Methodenartikel

Iatrogene verwonding gerecapituleerd: elektroexcisietechniek voor modellering van urethrale vernauwing bij ratten

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66864

⸱

11 oktober 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie presenteren we een nieuw, efficiënt en stabiel rattenmodel van urethrale vernauwing gecreëerd door elektroexcisie van de urethra van de rat, dat iatrogeen letsel effectief simuleert dat in klinische omgevingen wordt waargenomen.

Samenvatting

Urethrale strictuur (VS) is een veel voorkomende klinische aandoening in de urologie, gekenmerkt door een hoge prevalentie en morbiditeit op alle leeftijden. De huidige behandelingen voor de VS, zoals urethrale dilatatie en interne urethrotomie, lossen de aandoening niet volledig op en gaan gepaard met hoge recidiefpercentages en complicaties.

Bovendien wordt de pathogenese van de VS niet goed begrepen. Om de pathogenese van de VS te onderzoeken en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, is het van cruciaal belang om een gestandaardiseerd rattenmodel op te stellen dat de klinische manifestaties nauwkeurig weergeeft. Deze studie schetst een eenvoudige en herhaalbare methode voor het induceren van US bij ratten met behulp van een hoogfrequent elektrisch mes. De methode omvat het maken van een longitudinale incisie met het elektrische mes ingesteld op een unipolaire gemengde snijmodus bij 4 W, wat aanzienlijke urethrale schade toebrengt. Histopathologische analyse toont verdikking van het urotheel, inflammatoire infiltratie en ongeorganiseerde collageenvezels. Dit model repliceert effectief iatrogene schade door middel van elektroexcisie in de urethra van de rat. Samenvattend stelt deze studie met succes een nieuw, efficiënt en stabiel rattenmodel van de VS vast dat het klinische scenario nauw nabootst en een waardevol hulpmiddel biedt voor verder onderzoek naar de mechanismen en nieuwe behandelingen voor de VS.

Inleiding

Urethrale strictuur (VS) is een van de oudste urologische aandoeningen en komt nog steeds veel voor. Recente gegevens suggereren dat er tussen de 229 en 627 gevallen van de VS per 100.000 mannen zijn1. Degenen die lijden aan de VS ervaren een reeks symptomen, waaronder symptomen van de lagere urinewegen2, pijn3 en seksuele disfunctie4. Er zijn verschillende medische behandelingen beschikbaar, zoals urethrotomie, urethroplastiek en dilatatie5. Deze behandelingen worden echter vaak bemoeilijkt door problemen zoals bloedingen, infecties en incontinentie, die bijdragen aan de ziektelast en verschillende recidiefpercentages vertonen 6,7. Daarom blijft het identificeren van de meest effectieve therapeutische benaderingen een cruciale uitdaging om onderzoekers en clinici te betrekken.

US wordt over het algemeen gekenmerkt als een vernauwing van de voorste urethra veroorzaakt door fibrose en cicatrisatie van het urethrale slijmvlies en het omliggende spongiosum8. Ondanks de prevalentie zijn de oorzaken en mechanismen die ten grondslag liggen aan de VS slecht begrepen en is er een gebrek aan geschikte diermodellen voor diepgaand onderzoek. Iatrogeen letsel, voornamelijk door transurethrale chirurgie, is momenteel de belangrijkste oorzaak van de VS, goed voor 41% van de gevallen9. Daarom zou een ideaal diermodel voor Amerikaans onderzoek veelvoorkomende klinische verwondingen nauwkeurig moeten repliceren, nauwe genomische en proteomische overeenkomsten met mensen moeten vertonen en zowel efficiëntie als stabiliteit moeten vertonen. Een dergelijk model zou diepgaand onderzoek naar de pathogenese van de VS en de ontwikkeling van effectievere behandelingen aanzienlijk vergemakkelijken.

Om het pathogene proces en mechanisme van veel voorkomende klinische typen te onderzoeken, zijn verschillende diermodellen ontwikkeld met behulp van grote dieren zoals konijnen10,11, honden12 en varkens13,14 met behulp van technieken zoals elektrocoagulatie, elektroresectie15 en bleomycine-injecties16. Deze modellen worden echter vaak geconfronteerd met uitdagingen vanwege beperkingen van de steekproefomvang en genetische verschillen met mensen. Bovendien moet rekening worden gehouden met de kosteneffectiviteit van het gebruik van grote dieren; Ondanks de hoge kosten die gepaard gaan met dagelijkse verzorging, brengen grote dieren ook aanzienlijke risico's op infectie met zich mee, waardoor uitgebreide postoperatieve zorg en aanzienlijke kosten nodig zijn. Het is goed gedocumenteerd dat knaagdieren fysiologische en pathologische kenmerken delen met mensen in veel orgaansystemen. Een recente studie heeft homologie aangetoond tussen de urinewegcellen van knaagdieren en mensen17. Bovendien zijn de kosten van aankoop, huisvesting en postoperatieve verzorging van ratten aanzienlijk lager dan die van grote dieren18. Bijgevolg wordt een rattenmodel van de VS geschikt geacht; De ontwikkeling van dergelijke modellen bij ratten is echter onvoldoende beschreven.

