Het DREAM-implantaat: een lichtgewicht, modulair en kosteneffectief implantaatsysteem voor chronische elektrofysiologie bij muizen die zich op het hoofd fixeren en zich vrij gedragen

Samenvatting

Hier introduceren we een lichtgewicht, kosteneffectief sonde-implantaatsysteem voor chronische elektrofysiologie bij knaagdieren, geoptimaliseerd voor gebruiksgemak, sondeherstel, experimentele veelzijdigheid en compatibiliteit met gedrag.

Samenvatting

Chronische elektrofysiologische opnames bij knaagdieren hebben ons begrip van neuronale dynamiek en hun gedragsrelevantie aanzienlijk verbeterd. De huidige methoden voor het chronisch implanteren van sondes vertonen echter sterke compromissen tussen kosten, gebruiksgemak, grootte, aanpassingsvermogen en stabiliteit op lange termijn.

Dit protocol introduceert een nieuw chronisch sonde-implantaatsysteem voor muizen, de DREAM (Dynamic, Recoverable, Economical, Adaptable en Modular), ontworpen om de compromissen te overwinnen die gepaard gaan met de momenteel beschikbare opties. Het systeem biedt een lichtgewicht, modulaire en kosteneffectieve oplossing met gestandaardiseerde hardware-elementen die in eenvoudige stappen kunnen worden gecombineerd en geïmplanteerd en veilig kunnen worden geëxplanteerd voor herstel en meervoudig hergebruik van sondes, waardoor de experimentele kosten aanzienlijk worden verlaagd.

Het DREAM-implantaatsysteem integreert drie hardwaremodules: (1) een microdrive die alle standaard siliciumsondes kan dragen, waardoor onderzoekers de opnamediepte kunnen aanpassen over een reisafstand van maximaal 7 mm; (2) een driedimensionaal (3D)-printbaar, open-source ontwerp voor een draagbare kooi van Faraday bedekt met koperen gaas voor elektrische afscherming, impactbescherming en plaatsing van connectoren, en (3) een geminiaturiseerd hoofdfixatiesysteem voor verbeterd dierenwelzijn en gebruiksgemak. Het bijbehorende operatieprotocol werd geoptimaliseerd voor snelheid (totale duur: 2 uur), sondeveiligheid en dierenwelzijn.

De implantaten hadden een minimale impact op het gedragsrepertoire van dieren, waren gemakkelijk toepasbaar in vrij bewegende en hoofdgefixeerde contexten, en leverden duidelijk identificeerbare spike-golfvormen en gezonde neuronale reacties gedurende weken van gegevensverzameling na implantatie. Infecties en andere complicaties van operaties waren uiterst zeldzaam.

Als zodanig is het DREAM-implantaatsysteem een veelzijdige, kosteneffectieve oplossing voor chronische elektrofysiologie bij muizen, waardoor het dierenwelzijn wordt verbeterd en meer ethologisch verantwoorde experimenten mogelijk worden. Het ontwerp vereenvoudigt experimentele procedures voor verschillende onderzoeksbehoeften, waardoor de toegankelijkheid van chronische elektrofysiologie bij knaagdieren tot een breed scala aan onderzoekslaboratoria wordt vergroot.

Inleiding

Elektrofysiologie met chronisch geïmplanteerde siliciumsondes is naar voren gekomen als een krachtige techniek voor het onderzoeken van neurale activiteit en connectiviteit bij zich gedragende dieren, met name bij muizen, vanwege hun genetische en experimentele^{traceerbaarheid.} Met name laminaire siliciumsondes hebben bewezen een hulpmiddel van onschatbare waarde te zijn voor het identificeren van functionele relaties binnen corticale kolommen² en voor het relateren van de dynamiek van grote neuronale populaties aan gedrag op een manier die voorheen onmogelijk was³.

Twee complementaire benaderingen zijn de huidige gouden standaarden voor het registreren van neurale activiteit in vivo: twee-fotonmicroscopie ^4,5 en extracellulaire elektrofysiologie⁶. De keuze van de registratiemethodologie beperkt de aard van de uitlezingen die kunnen worden verkregen: twee-fotonmicroscopie is bijzonder geschikt voor longitudinale studies van individueel identificeerbare neuronen in grote populaties in de loop van de tijd, maar lijdt aan hoge apparatuurkosten en is beperkt tot oppervlakkige lagen van de cortex in intacte hersenen. Bovendien beperkt de typische temporele resolutie van ~30 Hz het vermogen om voortdurende neuronale dynamiek vast te leggen ^7,8.

Elektrofysiologische opnames daarentegen bieden een hoge temporele resolutie (tot 40 kHz) om neuronale activiteit van moment tot moment te volgen, kunnen op grote schaal worden toegepast op soorten en op corticale diepten, en hebben relatief goedkope opstellingen in vergelijking met twee-fotonmicroscopie. De identificatie van individuele neuronen, evenals het longitudinaal volgen van neuronale populaties, zijn echter moeilijk te bereiken. Dit geldt in het bijzonder voor draadelektroden, bijv. tetroden, en voor acute elektrode-inserties. Naast het ontbreken van het vermogen om neuronen te volgen tijdens opnamesessies⁹, veroorzaken herhaalde acute inserties lokaal trauma¹⁰ dat een immuunrespons opbouwt¹¹, waardoor de kans op infectie en gliose toeneemt. Dit vermindert uiteindelijk de stabiliteit van de geregistreerde neuronale activiteit en de levensverwachting van proefdieren, waardoor de reikwijdte van longitudinale studies met acute elektrofysiologische opnames wordt beperkt tot slechts enkele dagen¹².

Chronische opnames van siliciumsondes met hoge dichtheid zijn bedoeld om enkele van de beste eigenschappen van acute elektrofysiologie en beeldvorming met twee fotonen te combineren. Ze kunnen de dynamiek van de neurale populatie tijdens sessies volgen met slechts een enigszins verminderd vermogen om individuele neuronen te identificeren in vergelijking met beeldvorming met twee fotonen¹³. Deze opnames bieden een hoge flexibiliteit in de ruimtelijke plaatsing en nauwkeurige temporele resolutie van de opgenomen signalen, evenals een verbeterde levensduur en welzijn van proefdieren in vergelijking met acute opnames¹⁴. Bovendien vereist chronische elektrofysiologie, in tegenstelling tot acute opnames, slechts een enkele implantatiegebeurtenis, waardoor het risico op infectie en weefselbeschadiging effectief wordt verminderd en de stress voor de dieren wordt geminimaliseerd¹⁵. Samen maken deze voordelen chronische elektrofysiologie tot een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de organisatie en functie van het zenuwstelsel.

Veelgebruikte chronische implantatietechnieken voor muizen beperken onderzoekers echter om aanzienlijke afwegingen te maken tussen compatibiliteit met gedragsregistraties, implantaatgewicht, reproduceerbaarheid van implantaten, financiële kosten en algeheel gebruiksgemak. Veel implantaatprotocollen zijn niet ontworpen om het hergebruik van sondes¹⁶ te vergemakkelijken, waardoor de effectieve kosten van individuele experimenten sterk stijgen en het voor sommige laboratoria financieel moeilijk wordt om chronische elektrofysiologie te gebruiken. Ze vereisen ook vaak uitgebreid in-house prototyping- en ontwerpwerk, waarvoor de expertise en middelen mogelijk niet aanwezig zijn.

Aan de andere kant bieden geïntegreerde implantaatsystemen¹⁷ een breder toegankelijke oplossing voor chronische elektrofysiologie bij knaagdieren. Deze systemen zijn ontworpen om een microdrive die de sonde vasthoudt te integreren met de rest van het implantaat om het hanteren van implantaten en chirurgische ingrepen te vereenvoudigen. Eenmaal geïmplanteerd, kunnen dergelijke systemen echter topzwaar zijn en het vermogen van de onderzoeker beperken om een experiment flexibel aan te passen aan verschillende doelcoördinaten. Hun gewicht sluit vaak implantaten bij kleinere dieren uit, belemmert mogelijk de beweging van dieren en veroorzaakt stress¹⁸. Dit kan een onevenredige invloed hebben op onderzoek naar juveniele en vrouwelijke cohorten, aangezien gewichtsbeperkingen deze groepen waarschijnlijk meer treffen.

Bovendien maken niet alle geïntegreerde systemen het mogelijk om de elektrodeposities na implantatie aan te passen. Dit is relevant, omdat gliose of littekens als gevolg van het inbrengen van de sonde¹⁹, vooral in de eerste 48 uur na implantatie²⁰, de kwaliteit van de geregistreerde neuronale activiteit kunnen verminderen. Micro-aanpassingen aan de insteekdiepte van de sonde kunnen deze negatieve effecten op de signaalintegriteit beperken. Daarom kunnen micropositioneringsmechanismen, gewoonlijk microdrives genoemd, nuttig zijn, zelfs in sondes met een groot aantal elektroden verdeeld over hun lengte.

Om dergelijke compromissen te overwinnen, introduceren we een nieuw chronisch elektrofysiologisch implantaatsysteem voor muizen dat de beperkingen van eerdere ontwerpen aanpakt door een lichtgewicht, kosteneffectieve en modulaire oplossing te bieden. Het DREAM-implantaatsysteem is ontworpen om minder dan 10% (~2,1 g) van het typische lichaamsgewicht van een muis te wegen, waardoor dierenwelzijn en minimale impact op het gedrag worden gegarandeerd. Validatie van het DREAM-implantaatontwerp toont een minimale impact op belangrijke gedragsstatistieken zoals voortbeweging - die bij knaagdieren aanzienlijk kunnen worden beïnvloed wanneer er belasting op de schedel wordt geplaatst. Dit kan ten goede komen aan experimentele paradigma's die gebruik maken van vrij bewegende en met het hoofd gefixeerde dieren door het welzijn van dieren te stimuleren en meer ethologisch verantwoorde experimenten mogelijk te maken.

Het systeem omvat een microdrive voor flexibele aanpassing van de opnamediepte tot 7 mm en kan worden aangepast aan verschillende soorten sondes en opnameapparatuur, waardoor onderzoekers een kosteneffectief en veelzijdig hulpmiddel krijgen voor verschillende experimentele toepassingen. Het systeem wordt routinematig gecombineerd met een metalen microdrive²¹, die een consistente sondeterugwinning biedt in vergelijking met andere systemen (verwacht gemiddeld herstelpercentage: ca. drie betrouwbare hergebruiken per sonde) en de kosten van individuele experimenten drastisch verlaagt.

