Het isoleren van immuuncellen uit de hersenen en de schedel van muizen

Samenvatting

Om de immuunrespons op hersenaandoeningen te onderzoeken, is een veelgebruikte benadering het analyseren van veranderingen in immuuncellen. Hier worden twee eenvoudige en effectieve protocollen gegeven voor het isoleren van immuuncellen uit muizen hersenweefsel en schedelbeenmerg.

Samenvatting

Er zijn steeds meer aanwijzingen dat de immuunrespons die wordt veroorzaakt door hersenaandoeningen (bijv. Hersenischemie en auto-immuunencefalomyelitis) niet alleen in de hersenen voorkomt, maar ook in de schedel. Een belangrijke stap in de richting van het analyseren van veranderingen in immuuncelpopulaties in zowel de hersenen als het beenmerg van de schedel na hersenbeschadiging (bijv. beroerte) is het verkrijgen van voldoende aantallen hoogwaardige immuuncellen voor stroomafwaartse analyses. Hier worden twee geoptimaliseerde protocollen geboden voor het isoleren van immuuncellen uit de hersenen en het beenmerg van de schedel. De voordelen van beide protocollen worden weerspiegeld in hun eenvoud, snelheid en werkzaamheid bij het opleveren van een grote hoeveelheid levensvatbare immuuncellen. Deze cellen kunnen geschikt zijn voor een reeks stroomafwaartse toepassingen, zoals celsortering, flowcytometrie en transcriptomische analyse. Om de effectiviteit van de protocollen aan te tonen, werden immunofenotyperingsexperimenten uitgevoerd op beroerte-hersenen en normaal hersenschedelbeenmerg met behulp van flowcytometrie-analyse, en de resultaten kwamen overeen met bevindingen uit gepubliceerde studies.

Inleiding

De hersenen, de centrale spil van het zenuwstelsel, worden beschermd door de schedel. Onder de schedel bevinden zich drie lagen bindweefsel die bekend staan als de hersenvliezen - de dura mater, arachnoïdale mater en pia mater. Cerebrospinale vloeistof (CSF) circuleert in de subarachnoïdale ruimte tussen de arachnoïde mater en pia mater, waardoor de hersenen worden gedempt en ook afvalstoffen worden verwijderd via het glymfatisch systeem ^1,2. Samen zorgt deze unieke architectuur voor een veilige en ondersteunende omgeving die de stabiliteit van de hersenen behoudt en deze beschermt tegen mogelijk letsel.

De hersenen worden al lang beschouwd als immuunbevoorrecht. Dit idee is echter gedeeltelijk verlaten omdat er steeds meer bewijs is dat aangeeft dat, naast residente microglia in het parenchym, de grenzen van de hersenen, inclusief de plexus choroideus en de hersenvliezen, een breed scala aan immuuncellen herbergen^. Deze cellen spelen een cruciale rol bij het handhaven van de homeostase, het bewaken van de gezondheid van de hersenen en het initiëren van de immuunrespons op hersenletsel. Recente bevindingen geven met name aan dat de schedel betrokken is bij de immuniteit van hersenvliezen en kan bijdragen aan de immuunrespons in de hersenen na letsel. In 2018 deden Herisson et al. een baanbrekende ontdekking van directe vasculaire kanalen die het beenmerg van de schedel met de hersenvliezen verbinden, waardoor een anatomische route voor leukocytenmigratie wordt vastgesteld ^4,5. Later toonden Cugurra et al. aan dat veel myeloïde cellen (bijv. monocyten en neutrofielen) en B-cellen in de hersenvliezen niet afkomstig zijn uit het bloed⁶. Met behulp van technieken zoals calvaria-botflaptransplantatie en selectieve bestralingsregimes, leverden de auteurs overtuigend bewijs dat het beenmerg van de schedel dient als een lokale bron voor myeloïde cellen in de hersenvliezen en als als CZS-parenchym^na CZS-letsel. Verder stelde een andere studie voor dat meningeale B-cellen constant worden gevoed door het beenmerg^van de schedel 7. Meer recentelijk is een nieuwe structuur, de arachnoïdale manchetuitgang (ACE) genoemd, geïdentificeerd als een directe toegangspoort tussen de dura mater en de hersenen voor het verkeer van immuuncellen^.

