Methodenartikel

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

3.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66857

⸱

22 november 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Italian Liver Foundation, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde tweestaps collagenase-leverperfusietechniek in een rattenmodel en toont het gebruik van geïsoleerde hepatocyten voor in vitro langdurige kweek van 3D-organoïden.

Samenvatting

Primaire hepatocyten zijn een veelgebruikt hulpmiddel voor in vitro levergerelateerde onderzoeken. Het onderhoud van deze cellen is echter altijd een uitdaging geweest vanwege het snelle verlies van morfologie, levensvatbaarheid en functionaliteit in cultuur. Een recente benadering van langetermijncultuur is het genereren van driedimensionale (3D) organoïden, een in vitro hulpmiddel dat weefsels in een schaal kan recapituleren op basis van het wonderbaarlijke vermogen van de lever om zichzelf te regenereren. Gepubliceerde protocollen zijn ontworpen om op lange termijn functionele 3D-organoïden te verkrijgen uit primaire volwassen hepatocyten (Hep-Orgs). De geavanceerde 3D-organoïde tool vereist het vermogen om cellen te isoleren uit volwassen weefsel, en deze eerste stap is cruciaal voor een hoogwaardig eindresultaat. De tweestaps collagenaseperfusie, geïntroduceerd in de jaren 1970, is nog steeds een geldige procedure om enkelvoudige hepatocyten te verkrijgen. Het huidige artikel heeft tot doel alle cruciale stappen van de chirurgische ingreep te beschrijven en zo de primaire hepatocytenisolatieprocedure in het rattenmodel te optimaliseren. Bovendien wordt bijzondere aandacht besteed aan de PREPARE-richtsnoeren om de kans op succesvolle procedures te vergroten en resultaten van hoge kwaliteit te garanderen. Een gedetailleerd protocol stelt onderzoekers in staat om het stroomafwaartse werk te versnellen en te optimaliseren om 3D-organoïden van primaire volwassen hepatocyten van ratten vast te stellen. Vergeleken met 2D-hepatocyten waren Hep-Orgs op dag 15 nog steeds levensvatbaar en in actieve proliferatie, wat een potentieel op lange termijn aantoont.

Inleiding

Primaire hepatocyten zijn een belangrijk en veelgebruikt hulpmiddel voor in vitro levergerelateerde onderzoeken. Hun uitbreiding en onderhoud zijn echter historisch uitdagend geweest, omdat ze na een paar dagen in de cultuur morfologie en functionaliteit verliezen1. 2D-cultuur is een beperkende voorwaarde, met name voor hepatocyten met een veelhoekige vorm en een gepolariseerde structuur met gedifferentieerde apicale en basolaterale membranen. In feite verstoort de hechting van hepatocyten aan de plaat hun normale activiteit omdat het leidt tot een plat cytoskelet met beperkte interactie tussen cellen en tussen cellen en extracellulaire matrix (ECM), waardoor de polarisatie en de betrokken signaalroutes worden verminderd2.

Om de beperkingen van deze methode te omzeilen, gebruikten Dunn en collega's3 eerst de dubbele collageenlaag. Deze kweekmethode, bekend als "de sandwichcultuurmethode", is gebaseerd op het zaaien van primaire hepatocyten tussen de twee lagen van de matrix. Deze methode heeft veel voordelen, waaronder langdurige kweek, behoud van veelhoekige morfologie en transcriptionele activiteiten die vergelijkbaar zijn met die van vers geïsoleerde hepatocyten4. Een vergelijkbare methode, gebaseerd op hetzelfde principe, waarbij de onderlaag is samengesteld uit Matrigel en de bovenlaag uit collageen, heeft de aanwezigheid van een goed ontwikkeld canaliculaire netwerk aangetoond5.

Ondanks de betrouwbaarheid van de sandwichcultuurmethode voor de groei van hepatocyten, kijkt het huidige werk uit naar het opzetten van een 3D-organoïdecultuur, een in vitro hulpmiddel dat wordt gebruikt voor het recapituleren van weefsels in een schaal en het vormen van een potentiële brug naar gepersonaliseerde geneeskunde, waardoor het genereren van ziektespecifieke biologische inzichten mogelijk wordt, moleculaire doelen worden geïdentificeerd, medicijnen worden getest, biobanken worden opgericht en nieuwe horizonten worden geopend voor innovatieve technologieën zoals organ-on-chip6. Primaire hepatocyten werden ingebed in hemisferische matrixdruppeltjes die bekend staan als "koepels" om een robuuste groei van organoïden in de koepels mogelijk te maken en om de stroom van de oplosbare factoren, waaronder hepatocytgroeifactor (HGF) en epidermale groeifactor (EGF), uit het kweekmedium te garanderen. Deze groeifactoren activeren direct signaalroutes om de overleving van de hepatocyten te garanderen7. Leverorganoïden worden meestal verkregen uit stam-/voorlopercellen geïsoleerd uit embryonale stadia of volwassen ratten, muizen, menselijke (en ook honden en katten) lever8. Zelfs als de 3D-conformatie de differentiatie van stamcellen naar volwassen hepatocyten verbetert, mist dit hulpmiddel nog steeds de rijpheid van het oorspronkelijkeprimaire weefsel. Om dit probleem op te lossen, publiceerden twee verschillende groepen 9,10 in 2018 tegelijkertijd een protocol om een langdurige kweek van 3D-leverorganoïden te verkrijgen, uitgaande van volwassen primaire muizenhepatocyten (Hep-Orgs genoemd). Hun protocollen recapituleren de proliferatieve schaderespons van leverregeneratie, het kweken van hepatocyten met een hoog niveau van inflammatoire cytokines zoals het optreedt na gedeeltelijke hepatectomie. De bovenstaande studies tonen inderdaad aan dat hepatocyten kunnen overschakelen naar een ductale toestand na letsel12 of wanneer de proliferatie van cholangiocyten wordt onderdrukt13. Hun bipotente capaciteit maakt cellulaire plasticiteit mogelijk, wat belangrijk is voor complexe structuren zoals organoïden. Daarom overwinnen deze protocollen het probleem van het onvermogen om primaire hepatocyten in vitro te expanderen.

