonies, kan het moeilijk zijn om die positieve kolonies te identificeren die op de paringsplaat van de tester zijn waargenomen. Om deze reden wordt het ten zeerste aanbevolen om met een permanente marker een paar kleine lijnen aan elke kant van alle platen te tekenen. Teken soortgelijke lijnen op de ring van de replicerende stempel. Deze lijnen zullen nuttig zijn bij het oriënteren en lokaliseren van positieve kolonies op de hoofdplaat (zie het voorbeeld in figuur 2D).
  6. Zuiver de positieve kolonies door ze van de hoofdplaat naar een tweede selectieve uitvalplaat te strepen, zoals in stap 6.4.1. Twee nachten incuberen bij 30 °C.
    OPMERKING: Het is essentieel dat strepen de groei van enkele kolonies mogelijk maken om een zuivere soort te garanderen.
  7. Herhaal het selectieproces (stappen 6.2-6.5) om de aanwezigheid van het bacteriële plasmide in mitochondriën te bevestigen.
    OPMERKING: Gewoonlijk kan dit proces nog twee keer worden herhaald om stabiele synthetische rho- stammen te selecteren.
  8. Zodra de synthetische rhoud-stam het plasmide-DNA in mitochondriën stabiel houdt, selecteert u 3-5 verschillende positieve kolonies en inoculeert u ze in 2 ml YPD. Gebruik deze cultuur om een cryoviale voorraad te bereiden (door 600 μL cultuur en 600 μL 50% glycerol te mengen om te bewaren bij -70 °C) en om de plasmidesequentie in het mtDNA van belang in te voegen door cytoductie (stap 6.7).
    OPMERKING: Aangezien er geen selectieve druk is om het getransformeerde plasmide in de mitochondriën van de synthetische rho-stam te behouden, kan het plasmide gemakkelijk verloren gaan. Daarom raden we aan om de cytoductie zo snel mogelijk uit te voeren.

7. Integratie van de constructie aanwezig in de synthetische rho-stam in de doellocatie in het mitochondriale genoom door cytoductie

  1. Inoculeer twee buisjes met 3 ml YPD-media, één met de donorcellen (synthetische rho-cellen ) en één met de acceptorcellen (gistcel waarvan de uiteindelijke constructie wordt verwacht). 's Nachts incuberen bij 30 °C.
  2. Meng 750 μL van de donorstam en 250 μL van de receptorstam in een steriele microbuis (verhouding 3:1).
  3. Centrifugeer het mengsel gedurende 1 minuut op 13.200 × g; Gooi de supernatant weg. Neem met behulp van een pipetpunt van 1 ml, waarvan het uiteinde is afgesneden, een druppel van de celpellet en plaats deze op een YPD-plaat. Incubeer bij 30 °C gedurende 2-4 uur.
    OPMERKING: Om kruisbesmetting te voorkomen, mag u niet meer dan twee celsuspensies in een enkele plaat plaatsen (zie het voorbeeld in figuur 4A).
  4. Neem een kleine hoeveelheid van het cellenmengsel, resuspendeer het in 15 μL steriel water op een objectglaasje en plaats een afdekglaasje. Controleer onder een lichtmicroscoop op de aanwezigheid van shmoos met een 40x of 100x objectief; deze karakteristieke vorm komt tot uiting wanneer er twee paringstypen aanwezig zijn (Figuur 3B).
  5. Als er shmoos aanwezig zijn, resuspendeer dan een kleine hoeveelheid (~0,5mm3) van de celmassa in 2 ml YPD-medium. Incubeer gedurende 2 uur bij 30 °C in een roterend wiel om de binucleaire zygoten te laten herstellen.
  6. Vortex het mengsel en verdun 10 μL van de celsuspensie in 990 μL steriel water (1:100 verdunning). Gebruik glazen kralen of een steriel glazen handvat om 100 μL van de celverdunning te verspreiden op een dropout-medium waar alleen de acceptorstam (en sporadische diploïden) groeien. Incubeer 2-3 nachten bij 30 °C.
  7. Repliceer de resulterende kolonies op de benodigde selectieve media zoals uitgelegd in de inleiding (fase 4; zie figuur 4C voor een specifiek voorbeeld).
  8. Na identificatie van positieve kolonies, herken je ze op dezelfde selectieve media om de haploïde stam te zuiveren die het mtDNA van interesse draagt.
  9. Selecteer ten minste twee positieve kolonies en laat ze 's nachts groeien op 2 ml YPD-medium bij 30 °C. Maak een cryogene back-up door 600 μL 50% glycerol te mengen met 600 μL van de verzadigde YPD-cultuur. Bewaren bij -70 °C.
  10. Isoleer het DNA van de resulterende stammen31,32. Amplificeer het gewenste gebied door PCR en sequentie om de aanwezigheid van de mitochondriale mutatie te bevestigen.
    OPMERKING: Elke positieve kolonie is een technische replicaat die onafhankelijk moet worden bevestigd om de juiste sequentie in het mitochondriale genoom te garanderen.