Eerdere studies hebben chirurgische instrumenten zoals messen of naalden gebruikt om US te induceren bij rattenmodellen19. Deze aanpak is in verband gebracht met risico's zoals beschadiging van periurethrale bloedvaten, wat leidt tot aanzienlijke bloedingen. De subjectieve aard van deze chirurgische ingrepen kan ook leiden tot variabiliteit in de mate van mechanisch letsel, bij gebrek aan kwantitatieve criteria voor modellering, wat van invloed kan zijn op de beoordeling van de resultaten van urethraal herstel in latere therapeutische studies.

Gezien deze overwegingen is er een duidelijke behoefte aan de ontwikkeling van een aanvullend Amerikaans rattenmodel. Om een efficiënt, kosteneffectief en stabiel Amerikaans model bij ratten op te zetten, hebben we in ons onderzoek een hoogfrequente elektrische messenmachine gebruikt. Dit model zal verder onderzoek naar de mechanismen van de VS en de evaluatie van nieuwe therapeutische benaderingen vergemakkelijken alvorens over te gaan tot klinische proeven.

Protocol

In dit onderzoek werden twintig 6 maanden oude mannelijke Sprague-Dawley-ratten gebruikt, elk met een gewicht van 400-500 g. Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee in het Fifth Affiliated Hospital van de Sun Yat-Sen University (goedkeuringsnummer: 00349). De dieren werden gehuisvest in een faciliteit met gecontroleerde temperatuur en lichtomstandigheden. Een fundamenteel kenmerk van urethrale strictuur is de ontwikkeling van littekens in de urethra. Op basis van de vastgestelde tijdlijn voor littekenvorming, die meestal binnen 4 weken na het letsel optreedt, hebben we de aanwezigheid van waarneembaar littekenweefsel in de urethra op de 4 weken na de operatie aangewezen als het experimentele eindpunt.

1. Voorbereiding van chirurgische instrumenten

  1. Bereid de volgende chirurgische materialen voor: met teflon beklede katheter (0.6 x 1 mm), resorbeerbare hechtingen (6-0), hechtschaar, weefseltang, naaldhoudertang, gladde pincet, hoogfrequente elektrochirurgische eenheid (Figuur 1), inclusief het paneel van het hoogfrequente elektrische mes, chirurgische elektrode hoogfrequent elektrochirurgisch mes en de anale geleidende staaf (zie materiaaltabel).
  2. Reinig het operatiegebied met alcoholdoekjes die 75% ethanol bevatten.
  3. Voorbereiding voor het gebruik van een hoogfrequent elektrisch mes in een unipolaire elektrische snijmodus.
    1. Sluit het hoogfrequente elektrische mes met een netsnoer aan op de geaarde 220 V hoofdvoeding.
    2. Steek het gesteriliseerde, met de hand bediende meshandvat en de geleidende staaf in hun respectievelijke houders (Figuur 1C).
      NOTITIE: Zorg ervoor dat alle stroomkabels stevig zijn aangesloten om de veiligheid van de operatie te behouden.

2. Voorbereiding van het dier

  1. Zuig het natriumpentobarbital (60 mg/kg) op in een spuit.
  2. Zet de rat vast door zijn staart vast te pakken met de dominante hand en de huid van zijn oren en nek vast te houden met de niet-dominante hand om ervoor te zorgen dat hij stevig vastzit.
  3. Leg de onderbuik van de rat bloot en desinfecteer het gebied met wattenbolletjes gedrenkt in 75% ethanol.
  4. Steek de injectiespuitnaald ongeveer 1-2 mm naast de middellijn van de buik in de onderbuik en richt deze in een hoek van 45° in de buikholte.
    OPMERKING: U zult een verlies van weerstand voelen wanneer de naald het buikvlies binnendringt.
  5. Trek de zuiger van de spuit voorzichtig terug om ervoor te zorgen dat er geen bloed of vloeistof in de spuit zit.
  6. Injecteer langzaam het natriumpentobarbital. Trek de naald terug, voltooi de injectie en desinfecteer de plaats opnieuw met wattenbolletjes gedrenkt in 75% ethanol.
  7. Houd het ademhalingsritme van de rat in de gaten en knijp in zijn achterpoot om te controleren op reflexen.
    OPMERKING: Controleer of de ademhaling van de rat stabiel is en geen reflexen vertoont voordat u verder gaat met de operatie.
  8. Knijp de erytromycinezalf uit en doop een wattenstaafje in de zalf. Breng de zalf met het wattenstaafje aan op het hoornvlies van beide ogen om uitdroging van het hoornvlies tijdens de ingreep te voorkomen.
  9. Gebruik een elektrisch scheerapparaat om de onderbuik en het perineum te scheren nadat de anesthesie is bevestigd.
  10. Veeg losse haren van het geschoren gebied af met een tissue die is bevochtigd met zoutoplossing.
  11. Desinfecteer het gebied door het twee keer af te vegen met een gaasspons gedrenkt in jodofoor om huidirritatie te minimaliseren.
  12. Plaats de diep verdoofde rat in rugligging op een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37°C. Zorg voor steriliteit tijdens de chirurgische ingrepen door medische handschoenen te dragen.