Het ontwerp is voorzien van een 3D-geprinte beschermende kooi van Faraday, die goedkope maar robuuste bescherming biedt tegen elektrofysiologische ruis, mechanische schokken en infectieuze materialen, waardoor stabiele en ruisvrije opnames mogelijk zijn die last hebben van minimale infectiepercentages. Deze implanteerbare kooi bestaat uit de zogenaamde 'kroon', ontworpen voor bescherming tegen stoten en om structuur te bieden voor de geleidende metalen gaascoating van de kooi van Faraday, en de kroonring, die dient als houder voor een implanteerbare versterker en/of sondeconnector (zie figuur 1).

Ten slotte zijn de kopplaten in het modulaire implantaatsysteem ontworpen om compatibel te zijn met een nieuw, efficiënt hoofdfixatiesysteem zonder extra volume aan het implantaat toe te voegen. In tegenstelling tot andere bestaande systemen is het niet nodig om kleine schroeven dicht bij het implantaat aan te draaien, waardoor de fixatie van muizen in de experimentele opstelling wordt versneld en de relatie tussen experimentator en dier wordt verbeterd, evenals de gedragstherapietrouw. Tegelijkertijd wordt de kopplaat gebruikt als basis waarop de andere modules van het DREAM chronische elektrofysiologiesysteem worden gebouwd.

Ontwerpbestanden voor het DREAM-implantaat worden als open-source hardware op https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ gepubliceerd. In de volgende paragrafen wordt het ontwerp en de fabricage van het DREAM-implantaatsysteem beschreven, wordt de succesvolle implementatie ervan in een muismodel gedemonstreerd en worden de mogelijke toepassingen en voordelen ten opzichte van bestaande systemen besproken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van de Max Planck Society en goedgekeurd door de ethische commissie van de lokale overheid (Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, Projectgoedkeuringscode: F149-2000).

Figuur 1: Implantaatontwerp. (A) 3D-weergave van het implantaat dat op een muizenschedel is geplaatst met een siliciumsonde die is aangesloten op een sondeconnector. De centrale opening van de kopplaat is ongeveer 10 mm voor schaal. De hoogte van de aandrijving is ongeveer 17 mm. Het koperen gaas dat de buitenkant van de Faraday-kroon vormt, evenals de aarde/ref-draden, wordt niet getoond. (B) Hetzelfde als (A) met een aansluiting op een versterkerkaart in plaats van een sondeconnector. (C) Geëxplodeerde technische tekening van het implantaat, met de componenten ervan. (D) Weergave van een schuine afstandhouder die onder een microdrive kan worden geïmplanteerd, waardoor de microdrive consistent onder een vooraf bepaalde hoek kan worden geïmplanteerd (hier: 20°). (E) Weergave van een geïntegreerd kopfixatiemechanisme, met de geïmplanteerde kopplaat met Faraday-kroon met de omringende kopfixatieklem en de zwaluwstaartverbinding met de opstelling. (F) Afbeelding van het hoofd van de muis dat op een loopband is bevestigd met behulp van het geïntegreerde hoofdfixatiemechanisme van het implantaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: In de hoofdstukken 1 en 2 worden de preoperatieve voorbereidingen besproken

1. Voorbereiding van de siliciumsonde

1. In geval van hergebruik van de sonde, reinigt u de siliconensonde volgens de aanbevelingen van de sondeleverancier. Week de sonde 5-10 minuten in enzymatische reiniger (zie Materiaaltabel) en spoel hem vervolgens af in gedemineraliseerd water. Doe dit zo snel mogelijk na explantatie. Week de sonde een dag voor de (her)implantatie minimaal 30 minuten in 70% ethanol voor desinfectie.
2. Meet de kanaalimpedanties om er zeker van te zijn dat ze binnen de specificaties van het opgenomen signaal vallen. Volg het protocol voor het testen van ruisniveaus uit de gebruikershandleiding van Neuropixels²², meet de impedantie via de gewenste opnamesoftware (bijv. https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing) en volg de impedanties van het doelkanaal van de fabrikant van de siliciumsonde of het gegevensblad. Als de impedanties te hoog zijn, overweeg dan om de elektrodeplaatsen opnieuw te coaten²³.
3. Soldeer een 0.05" soldeerstaartbus (zie Tabel met materialen) aan de massa (GND) draad van de sonde. Sluit de aansluiting aan op de GND-pin (volgende stap) tijdens de operatie.
   OPMERKING: In dit protocol wordt geen aparte referentie (REF) pin gebruikt, aangezien GND en REF worden kortgesloten op de gebruikte headstage. Daarom zal in de rest van het protocol alleen de GND-pin worden vermeld. Als er een aparte REF wordt gebruikt, herhaalt u de volgende stap voor de REF-pin.
4. Om de GND-pin voor te bereiden, steekt u herhaaldelijk de penzijde van een 0.05" soldeerstaartdop (zie Materiaaltabel) in de GND 0.05" soldeerstaartmop totdat het inbrengen grotendeels moeiteloos is. Het gebruik van vergulde pinnen kan de noodzaak van deze gladstrijkstap verminderen. Dit zorgt ervoor dat de GND-pen en -mof tijdens de operatie gemakkelijk kunnen worden aangesloten zonder dat er overmatige druk hoeft te worden uitgeoefend, waardoor het risico op verwondingen bij het dier en sondeschade wordt verkleind.
5. Als een implanteerbare voorversterker voor de siliciumsonde wordt gebruikt, bereid deze dan voor op chronische implantatie volgens de procedures van de leverancier. Bevestig vervolgens de versterker/connector aan de ring van de Faraday-kooi door deze met siliconenpleister vast te lijmen aan het gebied van de Faraday-ring dat is ontworpen om de versterker vast te houden (zie afbeelding 1).
   OPMERKING: Het voorbereiden van de implanteerbare voorversterker voor de siliciumsonde voor chronische implantatie volgens de procedures van de leverancier kan inhouden dat ze worden bedekt met silicium of epoxy om te voorkomen dat vocht de elektronica beschadigt, evenals het herhaaldelijk koppelen van de versterkerconnector om de koppelingskracht te verminderen bij het aansluiten van de versterker op het opnamesysteem tijdens opnames. Dit is vooral handig voor gebruikers van Omnetics.

2. Voorbereiding van de microdrive en de hoofdband

1. Draai de schroef op de behuizing van de microdrive zodat de microdrive-shuttle bijna volledig naar boven is ingetrokken.
2. Bevestig eventueel een schuine afstandhouder (zie afbeelding 1D) aan de onderkant van de microdrive met cyanoacrylaatlijm of tandheelkundig cement, die kan worden gebruikt om een specifieke mate van kanteling mogelijk te maken, bijvoorbeeld bij opname door corticale lagen in een gebied binnen de centrale sulcus, of binnen diepe structuren die een niet-loodrechte benadering vereisen (voor schuine afstandhouder, zie Tabel met materialen).
3. Leg de microdrive horizontaal op de microdrive-houder (aanvullende afbeelding 1).
4. Plaats een klein stukje zelfklevende stopverf (zie Materiaaltabel) op de microdrive-houder op een afstand boven de microdrive waarop de hoofdstageconnector wordt geplaatst. Deze afstand is afhankelijk van de lengte van de flexkabel die de silicium sonde verbindt met de headstage connector.
5. Plaats een klein druppeltje siliconenpleister (zie Tabel met materialen) op de shuttle.
6. Haal de siliconensonde uit de verpakking met behulp van een botte pincet met zachte punt. Maak deze door een standaard pincet met naaldneus te coaten met krimpkous met een diameter van 3 mm (zie Materiaaltabel). Plaats de sonde met de flexkabel eerst op de shuttle van de microdrive zodat de onderkant van de flexkabel iets over de onderkant van de microdrive shuttle hangt.
7. Trek de flexkabel voorzichtig naar de bovenkant van de microdrive totdat de onderkant van de flexkabel de onderkant van de microdrive-shuttle raakt. Zorg ervoor dat u tijdens deze stap de flexkabel tegen de linkerrand van de microdrive-shuttle duwt, zodat deze aan het uiteinde precies verticaal op de microdrive wordt geplaatst. Zorg er op dit punt voor dat de schachten van de siliconensonde niet (of slechts minimaal) voorbij de onderkant van de microdrive uitsteken (afhankelijk van de exacte lengte van de sondeschachten en de diepte van het beoogde hersengebied).
8. Plaats de hoofdfaseconnector van de sonde op de zelfklevende stopverf aan de bovenkant van de houder om te voorkomen dat de sonde eraf valt.
9. Gebruik een injectienaald van 27 G om een klein druppeltje cyanoacrylaatlijm (zie Materiaaltabel) tussen de flexkabel en de shuttle aan te brengen om de sonde op zijn plaats te houden. Zorg ervoor dat de lijm niet op de microdrive of langs de flexkabel voorbij de shuttle loopt (dit is erg belangrijk)
10. Zodra de flexkabel op zijn plaats is gelijmd, bevestigt u de amplifier aan de kroonring (zie Tabel met materialen) met behulp van siliconenpleister. Bevestig vervolgens de flexkabel aan de amplifier en bedek de aansluiting en kabel met een dunne laag siliconenpleister.
11. Na 5 minuten, wanneer de pleister is uitgehard, bergt u de microdrive en sonde veilig op tot verder gebruik.
12. Snijd stukjes koperen gaas (zie Tabel met materialen) in een open donutvorm (zie snijpatroon in aanvullende figuur 2) om de kooi van Faraday te bedekken.
13. Bevestig de uitsparing van het koperen gaas op de kooi van Faraday met kleine druppels epoxyhars (zie Tabel met materialen). Voor deze stap kan men ook epoxy vervangen door tandheelkundig cement.
    OPMERKING: De kooi van Faraday bevat een ruimte om een sondeconnector of versterker te huisvesten. Deze ruimte is gemarkeerd met een X in het ontwerpbestand en bevat een ondersteunende basis voor de versterker/connector, evenals een grotere afstand tussen de twee aangrenzende spaken van de kooi. Om voldoende ruimte rond de versterker/connector te creëren, bevestigt u een kleine hoeveelheid extra gaas tussen de twee aangrenzende spaken, zodat er een uitsteeksel ontstaat. Dit zorgt ervoor dat de versterker/connector later in deze 'pocket' kan worden geplaatst zonder de kooi van Faraday aan te raken. Om een veilige hechting met minimale vervorming te garanderen, gebruikt u de kroonring die direct op de kroon is geplaatst om de vorm te behouden en de dunne spaken van de kroon te ondersteunen. Gebruik bovendien soldeerhelpende handen om de kroon en het gaas vast te zetten tijdens het drogen. Als men moeite heeft om de vorm van de kroon te behouden tijdens het ondergaan van de procedure, probeer dan slechts twee van de kroonarmen tegelijk te epoxy om kromtrekken te voorkomen.
14. Als afzonderlijke aarding van de kooi van Faraday gewenst is, soldeer dan een kleine koppen op een aardingsdraad van 30 mm (zie Materiaaltabel) en gebruik vervolgens geleidende epoxy om de draad aan de uitsparing van het koperen gaas te bevestigen.
    OPMERKING: Deze stap wordt in het lab niet gevolgd.
15. Bewaar op dit punt de voorbereide onderdelen veilig en voer in een later stadium een operatie uit.
    OPMERKING: In de hoofdstukken 3-6 wordt de implantatie van de microdrive en het hoofddeksel besproken.