Deze opwindende bevindingen hebben belangrijke implicaties voor de oorsprong van infiltrerende immuuncellen in de gewonde hersenen (bijvoorbeeld na ischemische beroerte). Een grote hoeveelheid bewijs heeft aangetoond dat na een beroerte veel immuuncellen de hersenen infiltreren, wat bijdraagt aan zowel acute hersenbeschadiging als chronisch hersenherstel. Het conventionele idee is dat deze cellen circulerende leukocyten in het bloed zijn die de hersenen infiltreren, wat grotendeels wordt vergemakkelijkt door door een beroerte veroorzaakte schade aan de bloed-hersenbarrière. Dit idee is echter aangevochten. In één onderzoek werden immuuncellen in de schedel en het scheenbeen van muizen anders gelabeld, en 6 uur na een beroerte werd een significant grotere afname van neutrofielen en monocyten gevonden in de schedel vs. het scheenbeen en meer van de schedel afgeleide neutrofielen waren aanwezig in de ischemische hersenen. Deze gegevens suggereren dat in de acute beroertefase neutrofielen in de ischemische hersenen voornamelijk afkomstig zijn uit het beenmerg van de schedel⁴. Interessant is dat CSF deze migratie kan begeleiden. Inderdaad, twee recente rapporten toonden aan dat CSF signaalsignalen van de hersenen rechtstreeks via schedelkanalen naar het beenmerg van de schedel kan doorgeven en celmigratie en hematopoëse in het beenmerg van de schedel kan instrueren na CZS-letsel ^9,10.

In het licht van deze recente bevindingen is het belangrijk geworden om veranderingen in immuuncellen in zowel de hersenen als het beenmerg van de schedel te analyseren bij het bestuderen van de immuunrespons op hersenaandoeningen. Bij dergelijke onderzoeken zijn voldoende aantallen hoogwaardige immuuncellen nodig voor stroomafwaartse analyses zoals celsortering, flowcytometrie-analyse en single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq). Hier is het algemene doel om twee geoptimaliseerde procedures te presenteren voor het bereiden van eencellige suspensies uit hersenweefsel en schedelbeenmerg. Het is belangrijk op te merken dat de calvaria (voorhoofdsbeen, achterhoofdsbeen en pariëtale botten) van de schedel meestal worden gebruikt om beenmerg te extraheren, en dit beenmerg wordt in dit onderzoek specifiek schedelbeenmerg genoemd.

Protocol

Het protocol is goedgekeurd door het Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Mannelijke C57Bl/6 muizen (3-4 maanden oud; 22-28 g) werden gebruikt in de huidige studie. De details van de reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Eencellige suspensie uit de hersenen van muizen

OPMERKING: Figuur 1 illustreert het overzicht van het protocol voor het isoleren van hersencellen.