Resultaten

In dit hoofdstuk worden enkele representatieve resultaten gepresenteerd van de verschillende stadia van mitochondriale transformatie. Figuur 6 toont een bombardementsprocedure. De synthetische rhocellen droegen een bacterieel plasmide met het reporter-gen ARG8m, dat de coderende sequentie van een mitochondriaal gen zal vervangen (Figuur 6A). Na het bombardement werd de plaat gerepliceerd op een medium zonder uracil (-URA); dit is de moederplaat (Figuur 6B). De groeiende kolonies hebben de gistexpressievector met de URA3-auxotrofiemarker. Volgens protocolsectie 6 werd de bombardementsplaat ook gerepliceerd op een YPD-medium dat een gazon van de testerstam bevatte. In dit geval had de testerstam een defect allel van het ARG8m-gen in het mitochondriale genoom (ARG8m-1)1. Na 2 nachten incubatie paren het gazon van de tester en de transformatiecellen en smolten de mitochondriën samen. Deze plaat werd gerepliceerd op een medium zonder arginine. Alleen die diploïden die het mitochondriale plasmide bevatten, konden op dit selectieve medium groeien omdat het ARG8m-gen dat aanwezig was in de synthetische rho-stam het defecte ARG8m-1 uit het mitochondriale genoom van de teststam verving.

Het aantal positieve kolonies varieert over het algemeen van nul tot 20 per plaat. In het huidige voorbeeld werden vier positieve synthetische rho-kolonies verkregen, die werden gezuiverd door ze te strepen op medium zonder uracil. In de eerste zuiveringsronde werden veel negatieve kolonies verkregen, samen met de positieve. Na twee of drie zuiveringsronden is het echter mogelijk om de zuivere positieve synthetische stam te verkrijgen. In figuur 6C toonden we een paar positieve synthetische rho-kolonies na drie rondes van zuivering en testen. De meeste kolonies van de -URA-moederplaat zijn positief voor de testsonde. Interessant is dat niet alle cellen van een positieve kolonie het mitochondriale plasmide bevatten, wat aangeeft dat het getransformeerde plasmide verloren is gegaan in een populatie van de kolonie. Dit resultaat is te verwachten omdat er geen selectieve druk is om het mitochondriale plasmide te behouden, waardoor het onstabiel wordt. Een synthetische rho-stam zoals die getoond in figuur 6C kan echter worden voortgezet naar de volgende stap, cytoductie (protocolsectie 7), en worden gebruikt om voorraad voor te bereiden die moet worden opgeslagen bij -70 °C. Figuur 6D toont ook de derde zuiveringsronde van een synthetische rho-stam. In dit geval werden de transformanten echter praktisch niet in staat om het mitochondriale plasmide in stand te houden, weggegooid.

We hebben een algemene strategie beschreven om positieve synthetische kolonies te selecteren, die is weergegeven in figuur 7A. In dit geval heeft het mitochondriale construct dat aanwezig is in de synthetische rho-cellen enkele honderden nucleotiden om te recombineren met het mitochondriale DNA van de testerstam (bijvoorbeeld het construct COX1ΔC15 in de synthetische rho-stam recombineert met het gemuteerde gen cox1D369N op het mitochondriale DNA van de tester (Figuur 2D); of het cox1Δ::ARG8m-construct in de synthetische rho-stam met het gemuteerde gen ARG8m-1 in het mitochondriaal DNA van de tester (figuur 6A). Als er echter geen teststam beschikbaar is om de positieve synthetische rho-cellen van belang te selecteren, is er een indirecte benadering om ze te selecteren33. In dit geval moet het bacteriële plasmide ook een fragment van een mitochondriaal gen bevatten, zoals COX2 of COX3. De teststam bevat een niet-functionele kopie van het mitochondriale cox2- of cox3-gen. In het gegeven voorbeeld kan de sequentie van het cox3-fragment dat aanwezig is in het bacteriële plasmide de cox3-sequentie die aanwezig is in de mitochondriën van de tester aanvullen en, na recombinatie, een functioneel COX3-gen opleveren. Na het kruisen van de synthetische rho-cellen met de testerstam, kunnen diploïden alleen ademen als de synthetische rho-cellen het bacteriële plasmide in mitochondriën bevatten (Figuur 7B).