3. Chirurgie: voorbereiding van sonde en werkruimte

1. Steriliseer chirurgische instrumenten en plaats ze in de chirurgische werkruimte volgens een goedgekeurde procedure.
   OPMERKING: Dit kan het gebruik van een kralensterilisator, autoclaafinstrumenten of spoelen met 30% peroxide of 90% ethanol omvatten, afhankelijk van het goedgekeurde experimentele protocol.
2. Plaats de keramische schaal die wordt gebruikt om het tandcement te bereiden in een koelbox, koelkast of vriezer volgens de instructies in de tandheelkundig cementkit (zie Materiaaltabel). Gebruik de gekoelde keramische schaal tijdens het mengen van cement om de tijd dat het cement kneedbaar is te verlengen. Gebruik een afgekoelde schaal wanneer langere cementeerstappen nodig zijn.
3. Als histologische verificatie van de plaatsing van de sonde aan het einde van het experiment gewenst is, verleng dan de siliconensonde vlak voor de operatie door de schroef op de microdrive tegen de klok in te draaien en breng een lipofiele kleurstof (zie Materiaaltabel) aan op de sonde door deze in een kleine druppel van de kleurstof te dopen. Bereid de lipofiele kleurstof voor uit een in de handel gekochte verdunde dimethylsulfoxide (DMSO) of ethanol (EtOH) verdunde stockoplossing (zie materiaaltabel) door deze te verdunnen in een geschikte buffer zoals PBS met een concentratie van 1-5 μM.

4. Chirurgie: Voorbereiding van het dier

1. Volg een goedgekeurd anesthesieprotocol voor een 2-4 uur durende knaagdierchirurgie onder aseptische omstandigheden. Dit kan algemene en lokale anesthesie, analgesie, toepassing van oogzalven en injecties met zoutoplossing omvatten. Gebruik hier injecteerbare anesthesie (ketamine 100 [mg/kg]/medetomidine 0,5 [mg/kg]) samen met lokale analgesiecrème en oogzalf (zie materiaaltabel) en plaats het dier op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur te reguleren.
2. Wanneer het dier volledig verdoofd is, verplaats het dan naar een aparte, niet-steriele scheerruimte.
   1. Zorg ervoor dat het dier voldoende wordt opgewarmd; Plaats hem bijvoorbeeld op een verwarmingskussen. Verwijder haar op de bovenkant van de schedel. Doe dit met een elektrisch scheerapparaat of ontharingscrème (zie Materiaaltabel) of door de bovenkant van het hoofd herhaaldelijk te scheren met een scalpel bedekt met 70% ethanol.
   2. Verwijder losse haren voorzichtig om ervoor te zorgen dat ze later niet in contact komen met blootliggend weefsel. Gebruik voor het verwijderen van haren bijvoorbeeld tissues die bevochtigd zijn met 70% ethanol en/of een knijpbalpomp. Als u ontharingscrème gebruikt, zorg er dan voor dat deze grondig wordt verwijderd met wattenstaafjes en zoutoplossing.
3. Desinfecteer het geschoren gebied meerdere keren met een ontsmettingsmiddel op basis van jodium (zie Materiaaltabel) en alcohol met behulp van wattenstaafjes, beweeg van het midden van het hoofd naar de zijkanten om eventuele resterende losse haren weg te borstelen van de incisieplaats.
4. Ontsmet de vacht op en rond het hoofd met betadine. Dit zorgt voor een steriel werkgebied en beschermt chirurgische instrumenten en materialen tegen contact met niet-steriele vacht.
5. Plaats het dier in een stereotactisch kader met behulp van oorstangen en neushouder (zie Materiaaltabel).
6. Knip met een kleine chirurgische schaar (zie Materiaaltabel) een amandelvormige opening in de huid bovenop de schedel af, die zich uitstrekt van alleen de achterkant van de lambdahechting tot tussen de ogen.
7. Verwijder het onderhuidse membraan en het periosteum door weg te snijden terwijl het nog nat is, en krab vervolgens de schedel met een scalpelmesje om zacht membraanweefsel op het schedeloppervlak te verwijderen dat de hechting van tandheelkundig cement kan belemmeren.
8. Optioneel: Zodra de schedel is ontdaan van membraanweefsel, brengt u kort een dunne laag 0,5% peroxide aan en wast u deze af met een jodiumdesinfectiemiddel op waterbasis (bijv. Betadine) voordat u het oppervlak van de schedel opruwt om de hechting van de primer aan de schedel te verbeteren.
9. Ruw het oppervlak van de schedel voorzichtig op door een kriskras patroon te krassen met de punt van het scalpel ondersteboven. Dit helpt tandheelkundig cement om later aan de schedel te hechten.
   OPMERKING: Krab niet te krachtig op de hechtingen, omdat hierdoor de hechtingen kunnen scheuren en intracraniale vloeistof kunnen lekken, wat de hechting van het tandcement schaadt.
10. Wissel af tussen een scalpelmesje en steriele wattenstaafjes om de nekspieren die aan de zijkanten van de lambdahechting zijn bevestigd voorzichtig weg te krabben/weg te duwen totdat de spieren zijn teruggeduwd naar de 'rand' van de schedel bovenop het cerebellum. Dit helpt om spierruis bij neuronale opnames te minimaliseren.
11. Vul een spuit van 1 ml met een naald van 27 G (zie Materiaaltabel) met kleine hoeveelheden chirurgische cyanoacrylaatlijm (zie Materiaaltabel). Lijm vervolgens de huid met de spuit aan de randen van de schedel om er kleine druppeltjes superlijm overheen te smeren. Lijm weefsel zo plat mogelijk op de schedel om ruimte te laten voor implantaten. Deze procedure zorgt ervoor dat huid en spieren niet in direct contact komen met delen van het implantaat, waardoor spierruis bij opnames wordt vermeden en de hechting van het tandcement wordt verbeterd.
12. Breng tandcementprimer aan over de schedel voor extra hechting en hard uit met UV-licht (zie Materiaaltabel). Dit verbetert de hechting van tandheelkundig cement en voorkomt dat schedelhechtingen gaan lekken en de craniaal-cementverbinding na verloop van tijd verzwakken.
13. Zoek de doellocatie voor de sonde-implantatie ten opzichte van bregma of lambda en schets de craniotomie eromheen met een chirurgische marker. Plaats de hoofdplaat op de schedel zodat de craniotomie erin ligt, met ruimte voor de microdrive aan één kant van de craniotomie, evenals voor 1-2 aardingspennen.
14. Implanteer de kopplaat met tandheelkundig cement. Meng tandheelkundig cement in de daarvoor bestemde gekoelde keramische schaal (zie stap 3.2). Zorg ervoor dat de hoofdplaat aan alle kanten aan de schedel hecht en een waterdichte 'put' vormt.
15. Boor met een tandboor (maat US 1/2 HP) een klein braamgat ter breedte van de in stap 1.4 voorbereide koppennen over het (de) hersengebied(en) die als GND/REF moeten worden gebruikt. Als het aarden van de kooi van Faraday gewenst is, boor dan nog een klein braamgat dicht bij de rand van de kooi van Faraday voor de pin van de Faraday-GND-header.
    OPMERKING: Plaats voor de GND/REF-headerpen(en) de craniotomie op voldoende afstand van de rand van de kooi, zodat de headerpen zelf er later in kan worden geplaatst zonder de kooi van Faraday aan te raken.
16. Reinig de craniotomie door er voorzichtig steriele zoutoplossing op te druppelen met een spuit en deze te verwijderen met niet-vervellende doekjes (zie Materiaaltabel). Herhaal dit totdat al het bloed en losse weefsel is verwijderd.
17. Bereid een 0,7% agar-oplossing (zie Materiaaltabel) in zoutoplossing, koel deze iets af en breng deze in de craniotomie met behulp van een naald van 27 G op een spuit van 1 ml.
18. Steek voorzichtig een GND-pen (zie stap 1.3) in elke craniotomie die in de vorige stap is geboord. De pin(s) worden aan alle kanten omgeven door agar (zie stap 4.17). Breng cement aan rond de koppennen om ze vast te zetten en elektrische isolatie te bieden.
19. Maak de keramische schaal schoon en plaats deze terug in de koelkast/vriezer.
20. Boor met een tandartsboor de omtrek van een grotere craniotomie (rond of vierkant) door in gestage bewegingen langs de rand te bewegen. Zorg ervoor dat de craniotomie 1 mm x 1 mm tot 2 mm x 2 mm is om kleine aanpassingen aan de plaatsing van de sonde mogelijk te maken om bloedvaten te vermijden zonder te veel van de cortex bloot te leggen. Vermijd indien mogelijk het plaatsen van craniotomieën over hechtingen. Boor in rondes van 20-30 s en koel de schedel af met zoutoplossing tussen de boorrondes door.
    OPMERKING: Wanneer u begint met boren, is het handig om de voorrand van de microdrive af te tekenen met een stift, zodat er bij het boren een rechte rand kan worden gevormd die parallel loopt aan de voorrand van de microdrive. Dit vergroot de kans om cement in de craniotomie te vermijden bij het bevestigen van de microdrive op zijn plaats, evenals het verbeteren van de hechting, het voorkomen van overhang van de microdrive over de craniotomie en het mogelijk maken van een grotere zijdelingse manoeuvreerbaarheid bij het plaatsen van de microdrive ten opzichte van de uiteindelijke positie van de opnameplaats.
21. Test na een paar eerste boorrondes de weerstand van het uitgeboorde deel van het bot door er voorzichtig op te drukken met een fijne pincet (maat 5 of fijner; zie Materiaaltabel).
    1. Blijf tussen de boorrondes door testen totdat het bot onder de tang begint te 'stuiteren' wanneer het wordt geduwd. Als dit het geval is, voeg dan een druppel zoutoplossing toe aan de craniotomie om het bot zachter te maken en gebruik vervolgens de tang om het uitgeboorde stuk bot voorzichtig te verwijderen.
    2. Als het bot niet voorzichtig kan worden verwijderd, doe dan nog een ronde boren, waarbij u zich concentreert op de punten waar het bot nog sterker vastzit. Probeer in het algemeen de schedel met lichte druk van de tang te verwijderen voordat deze volledig is doorboord, omdat dit doorgaans weefselbeschadiging minimaliseert.
       NOTITIE: Zorg ervoor dat het oppervlak van de dura regelmatig wordt bevochtigd, zowel tijdens het boren om de temperatuur te verlagen als na het verwijderen van de botflap. Dit vergroot de kans op het gemakkelijk inbrengen van de sonde door te voorkomen dat de dura uitdroogt en moeilijker te penetreren wordt. Als de dura te taai blijkt te zijn om door te dringen, of als er stompe sondes of sondes met meerdere schachten worden gebruikt, wordt een durotomie uitgevoerd door de dura op te tillen met een naald van 27 G en een kleine incisie uit te voeren onder onderdompeling in zoutoplossing om te voorkomen dat de dura aan het hersenoppervlak blijft plakken.
22. Bedek de craniotomie met een hemostatische spons (zie Materiaaltabel) gedrenkt in koele, steriele zoutoplossing om de dura en de hersenen te beschermen.