3. Procedure voor urethrale katheterisatie en letsel

  1. Steek de geleidende staaf in de anus van de rat om een effectief gesloten circuit tot stand te brengen voor de hoogfrequente elektrische messenmachine (Figuur 2A).
  2. Katheteriseer de urethra van de rat om te helpen bij het positioneren en ondersteuning te bieden tijdens de nabewerkingsstappen van de operatie.
    1. Smeer de urinekatheter in met paraffineolie.
    2. Stel de penis bloot door in de huid eromheen te knijpen om deze uit de buik te steken.
    3. Desinfecteer de penis van de rat met een gaasspons gedrenkt in jodofoor.
    4. Open de urethrale opening voorzichtig met een gladde tang en breng de gesmeerde katheter in de urethra.
    5. Breng de met teflon beklede katheter voorzichtig in de urethra in met het ritme van urethrale samentrekking; vermijd het krachtig inbrengen (Figuur 2B).
    6. Als er weerstand wordt ondervonden, trekt u de penis voorzichtig naar de ventrale zijde om de buighoek van de penis aan te passen en blijft u de katheter in de blaas brengen totdat de urine eruit stroomt (Figuur 2C).
    7. Bevestig een succesvolle katheterisatie door ervoor te zorgen dat de penis een hoek van ongeveer 45° met de buik vormt (Figuur 2D).
  3. Schakel de hoogfrequente elektrische messenmachine in, klik op de knoppen van het hoogfrequente messenpaneel om de unipolaire gemengde snijmodus te selecteren en stel het vermogen in op 4 W voor de volgende stappen van het elektroshockeren van de penis laag voor laag.
  4. Lijn de incisie uit met de katheter. Druk op de gele knop op het handvat van het elektrochirurgische mes en maak met het elektrische mes een incisie langs de markeerlijn van de katheter van de penishuid naar de buitenste laag van de urethra totdat de urethra bloot komt te liggen (Figuur 3A,B).
    NOTITIE: Zorg ervoor dat u op de gele knop drukt voor elektroexcisie, niet op de blauwe knop voor elektrocoagulatie.
  5. Ga door met het maken van een longitudinale incisie van 0,5 cm in de urethra met het elektrische mes, zorg voor een dwarsdiameter van 0,1 cm, totdat de katheter zichtbaar is (Figuur 3C).
  6. Hecht de wond en de oppervlakkige huid laag voor laag met behulp van resorbeerbare hechtingen (6-0) met doorlopende of onderbroken hechtingen (Figuur 3D,E).
  7. Verwijder de urethrakatheter en plaats de penis terug (Figuur 3F).
  8. Schakel het hoogfrequente elektrische mes uit en verwijder de geleidende staaf uit de anus van de rat.
  9. Reinig de chirurgische materialen met alcoholdoekjes (75% ethanol).

4. Postoperatieve zorg

  1. Leg de rat op een verwarmd kussentje (37 °C) en houd het herstel van de anesthesie nauwlettend in de gaten. Besteed veel aandacht aan de fysieke conditie van de rat, inclusief ademhalingsritme, lichaamstemperatuur en bewustzijnsniveau.
    OPMERKING: Zet de rat niet terug in zijn kooi totdat volledig herstel is waargenomen.
  2. Verblijf de ratten in een schone kooi en vul de waterfles met water met morfine (0,4 mg/kg) voor dagelijkse pijnbestrijding na herstel.
  3. Dien niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen toe (zoals Carprofen, 0,5 mg/kg, subcutane injectie) voor het volledige herstel van de ratten van postoperatieve pijn.