Figuur 8 illustreert het cytoductieproces. De donor- en acceptorstammen hebben respectievelijk leucine en adenine-auxotrofie. Daarom werd het mengsel na cytoductie uitgeplateerd op een medium zonder leucine, waardoor de groei van de donorcellen werd voorkomen. Dit is de moederplaat. Op dit punt zullen alleen haploïden met de nucleaire achtergrond van de acceptorstam en sporadische diploïden groeien. Om diploïden uit te sluiten, werd de hoofdplaat gerepliceerd op media zonder adenine, waar alleen diploïden kunnen groeien. In dit voorbeeld is het resulterende mitochondriale DNA na cytoductie gemuteerd en kunnen de beoogde haploïden niet groeien op het ademhalingsmedium van ethanol/glycerol. Daarom moet de hoofdplaat worden gerepliceerd op YPD-platen met een gazon van een teststam. De positie van positieve ademende diploïden geeft aan welke kolonies van de moederplaat moeten worden gezuiverd. Er zijn twee zuiveringsrondes nodig om de uiteindelijke, zuivere stam te verkrijgen. De mitochondriale integratie wordt meestal bevestigd door PCR-amplificatie van het omliggende interessegebied en sequencing.

Ten slotte kunnen genen worden ingebracht in de specifieke locus in het mitochondriale genoom. Reporter-genen kunnen bijvoorbeeld worden ingevoegd aan het 3'-uiteinde van de coderende sequentie van een mitochondriaal gen of het coderende gebied van het mitochondriale gen vervangen, naast andere opties (Figuur 9A). Genen kunnen echter ook worden ingebracht op ectopische plaatsen in niet-coderende regio's van het mitochondriale genoom. De algemeen gebruikte plaats is 295 nt stroomopwaarts van het startcodon van het COX2-gen . De verandering in dit niet-coderende gebied is onschadelijk13. Om het gen met succes tot expressie te brengen in de ectopische plaats, moet het worden geflankeerd door een mitochondriale promotor en terminator. De COX2-flankerende sequenties zijn het meest optimaal, aangezien COX2 het mitochondriën-gen is met de kortste 5' en 3' onvertaalde sequenties (73 nt van de 5' UTR en 119 nt van de 3' UTR) (Figuur 9B). Voor deze constructie heeft het bacteriële plasmide de volgende kenmerken: het sjabloon is een plasmide dat het COX2-coderende gebied bevat, met 1120 nt stroomafwaarts van het stopcodon en 670 nt stroomopwaarts van het AUG-startcodon , genaamd pXPM5025. Het gen van belang is gemanipuleerd om te worden geflankeerd door 73 nt van de COX2 5'-UTR en 119 nt van de COX2 3'-UTR. Daarna werd het, zoals eerder aangegeven, ingevoegd op 295 nt stroomopwaarts van het COX2 AUG-startcodon, wat een niet-coderend gebied is (Figuur 9B). Merk op dat dit plasmide, en bijgevolg, in het resulterende mitochondriale genoom, de COX2 5' en 3' UTR's worden gedupliceerd. Na het bombardement van dit plasmide worden de synthetische rho-cellen voor cytoductie gekoppeld aan een receptorstam die een uitgebreide deletie van het COX2-gebied (cox2-62-allel ) heeft1. Tijdens cytoductie recombineert het mitochondriale plasmide van de synthetische rho-stam met het mitochondriaal DNA van de acceptor. Het resulterende mitochondriale genoom heeft de ectopische constructie en een WT COX2-gen . Daarom zullen de positieve kolonies in staat zijn om te groeien in een ademhalingsmedium (Figuur 9B).