5. Chirurgie: Sonde-implantatie

1. Bevestig de op maat gemaakte microdrive-houder (zie Materiaaltabel) aan de arm van het stereotactische apparaat. Als de microdrive na de voorbereiding van de microdrive uit de microdrive-houder is verwijderd, plaatst u de microdrive met de aangesloten siliconen sonde in de microdrive-houder. Kantel de stereotaxi-arm naar wens om het gewenste doelhersengebied te bereiken. Plaats de kroonring met de aangesloten amplifier op de drie verticale pinnen aan de achterkant van de microdrive-houder (zie aanvullende afbeelding 1).
2. Laat de microdrive zakken tot op ~0.5 mm van de craniotomie en gebruik vervolgens een pincet om de GND/REF-headerpen(en) die aan de sonde zijn bevestigd aan te sluiten op de overeenkomstige GND/REF-pen(en) die op de schedel zijn geïmplanteerd (zie stappen 4.14-4.15). Zie aanvullende afbeelding 3 en aanvullende afbeelding 4 voor voorbeelden van aandrijving, craniotomie en plaatsing van GND/REF-pen.
3. Eenmaal op hun plaats, zet je de pen(s) optioneel vast met een druppel geleidende zilverepoxy (zie Materiaaltabel) voor een robuustere verbinding. Zodra zilverepoxy is uitgehard, bedek u de verbonden pinnen met een kleine hoeveelheid tandheelkundig cement (zie Materiaaltabel) om ervoor te zorgen dat de verbinding gedurende lange perioden stabiel blijft en dat er geen elektrische verbinding is met de omliggende weefsels en/of implantaatelementen.
4. Verwijder de hemostatische spons van de craniotomie (zie stap 4.22).
5. Plaats de stereotactische arm met de microdrive over de craniotomie.
   OPMERKING: Als de sonde is ingetrokken, zorg er dan voor dat de microdrive zo wordt geplaatst dat de sonde een deel van de craniotomie raakt dat geen grote bloedvaten bevat.
6. Laat de microdrive indien nodig zakken door de locatie en hoek aan te passen totdat de sondeschacht de dura of het hersenoppervlak raakt (zie stap 4.21) in het doelgebied.
7. Meng tandheelkundig cement in de daarvoor bestemde keramische schaal (zie stap 3.2) en cementeer de basis van de microdrive op zijn plaats, waarbij u zich concentreert op de drie zijden van de microdrive-basis die niet naar de elektrode zijn gericht. Zorg ervoor dat het cement de microdrive boven de verwijderbare 'basis' niet raakt (zie afbeelding 1D).
   1. Zorg ervoor dat alle ruimte tussen de basis en de schedel volledig bedekt is met tandheelkundig cement. Maak de keramische schaal schoon en zet deze terug in de koelkast/vriezer. Wacht tot het cement is uitgehard, ongeveer 10-15 minuten.
      OPMERKING: Er wordt een kleine opening gelaten tussen de basis van de microdrive en de schedel en het cement wordt in de meest vloeibare vorm gebruikt om het te vullen. Zodra het cement iets is ingedikt, wordt het cement tussen de wanden van de microdrive-basis en de schedel opgebouwd. Er worden altijd zeer kleine hoeveelheden cement gebruikt, omdat de stroom van de stof onvoorspelbaar kan zijn en grotere volumes naar ongewenste regio's kunnen stromen. Kleine hoeveelheden hemostatische spons gedrenkt in zoutoplossing kunnen worden gebruikt om delen van de craniotomie te bedekken. Als cement per ongeluk op de craniotomie stroomt, verwijder het cement dan met een tang zodra het een filmachtige consistentie krijgt.
8. Laat de siliciumsonde op de hersenen zakken en houd de positie van de sonde zorgvuldig in de gaten door een microscoop. Wanneer de sondeschachten de hersenen raken, laat u de sonde snel met ~250 μm zakken (één volledige omwenteling van de schroef is 282 μm) om ervoor te zorgen dat de sonde de weerstand van het dura/corticale oppervlak doorbreekt.
   1. Controleer dit visueel. Als de sonde niet in de cortex is doorgebroken, wacht dan 5 minuten en probeer dan met de schachtpunt door de dura te etsen door de sonde herhaaldelijk enkele tientallen micrometers omhoog en omlaag te brengen terwijl de dura/cortex onder spanning staat van de sondepunt.
9. Zodra de sonde door het oppervlak van de cortex is gebroken, laat u deze geleidelijk in een langzamer tempo (100-200 μm /min) zakken totdat de doelcoördinaten zijn bereikt of de sonde meer dan 1000 μm heeft bewogen. Als het doel vereist dat de sonde meer dan 1000 μm beweegt, beweegt u de sonde in stappen van maximaal 1000 μm/sessie over de volgende opnamesessies totdat de doelcoördinaten zijn bereikt.
   OPMERKING: Sla deze stap over als het monitoren van neuronale signalen tijdens het laten zakken van de siliciumsonde de voorkeur heeft. De stappen hiervoor worden beschreven in hoofdstuk 7.
10. Bereid siliconenelastomeer volgens de instructies (zie Materiaaltabel) en doseer een kleine druppel in de craniotomie met behulp van een spuit van 1 ml (zie Materiaaltabel).
11. Eenmaal droog, bedek je het siliconenelastomeer met een 50/50 mix van botwas en minerale olie. Deze stap beschermt de sonde verder en voorkomt de ophoping van vuil en droog plasma over de craniotomie, waardoor extractie eenvoudiger en veiliger wordt. Wees voorzichtig, want werken rond de sonde terwijl deze is neergelaten, kan leiden tot breuk.

6. Chirurgie: implantatie van de kooi van Faraday

1. Wanneer het tandcement volledig is gestold, maakt u de houder van de microdrive los door de zijdelingse schroef los te draaien waarmee de drive is bevestigd met een inbussleutel (zie aanvullende afbeelding 1). Trek de houder voorzichtig ~1 cm in zodat de microdrive vrijstaand is, maar de sonde amplifier/connector blijft bevestigd aan de implantaathouder zonder de flexkabel uit te rekken.
2. Plaats de kant-en-klare kroon en het Faraday-gaas rond de kopplaat door de kooi bij de opening uit te rekken en horizontaal over de microdrive en Flex-kabel te schuiven, en bevestig deze vervolgens met tandheelkundig cement op de kopplaat.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u alle ruimtes tussen de kooi van Faraday en de schedel afsluit met tandheelkundig cement om het implantaat te beschermen tegen besmetting.
3. Plaats de Faraday-kroonring (zie Materiaaltabel) met sondeconnector/hoofdtrap over de kroon en lijn de geïntegreerde houder voor de sonde uit amplifier/connector met het gebied gemarkeerd door een ingesprongen 'X' op de Faraday-kroon (zie stap 2.13).
4. Bevestig de ring aan de kooi van Faraday met een klein druppeltje cyanoacrylaatlijm of tandcement bij elke spaak-ringovergang.
5. Zodra de Faraday-ring met geïntegreerde sonde amplifier/connector op zijn plaats is bevestigd, trekt u de stereotactische arm volledig in met de microdrive-houder. Zie aanvullende afbeelding 3 voor een stapsgewijze handleiding voor de montage van deze componenten.

7. Testopname na de operatie

1. Sluit de sonde aan amplifier/connector op de opnamehardware en start een opname.
2. Als de sonde zijn doellocatie nog niet heeft bereikt tijdens de eerste inbrenging (zie stap 5.9), draai dan de microdrive-schroef langzaam tegen de klok in om de sonde te laten zakken terwijl u neuronale signalen bewaakt.
   OPMERKING: Signalen moeten veranderen a) wanneer de elektroden de laag siliconenelastomeer boven de craniotomie raken, en b) wanneer de elektroden in de hersenen beginnen te bewegen (zie stap 7.2). Hoogfrequente neuronale activiteit wordt geregistreerd door elektroden die volledig in de hersenen zijn ingebracht, terwijl elektroden die in contact komen met de CSF op het hersenoppervlak doorgaans een low-pass-gefilterd neuronaal populatiesignaal vertonen zonder spiking-activiteit (vergelijkbaar met een EEG-spoor), en opnameplaatsen in de lucht zullen verhoogde elektrische ruis registreren. Het is mogelijk om de insteekdiepte van de sonde extra te verifiëren door de impedantie van afzonderlijke kanalen na de testopname te meten. Kanalen die in contact komen met lucht moeten een hoge impedantie vertonen (wat wijst op een open circuit) en impedanties zoals die vóór de operatie zijn gemeten voor de kanalen die CSF raken of al in de hersenen zijn. Schuif de siliciumsonde vooruit met een maximale totale afstand van ongeveer 1000 μm per sessie, met een maximale snelheid van ongeveer 75 μm/min (zie stap 5.5).
3. Wanneer neurale lokale veldpotentialen zichtbaar zijn over de sonde en/of de sonde maximaal 1000 μm is vervroegd, beëindigt u de testopname en koppelt u de hoofdfaseconnector los.

8. Herstel

1. Bedek de kooi van Faraday met zelfklevende veterinaire folie (zie Materiaaltabel).
2. Beëindig de anesthesie en laat het dier een paar dagen herstellen volgens goedgekeurde experimentele richtlijnen.
3. Als de elektroden op de siliciumsonde zich nog niet op de gewenste doellocatie bevinden, draai dan de schroef van de microdrive in kleine stappen met maximaal vier volledige omwentelingen (of ~1000 μm) per sessie. Herhaal deze procedure indien nodig gedurende meerdere dagen totdat het doel is bereikt. Het wordt aanbevolen om de sondebeweging te combineren met gelijktijdige opnames om de elektrofysiologische activiteit in dwarsdoorde gebieden te evalueren.

9. Gedragsexperimenten en chronische opnames

1. Voor chronische opnames van het hoofd tijdens het uitvoeren van taken, bevestigt u de kopplaat aan de onderkant van de kooi van Faraday aan de hoofdfixatieklem door de klem handmatig te openen en de geïmplanteerde kopplaat vast te klemmen (zie afbeelding 1C, E, F).
   OPMERKING: Als hoofdfixatie niet nodig is, kan dit implantaatsysteem ook worden gebruikt voor vrij bewegende opnames. Sla stap 9.1 en 9.7 over voor vrij bewegende opnamen.
2. Verwijder de zelfklevende veterinaire wikkel van het implantaat.
   OPMERKING: Om het ongemak voor het dier tot een minimum te beperken, wordt voorgesteld om vóór deze stap een eenvoudige, lonende gedragstaak te starten als afleiding terwijl de onderzoeker met het implantaat werkt.
3. Sluit de versterker/connector aan op de opnameapparatuur.
4. Voer neuronale opnames uit terwijl het dier de taak uitvoert.
   OPMERKING: Als het doel is om het aantal geregistreerde extracellulaire eenheden te maximaliseren, verplaats de shuttle dan met enkele tientallen micrometers wanneer de neurale opbrengst op een locatie afneemt. Houd er rekening mee dat het na het verplaatsen van de sonde minuten tot uren kan duren voordat het signaal is gestabiliseerd. Daarom kan het nuttig zijn om de sonde aan het einde van een sessie te verplaatsen, zodat het signaal kan herstellen tot het begin van de volgende sessie.
5. Koppel de opnameapparatuur los en bedek het implantaat aan het einde van de gedragsopname in een nieuwe veterinaire wikkel.
6. Open de kopfixatieklem om het dier los te maken van de kopfixatie.

10. Herstel van de sonde

1. Aan het einde van de eindopname trekt u de siliconensonde zo ver mogelijk terug op de microdrive door de schroef met de klok mee te draaien. Doe dit terwijl het dier met het hoofd vast zit en zich gedraagt of terwijl het dier verdoofd is in de chirurgische opstelling. Breng de uitgang van de sonde uit de hersenen in kaart door tegelijkertijd neuronale signalen te monitoren en te controleren op de signatuur van elektroden die in de hersenen worden ondergedompeld, het hersenoppervlak raken of in contact komen met lucht (zie stap 7.3).
   OPMERKING: Afhankelijk van het histologieprotocol en de sonde worden elektrolytische laesies uitgevoerd voordat de sonde wordt ingetrokken om de exacte locatie van sommige elektroden op de sonde te bepalen. Als het niet nodig is om de uitgang van de sonde via neuronale registratie te controleren, is het ook mogelijk om de sonde in te trekken nadat het dier is beëindigd.
2. Beëindig het dier volgens goedgekeurde richtlijnen (dit omvat het perferen van het dier als het fixeren van de hersenen voor de daaropvolgende histologie is gepland).
3. Wacht ~ 10 minuten nadat het dier is gestorven. Bevestig het dier vervolgens met het hoofd in de stereotaxis en zorg ervoor dat het hoofd van het dier niet kan bewegen tijdens het explanteren om breuk van de sonde te voorkomen.
4. Breng een druppel zoutoplossing aan op de craniotomie en laat deze een paar minuten weken om opgedroogd biologisch weefsel op de sondeschacht te verzachten en de kans op breuk van de schacht te verkleinen.
5. Plaats de stereotactische houder ongeveer 0,5 cm boven de microdrive. Knip vervolgens het bovenste uiteinde van de spaken van de Faraday-kooi af met een kleine chirurgische schaar (zie Materiaaltabel) om de Faraday-ring los te maken die de versterker/connector vasthoudt en breng de ring terug op de verticale pinnen aan de bovenkant van de stereotactische houder (zie stap 5.1 en aanvullende afbeelding 1).
6. Knip het koperen gaas voorzichtig weg met dezelfde chirurgische schaar door u-vormige delen van het gaas tussen de spaken van de Faraday-kroon uit te knippen. Knip vervolgens de plastic spaken van de kroon aan de basis af.
   NOTITIE: Buig de bedrukte plastic spaken niet terwijl ze worden doorgesneden, omdat ze kunnen breken en plastic vuil in de richting van de sonde kunnen vliegen.
7. Laat de stereotactische houder zakken totdat de microdrive in de houder kan worden bevestigd met behulp van de zijdelingse schroef van de houder, bevestig de microdrive en draai vervolgens de T1-schroef los die de microdrive-behuizing met de microdrive-basis verbindt.
8. Trek de stereotactische arm met de implantaathouder langzaam in om de microdrive van de basis te tillen. Zorg ervoor dat de microdrive onder een loodrechte hoek (d.w.z. 'verticaal' van de basis) loskomt van de basis.
   OPMERKING: Als de behuizing en de basis van de microdrive niet gemakkelijk van elkaar kunnen worden gescheiden, controleer dan of de beweging van de stereotactische arm niet onder een hoek staat ten opzichte van de oriëntatie van de microdrive. Indien nodig worden de houder en de microdrive opnieuw uitgelijnd ten opzichte van elkaar door de fixatie van de kop van het dier iets los te maken en dienovereenkomstig te herpositioneren. De juiste uitlijning is een van de cruciale aspecten voor een eenvoudig herstel van de microdrive. Controleer ook of er tandheelkundig cement achterblijft dat de microdrive en de microdrive-basis verbindt (zie stap 5.5). Als dat het geval is, wordt het cement voorzichtig afgeschraapt met een scalpel en/of tandartsboor, afhankelijk van de hoeveelheid cement die wordt gebruikt.
9. Til de stereotactische arm op met de bevestigde sonde om voldoende ruimte eronder te creëren.
10. Verwijder het dier uit de stereotaxis en bereid de hersenen voor door desgewenst een goedgekeurd histologieprotocol te volgen. Herstel de geïmplanteerde microdrive-basis en reinig deze door deze enkele uren in aceton te laten weken voor later hergebruik.
11. Plaats een schone microdrive-basis op zelfklevende stopverf (zie Materiaaltabel), laat de microdrive vervolgens op de basis zakken en draai de schroef vast. Om breuk te voorkomen, moet u de positie van de sonde gedurende het hele proces onder een microscoop controleren. Deze stap kan op een later tijdstip worden voltooid als de geïmplanteerde microdrive-basis eerst moet worden gereinigd voor hergebruik.
    OPMERKING: Dit protocol vereist het gebruik van zelfklevende stopverf als platform voor de basis, wat van vitaal belang is omdat het zowel de basis vastzet als een zekere mate van meegeven heeft, zodat de basis niet wegglijdt en tegen de sonde botst. De stopverf moet worden gevormd tot een verticale 'rotswand' aan de kant van de microdrive-basis waar de sonde zal worden neergelaten. Dit zorgt ervoor dat als de sonde voorbij de basis wordt neergelaten, deze geen contact maakt met de stopverf eronder. De 'toren' van de stopverf moet ook hoog genoeg zijn zodat als deze voorbij de basis van de microdrive wordt neergelaten, de sonde geen contact maakt met het tafeloppervlak waarop de stopverf wordt geplaatst. Bevestig ten slotte de stopverf goed aan het oppervlak om te voorkomen dat deze wegglijdt of valt. Wanneer u de microdrive op de basis van de microdrive laat zakken die door de stopverf wordt vastgehouden, moet u ervoor zorgen dat het zijprofiel van de microscoop de voortgang controleert, zodat de sonde bij het neerlaten niet in botsing komt met de basis of de stopverf.
12. Reinig en steriliseer de sonde volgens de instructies van de fabrikant. Voor de meest algemeen verkrijgbare sondes, week ze gedurende 12 uur in een enzymatische reiniger (zie Materiaaltabel), spoel ze vervolgens af in gedemineraliseerd water en ontsmet ze in alcohol. Doe dit door de sonde in een groot bekerglas met de enzymatische reiniger te laten zakken terwijl deze nog steeds is bevestigd aan de microdrive-houder op de stereotactische arm.
    NOTITIE: Meet desgewenst de impedanties van de elektroden op de sonde na het reinigen om de mogelijke degradatie van individuele elektroden te controleren.
13. Bewaar de microdrive met de gereinigde sonde veilig tot het volgende experiment.

Resultaten

Dit protocol presenteert een chronisch implantatiesysteem dat onderzoekers in staat stelt om lichtgewicht, kosteneffectieve en veilige chronische elektrofysiologische opnames te implementeren bij muizen die zich gedragen (Figuur 1). De belangrijkste factoren die bepalend zijn voor een succesvolle toepassing van deze aanpak zijn: volledige cementbedekking van de schedel, een minimaal invasieve en goed beschermde craniotomie, veilige bevestiging van de microdrive en bedrading aan de schedel en volledige continuïteit van beschermend Faraday-materiaal. Wanneer met deze punten rekening wordt gehouden, kunnen opnames van hoge kwaliteit consistent worden bereikt. Hier worden representatieve resultaten getoond met betrekking tot de volgende hoofdaspecten van het succes van een operatie:

1) Verstoort het implantaat het gedrag of het welzijn van dieren?
2) Is de signaalkwaliteit hoog en kunnen signalen gedurende langere tijd worden gehandhaafd?
3) Kunnen opnames gemakkelijk worden gecombineerd met taakuitvoering?

Om de impact van het implantaat op het gedrag van dieren te beoordelen, analyseerden we gevolgde voortbewegingspatronen in vijf geïmplanteerde dieren. Figuur 2A toont een voorbeeld van een dier dat 10 minuten voor en 1 week na implantatie vrij beweegt in een speelkooi. Men kan zien dat bewegingspatronen onveranderd zijn. Deze waarneming wordt bevestigd door figuur 2B, C die de verdeling van bewegingssnelheden en koprichtingen over dieren weergeeft. Zowel de loopsnelheid als de hoofdrichtingen waren grotendeels onveranderd voor en na de implantatie, en de loopsnelheden leken na de operatie enigszins verhoogd te zijn. Aanvullende video 1 toont een korte video-opname van een dier 6 dagen na de implantatieoperatie. Typisch gedrag in een thuiskooi, zoals voortbeweging, verzorging, opfokken en foerageren in de thuisomgeving zijn allemaal zichtbaar en duiden op een succesvol herstel van een operatie, evenals op de algemene gezondheid. De lage gedragsimpact van het implantaat is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het lage gewicht en de beheersbare hoogte.

Figuur 2: Voortbeweging voor en na de operatie. (A) Voorbeeld van de voortbeweging van een dier voor (linkerpaneel) en na (rechterpaneel) implantatie. x/y-coördinaten zijn in centimeters, punten geven de positie van het dier op elk tijdstip aan over een periode van 10 minuten. (B) Verdeling van bewegingssnelheden in cm/s gedurende 5 sessies voor en 3 sessies na implantatie bij 5 dieren. (C) Kerneldichtheid voor de waarschijnlijkheid van beweging in verschillende richtingen, voor dezelfde sessies geanalyseerd in (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vervolgens wordt de signaalkwaliteit in Local Field Potential (LFP) en spiking-activiteit op verschillende opnamelocaties beoordeeld. Hier tonen we representatieve gegevens van corticale opnames in de primaire visuele cortex (V1). Voor validatie werd de vermeende activiteit van één eenheid geëxtraheerd uit breedband neuronale signalen die waren geregistreerd in V1 van een wakkere muis met behulp van Kilosort 3 (zie figuur 3). Figuur 3A toont de locatie van geëxtraheerde afzonderlijke eenheden op de sondeschacht, Figuur 3B toont de overeenkomstige spike-golfvormen en Figuur 3C toont de piekreacties van dezelfde neuronen op een current source density (CSD) -protocol. In dit paradigma werden breedveldflitsen gepresenteerd met een duur van 300 ms bij een frequentie van 1 Hz (d.w.z. 300 ms aan, 700 ms uit) gedurende 200 proeven. Ten slotte toont figuur 3D de reacties van dezelfde eenheden op een protocol voor het in kaart brengen van visuele receptieve velden, bestaande uit 2000 frames van willekeurig geselecteerde zwart-witte vierkanten op een grijze achtergrond, en elk gepresenteerd voor 16,6 ms. Vierkanten besloegen elk een visuele hoek van 12 graden en werden geselecteerd uit een veld van 15 x 5 mogelijke locaties, zodat het mapping-paradigma een visuele ruimte besloeg van -90 tot +90 graden azimut en -30 tot +40 graden elevatie in totaal. De reacties op de vuursnelheid op elk stimulusframe werden geëxtraheerd door de maximale vuursnelheid te analyseren over een venster van 16,6 ms, met een vertraging van tussen 40-140 ms, geïdentificeerd als optimaal per kanaal op basis van de maximale activiteit in elk venster. Dit type opname kan worden gebruikt om de aanpassing van de inbrengdiepte van elke elektrode te begeleiden en om de signaalkwaliteit na de implantaatoperatie te beoordelen.

Figuur 3: Opgenomen neuronale signalen. (A) Afgeleide locatie van afzonderlijke eenheden gesorteerd op Kilosort 3 spike-sorteerpakket langs de elektrodecontacten van de sonde. (B) Piek golfvormen voor dezelfde eenheden weergegeven in A gedurende 5 ms tijd. Dunne lijnen: Individuele spike-golfvormen. Dikke lijnen: Gemiddelde piekgolfvorm. (C) Rasterplot van pieken als reactie op een stroombrondichtheid (CSD) paradigma met 300 ms breedveldflitsen gevolgd door een 700 ms zwart scherm. Antwoorden worden getoond voor dezelfde eenheden als in A en B. Boven elkaar gelegde gekleurde lijnen vertegenwoordigen peri-stimulus tijd histogrammen (PSTH's) van dezelfde reacties. De vuursnelheden voor de PSTH's werden berekend in opslaglocaties van 10 ms en vervolgens genormaliseerd met de maximale vuursnelheid voor de gehele PSTH. Tijd 0 is gecentreerd rond de breedveldflitsstimulus. (D) Geschatte receptieve velden van dezelfde eenheden als in A-C, gemeten door een Sparse Noise Receptieve Field Mapping-paradigma. Elke grafiek toont de gemiddelde activiteit van de vuursnelheid gedurende een analysevenster van 16,6 ms als reactie op het begin (linkerpaneel) of offset (rechterpaneel) van witte en zwarte vierkante stimuli. Stimuli werden gepresenteerd voor de duur van 16,6 ms, willekeurig geplaatst over een raster van 5 x 15 vierkant met een horizontale gezichtshoek van 180 graden en een visuele hoek van 70 graden verticaal. De activiteit van de vuursnelheid werd z-gescoord over het gehele receptieve veldraster (zie kleurenbalk). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De opnamekwaliteit bleef weken tot maanden hoog bij herhaalde opnames. Figuur 4A toont longitudinale LFP-opnames van één dier gedurende 15 weken. LFP's werden geregistreerd als reactie op het hierboven beschreven CSD-paradigma (zie figuur 3A-C). Figuur 4A toont de gemiddelde LFP-respons 500 ms na het begin van de flits. In dit voorbeeld gebruikten we een lineaire sonde met 32 kanalen, met een interelektrodeafstand van 25 μm. Merk op dat op dag 18 de sondediepte werd aangepast, waardoor de sonde 600 μm naar beneden verschoof. Zowel voor als na deze aanpassing bleven de LFP-signalen stabiel over de opnamedagen.

In overeenstemming hiermee waren piekgolfvormen van vermeende enkele eenheden waarneembaar over veel opnames. Figuur 4B toont representatieve voorbeelden van piekgolfvormen van drie opnamesessies gedurende een maand van opnames, wat aantoont dat activiteit van één eenheid in de loop van de tijd met succes kan worden geïdentificeerd. Figuur 4C toont het totale aantal vermoedelijke afzonderlijke eenheden dat is geëxtraheerd uit chronische opnames bij zes dieren, verspreid over een periode van maximaal 100 dagen. Enkelvoudige eenheden werden gedefinieerd volgens de standaardcriteria van kilosort 3.0 (zie aanvullende tabel 1). Zoals men kan zien, bedroeg het aantal duidelijk gedefinieerde enkele eenheden doorgaans ~40 in de eerste week na implantatie, en daalde vervolgens geleidelijk, op weg naar een schijnbaar stabiele asymptoot van ~20 eenheden. Aangezien deze opnames werden uitgevoerd met behulp van lineaire 32-kanaals sondes, komt dit neer op een verwachte opbrengst van ongeveer 1,25 enkele eenheden per elektrode direct na implantatie, afnemend tot ca. 0,65 enkele eenheden per elektrode in langdurige opnames. Herhaalde verbinding met de versterker/connector van het implantaat tijdens sessies leek geen invloed te hebben op de opnamekwaliteit of de stabiliteit van het implantaat, aangezien de Faraday-kroon die de versterker/connector vasthoudt, bestand is tegen herhaalde krachten van meer dan 10 Newton, een orde van grootte groter dan zelfs de maximale paringskrachten die nodig zijn voor standaardconnectoren (zie aanvullende video 2).

Figuur 4: Stabiliteit van neuronale opnames in de tijd. (A) Gemiddelde LFP-activiteit als reactie op een breedveldflits CSD-stimulus, weergegeven over alle 32 kanalen van een chronisch geïmplanteerde sonde van 3-110 dagen na implantatie. De rode verticale lijn geeft aan dat de sonde naar een nieuwe locatie wordt neergelaten vanwege kanalen 0-8 die van buiten de hersenen worden opgenomen op dag 18 na de operatie. (B) Spike-golfvormen van drie voorbeeldeenheden van hetzelfde chronische implantaat, herhaaldelijk geregistreerd gedurende vier weken. Dunne lijnen: Individuele spike-golfvormen. Dikke gesuperponeerde lijn: Gemiddelde piekgolfvorm. (C) Het aantal vermoedelijke afzonderlijke eenheden dat door Kilosort 3 is gedetecteerd gedurende registratiedagen voor 6 dieren (zie bijleglegenda). Het rode vierkant geeft de dagen aan waarop de sonde werd verplaatst. De stippellijn geeft het aantal elektroden per implantaat aan dat in deze opnames wordt gebruikt (32). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ten slotte, door een modulair systeem te bieden met een microdrive, een draagbare kooi van Faraday en een hoofdplaat die ook dienst doet als implantaatbasis en een apparaat voor hoofdfixatie, maakt dit protocol de integratie van chronische elektrofysiologie met hoofdfixatiegedrag mogelijk. Hier worden voorbeeldgegevens getoond van muizen die een virtuele omgeving doorkruisen op een bolvormige loopband. Figuur 5A toont een hardloopgerelateerde spiking-activiteit van 20 eenheden in een voorbeeldproef. Figuur 5B toont de diverse maar robuuste relaties tussen loopsnelheid en spiking-activiteit van individuele spike-gesorteerde eenheden, evenals een populatiegemiddelde voor hetzelfde effect in Figuur 5C, wat het gevestigde effect van locomotorische activiteit op neuronale activiteit bij knaagdier V1 bevestigt²⁴.

Figuur 5: Neuronale reacties tijdens hoofd-gefixeerd gedrag. (A) Rasterdiagram van de respons van één eenheid in een voorbeeldproef, met de loopsnelheid (paarse lijn) en de gemiddelde vuursnelheden van alle afzonderlijke eenheden (lichtblauwe lijn) over elkaar heen. (B) Activiteit van één eenheid tijdens verschillende rijsnelheidscategorieën, weergegeven voor zes voorbeeldeenheden. (C) Gemiddelde spiking-activiteit over alle afzonderlijke eenheden in één voorbeeldsessie, uitgezet over de vijf kwintielen van de lopende snelheidsverdeling. De loopsnelheden in deze sessie varieerden van 0 tot 0,88 meter/seconde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Tabel met de standaardparameters die door Kilosort 3 worden gebruikt bij het identificeren van afzonderlijke eenheden in de opnamen die worden weergegeven in Figuur 3, Figuur 4 en Figuur 5. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 1: Video die de locomotorische activiteit van dieren na implantatie laat zien. De video die is gemaakt na een herstelfase van 5 dagen is voltooid en toont normaal locomotorisch gedrag en aanpassing aan de grootte en het gewicht van het implantaat. Het dier is normaal gesproken te zien in een speelkooi met omgevingsverrijking. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 2: Video die laat zien hoe er kracht wordt uitgeoefend op de gemonteerde Faraday-kroon. De krachten die door de Faraday-kroon worden weerstaan, zijn ongeveer een orde van grootte groter dan de verbindingskracht die nodig is voor standaardconnectoren zoals 4-pins gepolariseerde nanoconnectoren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 1: Afbeelding met afbeeldingen van de schijfhouder. Afdrukbare ontwerpbestanden zijn te vinden in de bijbehorende Github-repository (https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Sjabloon voor koperen gaas. Print het sjabloon met de originele schaalverdeling en gebruik het sjabloon voor het uitsnijden van het koperen gaas (stap 2.12). Gebruik de schaalbalk om de schaal van de afdruk te controleren en, indien nodig, aan te passen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Fotoserie van de montagestappen van het implantaat tijdens de operatie. In dit geval zijn twee microdrives en twee versterkers geïnstalleerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Tekening van de schedel van een muis met voorbeeldplaatsing van aandrijvingen, craniotomieën (in groen) en GND/REF-pin (in rood). De locatie van de pin wordt aanbevolen vanwege de plaatsing in het cerebellum, wat waarschijnlijk niet de corticale opnames verstoort. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit manuscript presenteert een protocol voor de snelle, veilige en gestandaardiseerde implantatie van sondes, waardoor ook sonde kan worden hersteld en opnieuw kan worden gebruikt aan het einde van het experiment. De aanpak maakt gebruik van een modulair systeem van implantaatcomponenten, met name een microdrive, die compatibel is met alle gangbare siliciumsondes en opnamesystemen, een kopplaat die kan worden gebruikt voor gedragsexperimenten met hoofdbevestiging en een draagbare kooi van Faraday om het implantaat te beschermen. Deze constellatie stelt gebruikers in staat om hun implantaat flexibel aan te passen aan verschillende experimentele paradigma's, zoals hoofdvast versus vrij bewegend gedrag of implantaatminiaturisatie (zonder kooi van Faraday) versus verhoogde signaalrobuustheid op lange termijn (met kooi van Faraday) - zonder dat ze daarbij de standaardisatie van het implantaat hoeven op te offeren.

Deze aanpak maakt chronische elektrofysiologische opnames meer gestandaardiseerd (door geprefabriceerde elementen die niet met de hand hoeven te worden gemonteerd), minder kostbaar (door sondeherstel), minder tijdrovend (door het vereenvoudigen van chirurgische stappen) en gemakkelijker compatibel met dierenwelzijn en gedrag (door verminderde implantaatgrootte en stressvrije hoofdfixatie). Als zodanig heeft dit protocol tot doel elektrofysiologische implantaten in zich gedragende knaagdieren bereikbaar te maken voor een breder scala aan onderzoekers buiten de baanbrekende laboratoria op het snijvlak van het veld.

Om dit doel te bereiken, minimaliseert het hier gepresenteerde protocol de afweging tussen verschillende vaak even cruciale aspecten van microdrive-implantaten, namelijk flexibiliteit, modulariteit, implantatiegemak, stabiliteit, totale kosten, compatibiliteit met gedrag en herbruikbaarheid van de sonde. Momenteel blinken beschikbare benaderingen vaak uit in sommige van deze aspecten, maar tegen hoge kosten voor andere functies. Voor gebruikssituaties die bijvoorbeeld absolute implantaatstabiliteit gedurende lange perioden vereisen, kan de beste implantaatbenadering zijn om de sonde rechtstreeks op de schedel te cementeren²⁵. Dit voorkomt echter ook hergebruik van de sonde, evenals herpositionering van opnameplaatsen in geval van slechte opnamekwaliteit, en het is onverenigbaar met gestandaardiseerde implantaatplaatsing. Evenzo, hoewel de AMIE-aandrijving een lichtgewicht, goedkope oplossing biedt voor herstelbare implantatie van sondes, is deze beperkt tot enkele sondes en beperkt in de plaatsing van de doelcoördinaten¹⁷. Aan de andere kant van het spectrum zijn sommige in de handel verkrijgbare nano-drives (zie tabel 1 16,17,21,26,27,28,29,30) extreem klein, kunnen ze vrij op de schedel worden geplaatst en maximaliseren ze het aantal sondes dat in een enkel dier kan worden geïmplanteerd¹⁶. Ze zijn echter duur in vergelijking met andere oplossingen, vereisen dat onderzoekers zeer bekwaam zijn voor succesvolle implantaatoperaties en verbieden hergebruik van sondes. De door Vöröslakos et ^al.21 ontwikkelde microdrive, waarvan een lichtgewicht versie ook deel uitmaakt van dit protocol, offert kleine implantaatgrootte op voor beter gebruiksgemak, lagere prijs en herbruikbaarheid van de sonde

Tabel 1: Vergelijking van populaire strategieën voor chronische sonde-implantaten bij knaagdieren. Beschikbaarheid: of de microdrive open source is (voor onderzoekers om zelf te bouwen), in de handel verkrijgbaar is, of beide. Modulariteit: Geïntegreerde systemen bestaan uit een of enkele componenten die in een vaste relatie tot elkaar staan, terwijl modulaire systemen een vrije plaatsing van de sonde/microdrive ten opzichte van de bescherming (hoofddeksel/kooi van Faraday) mogelijk maken na productie van het implantaat (bijv. op het moment van de operatie). Modulariteit werd bepaald op basis van gepubliceerde informatie of implantatieprotocollen van de vermelde implantaten. Hoofdfixatie: Ja: Het implantaat heeft mechanismen voor hoofdfixatie geïntegreerd in het ontwerp, X: Het implantaat laat de ruimte om zonder grote problemen een extra hoofdplaat toe te voegen voor fixatie, Nee: Het ontwerp van het implantaat veroorzaakt waarschijnlijk ruimteproblemen of vereist substantiële ontwerpaanpassingen voor gebruik met hoofdfixatie. Plaatsing van de sonde: Beperkt: De locatie van de sonde is beperkt in de ontwerpfase van het implantaat. Flexibel: de locatie van de sonde kan zelfs tijdens de operatie worden aangepast. Aantal sondes: het aantal sondes dat kan worden geïmplanteerd. Houd er rekening mee dat het implanteren van >2-sondes op een muis een aanzienlijke uitdaging vormt, onafhankelijk van het gekozen implantaatsysteem. Herbruikbaarheid van de sonde: ja, als de sondes in theorie kunnen worden hergebruikt. Gewicht/grootte: gewicht en omvang van het implantaat. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Om een systeem te creëren dat deze verschillende vereisten naadlozer met elkaar verzoent, is het DREAM-implantaat ontworpen op basis van het Vöröslakos-implantaat²¹, maar met verschillende fundamentele aanpassingen. Ten eerste, om het totale gewicht van het implantaat te verminderen, wordt de hier gebruikte microdrive geproduceerd in machinaal bewerkt aluminium in plaats van 3D-geprint roestvrij staal, en wordt de Faraday-kroon geminiaturiseerd, waardoor een totale gewichtsvermindering van 1,2-1,4 g wordt bereikt, afhankelijk van de keuze van het materiaal van de kopplaat (zie tabel 2). Ten tweede is de kopplaat rond de microdrive ontworpen om een geïntegreerd hoofdfixatiemechanisme mogelijk te maken dat een snelle en stressvrije hoofdfixatie mogelijk maakt, terwijl het ook dienst doet als basis voor de kooi van Faraday, waardoor toegang wordt gegeven tot de meeste potentiële doelgebieden voor neuronale opnames en slechts minimaal gewicht aan het implantaat wordt toegevoegd. De platte vorm van het fixatiemechanisme en het ontbreken van uitsteeksels zorgen ook voor een minimale verslechtering van het gezichtsveld of de voortbeweging van dieren (zie figuur 2A-C), een duidelijke verbetering ten opzichte van eerdere systemen^31,32. De Faraday-kroon en -ring die op de kopplaat zijn bevestigd, zijn ook aanzienlijk gewijzigd in vergelijking met eerdere ontwerpen. Ze vereisen nu geen ad-hoc aanpassing (bijv. in termen van plaatsing van connectoren) of solderen tijdens de operatie, waardoor mogelijke oorzaken van implantaatschade en onvoorspelbare variatie in implantaatkwaliteit worden weggenomen. In plaats daarvan biedt het DREAM-implantaat meerdere gestandaardiseerde kroonringvariaties waarmee elke connector op een van de vier vooraf gedefinieerde posities kan worden geplaatst, waardoor variabiliteit en inspanning tijdens de operatie tot een minimum worden beperkt. Ten slotte, door het implantaatsysteem te optimaliseren voor het herstel van de sonde, stelt het DREAM-implantaat onderzoekers in staat om de kosten en de voorbereidingstijd per implantaat drastisch te verminderen, aangezien de microdrive en de sonde doorgaans samen kunnen worden hersteld, schoongemaakt en hergebruikt.

Voor een uitgebreider overzicht van de wisselwerkingen van verschillende implantaatsystemen, zie Tabel 1. Hoewel de hier gepresenteerde aanpak over het algemeen geen maximale prestaties levert in vergelijking met alle andere strategieën, bijvoorbeeld in termen van grootte, stabiliteit of kosten, werkt het in het bovenste bereik van al deze parameters, waardoor het gemakkelijker toepasbaar is op een breed scala aan experimenten.

Drie aspecten van het protocol zijn bijzonder cruciaal om aan te passen aan elke specifieke use case: de constellatie van grond en referentie, de techniek voor het cementeren van de microdrive en implantaatvalidatie via neuronale registratie. Ten eerste was het doel om bij het implanteren van de massa- en referentiepennen de sweet spot te identificeren tussen mechanische/elektrische stabiliteit en invasiviteit. Hoewel bijvoorbeeld drijvende zilveren draden ingebed in agar minder invasief zijn dan botschroeven³³, zijn ze waarschijnlijk vatbaarder om na verloop van tijd los te raken. Het gebruik van pennen, in combinatie met agar, zorgt voor een stabiele elektrische verbinding, terwijl het ook het voordeel heeft dat het gemakkelijker te controleren is tijdens het inbrengen, waardoor weefseltrauma wordt voorkomen. Het is onwaarschijnlijk dat aardpennen die aan de schedel zijn gecementeerd, losraken, en in het geval dat de draad losraakt van de pen, is herbevestiging meestal eenvoudig vanwege het grotere oppervlak en de stabiliteit van de geïmplanteerde pen.

Tabel 2: Vergelijking van componentgewichten tussen het DREAM-implantaat en het implantaat beschreven door Vöröslakos et ^al.21. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Ten tweede moet het cementeren van de microdrive over het algemeen plaatsvinden voordat de sonde in de hersenen wordt ingebracht. Dit voorkomt zijwaartse beweging van de sonde in de hersenen als de microdrive tijdens het inbrengen niet perfect in de stereotactische houder is gefixeerd. Om de plaatsing van de sonde te controleren voordat de microdrive op zijn plaats wordt gecementeerd, kan men de punt van de sondeschacht kort laten zakken om vast te stellen waar deze in contact zal komen met de hersenen, aangezien het extrapoleren van de touchdown-positie moeilijk kan zijn gezien de parallaxverschuiving van de microscoop. Zodra de positie van de microdrive is vastgesteld, kan men optioneel de craniotomie beschermen met siliconenelastomeer voordat de microdrive wordt gecementeerd om ervoor te zorgen dat het cement niet per ongeluk in contact komt met de craniotomie; Het wordt echter niet aanbevolen om de sonde door het siliconenelastomeer te laten zakken, omdat siliconenelastomeerresten in de hersenen kunnen worden getrokken en ontstekingen en gliose kunnen veroorzaken.

Ten derde kan, afhankelijk van het gebruikte experimentele protocol, een testopname direct na de operatie al dan niet nuttig zijn. Grotendeels zal de neuronale activiteit die direct na het inbrengen van de sonde wordt geregistreerd, niet direct representatief zijn voor de chronisch geregistreerde activiteit, vanwege factoren zoals voorbijgaande zwelling van de hersenen en weefselbeweging rond de sonde, wat betekent dat het onwaarschijnlijk is dat zowel de invoegdiepte als de spike-golfvormen direct stabiliseren. Als zodanig kunnen directe opnames vooral dienen om de algemene signaalkwaliteit en de integriteit van het implantaat vast te stellen. Het wordt aanbevolen om de beweegbare microdrive-slee in de daaropvolgende dagen na de operatie te gebruiken, zodra de hersenen zijn gestabiliseerd, om de positie te verfijnen. Dit helpt ook om te voorkomen dat de sonde met meer dan 1000 μm per dag wordt verplaatst, waardoor schade aan de opnameplaats tot een minimum wordt beperkt en de levensduur van de opnameplaats wordt verlengd.

Ten slotte willen gebruikers het systeem misschien aanpassen om vanaf meer dan één doellocatie op te nemen. Omdat dit systeem modulair is, heeft de gebruiker veel speelruimte bij het monteren en plaatsen van componenten ten opzichte van elkaar (zie hierboven en aanvullende figuur 3 en aanvullende figuur 4). Dit omvat aanpassingen die het mogelijk maken om een horizontaal uitgeschoven shuttle op de microdrive te monteren, waardoor meerdere sondes of grote sondes met meerdere schachten kunnen worden geïmplanteerd, evenals de implantatie van meerdere individuele microdrives (zie aanvullende afbeelding 3 en aanvullende afbeelding 4). Dergelijke aanpassingen vereisen alleen het gebruik van een aangepaste kroonring, met een verhoogd aantal montagezones voor connectoren/interfaceborden/headstages. De ruimtebeperkingen van dit ontwerp worden echter gedicteerd door het diermodel, in dit geval de muis, wat het stapelen van meerdere sondes op één microdrive aantrekkelijker maakt in termen van voetafdruk dan het onafhankelijk van elkaar implanteren van meerdere microdrives. De microdrives die hier worden gebruikt, kunnen gestapelde sondes ondersteunen, en dus is de enige echte beperking het aantal hoofdtrappen of connectoren dat past bij de ruimte- en gewichtsbeperkingen die door het diermodel zijn gedefinieerd. Afstandhouders kunnen ook worden gebruikt om niet-verticale montage- en insteekpaden verder te vergroten.

Kortom, dit protocol zorgt voor goedkope, lichtgewicht en vooral verstelbare implantatie van een sonde, met als bijkomend voordeel een microdrive-ontwerp dat prioriteit geeft aan het herstel van de sonde. Dit pakt de problemen aan van de onbetaalbare kosten van sondes voor eenmalig gebruik, de hoge barrière van chirurgische en implantatievaardigheden, evenals het feit dat commerciële oplossingen voor chronische implantatie vaak moeilijk aan te passen zijn aan unieke gebruiksscenario's. Deze problemen vormen een pijnpunt voor laboratoria die al acute elektrofysiologie gebruiken en een afschrikmiddel voor degenen die nog geen elektrofysiologische experimenten uitvoeren. Dit systeem is bedoeld om de bredere acceptatie van chronisch elektrofysiologisch onderzoek buiten deze beperkingen te vergemakkelijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05" Solder Tail Socket	Mill-Max	853-93-100-10-001000
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- Reagent tetramethylindocarbocyanine perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))	ThermoFisher	D282	Lipofiele kleurstof gebruikt voor eenvoudigere histologische verificatie van de sonde locatie
Adhesive Putty (Blu-Tack)	Bostik	308590110	Variaties (bijv. van Pritt) zouden beschikbaar moeten zijn in uw kantoorartikelenwinkel
Agar	Sigma Aldrich	A1296	Maak met zoutoplossing voor geleidbaarheid.
Amplifier (Miniamp-64)	Cambridge Neurotech		Miniatuur en implanteerbare versterker en digitalisator. Alternatieve implanteerbare digitalisator of implanteerbare Omnetics-connector mogelijk.
Analgesic Cream (EMLA Cream)	Aspen	39699/0088	Analgesische crème voor operatieve pijn met prilocaïne, lidocaïne.
Angled Spacer	3DNeuro		Hoekige spacer voor niet-loodrecht draaframent. Open source, ook beschikbaar op https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Blue light curing LED	B.A. International	818223	Curing light voor primer polymerisatie. 420-480 nm golflengte
Bone wax	SMI	Z046	Was om craniotomie en sonde na de operatie te beschermen.
Buprenorphine	Elanco Europe LTD	401513	Injecteerbare buprenorfine-oplossing (0,3 mg/mL)
Copper mesh	Dexmet	3CU6-050FA	Kopergaas gebruikt om de sonde en craniotomie elektrisch en fysiek af te schermen.
Cyanoacrylate glue (Loctite)	Loctite	1363589	Cyanoacrylaat gellijm
Dental Cement (SuperBond C&B)	Sun Medical	K058E	Tandcement (SuperBond)
Depilation Cream (Veet)	Veet	310000091434	Haarverwijderingscrème voor het verwijderen van haar rond de chirurgische plek.
Enrofloxacin (Baytril)	Elanco Europe LTD	00879/4117	Injecteerbare enrofloxacine-oplossing (25 mg/mL)
Faraday crown	3DNeuro		3D geprinte implanteerbare beschermende kooi. Open source, ook beschikbaar op https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Faraday ring	3DNeuro		3D geprinte implanteerbare beschermende ring voor Faraday-kooi. Open source, ook beschikbaar op https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Haemostatic Sponge	SMI	ZHG101010	Absorbeerbare gelatine hemostatische spons
Heat Shrink Tubing	HellermannTyton	TA32-9/3 BK	Heat Shrink-slang voor het maken van zachte tipforceps
Iodine	Braunol	9322507	Waterige povidone-jood oplossing.
Metamizole (Novalgin)	Sanofi-Aventis Gmbh	4527098	Injecteerbaar metamizole (500mg/mL)
Metamizole (Novalgin)	Sanofi-Aventis Gmbh	1553758	Metamizole-oplossing
Microdrive (R2Drive)	3DNeuro		Herstelbare metalen microdrive met beweegbare shuttle. Open source, ook beschikbaar op https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5310-100ML	Olie gebruikt als oplosmiddel om craniotomie-beschermingsgel te maken.
Non-Shedding Wipes (Kimtech)	Kimtech	7552	Niet-afbrokkelende doekjes
Primer	Bisco	B-7202P	Universele schedelkleefstof die vocht voorkomt dat het cement verslechtert en een solide basis biedt om cement op te bouwen.
R2Drive holder	3DNeuro		Stereotactische bevestiging voor montage van R2Drive. Open source, ook beschikbaar op https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Self-adherent wrap	3M	VB050	Beschermende wrap voor implantaat na de operatie
Silicon probe (H2)	Cambridge Neurotech		Chronisch implanteerbare lineaire siliconensonde met 32 kanalen. Alternatieve sonde gebruik mogelijk.
Silicone Elastomer (Duragel)	Cambridge Neurotech		Silicone Elastomer
Silicone Plaster (Kwikcast)	WPI	KWIK-CAST
Silver conductive epoxy	MG Chemicals	8331D-14G	Zilveren epoxy
Size 5 Dumont forceps	FSTools	11251-10	Kleine pincet voor het tillen van botflap.
Stainless steel wire, Teflon coated	Science Products GmBH	SS-3T	Aarddraad
Stereotax (RWD)	RWD	68803	Stereotax voor chirurgische ingrepen bij muizen.
Tergazyme	Alconox	1304	Mogelijk enzymatische reiniger om sonde schoon te maken
Two Part Fast setting Epoxy Resin	Gorilla	EP3	Epoxy voor permanente binding van DREAM-implantaatonderdelen.
Vannas Spring Scissors Round Handle	FSTools	15403-08	0,075 mm rechte tipveterinair veerscharen.
Veterinary Cyanoacrylate glue (Vetbond)	3M	70-0068-5256-3	Veterinaire cyanoacrylaatlijm