5. Histologische evaluatie

  1. Wek vier weken na de operatie de mictiereflex op door de staarten van de ratten op te tillen. Plaats de rat in een euthanasiebox, open de klep van de CO2 -transmissieleiding en euthanaseer de ratten op humane wijze met een overdosis CO2.
  2. Draai de klep dicht nadat u hebt bevestigd dat de rat onbeweeglijk is en niet ademt en hebt waargenomen dat de pupil verwijd is. Blijf de fysieke toestand van de rat gedurende 2 minuten observeren om te bevestigen dat de euthanasie succesvol is.
  3. Haal de rat uit de euthanasiebox.
  4. Reinig het operatiegebied en de chirurgische materialen met doekjes gedrenkt in 75% ethanol.
  5. Ontleed de buik om de blaasvulstatus te observeren en de hele urethra te oogsten.
  6. Doe de rat na het oogsten van de urethra in een afsluitzak en bewaar deze in een koelkast van 4 °C voor verwerking door laboratoriumtechnici.
  7. Morfologisch evalueer de VS op grove pathologie, met de nadruk op de kleur en gladheid van het weefsel.
  8. Kleur het urethraweefsel in met hematoxyline en eosine (H&E) om de wondstructuur en de urotheelcellaag zichtbaar te maken.
    1. Dompel de glaasjes in xyleen voor deparaffinisatie (2 x 5 min).
    2. Rehydrateer de dia's in ethanol in volgorde (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
    3. Was de glijbanen in gedeïoniseerd water (2 min).
    4. Kleur de glaasjes met hematoxyline (10 min).
    5. Was de glijbanen in gedeïoniseerd water (5 min).
    6. Differentieer de monsters met differentiatieoplossing (40 s).
    7. Was de glijbanen in gedeïoniseerd water (2 x 3 min).
    8. Bevlek de glaasjes met eosine (2 min).
    9. Rehydrateer de dia's in ethanol in een bestelling (100% 1 x 3 s, 95% 1 x 3 s, 85% 1 x 3 s, 75% 1 x 3 s)
    10. Dompel de glaasjes in 100% ethanol (1 min) en transparant de glaasjes met xyleen (2 x 1 min).
    11. Voeg neutrale balsem toe en sluit af met het dekglaasje.
  9. Breng de trichrome kleuring van Masson aan op het urethraweefsel om de collageenvezelstructuur te benadrukken.
    1. Dompel de glaasjes in xyleen voor deparaffinisatie (2 x 5 min).
    2. Rehydrateer de dia's in ethanol in volgorde (100% 1 x 3 min, 95% 1 x 3 min, 85% 1 x 3 min, 75% 1 x 3 min).
    3. Was de glijbanen in gedeïoniseerd water (2 min).
    4. Kleur de objectglaasjes in de ijzerhematoxylineoplossing van Weigert (5 min).
    5. Was de glijbanen in gedeïoniseerd water (5 min).
    6. Beits de dia's in Biebrich Scarlet-Acid Fucshin (5 min).
    7. Was de glijbanen in gedeïoniseerd water (2 x 3 min).
    8. Kleur de objectglaasjes met fosfomolybdische zuuroplossing (5 min).
    9. Plaats de glaasjes in de Aniline Blue-oplossing (5 min). Gooi de oplossing weg.
    10. Spoel de glaasjes af, dehydrateer ze door alcohol en verduidelijk ze in xyleen.
    11. Voeg neutrale balsem toe en sluit af met het dekglaasje.
  10. Voer immunofluorescentiekleuring uit met behulp van een TGF-β-antilichaam om de urotheelcellaag te beoordelen.
    1. Voeg de juiste antigeenbuffer toe aan de snelkookpan. Plaats de snelkookpan op de kookplaat en zet hem op vol vermogen.
    2. Zodra ze koken, brengt u de dia's van het kraanwater over naar de snelkookpan. Laat koud water over het fornuis lopen en verwarm de dia's gedurende 10 minuten.
    3. Zet de snelkookpan uit en verwijder de dia's. Koel de glaasjes af tot kamertemperatuur.
    4. Was de dia's met PBS-oplossing.
    5. Markeer de marges van monsters met een liquid blocker-pen.
    6. Dompel de dia's 30 minuten in PBS plus 0,3% Triton X-100.
    7. Was de dia's in PBS met zacht roeren (2 x 5 min).
    8. Blokkeer in 10% geitenserum in PBS bij kamertemperatuur (60 min).
    9. Aspireerblokkeringsbuffer en incubeer met primair antilichaam gedurende een nacht bij 4 °C.
    10. Was de dia's met 1x PBS (3 x 5 min).
    11. Incubeer met fluorchroom-gelabeld secundair antilichaam verdund in antilichaamverdunningsbuffer.
    12. Was de dia's met 1x PBS (3 x 3 min).
    13. Monteer en dicht de dia's af.
  11. Scan de gekleurde dia's digitaal met behulp van een 40x objectief in een diascanner.
  12. Analyseer de afbeeldingen en meet de dikte van urotheel met behulp van de software waarnaar wordt verwezen (Materiaaltabel).
    1. Open de software.
    2. Klik op Lokale computer om de bevlekte dia's te selecteren.
    3. Klik op Afstand meten om de dikte van het urotheel te meten.
    4. Noteer de gegevens over de dikte van urotheel.