figure-results-1
Figuur 5: Schematische weergave van de apparatuur voor het bombarderen van microprojectielen met hoge snelheid. Ons lab maakt gebruik van het Biolistic-PDS-1000/He Particle Delivery System (Table of Materials). Afkorting: WPs = wolfraamdeeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 6: Voorbeeld van een transformatieplaat voor microprojectielen met hoge snelheid. (A,B) Na het bombardement werden de platen 5-7 nachten bij 30 °C geïncubeerd. Als er een verontreiniging groeit (aangegeven met een blauwe pijl), kan deze met een steriele spatel worden weggesneden. Na het repliceren van de platen op het selectiemarkermedium (-URA in dit geval), werd de hoofdplaat ook getest op de aanwezigheid van het mitochondriale plasmide door te paren met een testerstam. In dit geval heeft de testerstam het niet-functionele allel ARG8m-1 1. Na 2 nachten paren en het repliceren van de plaat op een medium zonder arginine (-ARG), ontstonden er vier positieve kolonies (aangegeven met rode pijlen). (C) De positieve synthetische rho-kolonies werden gezuiverd door ze opnieuw te reaaaken op -URA-medium, en replica-tests werden uitgevoerd zoals eerder beschreven. Deze platen vertegenwoordigen de derde ronde van zuivering. (D) Sommige positieve synthetische rho-kolonies verloren de mitochondriale constructie. Afkortingen: mtDNA = mitochondriaal DNA; -URA = ontbreken van uracil; -ARG = gebrek aan arginine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 7: Diagram dat laat zien hoe positieve synthetische rho-kolonies na bombardement kunnen worden geselecteerd. (A) Het bacteriële plasmide bevat een niet-functionele gemuteerde versie van een mitochondriaal gen. Voor detectie worden de synthetische rho-kolonies gekoppeld aan een teststam die een andere niet-functionele mutatie van hetzelfde gen in mitochondriaal DNA bevat. Na de paring recombineren de gemuteerde mtDNA's en kan een functioneel gen worden hersteld door complementatie. Hier groeit de diploïde op een selectief medium waar noch de synthetische rho-stam, noch de tester kan groeien. (B) In dit geval bevat het plasmide een extra sequentie van een mitochondriaal gen (d.w.z. een stukje COX3). Na transformatie wordt de synthetische rho-stam geselecteerd op basis van zijn vermogen om een COX3-mutatie in de teststam aan te vullen, zodat alleen de diploïden kunnen groeien op een selectief medium (d.w.z. ademhalingsmedium). Deze methode is handig als er geen teststam voor het betreffende gen beschikbaar is. De detectie van positieve synthetische rho-kolonies is in dit geval indirect. Afkorting: mtDNA = mitochondriaal DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 8: Voorbeeld van cytoductie om een construct te integreren in de doellocus in mitochondriaal DNA. Na paring en herstel werden de gemengde cellen en binucleaire zygoten uitgeplateerd op een medium zonder leucine. In dit geval, aangezien de donorstam het leu2,3-112-allel heeft, voorkomt dit medium donorgroei. Deze plaat werd gerepliceerd op hetzelfde medium (masterplaat), in een medium waar alleen diploïden kunnen groeien (-ADE) en in een medium waar de acceptor met de beoogde mutatie kan groeien (rode pijlen). In dit geval kunnen noch de donor, noch de receptorcellen groeien op respiratoire media. Alleen de resulterende diploïde na paring met een gazon van een teststam kan op een ademhalingsmedium groeien. Deze ademende diploïde kolonies zijn een leidraad voor het selecteren en zuiveren van de positieve kolonies van de hoofdplaat. Afkortingen: -LEU = zonder leucine; -ADE = gebrek aan adenine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 9: Diagram dat laat zien hoe het gemuteerde mitochondriale construct (aanwezig in de synthetische rho-stam) moet worden geïntegreerd in de acceptorstam. (A) In dit voorbeeld draagt de acceptorstam het ARG8m reporter-gen dat de codons van het betreffende gen vervangt. Het synthetische rho-DNA bevat een gemuteerde versie van dit gen. Het plasmide- en mitochondriaal DNA recombineren door de flankerende regio's 5' en 3', en de ARG8m-reporter wordt vervangen door de gemuteerde sequentie van het gen van belang. (B) Vreemde genen kunnen ectopisch worden ingebracht in specifieke regio's van het mitochondriale genoom 7,13,36. In dit voorbeeld kan een gen worden geïntroduceerd op een positie 295 nt stroomopwaarts van het COX2-gen. Dit is een niet-coderend gebied van mtDNA. Een vreemd gen van belang wordt geflankeerd door respectievelijk 73 nt en 119 nt van de COX2 5' UTR en 3' UTR. Deze constructie wordt ingebracht in een plasmide dat het COX2-gen bevat plus 670 nt en 1120 nt van de 5' en 3' UTR-regio's. De synthetische rho-stam (donor) draagt deze constructie in mitochondriën. In dit geval heeft de acceptorstam (XPM13)7 een significante deletie van het cox2-gen (allel cox2-62)1. Na cytoductie recombineert mitochondriaal DNA van de donor en de acceptor. Het COX2-gen wordt hersteld en het gen van belang wordt ingebracht op de ectopische plaats (295 nt stroomopwaarts van het COX2-gen). Afkortingen: mtDNA = mitochondriaal DNA; nt = nucleotiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gist stamGenotypeREF
NAB69 zei:Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)1
NB71Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , stuurman 1∆::ARG8m)7
XPM209 NLMatα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
XPM199 zei:Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)26
XPM13 NLMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
L45Matα, ade1, op1 (rho+, stuurman1-D369N)28