De geavanceerde 3D-organoïde tool vereist het vermogen om cellen te isoleren uit volwassen weefsel, en deze eerste stap is cruciaal voor een hoogwaardig eindresultaat. Hoewel de 3D-organoïdebereiding kan worden beschouwd als een recente en zich ontwikkelende techniek (omdat de organoïdedefinitie slechts tien jaar geleden werd bedacht door Lancaster14 en Huch15 ), is de tweestaps collagenaseperfusie een oud procedé dat in de jaren 1970 door Seglen werd geïntroduceerd16. Gericht op de meest recente publicaties in het veld, kunnen de protocollen van Ng17 en Shen18 worden beschouwd als de gouden standaard voor het uitvoeren van de procedure bij ratten, terwijl die van Cabral19 en Charni-Natan20 voor muizen. Het is niet ongebruikelijk dat onderzoekers zich concentreren op het kiezen van de beste extracellulaire matrix (ECM) en groeifactoren om 3D-organoïden te ontwikkelen, maar toch op mislukkingen stuiten zoals onjuiste chirurgische ingrepen, lage levensvatbaarheid en opbrengst van hepatocyten, of hoge niveaus van bacteriële besmetting. Deze problemen verlengen de stroomafwaartse experimenten en verhogen het aantal dieren dat nodig is voor de volgende experimenten. Omgekeerd, als de chirurgische en isolatieprocedures goed zijn opgezet, maakt het hoge aantal verkregen levensvatbare hepatocyten het mogelijk om een groot aantal organoïden te bereiden, waardoor het gebruik van dieren wordt beperkt. Het huidige protocol pakt deze problemen voornamelijk aan met behulp van commerciële oplossingen en door het optimaliseren van een nauwkeurige poortadercanulatie die zorgt voor optimale perfusie- en verteringsstappen met de lever in situ.

Om de kwaliteit, reproduceerbaarheid en vertaalbaarheid van ons dieronderzoek te verbeteren, hebben we de PREPARE-richtlijnen zorgvuldig overwogen: Planning Research and Experimental Procedures on Animals: Recommendations for Excellence21. Deze rapportagerichtlijnen proberen de kans op succes te vergroten door middel van planning en vormen een belangrijke stap in de implementatie van de 3 V's van Russel en Burch (vervanging, vermindering en verfijning). De PREPARE-richtlijnen behandelen 15 hoofdonderwerpen die volgens elk afzonderlijk onderzoeksproject moeten worden aangepakt. We beschrijven de onderwerpen waarop we ons hebben gericht tijdens de planning en voorbereiding van het project.

Het huidige werk heeft tot doel om, in een uitputtend, gedetailleerd en consequent protocol, de cruciale stappen van de operatie in het rattenmodel te beschrijven om onderzoekers in staat te stellen het stroomafwaartse werk te versnellen en te optimaliseren. Toen we deze protocollen voor het eerst benaderden, ondervonden we problemen met bacteriële besmetting, lage leververteringsefficiëntie, lage primaire hepatocytenopbrengst en lage levensvatbaarheid van hepatocyten die gemakkelijk het succes van de techniek kunnen beïnvloeden. Dit protocol laat zien hoe kritieke kenmerken kunnen worden aangepakt en opgelost en optimaliseerde de procedure voor de isolatie van primaire hepatocyten bij ratten. De perfusie van de rattenlever en de daaropvolgende isolatie van primaire volwassen hepatocyten zijn de belangrijkste voorbereidende stappen voor verschillende toepassingen. Dit protocol is met name geschikt voor alle procedures die een goede opbrengst van hoogwaardige en zeer levensvatbare volwassen hepatocyten vereisen. De protocolresultaten zijn geschikt om in vitro modellen op te stellen om leverfysiologie en pathologie te bestuderen.

Protocol

Alle procedures en huisvesting van de dieren werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Italiaanse wet en de richtlijn van de Europese Gemeenschap. Het experimentele protocol is goedgekeurd door het lokale Comité voor Dierenverzorging en door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (vergunning nr. 321/2022-PR) volgens art.31 van decreet 26/2014.

1. Voorbereiding op de dierproef

OPMERKING: Raadpleeg Tabel 1 voor de samenstelling van het medium en de buffer en de Tabel met materialen voor commerciële details.

  1. Verwarm het waterbad op 42 °C en plaats vervolgens de Perfusiebuffer en 1x PBS ongeveer 20 minuten in het waterbad.
    OPMERKING: Vanwege enzymgevoeligheid wordt de spijsverteringsbuffer alleen opgewarmd als de perfusieprocedure met succes is gestart. Houd tijdens de perfusieprocedure de oplossingen in het waterbad.
  2. Plaats William's complete medium en PBS + 3% P/S op ijs.
  3. Bereid de peristaltische pomp voor en sluit de slang aan op de glazen fles en de bellenvanger, beide gevuld met perfusiebuffer.
  4. Vul tijdens het vullen van de pomp de slang met warme perfusiebuffer om lucht te verwijderen en de resterende ethanol te wassen (lage pompsnelheid). Deze stap is ook belangrijk om te controleren op de juiste werking van de pomp en mogelijke lekkage van de slang.

2. Voorbereiding op hepatocytenisolatie

  1. Stel tijdens de dierprocedure de volgende instrumenten bloot aan UV-licht: petrischaal 100 mm, celzeef 100 μm, schraper maat M, groot pincet, beker voor ijs, bakje voor ijs.

3. Eerste dierproef en anesthesie

  1. Verdoof de volwassen rat (250-350 g lichaamsgewicht; 10-12 weken oud) door intraperitoneale injectie van een anestheticamix (eindconcentratie voor xylazine: 22,5 mg/kg; voor ketamine: 112,5 mg/kg; ca. eindvolume: 0,8-1,0 ml).
  2. Bewaak de diepte van de anesthesie door in de teen te knijpen totdat de rat niet meer reageert op schadelijke prikkels. Het duurt meestal 5 minuten. De verdovingsdosis zorgt voor een diepe, chirurgische anesthesie die het risico op lijden of angst tijdens de procedure minimaliseert
    OPMERKING: Verbloeding is de secundaire methode van euthanasie bij ratten die in dit experiment wordt gebruikt en zorgt ervoor dat het dier effectief is geëuthanaseerd.
  3. Scheer de buik en reinig deze met 70% ethanol om bacteriële besmetting tijdens de operatie te verminderen.
    OPMERKING: Dit is een niet-overlevingsoperatie, dus volledige asepsis wordt niet gehandhaafd.
  4. Plaats de rat in het midden van de dissectiebak en zet de ledematen vast met naalden.
  5. Maak een U-vormige incisie door de huid en spier van het midden van de onderbuik naar de ribbenkast, klem de huid vast en vouw deze omhoog naar het hoofd, waardoor de darmen bloot komen te liggen.
  6. Verplaats de darm voorzichtig naar de linkerkant van het dier, uit de buikholte, en leg de leverslagader en vena cava bloot.
  7. Laat met een tang een katoenen draad onder de poortader lopen en bereid 2 knopen voor, 1 cm van elkaar, die de ader zelf omringen.
    OPMERKING: Een zwarte draad is gemakkelijker te visualiseren.
  8. Injecteer 100-150 IE heparine opgelost in 1x PBS (totaal volume 300 μL) in de vena cava om bloedstolling te voorkomen.

4. Canulatie en leverperfusie

  1. Schakel de pomp in met een laag toerental (minder dan 1 ml/min debiet).
  2. Steek de 18 G angiocath in de poortader ter hoogte van de draad in een vlakke hoek ten opzichte van de ader.
  3. Verwijder handmatig de binnennaald om de canule in de ader te laten. Er zal bloed in stromen, de plug vullen en ingesloten luchtbellen vermijden in de volgende stap.
  4. Terwijl de perfusiebuffer in de slang stroomt, sluit u de canule aan door op de C-knop te drukken op het uitlaatuiteinde met behulp van een Luer-lock-connector.
  5. Maak nu de knopen, één rond de katheter in de ader en één rond de katheter, voordat u de ader binnengaat om de buis in de juiste positie te stabiliseren.
  6. Snijd de vena cava door om het bloed te laten ontsnappen. Zorg ervoor dat de lever snel (seconden) in 2-3 s begint te zwellen en bleken. Dit bevestigt dat de perfusiebuffer correct door de lever stroomt.
    OPMERKING: Als sommige lobben rood blijven, wordt de angiokatheter te diep geplaatst. Als er alleen rode vlekken zijn, kan licht tikken op de lever de perfusie in de specifieke punten helpen. Giet wat 1x PBS over de open buik om het bloed te helpen verplaatsen en controleer op lekken.
  7. Verhoog het pompdebiet langzaam tot 10 ml/min en houd dit gedurende ten minste 10 minuten vast om de reiniging van de lever van bloed mogelijk te maken.
  8. Oefen tijdens de perfusie druk uit op de vena cava met een wattenstaafje met tussenpozen van 10 s: Zorg ervoor dat de lever opzwelt bij het klemmen en ontspant bij het loslaten. Herhaal de druk periodiek (5-10 keer) en controleer op zwelling en ontspanning van de lever.
    OPMERKING: Deze stap dient als een cruciaal controlepunt voor het zichtbaar valideren van perfusie. Het is essentieel geweest om een hoge vitaliteit van de hepatocyten te garanderen en de uiteindelijke opbrengst te maximaliseren. Door dit proces actief te verifiëren, kan de buffer effectief alle delen van het levervaatstelsel bereiken, wat passieve bloedzuivering alleen niet zou bereiken.

5. De spijsvertering van de lever

  1. Schakel na de perfusie over op de voorverwarmde spijsverteringsbuffer zonder de stroom te onderbreken en luchtbellen in de slang te vermijden.
    OPMERKING: Het tijdelijk verminderen van de stroom kan helpen bij het uitvoeren van deze passage. De verteringsbuffer bevat fenolrood, wat de visualisatie van het overschakelen van de perfusiebuffer naar de spijsverteringsbuffer vergemakkelijkt.
  2. Verhoog de pompsnelheid tot 20 ml/min en druk regelmatig met het wattenstaafje voor zwelling en ontspanning van de lever.
  3. Zorg er na deze stap (die ongeveer 15 minuten duurt) voor dat de lever steeds papperiger wordt. Op dit punt kan de naald worden verwijderd en stopt de pomp.
  4. Omdat het leverkapsel na de spijsvertering kwetsbaar is, ontleedt u de lever voorzichtig en voorzichtig: pak met een tang het centrale bindweefsel tussen de lobben vast. Verbreek alle verbindingen met andere organen en til de lever op.
  5. Was de lever en dompel deze enkele seconden onder in de voorgekoelde PBS + 3% P/S-oplossing. Plaats het vervolgens in de voorgekoelde William's complete medium-bevattende buis.
    OPMERKING: Verbloeding en dood zorgen voor perfusie via de vena cava. De bevestiging van de dood van het dier komt van de pneumothorax die wordt geïnduceerd op het moment dat de lever wordt geëplanteerd en het middenrif volledig wordt ontleed, en bij inspectie zijn ademhaling en hartslag niet langer functioneel.

6. Zuivering van hepatocyten

  1. Breng onder de biologische kap de lever over in de petrischaal 100 mm met de 15 ml koud William's complete medium over een bak vol ijs.
  2. Druk krachtig op het orgaan met de schraper om de cellen in het medium los te maken.
    OPMERKING: Als de verteringsfase correct wordt uitgevoerd, zou de celafgifte gemakkelijk moeten zijn en niet veel druk op de lever moeten vereisen. Snijd de lever niet in stukjes; Laat het intact. Door de lever ondergedompeld te houden in het medium, wordt de celafgifte verbeterd.
  3. Verzamel de mediumhoudende cellen en filtreer ze met het 100 μm-filter terwijl u ze overbrengt naar een steriele conische buis. De filtratie maakt het mogelijk om bindweefsel en onverteerde weefselfragmenten te verwijderen.
  4. Giet ongeveer 15 ml koud William's complete medium over de gebroken lever in de petrischaal om meer cellen vrij te maken. Herhaal stap 6.2 en 6.3.
  5. Herhaal punt 6.4 minstens één keer, totdat alle cellen zijn losgekomen. Verdeel het medium indien nodig in meer conische buizen en gebruik meerdere filters van 100 μm.
    OPMERKING: Nadat de hepatocyten zijn vrijgegeven en vóór het filteren, moet het medium er ondoorzichtig uitzien vanwege de aanwezigheid van de hepatocyten. De resterende lever moet er vezelig uitzien en zal worden weggegooid.
  6. Centrifugeer het gefilterde medium met levercellen bij 50 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C met een rem bij lage snelheid.
    OPMERKING: Hepatocyten zijn dichter dan andere levercellen. Door de lage centrifugatiekracht zullen alleen hepatocyten in de pellet zitten, terwijl andere cellen in de supernatant blijven.
  7. Gooi het supernatans weg zonder de celkorrel te verstoren. Voeg voorzichtig ongeveer 40 ml ijskoude William's complete medium toe aan de tube en pipetteer langzaam 2 tot 3 keer op en neer om de celpellet te resuspenderen.
    OPMERKING: De celpellet moet voorzichtig opnieuw worden suspendeerd om beschadiging van de cellen te voorkomen.
  8. Centrifugeer op 50 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Tel voor de eerste pogingen de levensvatbare cellen met een trypan-blauwe test van 1:10 na de tweede centrifugatie voordat u doorgaat naar de volgende stappen. Dit kan verspilling van media en tijd voorkomen als alle cellen dood zijn.
  9. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 25 ml ijskoud William's complete medium.
  10. Voeg 25 ml 90% dichtheidsgradiëntoplossing toe aan de tube en meng voorzichtig.
    OPMERKING: Een oplossing met dichtheidsgradiënt scheidt levensvatbare hepatocyten van dode hepatocyten en celresten op basis van hun dichtheid.
  11. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Op de bodem van de buis moet een zichtbare korrel worden verkregen, die overeenkomt met de levensvatbare hepatocyten, en een doorzichtige laag aan de bovenkant van de gradiënt die bestaat uit dode hepatocyten.
    OPMERKING: Als er helemaal geen pellet is, probeer dan de oplossing opnieuw te mengen door te draaien en herhaal het centrifugeren.
  12. Zuig de dode cellaag op vanaf de bovenkant van de gradiënt en laat 1-2 ml van het medium bij de pellet.
  13. Resuspendeer de pellet in 30-40 ml van William's complete medium.
    OPMERKING: Gebruik voor de gehele procedure alleen serologische pipetten van 25 ml. Pipetten met een kleinere boring kunnen de levensvatbaarheid van de hepatocyten verminderen. Alle stappen moeten op ijs worden uitgevoerd om +4°C te behouden.
  14. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4°C en zuig vervolgens het supernatant op.

7. Hepatocytencultuur en RNA-verzameling

  1. Voeg een geschikte hoeveelheid medium toe voor het tellen van cellen. Tel de levensvatbaarheid van de cellen met 1:10 Trypan blauw.
  2. 2D hepatocyten kweken
    1. Plaatcellen met een concentratie van 500.000 cellen/putje van een schotel met 6 putjes op een met collageen beklede celplaat met voorverwarmd William's complete medium.
    2. Plaats de celcultuur in een bevochtigde incubator met 95% lucht, 5% CO2 bij 37 °C.
    3. Vervang na 4 uur het medium door het nieuwe voorverwarmde William's complete medium.
    4. Bewaar cellen in de couveuse. Verander het medium dagelijks.
    5. Verzamel primaire hepatocyten in een reagens voor RNA-extractie vóór het plateren (dag 0) en op dag 1 tot 3 van de kweek.
    6. Extraheer RNA volgens het protocol van de fabrikant en transcribeer het omgekeerd naar cDNA voor evaluatie van levermerkergenen door RT-qPCR. De inleidingslijst is weergegeven in tabel 2.
  3. Voor 3D-hepatocytencultuur op lange termijn:
    1. Resuspendeer de cellen in de koude zuivere matrix met een concentratie van 1.000-10.000 cellen in 20 μL.
      OPMERKING: Probeer het maken van matrixbubbels te vermijden.
    2. Met behulp van voorgekoelde pipetpunten worden matrix-bevattende celdruppeltjes in de voorverwarmde celcultuurplaat geplaatst.
    3. Draai de plaat ondersteboven en laat hem 20-30 minuten in de celcultuurincubator staan.
    4. Draai het hoger en voeg het voorverwarmde 3D-hepatocytenmedium op lange termijn en het specifieke kweekmedium toe volgens het werk van Peng22. Bewaar cellen in de couveuse.
    5. Vervang het 3D-hepatocytenmedium op lange termijn elke 2-3 dagen.
    6. Ten minste na 14 dagen cultuur worden de Hep-Orgs gescheiden van de matrix en worden levensvatbare Hep-Orgs geëvalueerd door Trypan blue en EdU proliferatietest en gepasseerd volgens het werk van Peng.

Resultaten

Aan het einde van de opstellingsprocedures (stap 6.13) verkregen we een celopbrengst van maximaal 1 x 108 cellen per isolatie uit de lever van ongeveer 300 g van een rat. De levensvatbaarheid van de cellen tussen 78% en 97% werd vastgesteld door Trypan-blauwtelling.

Zoals al beschreven in eerdere studies 1,18,19, verliezen primaire hepatocyten in cultuur hun morfologie, leverspecifieke functies en sterven ze binnen enkele dagen af.

Het is bekend in de literatuur23,24 dat primaire volwassen hepatocyten snel de kubusvormige-zeshoekige morfologie verliezen, binnen een paar dagen in een "fibroblastachtige" vorm veranderen en afsterven. Figuur 1 geeft de verschillende fasen weer: 4 uur na het uitplaten op een met collageen beklede plaat hechten de hepatocyten zich aan het oppervlak, verspreid in een typische monolaag die een kubusvormige morfologie vertoont, de randen van de cellen zijn gedefinieerd, de verbindingen tussen de cellen zijn lineair en het oppervlak van de cellen ziet er glad uit (Figuur 1A). Op dag 1 krijgen de primaire hepatocyten hun typische zeshoekige vorm en worden lipidedruppeltjes zichtbaar (Figuur 1B). Op dag 2-3 nemen de lipidedruppeltjes toe (Figuur 1C-1D), terwijl op dag 4-5 de cellen actine-stressvezels accumuleren (Figuur 1E-F). We evalueerden ook het percentage levensvatbare cellen in primaire 2D-cultuur van dag 1 tot dag 5 en vergeleken dit met de levensvatbaarheid vóór het plateren op dag 0 (Figuur 2). Het is mogelijk om al in de eerste dagen van de kweek een drastische vermindering van de levensvatbaarheid waar te nemen, tot 49,5% (SD 12,7) op dag 1, die daalt tot 45,2% (SD 18,2) op dag 2 en 33,5% (SD 0,77) op dag 3. Het percentage levensvatbare cellen op dag 4 is al 16,9% (SD 5,4), terwijl het op dag 5 9,1% bereikt (SD 0,38). Daarom is het duidelijk dat het verlies van morfologie gepaard gaat met een snelle progressieve celdood van volwassen hepatocyten in 2D-cultuur.

Geïsoleerde hepatocyten vertoonden vóór het plateren (dag 0) een hoge mRNA-expressie van levermerkergenen (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2) geëvalueerd door RT-qPCR (Figuur 3). Alle geanalyseerde genen vertonen al op dag 1 in cultuur een cultuurtijdafhankelijke afname van de expressie. De mRNA-expressieniveaus benadrukken het functionele en levensvatbaarheidsverlies van primaire hepatocyten gedurende de tijd.

Geïsoleerde hepatocyten werden bekleed met 3D-matrixdruppeltjes en 3D-organoïde celstructuren volgden in de loop van de tijd. Op dag 1 van de kweek worden enkelvoudige hepatocyten gesuspendeerd in de matrixdruppeltjes (Figuur 4A). De celconcentratie wordt opzettelijk laag gehouden om hepatocyten voldoende ruimte te geven om te groeien. Dit stelt ons ook in staat om de groei van de organoïde visueel te volgen. Primaire hepatocyten vertoonden celdeling in de eerste paar dagen van de kweek (figuur 4C). Bovendien, terwijl op dag 0 Hep-Orgs 30 μm werden gemeten, verdubbelden Hep-Orgs op dag 2 bijna hun afmetingen, wat de groei van de grootte onderstreepte die tot dag 15 werd gehandhaafd (33,08 μm op dag 1; 64,86 μm op dag 2; 45,06 μm op dag 5; 55,19 μm op dag 7; 51,93 μm op dag 10; 62,90 μm op Fay 15). Wat de vorm van Hep-Orgs betreft, terwijl ze op dag 1 rond van vorm waren, bereikten ze de volgende dagen de "trosvorm van druiven" (typisch voor leverorganoïden).

Hepatocyten die in een 3D-matrix zijn geplateerd, blijven wekenlang in cultuur en vertonen een levensvatbaarheid van 23% ±10% na 15 dagen met behulp van de trypan-blauwtest (figuur 4B, eerste rij). Om de proliferatie van Hep-Orgs bij ratten te valideren, werd op dag 15 een EdU-test uitgevoerd (Figuur 4D). Desalniettemin vertoonde de Hoechst-kleuring een hoog aantal afzonderlijke cellen in plaats van Hep-Orgs, er was een proliferatieve activiteit van hepatocyten (groene cellen) aanwezig, zelfs als de EdU-opname laag was (9% ± 7%) (Figuur 4B, tweede rij).

figure-results-1
Figuur 1: Primaire hepatocyten 2D-cultuur op met collageen beklede platen in de loop van de tijd. De foto's zijn gemaakt met een vergroting van 20x met (A) fasecontrastmicroscopie 4 uur na het plateren, (B) dag 1, (C) dag 2, (D) dag 3, (E) dag 4, (F) dag 5. In elke afbeelding wordt een schaalbalk weergegeven die overeenkomt met 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Levensvatbare primaire cellen in 2D-cultuur op met collageen beklede platen. De grafiek toont het percentage levensvatbare cellen van dag 1 tot dag 5, vergeleken met levensvatbare cellen op dag 0, beschouwd als 100%. Resultaten worden gerapporteerd als enkelvoudige replicaten, gemiddelde en SD van 3 verschillende experimenten (* p-waarde ≤ 0,05; ** p-waarde ≤ 0,005). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: mRNA-expressie van levermarkers gemeten met RT-qPCR in primaire hepatocyten. De resultaten werden genormaliseerd op β-actine en/of GAPDH (huishoudgenen) en worden uitgedrukt als relatief ten opzichte van primaire hepatocyten verzameld vóór het plateren op dag 0, beschouwd als 1. De resultaten worden gerapporteerd als gemiddelde ± SD van ten minste 3 verschillende experimenten (**+ p-waarde ≤ 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: 3D-hepatocytencultuur in matrixdruppeltjes in de loop van de tijd. (A) Geïsoleerde hepatocyten geplateerd in matrixdruppels voor Hep-Orgs op lange termijn: op de foto zijn de matrixdruppels zichtbaar op het oppervlak van het putje (rode cirkel = één druppel). (B) Percentage levensvatbare cellen door trypanblauwe en proliferatieve cellen door EdU op dag 15 vóór passage. De kwantificering van EdU-positieve cellen werd uitgevoerd door ImageJ2-software. De resultaten worden gerapporteerd in percentages als gemiddelde±SD van ten minste 3 verschillende experimenten. (C) Fasecontrastbeelden van 3D-cultuur van Hep-Orgs van ratten op verschillende groeidagen in 3D-cultuur: dag 1, 2, 5, 7, 10, 15. Vergroting van het beeld 20X. In elke afbeelding wordt een schaalbalk weergegeven die overeenkomt met 50 μm. (D) EdU-incorporatietest van Hep-Orgs van ratten op dag 15. Vergroting van het beeld 20X. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Buffers en mediasamenstelling. De tabel rapporteert de naam en de componenten (met hun uiteindelijke concentratie) van alle buffers en de celmedia die in het protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Lijst van rattenprimers. De tabel geeft de lijst weer van primers die zijn gebruikt voor RT-qPCR-experimenten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

3D-organoïden zijn een grens voor gepersonaliseerde geneeskunde en maken een langdurige hepatocytencultuur mogelijk. De kwaliteit van deze innovatieve techniek vereist een goede opbrengst van levensvatbare primaire hepatocyten en goed uitgevoerde leverperfusie en hepatocytenisolatie. Deze oude procedure wordt nog steeds veel gebruikt; Het bestaat echter uit verschillende stappen die een uitdaging kunnen zijn. Bij het naderen van de procedure ondervonden we kritieke problemen zoals bacteriële besmetting, lage efficiëntie van de leververtering, lage primaire hepatocytenopbrengst en lage levensvatbaarheid van hepatocyten, die allemaal gemakkelijk het succes van de techniek kunnen beïnvloeden. Uitgaande van de gouden standaardprotocollen17,18, belichten we hier hoe veelvoorkomende problemen kunnen worden overwonnen, verduidelijken we de meest kritieke stappen in de isolatie van primaire hepatocyten van ratten en vatten we de verspreide tips samen die gemakkelijk het succes van de techniek in het rattenmodel kunnen beïnvloeden. Hoewel de procedure van leverperfusie vrij uitdagend is en nauwkeurige expertise van de operator vereist, garandeert het hoogwaardige resultaten in termen van opbrengst, integriteit, levensvatbaarheid en functionaliteit van primaire hepatocyten. Deze functies zijn essentieel voor de volgende fasen.

Tijdens de planning van het project hebben we zorgvuldig rekening gehouden met de PREPARE-richtlijnen checklist21. Speciale aandacht werd besteed aan de literatuur uit het verleden, het vergelijken van verschillende eerdere werken en het in contact komen met enkele van de auteurs (PREPARE guidelines checklist _topic A1). De organoïde tool zelf is een belangrijke manier om het aantal dieren te verminderen, aangezien de cellen tot 7 maanden in cultuur kunnen worden vermeerderd (PREPARE guidelines checklist _topic A3). Door de dialoog met het personeel van de dierenfaciliteit hebben we een ervaren technicus geselecteerd die hulp bood bij de procedure en bijdroeg aan het vermijden van het gebruik van overtollige proefdieren (PREPARE guidelines checklist _topic B5). Er werd een geschikte peristaltische pomp verkregen die nodig is om leverperfusie uit te voeren (checklist voor PREPARE-richtlijnen _topic B6).

De publicaties van Ng17 en Shen18 zijn de meest recente die de procedure bij ratten beschrijven. De belangrijkste vragen die in dit protocol aan de orde komen en die in de vorige niet aan bod komen, hebben betrekking op het gebruik van commerciële oplossingen en de optimalisatie van een nauwkeurige poortadercanulatie die zorgt voor optimale perfusie- en verteringsstappen die de lever in situ houden. Terwijl de protocollen van Shen18 en Ng17 zelfgemaakte oplossingen gebruikten, is ons protocol gebaseerd op commerciële perfusie- en vergistingsoplossingen om de variabiliteit in de bufferbereiding te verminderen. Een teveel aan digest-enzymconcentratie kan agressief zijn ten opzichte van hepatocyten en de kwaliteit en levensvatbaarheid van cellen beïnvloeden25. Het gebruik van commerciële oplossingen is van cruciaal belang om de reproduceerbaarheid van het protocol te verbeteren en standaardisatie te garanderen. Bovendien kan het protocol dat door Ng17 wordt uitgevoerd, een uitdaging zijn vanwege de noodzaak om de lever vóór de verteringsfase te verwijderen. Ons protocol is gebaseerd op perfusie en vertering van de lever zonder deze te verwijderen totdat beide fasen zijn uitgevoerd, dit vereenvoudigt de procedure. In termen van celopbrengst en cellevensvatbaarheid zijn de resultaten van ons protocol vergelijkbaar met eerdere werken.

Het reinigen en desinfecteren van perfusieslangen, voor en na de ingreep, samen met huiddesinfectie voor aanvang van de operatie, zijn erg belangrijk om bacteriële besmetting te beperken. Bovendien is het volledig drogen van de slang na ethanolreiniging en daaropvolgende wasbeurt met het medium van cruciaal belang om de levensvatbaarheid van de cellen te vergroten. In feite zou zelfs een enkele injectie met ethanol die in de lever wordt geïnjecteerd, tijdens de procedure celdood veroorzaken.

De temperatuur van de geïnjecteerde oplossing is belangrijk, maar ook de gevoeligheid van het collagenase-enzym voor temperatuur moet in overweging worden genomen. Om deze reden hebben we de perfusiebuffer voorverwarmd tot 42 °C voordat we met de chirurgische ingreep begonnen, terwijl we de spijsverteringsbuffer alleen tijdens de perfusiestap in het verwarmingsbad doen. Door een bellenvanger toe te voegen aan de slang stroomopwaarts van de katheter wordt voorkomen dat ontsnapte bellen de katheter bereiken en dat er lucht in de lever terechtkomt wanneer de perfusieoplossing opis 17.

De samenstelling van de buffer, de perfusiedruk en het debiet moeten binnen het juiste bereik17 liggen. We hebben ervaren dat lage druk en een laag debiet een lage opbrengst veroorzaken en de levensvatbaarheid van de cellen negatief beïnvloeden, omdat de buffer de kleine vaten niet kon bereiken. Aan de andere kant mag het debiet niet te hoog zijn om de capsule van de Glisson intact te houden. Aangezien de integriteit van de celadhesie Ca2+ 18 vereist, is de perfusiebuffer een Ca2+-vrije oplossing die EDTA bevat om de calciumhoudende bruggen tussen de cellen aan te vallen, dus het is essentieel voor het verwijderen van calcium en het wegspoelen van bloed uit de lever. De perfusietijd van 8-15 minuten met een stroomsnelheid van 10 ml/min is cruciaal om alle cellen te bereiken door de EDTA, Ca2+-vrije oplossing. Een suboptimale perfusie kan leiden tot een verminderde spijsvertering.

De verteringsbuffer bevat Ca2+, aangezien het collagenase dat de collageenmatrix verteert Ca2+ afhankelijk is. Het debiet van de vergistingsbuffer moet minimaal op 20 ml/min worden gehouden en de tijd is afhankelijk van de collagenasecapaciteit. In het geval van de specifieke spijsverteringsbuffer die we gebruiken, moeten we 15 minuten perfuseren voor een uiteindelijk volume van 300 ml oplossing. Als de spijsvertering onvolledig is, blijven de cel-celverbindingen behouden en zal opeenvolgende mechanische druk de cellen beschadigen, waardoor de levensvatbaarheid afneemt. Het langzaam verhogen van de stroomsnelheid draagt bij aan de vermindering van de stressvolle impact van de perfusie op de cellen. Tijdens de operatie concentreerden we ons op de voorbijgaande inferieure vena cava-klemming en de daaropvolgende zwelling van de lever: deze passage verbeterde zowel de spijsverteringsefficiëntie als het celherstel aanzienlijk. Aan het einde van de spijsvertering moet de lever er lichtbruin en zacht uitzien. Naarmate de leverresectie is voltooid, vermindert het wassen van de geïsoleerde lever in PBS +3% P/S de bacterietitel en helpt het besmetting in het volgende deel van de procedure te voorkomen.

Voor de stappen voor de isolatie van de hepatocyten onder de biologische kap vermijdt het gebruik van serologische pipetten van 25 ml de vermindering van de levensvatbaarheid van de hepatocyten door pipetten met een kleinere boring. We hebben een optionele stap toegevoegd om de primaire hepatocytenopbrengst te verhogen, namelijk het gieten van William's volledige medium over de verbrijzelde lever om de schraapstap onder de kap te herhalen. Deze stap wordt uitgevoerd na het filteren van het door cellen vrijgegeven medium uit de geïsoleerde lever, en het helpt de Petri schoon te maken en meer cellen uit het leverkapsel te herstellen. Als het nodig is om hoge druk uit te oefenen om de hepatocyten door de filters te bewegen, zal de levensvatbaarheid van de cel laag zijn19.

Het onvermogen van hepatocyten om langer dan 2 dagen als 2D te worden gekweekt, bracht ons ertoe een alternatief kweekmodel voor de lange termijn te vinden. Een geschikt model om hepatocyten voor een langere tijd te kweken is volwassen Hep-Org. Vergeleken met 2D-hepatocyten bleken Hep-Orgs op dag 15 nog steeds levensvatbaar en in actieve proliferatie te zijn, wat een potentieel op lange termijn aantoont.

De perfusie van de rattenlever en de daaropvolgende isolatie van primaire volwassen hepatocyten zijn de belangrijkste voorbereidende stappen voor verschillende toepassingen. Hoewel reproduceerbaarheid een beperking van de techniek kan zijn, aangezien de procedure veel stappen en variabelen omvat, helpt aandacht voor de visuele beschrijving van de procedure om de methode met een hoog slagingspercentage te repliceren. Door de kritieke stadia aan te wijzen en te laten zien hoe deze moeten worden aangepakt, optimaliseert dit protocol de procedure voor de isolatie van primaire hepatocyten van ratten en de resultaten die geschikt zijn om in vitro-modellen op te stellen, zoals de Hep-Orgs-generatie, om de leverfysiologie en pathologie te bestuderen.

Openbaarmakingen

Alle auteurs hebben alle belangenconflicten openbaar gemaakt.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Davide Selvestrel en prof. Giovanni Sorrentino van het SorrentinoLab aan de Universiteit van Triëst voor hun hulp bij het uitvoeren van de EdU-proliferatietest. Het werk werd ondersteund door een ad-hocsubsidie van de Banca d'Italia en intramurale FIF-subsidies.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A83-01- ALK5 Inhibitor IVTwin Helix T3031
B27Thermofisher Scientific0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System  Bio-Rad
CHIR99021Twin HelixT2310
Click EdU Alexa 488 imaging kitThermofisher ScientificC10499
Collagen, Type I, solution from rat tailMerckC3867-1VL
Dexamethasone MerckD4902
EGFMerck E9644
Fetaal bovien serum (FBS)EurocloneECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BMEThermofisher ScientificA1413202
Heparine natrium 25000 IE/5 mlB. Braun Melsungen AGB01AB01
HGFPeprotech 100-39H 
Insulin-Transferrine-Selenium oplossing 100x Thermofisher Scientific41400045
L-Glutamine oplossingEurocloneECB3000D
Lever Digest Medium Thermofisher Scientific 17703-034
Lever Perfusie MediumThermofisher Scientific17701038
N2 supplementThermofisher Scientific17502048
N-acetylcysteïneMerckA9165
NicotinamideMerck N-0636
Niet-Essentiële AminozurenMerckM7145
NormocinAurogeneant-nr-1
PBS buffer 1XPanReac AppliChemA0964,9050
Penicilline-streptomycine oplossing 100xEurocloneECB3001D
PercollSanta Cruzsc-296039A
PeristaltiekpompIsmatec™ MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFaPeprotech 300-01A
TRI ReagentMerckT9424
Tubing Ismatec™  ID.2,79mm
Williams' E Medium, geen glutamineThermofisher Scientific31415029
Y27632Twin HelixT1725
```

Referenties

  1. Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
  2. Ietto, G., et al. Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components. Cells. 12 (10), 1429(2023).
  3. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  4. Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. Primary Hepatocytes in sandwich culture. Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).
  5. Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).
  6. Thompson, W. L., Takebe, T. Human liver model systems in a dish. Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).
  7. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).
  8. Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals. Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).
  9. Raju, R., et al. In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development. Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).
  10. Peng, W. C., et al. Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture. Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).
  11. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).
  12. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures. Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).
  13. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science (New York, N.Y.). 345 (6194), 1247125(2014).
  15. Huch, M., Koo, B. -K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).
  16. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  17. Ng, I. C., et al. Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control. J Vis Exp. (170), e62289(2021).
  18. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
  19. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. J Vis Exp. (132), e56993(2018).
  20. Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).
  21. Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
  22. Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).
  23. Shulman, M., Nahmias, Y. Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).
  24. Knobeloch, D., et al. Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).
  25. Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D organo denscultuurcollagenase perfusiehepatische organo denPercoll dichtheidsgradi ntcelviabiliteithepatocytencultuurleverregeneratietrypaanblauwkleuring
Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.