Resultaten

Het protocol dat in deze studie werd beschreven, stelde met succes een stabiele urethrale vernauwing bij ratten vast en toonde een hoge reproduceerbaarheid aan. De gemiddelde duur van de operaties was 20 minuten en er deden zich geen technische problemen voor tijdens de procedures. Urethrale monsters werden 4 weken na de ingreep met succes geoogst.

In de experimentele groep vertoonden de blazen van de ratten tekenen van overmatige uitzetting, in tegenstelling tot de controlegroep waar de blazen leeg waren (figuur 4). Deze waarnemingen wijzen op een significante verslechtering van de mictiefunctie van ratten na de experimentele modellering.

Vier weken na de operatie hadden de wondplaatsen zich ontwikkeld tot wasachtig wit littekenweefsel dat uit het oppervlak van de urethra stak (Figuur 5B), terwijl de urethrale secties in de controlegroep glad en lichtrood leken (Figuur 5A).

Histologisch onderzoek met hematoxyline en eosine (H&E) kleuring van de urethrale sectie toonde significante verdikking van het urotheel en aggregatie van lymfocyten. Bovendien identificeerde Masson-kleuring een uitgesproken roodachtig gebied van hyperplastisch en metaplastisch urethraal epitheelweefsel, vergezeld van ongeordende collageenvezels (zie aanvullende figuur S1 voor gedetailleerde afbeeldingen van Masson-kleuring), wat wijst op afwijkingen in de structuur van gladde spieren en collageenvezels (Figuur 6).

Immunofluorescentieanalyse van cryosecties toonde verhoogde TGF-β in het urethrale weefsel na de operatie (Figuur 7), wat suggereert dat de vorming van de urethrale structuur geassocieerd is met verhoogde expressie van TGF-β.

figure-results-1
Figuur 1: Belangrijkste instrumenten die zijn gebruikt om het Amerikaanse model vast te stellen. (A) Met teflon beklede katheter (0,6 x 1 mm); (B) resorbeerbare hechtingen (6-0), weefseltang, naaldtang en gladde pincet (van links naar rechts); (C) hoogfrequente elektrochirurgische pen en anale geleidende staaf; (D) het paneel van het elektrische mes met een hoge frequentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Voorbereidingen voor de operatie. (A) Scheer de onderste helft van de buik van de rat en sluit de anale geleidende staaf aan. (B-D) Illustreer de plaatsing van de urethrale katheter in de urethra. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Het elektroresectieproces. (A) Toont het ontstaan van een longitudinale incisie op de huid van de penis van 0,8 cm; (B) blootstelling van de urethra; (C) beschrijft de elektrosectie door alle lagen van de urethrale wand totdat de katheter in de urethra zichtbaar is. (D,E) Toont het verwijderen van de urethrale katheter en het herpositioneren van de penis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: De vulstatus van de blaas bij ratten onder anatomische omstandigheden. (A) Kenmerkt een lege blaas van ratten in de controlegroep; (B) vertoont een overvolle blaas van ratten in de experimentele groep. De blazen bevinden zich binnen de rode stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Macroscopische bevindingen van de gereseceerde urethrale monsters. (A) Het normale urethrale weefsel. (B) Het urethrale littekenweefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Resultaten van de histologie van de urethrale monsters. (A) Urethraal weefsel uit de controlegroep gekleurd met H&E (oorspronkelijke vergroting, 100x). (B) Masson's trichrome kleuring van een urethrale massa bij 100x oorspronkelijke vergroting. (C) Vergroting en de meetgegevens van de normale dikte van urotheel, die 85,9 μm is. Schaalbalk = 20 μm. (D) Toont H&E-kleuring van urethrale weefsel uit de experimentele groep bij 100x oorspronkelijke vergroting. (E) Toont Masson's trichrome kleuring van urethraal weefsel uit de experimentele groep, ook bij 100x oorspronkelijke vergroting. Schaalbalken = 100 μm. (F) Vergroting van het urethralitteken en de meetgegevens van verdikt urotheel-231,2 μm. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Immunohistochemische bevindingen op uitgesneden urethrale monsters. TGF-β-antilichaamlabeling benadrukt urotheelcellen; Een groene fluorescentie wordt uitgezonden bij binding van het antilichaam aan de cellen. (A-C) Vertoon een lagere signaalintensiteit in urotheelcellen van de controlegroep in vergelijking met (D-F) hogere signaalintensiteit in urotheelcellen van de experimentele groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Het hele beeld van Masson-kleuring van urethramonsters. (A) Masson-kleuring van de controlegroep; (B) Masson-kleuring van de experimentele groep. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De VS vormen een aanzienlijke last voor de gezondheidszorg met een aanzienlijke economische impact, die een negatieve invloed heeft op zowel het psychologische als het fysieke welzijn20. Er is nog steeds behoefte aan een behandeling die niet alleen de VS volledig geneest, maar ook herhaling effectief voorkomt.

