Methodenartikel

Split-luciferase herassemblagetest om endoplasmatisch reticulum-mitochondriëncontacten in levende cellen te meten

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66862

⸱

11 oktober 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We hebben een split-luciferase reassemblagetest opgezet om de contacten tussen endoplasmatisch reticulum en mitochondriën in levende cellen te monitoren. Aan de hand van deze test beschrijven we een protocol om het niveau van deze inter-organelkoppelingen in HEK293T cellen kwantitatief te meten, onder de voorwaarde van chemische behandeling.

Samenvatting

Endoplasmatisch reticulum (ER)-mitochondriën contactplaatsen spelen een cruciale rol in de gezondheid en homeostase van cellen, zoals de regulatie van Ca2+ en lipidehomeostase, mitochondriale dynamiek, autofagosoom en mitofagosoom biogenese, en apoptose. Het niet handhaven van een normale ER-mitochondriale koppeling is betrokken bij veel neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose en erfelijke spastische dwarslaesie. Het is van groot belang om te onderzoeken hoe de ontregeling van ER-mitochondriale contacten zou kunnen leiden tot celdood en of het herstellen van deze contacten tot het normale niveau neurodegeneratieve aandoeningen zou kunnen verbeteren. Verbeterde tests die het niveau van deze contacten meten, kunnen dus helpen om de pathogene mechanismen van deze ziekten te verlichten. Uiteindelijk zal het opzetten van eenvoudige en betrouwbare tests de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën vergemakkelijken. Hier beschrijven we een split-luciferase-test om het niveau van ER-mitochondriëncontacten in levende cellen kwantitatief te meten. Deze test kan worden gebruikt om de pathofysiologische rol van deze contacten te bestuderen en om hun modulatoren te identificeren bij high-throughput screening.

Inleiding

De interacties tussen het ER en de mitochondriën zijn van vitaal belang voor cellulaire homeostase en overleving 1,2,3,4. Eerder bewijs geeft aan dat elke vorm van verstoring of ontregeling in contactplaatsen van ER-mitochondriën kan bijdragen aan verschillende neurodegeneratieve, metabole en cardiovasculaire ziekten, evenals kanker 5,6,7,8,9,10. Een abnormale toename van de opname van Ca2+ in de mitochondriën kan bijvoorbeeld leiden tot celdood door de permeabiliteitsovergangsporiën van mitochondriën te openen, die vaak worden gezien in sommige modellen van de ziekte van Alzheimer 5,11. Evenzo kunnen verminderde contacten tussen ER en mitochondriën leiden tot een afname van de ATP-productie en een verslechtering van de inname van Ca2+, zoals te zien is in modellen van amyotrofische laterale sclerose 5,11,12. Naarmate er meer studies worden uitgevoerd op het gebied van ER-mitochondriëncontacten, worden aanvullende ziektegerelateerde eiwitten en genen ontdekt die deze contacten kunnen beïnvloeden. Ondanks de huidige kennis en bewijs dat de rol van ER-mitochondriën-contactplaatsen aantoont, is er nog veel werk nodig om op te helderen hoe deze contacten kunnen leiden tot verlies van cellulaire functie en uiteindelijk celdood.

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de nabijheid van de twee membranen, de structurele morfologie en de afstand tussen de twee organelcontactplaatsente evalueren 3,4,13. De benaderingen om de koppeling van ER en mitochondriën te bewaken, omvatten beeldvorming op basis van fluorescentiemarkers14,15, op FRET-reporters gebaseerde beeldvorming16 en beeldvorming op basis van gesplitste fluorescentiesondes17,18, die gebruik maken van epifluorescentie en confocale microscopie. Superresolutie- en atomaire resolutiemicroscopie zijn ook krachtige hulpmiddelen voor het nauwkeurig visualiseren van contacten tussen organellen, hoewel het gebruik ervan bij de analyse van contactplaatsen nog steeds beperkt is, omdat ze zeer toegewijde microscopen en technische expertise vereisen19. Daarnaast worden transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), scanning-elektronenmicroscopie (SEM) en andere EM-technieken zoals elektronentomografie (ET) en cryo-elektronenmicroscopie vaak gebruikt, omdat ze ultrastructurele beeldvorming met hoge resolutie van de contactplaatsen bieden, die vaak onmogelijk te verkennen zijn met behulp van andere experimentele benaderingen 20,21,22. Deze op EM gebaseerde methoden zijn echter een techniek met een zeer lage doorvoer die ook kan worden beïnvloed door chemische fixatieprocedures. Meer recentelijk zijn op nabijheidsetikettering gebaseerde methoden gebruikt om contactplaatsen te detecteren en om nieuwe contactplaatseiwitten te identificeren. Zo is de nabijheidsligatietest (PLA) gebruikt om de nabijheid van organellen te kwantificeren 23,24, terwijl een herziene versie van de ascorbaatperoxidase (APEX)-test is gebruikt bij het identificeren van nieuwe contactplaatseiwitten25,26. Het is belangrijk om te erkennen dat al deze hierboven beschreven methoden sterke punten en intrinsieke beperkingen hebben bij het detecteren van de contacten tussen de organellen. Het koppelen van verschillende technieken is dus vereist om een grondige interpretatie van de contactplaatsen van de organellen te verkrijgen.