1. Verdoof, intubereer en beveilig de muis, zoals eerder aangetoond¹¹.
2. Maak een incisie in de bovenbuik door de huid en de onderliggende spierlagen en snijd voorzichtig door het middenrif en de ribben om de opening in de borstholte te creëren.
3. Vul een spuit van 30 ml met koud PBS en bevestig deze via een siliconenslang aan de botte perfusienaald. Steek de perfusienaald voorzichtig in de linker hartkamer.
4. Voer een kleine inkeping uit in het rechteratrium om bloedafvoer mogelijk te maken en laat de muis vervolgens¹² perfuseren met een stroomsnelheid van ~ 10 ml/min gedurende 3-4 minuten.
   OPMERKING: Om de bloedklaring in de hersenen te verbeteren, kan worden overwogen het volume van de perfusieoplossing te verhogen en heparine toe te voegen.
5. Onthoofd de muis en maak een incisie in de middellijn door de huid op de bovenkant van het hoofd om de schedel bloot te leggen.
6. Schraap voorzichtig al het bindweefsel weg dat over de schedel ligt met een stompe pincet.
7. Gebruik een scherpe dissectieschaar om de schedelhechtingen langs de middellijn en aan beide zijden voorzichtig door te knippen, zodat er een flap ontstaat.
8. Til de schedelflap voorzichtig op om de hersenen bloot te leggen en gebruik een stompe tang om de hersenen voorzichtig uit de schedelholte te verwijderen.
9. Dompel de hersenen onder in een petrischaaltje met ijskoude PBS en verwijder eventueel achtergebleven hersenvliesweefsel.
   OPMERKING: Om de levensvatbaarheid van de cellen beter te behouden, wordt aanbevolen om alle volgende stappen uit te voeren op ijs of bij 4 °C.
10. Plaats de hersenen in een voorgekoelde glazen Dounce-homogenisator van 15 ml met 20 ml (hele hersenen) of 12 ml (halve hersenen) ijsoude HBSS-buffer.
11. Gebruik de losse Dounce-stamper om het hersenweefsel voorzichtig en langzaam te dissociëren met ongeveer 100-120 slagen op ijs.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een grote hoeveelheid gezonde hersencellen. Deze stap duurt ongeveer 10 minuten. Stop de homogenisatie wanneer er geen substantiële stukjes hersenweefsel zichtbaar zijn in de suspensie. Op dit punt kan de stamper gemakkelijk zonder enige kracht naar beneden bewegen.
12. Filtreer de resulterende suspensie van hersenweefsel door een celzeef van 70 μm in een centrifugebuis van 50 ml.
13. Spoel de Dounce-buis met 5 ml HBSS en ga verder met filtratie om de celverzameling te maximaliseren.
14. Centrifugeer de gefilterde weefselsuspensie bij 550 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C.
15. Verwijder het supernatans met behulp van een vacuümaspirator en resuspendeer de celpellet in 1 ml 30% isotone dichtheidsgradiëntoplossing.
    OPMERKING: Om 15 ml 30% isotone dichtheidsgradiëntoplossing te maken, mengt u 4.5 ml 100% voorraaddichtheidsgradiëntmedium, 1.5 ml 10× PBS en 9 ml ddH₂O.
16. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml en voeg 9 ml (hele hersenen) of 6 ml (halve hersenen) 30% dichtheidsgradiëntoplossing toe.
17. Keer de tube voorzichtig om om een grondige menging te garanderen.
18. Centrifugeer de buis onmiddellijk bij 845 x g met acceleratie en rem ingesteld op niveau 3, gedurende 20 minuten bij 4 °C.
19. Verwijder de buis voorzichtig uit de centrifuge zonder te schudden en zuig de bovenste myelinelaag voorzichtig op met behulp van een tip van 1 ml die op het vacuüm is aangesloten.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om deze laag niet te verstoren. Elke resterende myeline kan een negatieve invloed hebben op de gezondheid van de cellen en stroomafwaartse analyses in gevaar brengen.
20. Zuig het supernatant op, laat 1-2 ml achter en resuspendeer de celpellet met minimaal 10 ml koude HBSS.
21. Centrifugeer bij 550 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C.
22. Was nog een keer met minimaal 7 ml koude HBSS.
23. Verwijder zoveel mogelijk van het supernatans en resuspendeer de cellen voor flowcytometrie-analyse met behulp van 100-200 μL flowcytometriebuffer.
    OPMERKING: De flowcytometrie FACS-buffer die voor dit onderzoek is gebruikt, bevat 0,5% BSA en 2 mM EDTA in 1× PBS. Een 96-well V-bodemplaat voor celkleuring wordt aanbevolen om celverlies tijdens de wasstappen te minimaliseren.
24. Voer flowcytometrie-analyse uit met behulp van een standaardprotocol dat in individuele laboratoria is vastgesteld¹³.
    1. Meng kort 80 μl celsuspensie met 20 μl van het antilichaammengsel in een 96-wells V-bodemplaat en incubeer gedurende 25 minuten bij 4 °C.
    2. Wassen met 200 μL FACS-buffer en vervolgens de cellen resuspenderen met 100 μL HBSS plus kleuringsreagens voor de levensvatbaarheid van de cellen.
    3. Na een incubatie van 15 minuten bij 4 °C, wassen met FACS-buffer en resuspenderen in 200 μL FACS-buffer voor flowcytometrieanalyse.

2. Bereiding van eencellige beenmergsuspensie uit calvaria van muizen

OPMERKING: Figuur 2 geeft het overzicht weer van de procedure voor het isoleren van het beenmerg van de schedel.