In deze studie gebruikten we een rattenmodel om een eenvoudige en reproduceerbare methode te ontwikkelen voor het nabootsen van urethrale beschadiging bij patiënten, gevolgd door transurethrale chirurgie-geïnduceerde urethrale verwonding. Ratten hebben de voorkeur als diermodel omdat ze kosteneffectief en gemakkelijk te hanteren zijn, herhaalbaarheid bieden en betrouwbare gegevens leveren. Het rattenmodel dat in dit onderzoek is gebruikt, heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere modellen: het wordt vaak gebruikt in verschillende omics-analyses en is gemakkelijk te beheren. Bovendien maakt de gelijkenis in genexpressie van urinewegepitheelcellen tussen knaagdieren en mensen het Amerikaanse model van ratten bijzonder geschikt voor dieper onderzoek21.

Zoals te zien is in figuur 7, werd TGF-β tot expressie gebracht in de hele cirkel van de urethra, zowel in de controlegroep als in de experimentele groep, en de expressie van TGF-β in de experimentele groep was duidelijk hoger dan in de controlegroep. Eerder werk heeft gedocumenteerd dat de residente urotheelcellen na het letsel virtueel een fenotypische omschakeling naar myofibroblasten ondergaan, waarvan het proces voornamelijk wordt aangedreven door TGF-β, dat significante effecten heeft op de vorming van littekens door de productie van ECM (extracellulaire matrix), immuunmodulatie, celproliferatie, migratie en differentiatie te reguleren22,23. Onze bevinding suggereert dat de overexpressie van TGF-β de vorming van urethrale littekens kan bevorderen en dat de afscheiding van TGF-β niet beperkt is tot de aanwezige cellen in het wondoppervlak, maar de deelname van de hele urethra vereist.

De kleine diameter en kromming van de mannelijke raturethra vormen een uitdaging bij het detecteren van veranderingen in urodynamica na modellering. Er is een schaarste aan onderzoek naar methoden voor het beoordelen van de urinefunctie bij mannetjesratten. In deze studie gebruikten we indirecte methoden om veranderingen in de urinefunctie te observeren door de status van de blaasvulling 4 weken na de operatie te beoordelen. Bij het stimuleren van de mictiereflex toonde de observatie van de ontlede buik van de rat aan dat de experimentele groep een aanhoudende volheid van de blaas vertoonde, wat wijst op een significante verslechtering van de mictiefunctie na het modelleren. Deze bevindingen komen overeen met de klinische symptomen van moeilijk urineren die worden ervaren door patiënten met urethrale stenose24. Het ontwikkelen van methoden om fysiologisch onderzoek uit te voeren naar urinaire parameters bij mannelijke ratten, zoals mictiefrequentie, gemiddeld mictievolume en mictie-efficiëntie, blijft echter een uitdaging.

De keuze van modi en vermogensinstellingen van hoogfrequente elektrische messen heeft een kritische invloed op de mate van letsel bij chirurgische ingrepen. Deze studie introduceert een chirurgische techniek die zorgt voor een passend niveau van letsel, en een adequate mate van het hoogfrequente elektrische mes, dat 4 W is, voor het ontwikkelen van een Amerikaans model bij ratten. De meest gebruikelijke methode in Amerikaanse modellen bij ratten is het maken van incisies met een naald of scalpel25. Het gebruik van een scalpel heeft echter de neiging om de kans op continue bloedingen te vergroten vanwege het gladde oppervlak en de kleine diameter van de urethra van de rat, die onbedoeld de omliggende bloedvaten kunnen beschadigen.

Het hoogfrequente mes biedt een aanzienlijk voordeel door gelijktijdige hemostase te bieden door de toepassing van een stabiele en instelbare elektrische stroom op weefsels, waardoor de stabiliteit en het gemak van de procedure worden verbeterd. Bovendien maakt de beheersbaarheid van de vermogensinstelling een kwantificeerbare beoordeling van de toegebrachte schade mogelijk.