Eerder hebben we de split-Renilla luciferase 8 reassemblagetest (split-Rluc assay) opgesteld om het niveau van ER-mitochondriën membraancontacten te monitoren (Figuur 1A)24,26,27. In het kort wordt elke gespleten helft van Renilla luciferase geconjugeerd met een ER- of mitochondriën-targetingsequentie. Wanneer ze samen worden getransfecteerd, wordt elke gesplitste helft van het enzym tot expressie gebracht in het ER- of mitochondriale membraan. Wanneer de ER en mitochondriën dicht bij elkaar worden geplaatst, komen de gespleten helften samen en reconstrueren ze het hele enzym met luciferase-activiteit. Voor de split-Rluc constructie gebruikten we Renilla luciferase 8 (Rluc8) in pBAD/Myc-His27 voor het initiële sjabloon. De gesplitste plaats (tussen aminozuren 91 en 92) werd bepaald op basis van eerdere rapporten27. Voor de N-terminale helft van de Rluc8 werden DNA-sequenties voor aminozuren 1-91 van de Rluc8 gefuseerd met het 3'-uiteinde van de FLAG-tag en de mitochondriale targetingsequentie van de muis AKAP1 in pcDNA3.1 TOPO-vector door PCR27. Voor de C-terminale helft gericht op het ER, werden DNA-sequenties die coderen voor aminozuren 92-311 gefuseerd met het 5'-uiteinde van de myc-tag en de gist UBC6 ER-lokalisatiesequentie. Hier hebben we het gespleten Rluc-plasmide-construct geüpgraded zodat gespleten helften van het Renilla-luciferase tot expressie worden gebracht in een enkele vector (pCAG) onder dezelfde promotor en vervolgens in twee fragmenten worden gesplitst terwijl T2A, een zelfsplitsende peptide 2A-sequentie van het Thosea asigna-virus, tussen de twee gespleten helften wordt ingevoegd (Figuur 1B). De plasmide-DNA-kaart en sequenties zijn te vinden in aanvullend bestand 1 en aanvullende figuur S1. Met behulp van dit systeem hebben we de effecten gemeten van drie chemicaliën (remmende GTPases die betrokken zijn bij actinepolymerisatie) op ER-mitochondriëncontacten. Deze split-Rluc-assay is een eenvoudig maar robuust testsysteem voor high-throughput screening voor inter-organel contactmodulatoren24.

Protocol

1. Celonderhoud en zaaien (dag 1)

  1. Onderhoud HEK293T cellen in celkweekmedia die Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bevatten met 10% foetaal runderserum (FBS) (in kweekschaaltjes van 100 mm) in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  2. Controleer voordat u begint de samenvloeiing van de plaat door deze onder de microscoop te bekijken. Wanneer de cellen ongeveer 80-90% samenvloeiing bereiken, bereidt u zich voor om de cellen in een kweekplaat met 6 putjes te zaaien door de media te verwijderen en te wassen met 10 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).
  3. Haal de DPBS uit het kweekschaaltje en behandel de cellen met 1 ml 0,05% Trypsine-EDTA fenolrood. Incubeer gedurende 3 minuten, haal dan de plaat uit de couveuse en voeg 9 ml kweekmedia toe (DMEM met 10% FBS) om de trypsinereactie te stoppen. Pipeteer langzaam op en neer om ervoor te zorgen dat eventuele cellen die nog aan de plaat vastzitten, losraken. Breng de celsuspensie over in een buisje van 50 ml.
  4. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de media en resuspendeer de celpellets met 1 ml verse media (DMEM + 10% FBS).
  5. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
    1. Zorg voor een gelijkmatige verdeling van de cellen door de buis voorzichtig rond te draaien. Verwijder onmiddellijk 10 μl van de celsuspensie en plaats deze in een microcentrifugebuisje van 1,7 ml. Voeg 90 μL media toe aan dezelfde buis.
    2. Nadat u de cellen en media voorzichtig hebt gemengd, neemt u de celsuspensie en brengt u 10 μl aan op elk van de kamers van de hemocytometer door voorzichtig onder het dekglaasje te pipetteren.
    3. Gebruik een 10x objectief om de rasterlijnen van de hemocytometer onder een microscoop scherp te stellen. Eenmaal scherpgesteld, tel je het aantal cellen in een set van 16 vierkanten (4 x 4 vierkanten) met behulp van een teller voor het tellen van de hand. Herhaal dit totdat alle vier de sets van 16 vierkanten zijn geteld.
    4. Bereken het totale aantal cellen/ml door het gemiddelde aantal cellen te nemen (van elk van de 16 hoekvierkanten) en dat te vermenigvuldigen met 105.
      OPMERKING: In plaats van een hemocytometer te gebruiken om cellen te tellen, kan een geautomatiseerde cellenteller worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant.
  6. Zodra het tellen van de cellen is voltooid, bereidt u zich voor op het plaatsen van cellen in een plaat met 6 putjes bij 7,5 × 105 cellen/putje met 2 ml media/putje. Voeg in een buisje van 50 ml het benodigde volume cellen toe, samen met 13 ml media. Doseer 2 ml van de verdunde celsuspensie in elk van de 6 putjes.
    1. Bereken vóór het plateren het aantal cellen dat nodig is voor 7,5 ×10 5 cellen/put met behulp van C1V1 = C2V2 waarbij C1 het initiële celgetal is (celnummer/ml), V1 het volume is dat nodig is vanaf de initiële celsuspensie, C2 de gewenste doelceldichtheid is (celnummer/ml), en V2 is het uiteindelijke volume dat nodig is voor het zaaien van cellen.
  7. Tik na het doseren zachtjes aan alle kanten op de plaat om de cellen te verspreiden en plaats deze vervolgens een nacht in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 .

2. Polyethyleenimine (PEI)-gemedieerde celtransfectie en post-transfectie celzaaien (dag 2)

  1. Verwijder de plaat met 6 putjes uit de incubator en zuig de bestaande kweekmedia uit elk putje op. Voeg 2 ml vers medium per putje toe.
  2. Transfecteer de cellen met split-Rluc plasmide-DNA (pCAG-Mito,R, luc, N-T2A-R, luc,CER-IRES-mCherry), opgelost in TE-buffer (pH 8,0).
    1. Meng voor elk putje het DNA (750 ng) en PEI (verhouding van DNA/PEI = 1:3) in 200 μL DMEM in een microcentrifugebuisje van 1,7 ml. Draai het DNA/PEI snel rond op niveau 8 gedurende ongeveer 2 s om ervoor te zorgen dat ze goed met elkaar mengen om complex te vormen. Draai het daarna kort (<3 s) rond in een minicentrifuge.
    2. Laat het mengsel van DNA/PEI 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen en voeg het mengsel vervolgens (door het te laten vallen) toe aan het oppervlak van de kweekmedia in de plaat met 6 putjes die cellen bevat. Tik zachtjes op de plaat (om het mengsel gelijkmatig te verdelen) en incubeer het in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 6 uur.
  3. Bereid tijdens het broeden een met Poly-D-Lysine (PDL) gecoate plaat met 96 putjes voor door eerst 70 μL PDL (50 μg/ml in DPBS) aan elk putje toe te voegen en te incuberen in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende ten minste 1 uur. Verwijder de PDL-oplossing en was vervolgens elk putje 2x met 100 μL DPBS. Zorg er aan het einde van de tweede wasbeurt voor dat alle resterende DPBS zijn verwijderd.
  4. Bereid u 6 uur na transfectie voor om de getransfecteerde cellen te zaaien in een PDL-gecoate plaat met 96 putjes.
    1. Haal de plaat met 6 putjes met getransfecteerde cellen uit de couveuse, zuig de media op en was elk putje met 2 ml DPBS. Voeg na het verwijderen van de DPBS 350 μL 0,05% trypsine-EDTA fenolrood toe en incubeer gedurende 1-2 minuten. Om de trypsinereactie te stoppen, voegt u 1,7 ml media toe aan elk putje.
    2. Nadat u de cellen samen met het medium hebt overgebracht naar een buisje van 50 ml, draait u het buisje gedurende 5 minuten rond op 300 × g in een tafelcentrifuge. Zuig het medium op en resuspendeer het celpellet met 1 ml vers medium. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer (zoals beschreven in stap 1.5).
  5. Zaai de cellen in een PDL-gecoate plaat met 96 putjes met een dichtheid van 4 × 104 cellen/putje in 100 μl kweekmedia. Voeg hiervoor in een buisje van 50 ml het benodigde volume cellen toe (zie hieronder voor berekening) samen met het juiste volume media (totaal volume van 12 ml). Doseer met behulp van een meerkanaalspipet 100 μl van de verdunde celsuspensie in elk van de 96 putjes. Incubeer de cellen gedurende 18 uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 .
    1. Bereken het aantal cellen dat nodig is voor 4 ×10 4 cellen/putje met behulp van C1V1 = C2V2 waarbij C1 het initiële celgetal is (celnummer/ml), V1 het volume is dat nodig is vanaf de initiële celsuspensie, C2 de gewenste doelceldichtheid (celnummer/ml) en V2 het uiteindelijke volume is dat nodig is voor celzaaiing.

3. Chemische behandeling en luciferase-test in levende cellen (dag 3)

  1. Bereid in een microfuge-buis van 1,7 ml de drie verse oplossingen van 50 μM Rhosin (50 mM voorraad in DMSO), 25 μM Ehop-016 (25 mM voorraad in DMSO) en 50 μM ZCL278 (50 mM voorraad in DMSO) door elke standaardoplossing (50 mM Rhosin, 25 mM Ehop-016 en 50 ml ZCL278; allemaal in DMSO) 1:1.000 in de vereiste hoeveelheid (50 μL/putje × aantal putjes) van kweekmedia te verdunnen. Voeg aan elke oplossing levend celsubstraat toe (50 mM voorraad in DMSO) voor Renilla luciferase verdund 1:2.000 tot een eindconcentratie van 25 μM. Om ZCL278-oplossingen van 0,5, 5 en 50 μM te maken, voert u seriële verdunningen uit met behulp van de initiële 50 μM ZCL278 in kweekmedia.
    OPMERKING: Als de chemische incubatietijd minder dan 1-1,5 uur gewenst is, kunnen de cellen gedurende 1-1,5 uur worden voorgeïncubeerd met levend celsubstraat (voor Renilla luciferase) voordat ze met elke chemische stof worden behandeld. We voegen tegelijkertijd chemicaliën en levend celsubstraat toe om het protocol voor high-throughput drug screening te optimaliseren.
  2. Verwijder het medium uit elk putje van de plaat met 96 putjes met getransfecteerde cellen en voeg 50 μl chemisch en substraatmediamengsel toe aan elk putje.
  3. Nadat u de cellen gedurende 1 uur, 2 uur of 5 uur hebt geïncubeerd, haalt u de kweekplaat uit de couveuse, plaatst u deze op de luminescentieplaatlezer en meet u de luminescentie.
    1. Voordat u begint, moet u ervoor zorgen dat de plaatlezer is ingeschakeld. Open de software van de microplaatlezer en maak een nieuw bestand door op Nieuwe sessie te klikken. Stel de temperatuur van de plaatlezer in op 37 °C door op Incubator te klikken, de temperatuuroptie aan te vinken en 37 °C in te voeren. Kies onder Plaatlay-out de optie Onbekend en geef de te meten putten op door te klikken en te slepen.
    2. Klik onder Protocol op Luminescentie en houd u aan de standaardinstellingen. Als u klaar bent met de installatie, plaatst u de plaat met het deksel eraf in de plaatlezer en kiest u Run Plate In. Klik op Start en het venster Bestand opslaan verschijnt. Sla het bestand op uw bureaublad op door het te hernoemen en op Opslaan te klikken.
      OPMERKING: De luminescentie wordt nog >24 uur geproduceerd na toevoeging van het levende celsubstraat.
  4. Zodra de meting is voltooid, verwijdert u de plaat van de plaatlezer en klikt u vervolgens op Plaat uitvoeren om de lezer terug te plaatsen. Als u klaar bent, plaatst u de plaat terug in de bevochtigde incubator (37 °C, 5% CO2) tot de volgende meting.
  5. Als u klaar bent, brengt u de luminescentiegegevens over naar een grafisch programma om de relatieve luminescentie-eenheid (RLU) (y-as) voor elke variabele (bijv. chemicaliën of concentraties) (x-as) uit te zetten en de gegevens te analyseren.

4. Validatie van de split-R luc-test met andere methoden.

  1. Voer andere tests uit, zoals de nabijheidsligatietest (PLA), transmissie-elektronenmicroscopie en mitochondriale calciumopnamemonitoring om de resultaten te valideren die zijn verkregen met de split-Rluc-test zoals eerder beschreven24.

Resultaten

We hebben het hierboven beschreven protocol gebruikt om het niveau van ER-mitochondriëncontacten te meten na toevoeging van drie verbindingen waarvan bekend is dat ze specifieke GTPases remmen. CDC42, RHO en RAC zijn GTPases die actinepolymerisatie28 bevorderen wanneer ze worden geactiveerd en worden geremd door respectievelijk ZCL278, Rhosin en Ehop-01624. HEK293T cellen getransfecteerd met split-Rluc werden behandeld met DMSO (controle), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) of Ehop-016 (25 μM) en geïncubeerd gedurende 1 uur, 2 uur en 5 uur. Met behulp van een plaatlezer hebben we de split-Rluc-activiteit op gedefinieerde tijdstippen gemeten (Figuur 2).

Met rhosine (RHO GTPaseremmer) behandelde cellen vertoonden geen significante veranderingen in luciferase-activiteit in vergelijking met de met DMSO behandelde controlecellen na 1 uur, 2 uur en 5 uur van de behandeling (p > 0,9999, p= 0,6956, p > 0,9999) (Figuur 2). Deze resultaten tonen aan dat Rhosin geen invloed heeft op ER-mitochondriëncontacten, wat suggereert dat RHO GTPase-activiteit niet betrokken is bij het reguleren van de contacten tussen de twee organellen.

Daarentegen vertoonde de RAC GTPase-remmer Ehop-016 een significant lagere luciferase-activiteit dan DMSO na 1 uur, 2 uur en 5 uur van de behandeling (p = 0,0106, p = 0,0009, p = 0,0024) (Figuur 2). Deze gegevens geven aan dat RAC GTPase-activiteit vereist is voor het handhaven van een normale ER-mitochondriëninteractie in de cel.

Ten slotte vertoonde CDC42-remmer ZCL278 de meest drastische veranderingen in luciferase-activiteit (Figuur 2). Met ZCL278 behandelde cellen vertoonden een significante afname van de luciferase-activiteit in vergelijking met de controle-DMSO en hadden de laagste p-waarden op alle drie de tijdstippen, waarbij een p < 0,0001 werd gehandhaafd. Onze gegevens tonen een sterke remming van de koppeling tussen ER en mitochondriën aan wanneer de activiteit van CDC42 GTPase wordt geblokkeerd door ZCL278, in overeenstemming met ons vorige rapport met behulp van de originele split-Rluc-test die werd uitgevoerd in cellen die samen waren getransfecteerd met twee vectoren die elke helft van het gesplitste luciferase afzonderlijk coderen24.

Gezien de opvallende resultaten met ZCL278, vooral in vergelijking met de andere GTPase-remmers, werd de activiteit van ZCL278 verder getest bij verschillende concentraties [0,5 μM, 5 μM, 50 μM] tegen een DMSO-controle. Luciferase-activiteiten gemeten 1 uur, 2 uur en 5 uur na de behandeling vertoonden een dosisafhankelijke respons; 0,5 μM ZCL278 resulteerde in het zwakste effect op de luciferase-activiteit, terwijl 5 μM sterker was en 50 μM de sterkste vermindering van gereconstitueerde enzymactiviteit vertoonde (Figuur 3). Samen tonen onze resultaten aan dat ZCL278 de split-Rluc-activiteit op een dosisafhankelijke manier verlaagt en, naarmate de tijd vordert, vertonen hogere concentraties ZCL278 (CDC42-remmer) nog steeds een significante verandering ten opzichte van de controle-DMSO in vergelijking met lagere concentraties.

Als een manier om onze split-Rluc-test te valideren, kunnen gevestigde onafhankelijke tests worden uitgevoerd, zoals de nabijheidsligatietest (PLA), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en mitochondriale calciumopnamemonitoring (Figuur 4 en gegevens niet weergegeven)24. Isoproterenol, een β2-adrenerge receptoragonist, een van de verbindingen die in onze screening zijn geïdentificeerd voor ER-mitochondriën-contactpromotoren (Figuur 4A), werd gebruikt om te bevestigen dat de luciferase-activiteit van de split-Rluc bij behandeling met isoproterenol verhoogd was als gevolg van verbeterde ER-mitochondriëncontacten, zoals blijkt uit veranderingen in de intensiteit van het PLA-signaal en de mitochondriale calciumopname (Figuur 4B-E).

figure-results-1
Figuur 1: De split-Rluc reassembly assay. (A) Schematische weergave van de Split-RLuc assay. Waar er geen membraancontacten zijn tussen de mitochondriën en het endoplasmatisch reticulum, werken de Mito-R lucN en de RlucC-ER niet samen en is er dus geen Rluc8-activiteit. Interactie tussen de Mito-R luc N en de RlucC-ER, waarbij de ER en mitochondriënmembranen in contact komen, resulteert echter in volledige enzymatische activiteit, die wordt gedetecteerd door de omzetting van het substraat in luminescentie. (B) Schematische kaart van het gesplitste LucDNA-construct (pCAG-MitoR, luc, N-T2A-R, luc, CER-IRES-mCherry). (C) Diagram van de workflow voor de split-Rluc-test in HEK293T cellen. Afkortingen: Mito = mitochondriën; ER = endoplasmatisch reticulum; IRES, interne ribosomale ingangsplaats; rb_glob pA, konijn bèta-globine poly-adenyleringssignaal; T2A, een zelfsplitsende peptide 2A-sequentie van het Thosea asigna-virus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: De split-Rluc-activiteiten die overeenkomen met de niveaus van ER-Mito-contacten in de cellen die zijn behandeld met GTPaseremmers. (A-C) Gereconstitueerde luciferase-activiteiten bij (A) 1 uur, (B) 2 uur, of (C) 5 uur na DMSO (controle), Rhosine [50 μM], Ehop-016 [25 μM] of ZCL278 [50 μM] behandeling (n = 12 voor elke groep). Alle gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen. P-waarden worden gerapporteerd als p > 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Foutbalken geven de gemiddelde ± standaardmeetfout aan. Afkortingen: Mito = mitochondriën; ER = endoplasmatisch reticulum; RLU = relatieve lichteenheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: De split-Rluc-activiteiten die de niveaus van ER-Mito-contacten meten in de cellen die met ZCL278 zijn behandeld. (A-C) Gereconstitueerde luciferase-activiteiten bij (A) 1 uur, (B) 2 uur of (C) 5 uur na DMSO (controle) of ZCL278 bij een concentratie van [0,5 μM], [5 μM] of [50 μM] (n = 12 voor elke groep). Alle gegevens werden geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen. P-waarden worden gerapporteerd als p > 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Foutbalken geven de gemiddelde ± standaardmeetfout aan. Afkortingen: Mito = mitochondriën; ER = endoplasmatisch reticulum; RLU = relatieve lichteenheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Validatie van de split-Rluc-analyse. (A) Een voorbeeld van kwantificering van split-Rluc-activiteit na behandeling van HEK293T cellen met 11 geneesmiddelen, waaronder isoproterenol, geïdentificeerd in een samengestelde screening voor ER-mitochondriën-contactpromotors. (B) Een voorbeeld van nabijheidsligatietest in HeLa-cellen die zijn behandeld met DMSO of isoproterenol (1 μM). PLA-signaal (rood) geeft een nauw contact aan tussen ER en Mito. Sec61-GFP (groen): om ER te labelen; DAPI (blauw): kern. (C) Kwantificering van het PLA-signaal in A (n = 4 experimenten met elk 77-97 cellen; Mann-Whitney-test). (D) Mitochondriale calciumopname als reactie op histamine (100 μM). Mito-R-GECO1 fluorescerende intensiteitsverandering (gemiddeld werd genomen over meerdere HeLa-cellen) geplot elke 2,5 s in met DMSO of isoproterenol behandelde cellen. Pijl geeft histaminetoevoeging aan. (E) Links: Maximale piek van mitochondriale calciumopname in A. Ongepaarde tweezijdige t-test (n = 10, DMOS; 14, Isoproterenol). Rechts: Mitochondriale calciumopnamesnelheid (zoals in A; 7,5 tot 12,5 s). Mann-Whitney-test (n = 12, DMSO; 11, Isoproterenol). Dit cijfer is aangepast van Lim et al.24. Afkortingen: RLU = relatieve lichteenheid; PLA = nabijheidsligatietest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenvatting van de huidige technieken voor ER-mitochondriëncontacten. Lijst met voordelen en beperkingen voor elke methode. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Zip-bestand met DNA-sequentie (PDF- en GBK-formaten) van pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Kaart van pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

We hebben een split-Renilla luciferase 8 reassemblagetest (split-Rluc-assay) gebruikt om het niveau van ER-mitochondriënkoppelingen te kwantificeren. In deze studie hebben we het originele split-Rluc-construct24 gemodificeerd door een enkele vector te genereren, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, die codeert voor elke split-Rluc-component (MitoRlucN en RlucCER) en een zelfsplitsende peptide 2A-sequentie van het Thosea asigna-virus om de expressie van dezelfde hoeveelheid van elke gesplitste helft van luciferase te garanderen. Als substraat voor het Renilla-luciferase werd in plaats van coelenterazine een gemodificeerd levend celsubstraat (beschermd derivaat van coelenterazine; zie de materiaaltabel) gebruikt om de volgende redenen. Ten eerste genereert dit beschermde derivaat, in tegenstelling tot coelenterazine dat autoluminescentie genereert in een waterige omgeving (vooral erger in serum), een zeer lage autoluminescentie (vaak niet detecteerbaar) in een medium dat 10% serum bevat, waardoor de signaal-achtergrondverhouding hoger is dan die van coelenterazine. Ten tweede, in tegenstelling tot coelenterazine, waar de luminescentie kort na het toevoegen van het substraat het sterkst is, maar zeer snel begint af te nemen, komt de luminescentie die door het gemodificeerde levende substraat wordt geproduceerd ongeveer 1,5 uur na toevoeging van het substraat aan op het hoogst haalbare punt en blijft deze langer dan 24 uur continu. Deze veranderingen in reactiekinetiek maken het gemakkelijker om luminescentie te meten in een plaat met meerdere putjes, wat erg handig is voor screening met hoge doorvoer. Bovendien maakt de luminescentie die wordt geproduceerd doordat het beschermde substraat op de lange termijn constant blijft, het mogelijk om een enkele set monsters op meerdere tijdstippen te meten, in tegenstelling tot het meten van meerdere sets monsters die op verschillende tijdstippen worden gebruikt (één punt per monster).

Met behulp van deze bijgewerkte versie van de split-Rluc-constructie hebben we getest of RHO-, RAC- en CDC42 GTPases deelnemen aan de vorming van ER-Mito-contacten. We hebben GTPase-remmers, Rhosin (RHO-remmer), Ehop-016 (RAC-remmer) en ZCL278 (CDC42-remmer) toegevoegd aan HEK293T cellen die split-Rluc-componenten tot expressie brengen. Onze testresultaten geven aan dat ZCL278 de krachtigste remmer is van de contactvorming tussen ER en mitochondriën en dat Ehop-016 de volgende belangrijke remmer is, terwijl Rhosin hun contacten niet beïnvloedde. Deze gegevens suggereren dat CDC42-gemedieerde actinepolymerisatie (evenals in mindere mate RAC-gemedieerde) nodig is om ER-mitochondriëncontacten in de cel te behouden, terwijl RHO-gemedieerde actinepolymerisatie waarschijnlijk niet belangrijk is.

Om maximale efficiëntie te garanderen, zijn er veel kritieke stappen die voor dit protocol moeten worden overwogen. Eerst en vooral moet de hoeveelheid getransfecteerd construct worden getest, omdat te veel DNA een toxisch effect kan hebben op de cellen. Ten tweede, aangezien het aantal cellen een aanzienlijke invloed kan hebben op de gemeten luciferaseniveaus, is het van cruciaal belang om de dichtheid van cellen zo dicht mogelijk bij wat in het protocol werd vermeld te houden om de ideale en consistente samenvloeiing van cellen met 80% te garanderen tegen het moment van de test. Er kan een vermindering van de luminescentie optreden als de cellen samenvloeiing bereiken tijdens de chemische blootstellingstijd, aangezien confluente cellen over het algemeen minder eiwit maken. Ten derde, om ervoor te zorgen dat de cellen niet afstoten tijdens de toevoeging van chemicaliën en substraat, gebruiken we een plaat met 96 putjes die vooraf is gecoat met Poly-D-Lysine. Ten vierde is het voor de verbindingen (inclusief het substraat) die in dit protocol worden gebruikt, belangrijk om ze in aliquots op -20 °C of lager (-70 °C) te houden en ze onmiddellijk aan de ontdooide cellen toe te voegen. Ten slotte is het, vanwege mogelijke temperatuurschommelingen die de luciferase-activiteit kunnen beïnvloeden, misschien het beste om ervoor te kiezen de binnenste putjes van de plaat te gebruiken en de putjes aan de buitenkant van de plaat te negeren.

De split-Rluc8-assay biedt een eenvoudige maar robuuste methode om ER-mitochondriëncontacten te bepalen, ideaal voor screening met hoge doorvoer; Er zijn echter enkele beperkingen die moeten worden opgemerkt. Voor de celfysiologie is er het probleem van veranderingen in het gedrag van cellen als gevolg van de constante overexpressie van het construct-DNA. Momenteel werken we aan een construct met een induceerbare promotor om de mogelijke veranderingen in de celfysiologie als gevolg van constante overexpressie tegen te gaan. Verder, wanneer deze test wordt gebruikt voor een screeningsdoeleinden, moet worden opgemerkt dat vals-positieve resultaten kunnen voortvloeien uit een indirect effect van de geneesmiddelen op i) expressieniveaus, ii) organelgerichte werkzaamheid van de genoemde eiwitfragmenten, of iii) enzymatische activiteiten van de gereconstitueerde luciferasen. Vanwege deze beperkingen moet deze test worden getest in combinatie met andere methoden om de resultaten verder te valideren. Tabel 1 verwijst naar verschillende methoden om deze contactplaatsen te testen, samen met hun voor- en nadelen. We hebben gebruik gemaakt van andere methoden, waaronder maar niet beperkt tot nabijheidsligatietests (PLA), die nabijheid tussen eiwitten detecteren, en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), die een duidelijke visualisatie van organelcontacten mogelijk maakt, in combinatie met de split-Rluc-test om te valideren dat de resulterende veranderingen in RLU inderdaad te wijten zijn aan veranderingen in ER-mitochondriëncontactplaatsen (Figuur 4 en Lim et al.24). We hebben ook een correlatie aangetoond tussen verandering in ER-mitochondriëncontacten en functionele parameters zoals calciumoverdracht en mitochondriale splijting (Figuur 4 en Lim et al.24). Om ervoor te zorgen dat het effect van de geneesmiddelen op de activiteit van split-Rluc niet te wijten is aan een verhoogde expressie van het split-Rluc-gen, kan een transcriptie- of translatieremmer samen met de geneesmiddelen worden toegevoegd, zoals we eerder hebben gedaan24.

Voor de toepassing van het split-Rluc-systeem in gedifferentieerde neuronen in cultuur waar de transfectiesnelheid laag is, zou virale infectie (met lentivirus dat split-Rluc-componenten tot expressie brengt) een alternatieve benadering zijn. Het gebruik ervan kan worden uitgebreid om een screeningsysteem te creëren waarbij de cellen (bijv. door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen) worden gemanipuleerd om elk onderdeel van de split-Rluc, MitoRlucN en RlucCER stabiel tot expressie te brengen, hetzij door virale infectie of door CRSPR-gemedieerde genbewerking. Voor een stabiel expressiesysteem moet men zich er echter van bewust zijn dat er een selectiedruk kan zijn voor cellen die het split-Rluc-systeem beter verdragen, wat mogelijk niet representatief is voor de normale fysiologische toestand. Deze aanpassing of selectie kan leiden tot vertekening in de experimentele resultaten.

Samenvattend, ondanks enkele van de hierboven besproken beperkingen, is split-Rluc een snelle, ongecompliceerde en krachtige test voor high-throughput screening op kleine moleculen of genen die de inter-organelcontacten in de cel reguleren, zoals is aangetoond in onze vorige studie naar geneesmiddelenscreening24.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center) dankbaar voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het National Institute of Neurological Disease and Stroke (NINDS, R01NS113516).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge TubeSorenson16070
6-well plate TC TreatedUSA ScientificCC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTipUSA Scientific1110-3700
10 µL pipette tips OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 µL Beveled tips OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL Polypropylene Conical TubeFalcon352070
96-Well Flipper Microtube RacksThermoFisher Scientific8770-11
96-well plate TC TreatedUSA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated DishUSA ScientificCC7682-3394
1250 µL Tips OneTipUSA Scientific1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - Refrigerated CentrifugeEppendorf5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM, high glucoseThermoFisher Scientific11965092
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell SubstratePromegaE6481Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 µL pipetteEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 µL pipetteEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipetteEppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12-channelEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 µL pipetteEppendorf3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regionsThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless SteelThermoFisher Scientific381
Hand tally counterSigma-AldrichHS6594
HEK 293T CellsATCCCRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting ChamberLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE BufferThermoFisher Scientific8019005
MicroscopeZeissAxiovert 25 CFL
Mini centrifugeBenchmark ScientificC1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge TubesBoekel Scientific120008
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP6407-5MG
Rhosin hydrochlorideBio-Techne Tocris5003Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX multimode microplate readerThermoFisher ScientificVL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365level 8
VWR Vacuum Aspiration SystemVWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794Dissolve in DMSO; store at -70 °C

Referenties

  1. Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
  2. Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).
  3. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).
  4. Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
  5. Paillusson, S., et al. There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
  6. Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
  7. Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
  8. Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).
  9. Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).
  10. Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
  11. Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
  12. Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
  13. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).
  14. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  15. Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
  16. Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  17. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  18. Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).
  19. Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).
  20. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  21. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
  22. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
  23. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  24. Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).
  25. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  26. Cho, I. -T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
  27. Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
  28. Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Split luciferase assayER mitochondri le contactenlive cell imagingmembraancontactplaatsenneurodegeneratieve ziektenhigh throughputscreeningmitochondriale dynamiekcalciumhomeostaseluminescentieplaatlezerHEK293T cellen
Split-luciferase herassemblagetest om endoplasmatisch reticulum-mitochondriëncontacten in levende cellen te meten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.