1. Laat de muis doorklinken zoals beschreven in stap 1.4.
2. Onthoofd de muis en maak een incisie in de middellijn van de huid op de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen.
3. Snijd door de schedel, beginnend bij het foramen magnum en naar voren langs de zijkanten van de calvaria met een scherpe schaar. Til vervolgens de calvaria op en verwijder deze.
   OPMERKING: De hersenen kunnen van dezelfde muis worden geoogst en verwerkt met behulp van stap 1, waardoor analyse van immuuncellen uit zowel de hersenen als het beenmerg van de schedel mogelijk wordt.
4. Trek de dura mater voorzichtig af van de schedel onder een ontleedmicroscoop met een stompe pincet.
   OPMERKING: Het is gemakkelijker om aan de randen van het achterhoofdsbeen te beginnen, langzaam los te maken en gestaag naar het frontale gebied te gaan, naar binnen werkend.
5. Leg de calvaria in de schaal op ijs en gebruik een pipet van 1 ml om de calvaria af te spoelen, zodat bloedresten van het oppervlak worden verwijderd.
6. Breng de calvaria over naar een nieuwe schaal met verse, koude PBS die voldoende is om de calvaria onder te dompelen.
7. Gebruik een steriele schaar om de calvaria in koude PBS in fragmenten van ongeveer 3 mm x 3 mm te knippen.
   OPMERKING: Bijsnijdmethoden kunnen de efficiëntie van calvaria-beenmergextractie beïnvloeden. Het wordt aanbevolen om dezelfde bijsnijdmethode te gebruiken om de variabiliteit te minimaliseren. Ook is het belangrijk om de hechtingen open te knippen. Figuur 2B illustreert één benadering.
8. Prik met een naald van 18 G een gaatje in de bodem van een microcentrifugebuisje van 500 μl.
9. Steek dit buisje in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml met 20 μl koud PBS.
10. Breng de calvariafragmenten over in de buis van 500 μl.
    OPMERKING: De botfragmenten moeten losjes worden verpakt om de extractie-efficiëntie te verhogen.
11. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C.
    OPMERKING: Om het celherstel te maximaliseren, gebruikt u een naald van 18 G om de calvariafragmenten voorzichtig te roeren en herhaalt u deze stap nog 1-2 keer.
12. Resuspendeer de verzamelde calvaria-beenmergcellen in 500 μl lysisbuffer van rode bloedcellen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s.
13. Breng de suspensie over in een centrifugebuis van 15 ml met 4 ml koud PBS.
14. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C.
15. Was nog een keer met 5 ml koude PBS.
16. Resuspendeer de celpellet in een geschikte buffer. Voor flowcytometrie gebruiken we meestal 500 μL FACS-buffer.
17. Voer voor flowcytometrie-analyse celtelling uit en gebruik ongeveer 1 x 10⁶ cellen voor antilichaamkleuring.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u de Fc-blokstap opneemt voordat u antilichaamkleuring¹³ bevestigt.

Resultaten

Om immuuncellen uit het hersenweefsel van muizen te bereiden, levert het protocol over het algemeen cellen op met een hoge levensvatbaarheid (84,1% ± 2,3% [gemiddelde ± SD]). Ongeveer 70%-80% van deze cellen is CD45-positief. In de normale muizenhersenen zijn bijna alle CD45^+-cellen microglia (CD45^LowCD11b⁺), zoals verwacht. Dit protocol is in het laboratorium gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder flowcytometrie-analyse, fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en scRNA-seq-analyse. Als voorbeeld werd een flowcytometrie-analyse uitgevoerd in een beroertemodel (Figuur 3). Muizen werden onderworpen aan een voorbijgaand beroertemodel, 30 minuten filament occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO)¹⁴. Op dag 3 na een beroerte werden cellen bereid uit muizenhersenen en gekleurd met gemeenschappelijke markers voor het oppervlak van immuuncellen. De poortstrategie is weergegeven in figuur 3A. In overeenstemming met eerder onderzoek^13,15 werd een duidelijke toename van CD45^High-cellen in de ipsilaterale hemisfeer waargenomen (Figuur 3B,C), wat wijst op infiltratie van de immuuncel in de hersenen.

Voor het schedelbeenmergprotocol werd consequent een substantiële opbrengst van schedelbeenmergcellen (ongeveer 2 x 10⁶ cellen) bereikt met een uitstekende levensvatbaarheid (93,8% ± 1,8% [gemiddelde ± SD]). Zoals verwacht zijn de meeste van deze cellen CD45-positief. Om het nut van dit protocol te illustreren, werd een vergelijkende studie uitgevoerd om de samenstelling van immuuncellen in zowel het dijbeen als het beenmerg van de schedel van naïeve muizen te karakteriseren (Figuur 4). Zoals weergegeven in de representatieve grafieken, was de samenstelling van de immuuncellen vergelijkbaar tussen het dijbeen en het beenmerg van de schedel (figuur 4A,B). Interessant is dat de frequentie van neutrofielen hoger lijkt te zijn in het dijbeen dan in het schedelbot (Figuur 4C). Deze bevinding vereist echter verdere validatie, aangezien de steekproefomvang klein was voor deze pilotstudie.

Figuur 1: Overzicht van het protocol voor het isoleren van hersencellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Het protocol voor de isolatie van beenmergcellen in de schedel. (A) Overzicht van de procedure. (B) Het aanbevolen patroon voor het snijden van schedels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve flowcytometrie-analyse van de immuuncellen in de hersenen van een beroerte. (A) Een voorbeeld van de gating-strategie. De grafieken tonen de volgende immuuncelpopulaties: microglia (CD45^LowCD11b⁺), NK-cellen (CD45^HighNK1.1⁺), neutrofielen (CD45^HighLy6G⁺), ^T-cellen (CD45^HighCD11b-CD3⁺) en B-cellen (CD45^HighCD11b-CD19⁺). Dit voorbeeld vertegenwoordigt een analyse van immuuncellen in de hersenen in de ipsilaterale hemisfeer op dag 3 na een beroerte. (B,C) Infiltreren van immuuncellen in de hersenen van de beroerte. Jonge mannelijke muizen werden onderworpen aan voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO). Op dag 3 werden de hersenen verzameld en opgesplitst in de linker (contralaterale) en rechter (ipsilaterale) hemisferen. Hersencellen werden geprepareerd volgens het beschreven protocol en vervolgens onderworpen aan flowcytometrie-analyse. Representatieve grafieken illustreren verhoogde infiltrerende immuuncellen in de ipsilaterale hemisfeer (CD45^Hoge cellen; B). Kwantitatieve gegevens worden weergegeven in de staafdiagrammen (C). Het aantal cellen werd berekend op basis van het aantal cellen en het volume dat werd geregistreerd in de flowcytometriegegevens. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve flowcytometrie-analyse van de beenmergcellen van de schedel. Ter vergelijking werd analyse van beenmergcellen van het dijbeen opgenomen. De grafieken tonen de volgende immuuncelpopulaties: NK-cellen (CD45⁺NK1.1⁺), neutrofielen (CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺), T-cellen (CD45⁺CD11b-CD3⁺) en B-cellen (CD45⁺CD11b-CD19⁺). (A) Representatieve grafieken voor het beenmerg van het dijbeen. (B) Representatieve waarnemingspunten voor het beenmerg van de schedel. (C) Vergelijking van de samenstelling van immuuncellen tussen dijbeen en schedelbeenmerg. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hier worden twee eenvoudige maar effectieve protocollen gepresenteerd voor het isoleren van immuuncellen uit de hersenen en het beenmerg van de schedel. Deze protocollen kunnen op betrouwbare wijze een grote hoeveelheid levensvatbare immuuncellen opleveren die geschikt kunnen zijn voor diverse stroomafwaartse toepassingen, met name voor flowcytometrie.

Om neuro-inflammatie bij verschillende hersenaandoeningen te bestuderen, zijn er veel protocollen voor immuuncelpreparaten uit de hersenen opgesteld en gebruikt in verschillende laboratoria 15,16,17. De gebruikelijke benaderingen omvatten enzymgebaseerde celdissociatie gevolgd door gradiëntscheiding. Doorgaans wordt in deze protocollen hersenweefsel fijngehakt en vervolgens geïncubeerd in een enzymverteringsoplossing die zowel collagenase als DNase bevat gedurende 30-60 minuten bij 37 °C met zacht schudden. Na de spijsvertering ondergaan de cellen verdere dissociatie met behulp van een mechanische methode zoals pipetteren of Dounce-homogenisatie. Nadat ze door een celzeef zijn gegaan (bijv. 70 μm-zeef), worden cellen vervolgens onderworpen aan gradiëntcentrifugatie (vaak 30%/70% dichtheidsgradiëntoplossing) om myeline, rode bloedcellen en puin te verwijderen en leukocyten te verrijken. Deze aanpak vereist echter een langdurige enzymatische incubatie bij 37 °C die het transcriptoom en proteoom van immuuncellen in de hersenen aanzienlijk kan veranderen. Een systematisch onderzoek suggereerde inderdaad dat de enzymatische benadering diepgaande veranderingen introduceert in het transcriptoom en het proteotype van specifieke hersencellen¹⁸. Dit kan leiden tot artefacten in latere transcriptomische analyses zoals scRNA-seq. Daarentegen maakt het hier gerapporteerde protocol gebruik van een mechanische dissociatiebenadering bij koude temperaturen gedurende de hele procedure, waardoor het cellulaire metabolisme wordt onderdrukt. Dit zorgt voor een beter behoud van de transcriptionele en proteomische toestand, waardoor potentiële artefacten worden geminimaliseerd. Tijdens de ontwikkeling van het protocol merkten we dat het gebruik van een grote Dounce-homogenisator voor het homogeniseren van hersenweefsel van cruciaal belang is voor het bereiken van hogere celtellingen met een lagere celdood. Het is waarschijnlijk dat tijdens Dounce-homogenisatie de massale aanwezigheid van extracellulaire matrices, celresten en cytoplasmatische componenten giftig is voor cellen. Het gebruik van een overmatige hoeveelheid buffer helpt deze giftige stoffen te verdunnen en vermindert zo hun schadelijke effecten, wat leidt tot een betere levensvatbaarheid van de cellen. De flowcytometriegegevens bevestigden een levensvatbaarheid van ongeveer 85% van immuuncellen die met dit protocol waren bereid. Bovendien is het opmerkelijk dat centrifugatie met slechts een oplossing met een dichtheidsgradiënt van slechts 30% de immuuncellen van de hersenen effectief verrijkt en myeline verwijdert. Dit kan ook de kosten van celvoorbereiding verlagen.

Studies naar immuuncellen in het schedelbeenmerg zijn nog beperkt. Een methode die vaak wordt gebruikt om cellen uit de schedel van de muis calvarium te isoleren, is het snijden van de schedel in kleine stukjes en vervolgens het mechanisch pletten van de stukken met een stamper⁶. In het huidige protocol wordt korte centrifugatie gebruikt. Deze methode is een bewerking van een gepubliceerd protocol voor het bereiden van beenmerg uit dijbenen en scheenbenen¹⁹. Voor deze lange botten hoeft men slechts één uiteinde van het bot af te snijden om beenmerg te verzamelen door middel van centrifugeren. Voor de schedel wordt deze stap gewijzigd door deze in verschillende kleine stukjes te snijden om de mergholte te openen. Het wordt aanbevolen om een consistent patroon te gebruiken voor het snijden van de schedel om reproduceerbare celtellingen te verkrijgen. Om het herstel van beenmergcellen te maximaliseren, kunnen de schedelstukken bovendien 2-3 centrifugatierondes ondergaan met menging tussen elke centrifugatie.

Beide protocollen hebben beperkingen. Ten eerste is het mogelijk dat het gebruik van centrifugatie met een dichtheidsgradiëntoplossing met 30% de resterende rode bloedcellen in de hersenen niet effectief verwijdert, wat kan optreden als gevolg van onvolledige perfusie. Bovendien, als de myelinestructuur onder bepaalde omstandigheden wordt gemoduleerd, is een oplossing met een dichtheidsgradiënt van 30% mogelijk niet een optimale concentratie voor hun verwijdering. In dit geval moet een andere werkconcentratie van dichtheidsgradiëntoplossing worden vastgesteld. Ten tweede, hoewel flowcytometrie-analyse een goede cellevensvatbaarheid van de immuuncellen in de hersenen aangeeft met behulp van het beschreven protocol, moet het nog worden geëvalueerd voor andere toepassingen, zoals transcriptomische analyse waarin actinomycine D kan worden gebruikt. Ten derde wordt de calvaria gebruikt om schedelbeenmerg te bereiden. Er moet echter worden opgemerkt dat immuuncellen in veel andere delen van de schedel voorkomen. Ten slotte herbergen de hersenvliezen, vooral de dura mater, diverse immuuncellen en spelen ze een rol bij de homeostase en disfunctie van de hersenen²⁰. Voor immuunanalyse van de hersenvliezen kan een elders gepubliceerd protocol worden aangenomen 17,21,22,23.

Samenvattend worden twee robuuste protocollen beschreven voor het isoleren van immuuncellen uit zowel de muizenhersenen als de schedel. Deze protocollen zullen naar verwachting nuttig zijn voor het verkrijgen van een grote hoeveelheid cellen van hoge kwaliteit, geschikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conische buizen	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 inch BD PrecisionGlide naald	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conische buizen	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bodem microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 verdunning
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 verdunning
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 verdunning
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 verdunning
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 verdunning
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 verdunning
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 verdunning
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 verdunning
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 verdunning
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 verdunning
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 verdunning
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 verdunning
Percoll (dichtheidsgradiëntmedium)	Cytiva	17089101
Fosfaat bufferoplossing (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Schaar	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Grootte	DWK Life Sciences	357544