Een ideaal experimenteel protocol zou consequent urethrale wonden van uniforme grootte en diepte produceren. In deze studie werd de unipolaire gemengde snijmodus geselecteerd om urethraschade te veroorzaken. In tegenstelling tot de elektrocoagulatiemodus, die voornamelijk zorgt voor de vervluchtiging van vloeibare componenten, drogen, coagulatie van weefsels en afdichting van bloedvaten zonder weefselbreuk - wat leidt tot snelle weefselverschroeiing en hechting - maakt de snijmodus nauwkeurige, laag-voor-laag incisies in het penisweefsel mogelijk. Hoewel elektrocoagulatie vaak wordt gebruikt in Amerikaanse konijnenmodellen en extra stappen vereist, zoals het scheiden van de penis van het radium en het maken van incisies met andere chirurgische instrumenten26, wat het risico op trauma en complicaties bij dieren verhoogt, maakt de unipolaire gemengde snijmodus directe incisies in de voorhuid mogelijk om de urethra bloot te leggen. Deze methode verbetert de operationele efficiëntie en minimaliseert trauma voor de proefdieren.

De vermogensinstelling in de vorige studie was niet in detail gespecificeerd, omdat deze meestal afhangt van het gewicht van de proefdieren en het contactoppervlak tussen het elektronische mes en het weefsel. In deze studie waren de proefpersonen 6 maanden oude SD-ratten met een gewicht tussen 400 g en 500 g. Voor deze omstandigheden werd bepaald dat het optimale vermogen tussen 4-7 W lag, wat een nauwkeurige controle over de grootte en diepte van de incisie mogelijk maakte. We raden aan dat operators beginnen met een lager vermogen wanneer ze het hoogfrequente mes voor het eerst gebruiken om het Amerikaanse rattenmodel te ontwikkelen, en indien nodig aan te passen om de meest geschikte waarde voor verschillende omstandigheden te vinden.

Bovendien is een cruciale stap de katheterisatie van de urethra van de ratten voorafgaand aan de operatie. Succesvolle katheterisatie wordt bevestigd wanneer de katheter correct in de blaas is geplaatst. Hoewel de katheter als tijdelijke steiger dient, moet deze de positie van de urethra behouden en helpen bij het identificeren van de operatieplaats. De urethra van de mannelijke rat heeft een relatief kleine diameter en er is beperkte ruimte tussen de voorhuid en het penisweefsel, waardoor het gemakkelijk is om de katheter per ongeluk in de verkeerde opening in te brengen, wat latere procedures mogelijk bemoeilijkt. De juiste plaatsing van de katheter wordt gecontroleerd wanneer de urine naar buiten stroomt, wat aangeeft dat de katheter stevig in de blaas zit. Bovendien moet de gekatheteriseerde penis in een hoek van 45° worden geplaatst om de stabiliteit in de urethra te verbeteren en de chirurgische ingreep te vergemakkelijken.

Concluderend demonstreert deze studie een nieuwe, zeer effectieve en kostenefficiënte methode voor het creëren van een Amerikaans model bij ratten. Deze methode wordt gekenmerkt door zijn eenvoud, hoge slagingspercentage en stabiliteit en biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van een breed scala aan innovatieve behandelingen voor urethrale strictuur.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (nr. 2019A1515012116 en nr. 2022A1515012559).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
absorbeerbare hechtingen (6-0)KERONG COMPANYKR2230814
DierveiligheidsmatGeleverd door Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical ImagingNA
CaseViewer 2.43DHISTECH Ltd.
CarprofenSigma-AldrichMFCD00079028
CoraLite488-geconjugeerd Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)ProteintechSA00013-2
H&E KleursetAbcamab150669
 hoogfrequente elektrochirurgische unitBeijing Taktvoll Technology CompanyES-100v
Masson kleuringskitMerckHT15
naaldhouderRWD Life ScienceS15001-11
ParaffineolieNANA
gladde forcepsRWD Life ScienceF13019-12
Natrium pentobarbitalGuangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical ImagingNA
Sprague–Dawley ratGuangdong Medical Laboratory Animal CenterGDMLAC-035
hechtschaarRWD Life ScienceS15001-11
Teflon gecoate katheter (0,6 mm x 1 mm)DGZF new materials companyNA
TGF Beta 1 Polyklonaal antilichaamProteintech21898-1-AP
WeefselschaarRWD Life ScienceS13029-14