Tabel 1: Voorbeelden van giststammen die worden gebruikt bij biolistische transformatie en cytoductie.

Groei mediaOnderdelen
YPD2% Glucose, 2% bactopepton, 1% gistextract
Jonge klant2% Raffinose, 2% bactopepton, 1% gistextract
YPEG*3% Glycerol, 3% ethanol*1, 2% bactopepton, 1% gistextract
Drop-out media2% Glucose, 6,8% Gist stikstofbase met (NH4)2SO4, drop-out aminozuurmix*2
De media van het bombardement5% Glucose, 6,8% giststikstofbase met (NH4)2SO4, 1 M sorbitol, drop-out aminozuurmix*2,3.
*1 Voeg ethanol toe na het autoclaveren wanneer het medium warm is.
*2 De hoeveelheid aminozuurmix kan variëren afhankelijk van de beschikbare voorraden of de hoeveelheid die door de fabrikant wordt aangegeven.
*3 Voeg voor de bombardementsmedia de aminozuren en stikstofbasen toe indien nodig, afhankelijk van de giststam. Zorg ervoor dat de samenstelling specifiek is voor de auxotrofie op het plasmide van 2 μl dat voor de selectie is gebruikt.

Tabel 2: Gistgroeimedia die in dit protocol worden gebruikt.

Discussie

Het huidige werk beschreef hoe mitochondriën van de gist S. cerevisiae met succes kunnen worden getransformeerd. Het proces, van het bombardement met microprojectielen met hoge snelheid tot de zuivering van de beoogde giststam, duurt ~8-12 weken, afhankelijk van het aantal zuiveringsrondes van de synthetische rho-stam dat nodig is. Enkele van de kritieke stappen van de methode zijn als volgt. Ten eerste, hoe groter de flankerende gebieden die rond de mutatieplaats in het mitochondriale genconstruct worden toegevoegd, hoe groter de kans op succesvolle integratie van de doelmutatie. De minimale grootte van de flankerende regio's is ~100 nt; Het gebruik van meer dan 500 NT aan elke kant van de mutatie wordt echter sterk aanbevolen. Ten tweede wordt bij het selecteren van de synthetische rho-kolonies na transformatie aanbevolen dat er niet meer dan 3-4 zuiveringsrondes plaatsvinden; Anders is er een groot risico dat uiteindelijk het mitochondriale construct verloren gaat, omdat er geen selectieve druk is om het plasmide in mitochondriën te houden. Ten derde, om schade aan de gebruiker of de apparatuur te voorkomen, moet u de handleiding van de bombardementsmachine zorgvuldig lezen voordat u met de procedure begint. Deze apparatuur is delicaat en maakt gebruik van hoge druk en vacuüm.

Een beperking van deze procedure is dat tot nu toe alleen gist en de groene alg C. reinhardtii kandidaten zijn om mitochondriën met deze methode te transformeren. Het zou relevant zijn als we plaatsgerichte mutaties op het mitochondriale genoom van andere organismen zouden kunnen introduceren. Een andere beperking is dat het een uitdaging is om veel verschillende constructies in dezelfde sessie te transformeren. Het wordt aanbevolen om voor elke constructie zes transformaties uit te voeren, die elk moeten worden getest, geselecteerd en gezuiverd. Dit resulteert in meer dan 50 platen media om zuivere rho-kolonies van een enkele mitochondriale mutatie te verkrijgen.

Ondanks deze beperkingen heeft het vermogen om het mitochondriale genoom van gist te manipuleren aanzienlijk bijgedragen aan het begrijpen van vele routes van biogenese van ademhalingscomplexen. Deze benadering kan worden gebruikt om reportergenen te introduceren om mitochondriale translatie te monitoren en te kwantificeren 1,7,36,37, mitochondriale genen te onderbreken38, assemblagechaperonnes van respiratoire complexen te identificeren39, de mechanismen van gekoppelde mitochondriale translatie en assemblage beter te begrijpen 7,11,12,36, en zoek naar onderdrukkers bij het volgen van de expressie van een gemuteerd mitochondriaal gen40. Hoewel bepaalde benaderingen om het mitochondriale genoom bij zoogdieren te manipuleren eerder zijn gerapporteerd41, bestaat er tot nu toe geen wijdverbreide methode om mitochondriaal DNA te transformeren voor deze organismen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

Deze publicatie werd ondersteund door Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 to XP-M]. UPD is een CONAHCYT fellow (CVU:883299). We willen Dr. Ariann Mendoza-Martínez bedanken voor de technische hulp bij de lichtmicroscoopbeelden. Biorender-licenties: DU26OMVLUU (Figuur 2); BK26TH9GXH (figuur 3); GD26TH80R5 (figuur 4); PU26THARYD (figuur 7); ML26THAIFG (figuur 9).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL pipette tipsAxygenT-1000-B
1.5 mL MicrotubeAxygenMCT-150-C
10 μL pipette tipsAxygenT-10-C
15 mL conical bottom tube AxygenSCT-25ML-25-S
200 μL pipette tipsAxygenT-200-Y
50 mL conical bottom  tubeAxygenSCT-50ML-25-S
AfiIINew England BioLabsR0520S
AgaroseSeaKem50004
Analytic balanceOHAUSARA520
AutoclaveTOMYES-315
Bacto agarBD214010
Bacto peptoneBD211677
Biolisitic Macrocarrier holder BIO-RAD1652322
Bunsen burnerVWR89038-528
Calcium chlorideFisher ScientificC79-500
CSM -ADEFormediumDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormediumDCS0169
Culture glass flaskKIMAX KIMBLE25615
Culture glass tubePyrex9820
DextroseBD215520
EthanolJT Baker 9000
ForcepsMillipore620006
Glass beadsSigmaZ265926
Glass handleSigmaS4647
GlycerolJT BAKER2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)--
HSTaq  KitPCR BIO
MicrocentrifugueEppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
Orbital shakerNew Brunswick scientificNB-G25
PCR tubesAxygenPCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery SystemBIO-RAD165-2257
Petri dishes (100X10)BD252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
RaffinoseFormediumRAF03
Replica platerSciencewareZ363391
Rupture discs 1350 PsiBIO-RAD1652330
SorbitolSigmaS7547
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseThermo ScientificEL0011
Tissue Culture RotatorThermo Scientific88882015
Tungsten microcarriers M10BIO-RAD1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity--
Velvet padsBel-ArtH37848-0002
Vortex Scientifc IndustriesSI-0236
Wood aplicator stickPROMA1820060
Yeast extractBD212750
Yeast Nitrogen base without aminoacidsBD291920

Referenties

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965(2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359(2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), 4146(2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory manual. 2000 ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. : a. Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. 2015 edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144, Pt 1 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Saccharomyces cerevisiaemitochondri le translatiebiolistisch bombardementmitoriboosoomfunctieoxidatieve fosforyleringbewerking van het mitochondri le genoomgistmitochondri n
Mitochondriale transformatie bij Baker
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.