Referenties

  1. Rourke, K. F., et al. Canadian Urological Association guideline on male urethral stricture. Cuaj-Can Urol Assoc. 14 (10), 305-316 (2020).
  2. Cotter, K. J., et al. Prevalence of post-micturition incontinence before and after anterior urethroplasty. J Urol. 200 (4), 843-847 (2018).
  3. Bertrand, L. A., et al. Lower urinary tract pain and anterior urethral stricture disease: Prevalence and effects of urethral reconstruction. J Urol. 193 (1), 184-189 (2015).
  4. Mondal, S., Bandyopadhyay, A., Mandal, M. M., Pal, D. K. Erectile dysfunction in anterior urethral strictures after urethroplasty with reference to vascular parameters. Med J Armed Forces India. 72 (4), 344-349 (2016).
  5. Campos-Juanatey, F., et al. European association of urology guidelines on urethral stricture disease (part 2): Diagnosis, perioperative management, and follow-up in males. Eur Urol. 80 (2), 201-212 (2021).
  6. Hoy, N. Y., Chapman, D. W., Dean, N., Rourke, K. F. Incidence and predictors of complications due to urethral stricture in patients awaiting urethroplasty. J Urol. 199 (3), 754-759 (2018).
  7. Anger, J. T., Buckley, J. C., Santucci, R. A., Elliott, S. P., Saigal, C. S. Trends in stricture management among male medicare beneficiaries: Underuse of urethroplasty. Urology. 77 (2), 481-485 (2011).
  8. Milenkovic, U., Albersen, M., Castiglione, F. The mechanisms and potential of stem cell therapy for penile fibrosis. Nat Rev Urol. 16 (2), 79-97 (2018).
  9. European Association of Urology. EAU guidelines on urethral-strictures. , Available from: https://uroweb.org/guidelines/urethral-strictures (2023).
  10. Faydacı, G., et al. Comparison of two experimental models for urethral stricture in the anterior urethra of the male rabbit. Urology. 80 (1), 225.e7-225.e11 (2012).
  11. Yang, M., et al. Urine-microenvironment-initiated composite hydrogel patch reconfiguration propels scarless memory repair and reinvigoration of the urethra. Adv Mater. 34 (14), 210952(2022).
  12. Orabi, H., Aboushwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: A preclinical study. Eur Urol. 63 (3), 531-538 (2013).
  13. Sievert, K. -D., et al. Introducing a large animal model to create urethral stricture similar to human stricture disease: A comparative experimental microscopic study. J Urol. 187 (3), 1101-1109 (2012).
  14. Sievert, K. -D., et al. Urethroplasty performed with an autologous urothelium-vegetated collagen fleece to treat urethral stricture in the minipig model. World J Urol. 38 (9), 2123-2131 (2019).
  15. Hu, W. -F., Li, C. -L., Zhang, H. -P., Li, T. -T., Zeng, X. -Y. An experimental model of urethral stricture in rabbits using holmium laser under urethroscopic direct visualization. Urol Int. 93 (1), 108-112 (2014).
  16. Hua, X., et al. An experimental model of anterior urethral stricture in rabbits with local injections of bleomycin. Urology. 116, 230.e9-230.e15 (2018).
  17. Strittmatter, F., et al. Expression of fatty acid amide hydrolase (faah) in human, mouse, and rat urinary bladder and effects of faah inhibition on bladder function in awake rats. Eur Urol. 61 (1), 98-106 (2012).
  18. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  19. Castiglione, F., et al. Adipose-derived stem cells counteract urethral stricture formation in rats. Eur Urol. 70 (6), 1032-1041 (2016).
  20. Cheng, X., et al. The changing trend in clinical characteristics and outcomes of male patients with urethral stricture over the past 10 years in China. Front Public Health. 9 (794451), 1-8 (2021).
  21. Yu, Z., et al. Single-cell transcriptomic map of the human and mouse bladders. J Am Soc Nephrol. 30 (11), 2159-2176 (2019).
  22. Lichtman, M. K., Otero-Vinas, M., Falanga, V. Transforming growth factor beta (tgf-β) isoforms in wound healing and fibrosis. Wound Repair Regen. 24 (2), 215-222 (2016).
  23. Tatler, A. L., Jenkins, G. Tgf-β activation and lung fibrosis. Proc Am Thorac Soc. 9 (3), 130-136 (2012).
  24. Palminteri, E., et al. Contemporary urethral stricture characteristics in the developed world. Urology. 81 (1), 191-197 (2013).
  25. Hedlund, P., Streng, T., Lee, T., Andersson, K. -E. Effects of tolterodine on afferent neurotransmission in normal and resiniferatoxin treated conscious rats. J Urol. 178 (1), 326-331 (2007).
  26. Yao, H. -J., et al. Three new experimental models of anterior urethral stricture in rabbits. Transl Androl Urol. 11 (6), 761-772 (2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Rattenmodelurethraal letselhoogfrequent elektrisch meshistopathologische analyseurethrale beschadigingdesorganisatie van collageenvezelsinflammatoire infiltratie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen