Het protocol beschrijft de bereiding van natriumalginaatmicrosferen die zijn verknoopt met verschillende metaalionen met behulp van een microfluïdisch apparaat voor het ontwerp van geneesmiddeldragers. De antimicrobiële eigenschappen en de langzame afgifte van deze microsferen werden ook onderzocht.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bereiding van vernette natriumalginaatmicrosferen met verschillende metaalionen met behulp van de microfluïdische elektrospraytechnologie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Microsferen zijn deeltjes ter grootte van een micrometer die medicijnen kunnen laden en geleidelijk kunnen afgeven via fysieke inkapseling of adsorptie op het oppervlak en in polymeren. Op het gebied van biogeneeskunde zijn hydrogel-microsferen uitgebreid bestudeerd voor hun toepassing als medicijndragers vanwege hun vermogen om de frequentie van toediening van geneesmiddelen te verminderen, bijwerkingen te minimaliseren en de therapietrouw van de patiënt te verbeteren. Natriumalginaat (ALG) is een van nature voorkomend lineair polysacharide met drie ruggengraatglycosidische bindingen. Er zijn twee hulphydroxylgroepen aanwezig in elk van de delen van het polymeer, die de kenmerken hebben van een alcoholhydroxylgroep. De synthetische ALG-eenheden kunnen chemische verknopingsreacties ondergaan met metaalionen, waardoor een verknoopte netwerkstructuur van polymeerstapels wordt gevormd en uiteindelijk een hydrogel wordt gevormd. Hydrogel-microsferen kunnen worden bereid met behulp van een eenvoudig proces waarbij de ionische verknopingseigenschappen van ALG worden gebruikt. In deze studie hebben we op ALG gebaseerde hydrogel-microsferen (ALGMS) bereid met behulp van een microfluïdische elektrodepositiestrategie. De geprepareerde hydrogel-microsferen hadden een uniforme grootte en waren goed verspreid, dankzij de nauwkeurige regeling van de microfluïdische elektrospraystroom. ALGMS verknoopt met verschillende metaalionen werd bereid met behulp van een microfluïdische elektrospraytechniek die microfluïdisch en hoog elektrisch veld combineerde, en de antimicrobiële eigenschappen, het vermogen om langzame medicijnafgifte en biocompatibiliteit te onderzoeken. Deze technologie is veelbelovend voor toepassing in de ontwikkeling en productie van geavanceerde geneesmiddelen.
Inleiding
Geneesmiddelafgiftesystemen zijn een onderzoekshotspot op het gebied van bioweefselmanipulatie, met als doel de efficiëntie en werkzaamheid van geneesmiddelafgifte te verbeteren en bijwerkingen en bijwerkingen teverminderen. Van deze systemen zijn hydrogel-microsferen, gekenmerkt door een goede biocompatibiliteit, afstembare mechanische eigenschappen en functionele plasticiteit, een van de meest gebruikte voertuigen voor het laden en afleveren van geneesmiddelen2. Ze kunnen worden gebruikt voor zowel langzame als gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen, bieden goede beschermende effecten voor geneesmiddelen, vermijden of minimaliseren niet-specifieke effecten van geneesmiddelen in andere weefsels en richten zich op de afgifte van geneesmiddelen aan specifieke weefselstructuren. Daarom zijn hydrogel-microsferen een nieuw en efficiënt systeem voor medicijnafgifte geworden, waarbij onderzoek op dit gebied geleidelijk aan in opkomst is4.
Hydrogel-microsferen worden meestal gesynthetiseerd uit biologisch afbreekbare materialen, waaronder polysachariden, eiwitten en natuurlijke polymeren5. Onder hen is ALG een biocompatibel, biologisch afbreekbaar polysacharide dat wordt gewonnen uit bruine zeealgen6. De moleculaire keten bevat vrije hydroxyl- en carboxylgroepen die kunnen verknopen met de meeste tweewaardige of multivalente kationen om een in water onoplosbare hydrogelstructuur te vormen met een driedimensionaal netwerk5. De hydrogel-microsferen gevormd door ALG kunnen worden omgezet in negatief geladen polyelektrolyten in neutrale en alkalische oplossingen. Deze afstoting tussen negatieve ladingen zorgt ervoor dat de microsferen opzwellen, waardoor het ingekapselde actieve ingrediënt of medicijn vrijkomt. Deze eigenschappen hebben ertoe geleid dat ALG-microsferen worden beschouwd als veelbelovende medicijndragers die veel worden gebruikt voor het laden van geneesmiddelen en gecontroleerde afgifte7.
Er bestaan verschillende methoden voor de bereiding van hydrogel-microsferen. Traditionele ALGMS-bereidingsmethoden omvatten meestal de sol-gel-methode of de emulsie-sol-methode. Deze methoden omvatten stappen zoals precipitatie, co-precipitatie en geleringsreacties om de doelmicrosferen te verkrijgen8. In de afgelopen jaren, met de voortdurende ontwikkeling van microfluïdische technologie, is de microfluïdische electrospray-methode geleidelijk een efficiënte en nauwkeurige microsferenbereidingsmethode geworden9. Deze methode maakt gebruik van microfluïdische technologie om een polymeeroplossing door een microfijn mondstuk te elektrospray om druppeltjes en microbolletjes ter grootte van een micrometer te vormen tijdens het daaropvolgende uithardings- of verknopingsproces10. Vergeleken met de traditionele methode biedt microfluïdische elektrospray een nauwkeurige regeling van de deeltjesgrootte en morfologie van de microbol door parameters zoals de stroomsnelheid, spanning en fijne mondstukgrootte11 aan te passen. Het maakt ook een continue bereiding van microsferen met hoge snelheid mogelijk, waardoor de efficiëntie van de bereiding wordt verbeterd en milde reactieomstandigheden worden gehandhaafd. Bovendien kan ALGMS worden voorbereid om verschillende functies te bezitten, zoals geneesmiddelen met gecontroleerde afgifte en geladen katalysatoren, waardoor ze gemakkelijk op verschillende gebieden kunnen worden toegepast.
Hier presenteren we een protocol voor de bereiding van ALG-microsferen met behulp van de microfluïdische elektrospray-methode. Het proces omvat het passeren van een ALG-oplossing door een microfluïdisch apparaat en het onderwerpen aan elektrospray. De resulterende druppeltjes werden verzameld in de oplossing met verschillende metaalionen (Ca2+, Cu2+, Zn2+ en Fe3+) om de verknopingsreactie op gang te brengen. Deze reactie verbetert de stabiliteit en hechting van de microsferen en geeft ze verschillende functionaliteiten. Deze methode is gemakkelijk uit te voeren en de gesynthetiseerde microsferen vertonen een goede uniformiteit van de grootte in hun morfologie. Daarnaast hebben we hun antimicrobiële eigenschappen, vermogen om geneesmiddelen langzaam af te geven en biocompatibiliteit onderzocht. Dit protocol zal nuttig zijn voor de verdere ontwikkeling en productie van geneesmiddelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het bloed dat in de experimenten werd gebruikt, werd verkregen van SPF-klasse BALB/c vrouwelijke muizen met een gewicht van 20-25 g en ongeveer 7 weken oud. De ethische commissie voor dierproeven van het Zhejiang Shuren College keurde alle dierverzorging en experimentele procedures goed.
1. Voorbereiding van de oplossing
- Weeg ALG af en los op in ultrapuur water door te roeren in een waterbad van 50 °C om 2% ALG-oplossing te verkrijgen.
- Bereid afzonderlijk massafractie met 5% (of molaire massaconcentratie is 0,3 M) oplossingen van CaCl2, FeCl3, ZnSO4 en CuSO4 in ultrapuur water. Giet elke oplossing afzonderlijk in een opvangschaal.
2. Microfluïdisch electrospray-apparaat
- Neem een glazen capillaire buis en plaats deze over een brandervlam om zacht te worden, en rek deze vervolgens uit tot verschillende diameters (50 μm-500 μm). Snijd de fijne delen af met een glassnijder en polijst de tippoort voorzichtig met hoogwaardig siliciumcarbide schuurpapier. Sluit na het reinigen het dikke uiteinde van de capillaire slang aan op een lange slang en het andere uiteinde van de slang op een doseernaald en een spuit van 5 ml (aanvullende afbeelding 1).
NOTITIE: Scherpe randen van sneden in glazen buizen zijn moeilijk in de slang te steken; De breuk moet dus aan de rand van de vlam worden afgerond. - Bevestig de spuit aan de pomp van de microfluïdische spuit en de capillaire slang aan het ene uiteinde aan de houder. Sluit de rode hoogspanningsklem van de hoogspanningsvoeding aan op de doseernaald van de spuit en plaats de zilveren klem in de opvangvloeistof. Deze configuratie creëert een eenvoudig microfluïdisch elektrospray-apparaat (Figuur 1A).
NOTITIE: Plaats de capillaire buis loodrecht op de tafel.
3. Bereiding van ALG-microsferen
- Plaats de aparte opvangschaaltjes met verschillende metaalionen direct onder het capillaire buisje. Schakel de pomp van de microfluïdische spuit in en selecteer Fast Forward om de slang met de ALG te vullen en stel vervolgens het juiste debiet in (2 ml/u).
- Zet de hoogspanningsschakelaar aan en draai aan de knop om de juiste spanning in te stellen (5-7 kV).
- Voeg 20 ml oplossing toe aan elk van de 90 mm petrischaaltjes om ALG-microsferen te verzamelen om ALGMS te vormen die verknoopt zijn met verschillende metaalionen (Figuur 1B).
- ALG vormt binnen enkele seconden microsferen onder invloed van een elektrisch veld en zwaartekracht in verschillende ionenverzamelende oplossingen. Zuig de microsferen op met een gesteriliseerde pipet en breng ze over in afzonderlijke centrifugebuisjes van 1,5 ml om Zn2+, Ca2+, Cu2+ en Fe3+ -ALG hydrogelmicrosferen te verkrijgen (Figuur 1C). Label de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS en Fe-ALGMS buizen.
OPMERKING: Microsferen met verschillende diameters kunnen worden verkregen door parameters zoals spanning, tipdiameter, debiet en oplossingsconcentratie aan te passen. - Neem een kleine hoeveelheid van de voorbereide microbolletjes, verdeel ze zo gelijkmatig mogelijk in PBS en plaats ze onder een microscoop voor visualisatie.
- Willekeurig geselecteerde 10 waarnemingsvelden in dezelfde batch microsferen, importeer de te meten afbeeldingen in de ImageJ-software, converteer de afbeeldingen naar de juiste grijswaardenmodus en gebruik de drempelsegmentatietechnologie om het gebied van de doeldeeltjes nauwkeurig te definiëren en start de functie van het analyseren van de deeltjes, zodat ImageJ de doeldeeltjes kan identificeren en meten. Verkrijg gegevens over de microsferen en importeer de gegevens vervolgens in de Origin-software voor analyse en het in kaart brengen van de deeltjesgrootte.
4. Antimicrobiële prestatietest
- Bereid 5 ml suspensies van Staphylococcus aureus (S. aureus) en Escherichia coli (E. coli) met een initiële bacteriële troebelheid van 0,2 mcF met behulp van een vloeibaar Luria-Bertani (LB) medium.
- Voeg 10 ml van elke bacteriële oplossing toe aan 4 afzonderlijke steriele centrifugebuisjes van 15 ml. Voeg vervolgens 0,5 ml Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS en Fe-ALGMS ALG toe aan elke buis en plaats ze gedurende 12 uur in een shaker met constante temperatuur bij 37 °C en 200 tpm. Voeg een gelijke hoeveelheid zoutoplossing toe aan de controlegroep.
- Verdun elke bacteriële oplossing tot 105 keer met steriel water. Gebruik een steriele glasparel om 200 μL bacteriële oplossing op een LB vast medium te verspreiden.
- Verdeel de oplossing snel en gelijkmatig over de coatingplaat en vermijd heen en weer in hetzelfde gebied. Plaats de borden vervolgens gedurende 12 uur in een incubator bij 37 °C. Observeer de kolonies van verschillende groepen.
OPMERKING: Alle aseptische procedures moeten worden uitgevoerd in de buurt van een alcohollamp. Steriliseer microbiële kweekvaten, inentingsinstrumenten en kweekmedia.
5. Testen van de afgifte van geneesmiddelen
- Om het vermogen van verschillende microsferen om het vermogen van verschillende microsferen om het geneesmiddel af te geven, gebruikt u runderserumalbumine (BSA) als een geladen modelgeneesmiddel. Voeg 500 μl van elke microbol (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS en Fe-ALGMS) toe aan 1 mg/ml BSA-suspensie gedurende 24 uur.
- Voeg voor de bepaling van de afgifte van het geneesmiddel elk verzadigd monster toe aan 5,0 m fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,4), gevolgd door roeren gedurende 15 minuten bij 37 °C met continu schudden bij 80 tpm.
- Gebruik 100 μL van de oplossing en vervang het medium door een vers medium na 1, 3, 6, 12, 24, 36 en 48 uur.
- Kwantificeer de supernatante eiwitconcentraties op specifieke tijdstippen met behulp van een BCA-kit volgens de instructies van de fabrikant. Meet het vrijgekomen geneesmiddel kwantitatief met behulp van een enzymmarker om de bijbehorende absorptie te verkrijgen en zet de gemeten waarde om in de werkelijke geneesmiddelconcentratie volgens de standaardcurve. Bereken de snelheid van afgifte van geneesmiddelen met behulp van de volgende formule:
Percentage van vrijlating van geneesmiddel = (concentratie van vrijgekomen geneesmiddel op een specifiek tijdstip / initiële geneesmiddelconcentratie) x 100% - Verwijder met regelmatige tussenpozen een gelijk volume PBS uit elk putje en vervang het door een gelijk volume vers medium.
6. Hemolyse test
- Breng de bereide Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS en Fe-ALGMS in PBS en incubeer ze gedurende 24 uur bij 37 °C om de incubatieoplossing te formuleren.
- Verkrijg volbloed van gezonde BALB/c-muizen door middel van oculaire aderlaten, verzameld in antigecoaguleerde buisjes die natriumcitraat bevatten. Vortex en centrifugeer bij 1509 x g gedurende 15 minuten om rode bloedcellen te verkrijgen.
- Spoel de rode bloedcellen 2x-3x met PBS en bereid een 10% rode bloedceloplossing met PBS.
- Bereiding van verschillende ALGMS: Neem 500 μl van elke microbol voor de experimentele groep, 1 ml ultrapuur water (ddH2O) voor de positieve controlegroep en 1 ml PBS-oplossing voor de negatieve controlegroep en meng elk met 20 μl bloedceloplossing.
- Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 4 uur, centrifugeer bij 1509 x g, 15 min. Houd het supernatans opzij en fotografeer de rode bloedcellen in elke groep na hemolyse.
- Neem de hemolysesnelheid van de positieve controlegroep als 100% en de negatieve controlegroep als 0%. Meet de absorptiewaarden van de supernatanten in elke groep en bereken de hemolysesnelheid met behulp van de formule:
Hemolyse (%) = (Absorptiewaarden van de supernatanten van elke groep-
Absorptiewaarden van alleen gedestilleerd water) / (Absorptiewaarden van de positieve controlegroep - Absorptiewaarden van alleen gedestilleerd water) x 100
7. Test op cytobiocompatibiliteit
- Was de verschillende ALGMS 2x met PBS en leg ze 15 minuten in een petrischaaltje van 5 ml en gooi de supernatant weg.
- Voeg afzonderlijk verschillende ALGMS toe van 0,2 ml in volledig kweekmedium (DMEM) dat 10% FBS bevat, incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur en filtreer de oplossing om het percolaat te verkrijgen.
- Kweek NIH3T3-cellen tot ongeveer 70% celdichtheid in platen met 24 putjes, behandel de NIH3T3-cellen met een uitlogingsoplossing voor microsferen en blijf nog 24 uur met volledig medium kweken.
- Verwijder het celkweekmedium en was de cellen met PBS.
- Beoordeel de levensvatbaarheid van de cel met behulp van Calcein-AM/PI-assay. Neem 2,5 μL Calcein-AM-oplossing (4 mM) en 12,5 μL PI-oplossing (2 mM) en voeg deze toe aan 5 ml 1x PBS en meng goed om een werkende oplossing te verkrijgen met 2 μM Calcein-AM en 5 μM PI.
- Voeg de werkoplossing toe aan eerder gezaaide celkweekplaten in een concentratie van 500 μl per putje, incubeer bij 37 °C onder lichtbescherming gedurende 15 minuten en observeer en fotografeer onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Stel drie replicaten in voor elke groep.
- Bereken de levensvatbaarheid van de cel aan de hand van de volgende formule:
Levensvatbaarheid van de cellen (%) = aantal levensvatbare cellen / (aantal levensvatbare cellen + aantal dode cellen)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Karakterisering van ALGMS verknoopt met verschillende metaalionen
De optische morfologie van Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS en Fe-ALGMS wordt weergegeven in figuur 2, met een goede bolvorm, een glad oppervlak, een uniforme deeltjesgrootteverdeling (aanvullende figuur 2) en een uitstekende monodispersiteit. We voerden verder microscopische karakterisering uit met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) en energiedispersieve spectroscopie (EDS) analys...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit protocol presenteren we een methode voor het bereiden van ALGMS op basis van microfluïdische electrospray-technologie. De methode is eenvoudig te bedienen en levert een groot aantal microsferen op met een uniforme rondheid en regelbare diameter. Deze aanpak biedt gemak aan onderzoekers en kan het onderzoek naar en de toepassing van hydrogel-microsferen bevorderen. Bovendien werden door verknoping met verschillende metaalionen de stabiliteit en bioactiviteit van het ALGMS verbeterd. In de antimicrobiële experimente...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er mogen geen belangenconflicten worden bekendgemaakt.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een onderzoeksproject van de Zhejiang Shuren University (2023R053 en 2023KJ237).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 120 mesh screen | Solarbio,China | YA0946 | |
| Alcohol brander | Solarbio,China | YA2320 | |
| BALB/c muizen | Wukong Biotechnology,China | ||
| Bicinchoninic zuur assay reagens | Meilunbio,China | MA0082 | |
| Rund serum albumine | Lablead,China | 9048-46-8 | |
| CaCl2 poeder | Aladdin,China | 10043-52-4 | |
| Calcein-AM/PI | Biosharp,China | BL130A | |
| Centrifugebuizen | Corning,Amerika | 430290 | |
| CuSO4 poeder | Jnxinyuehuagong,China | 7758-99-8 | |
| DMEM | Gibicol,China | C11995500BT | |
| FeCl3 poeder | Aladdin,China | 7705-08-0 | |
| Fetaal rund serum | HAKATA,China | HN-FBS | |
| Glasbuizen | Sartorius,Duitsland | CC0028 | |
| Lichtmicroscoop | Evidentscientific,Japan | BX53(LED) | |
| Microfluidische spuitpomp | Longerpump,Engeland | LSP01-3A | |
| NIH3T3 | HyGyte,China | TCM-C752 | |
| Petrischaal | Thermofisher,Amerika | 150464 | |
| Fosfaat bufferoplossing | Thermofisher,Amerika | 3002 | |
| Scanning elektronenmicroscoop | Thermofisher,Amerika | Axia ChemiSEM | |
| Natriumalginaat poeder | Bjbalb,China | Y13095 | |
| ZnSO4 poeder | Jnxinyuehuagong,China | 7733-02-0 |
Referenties
- Gong, J., et al. A review of recent advances of cellulose-based intelligent-responsive hydrogels as vehicles for controllable drug delivery system. Int J BiolMacromol. 264 (2), 130525(2024).
- Zhao, Z., et al. Injectable microfluidic hydrogel microspheres for cell and drug delivery. Adv Funct. 31 (31), 2103339(2021).
- Qiao, S., Chen, W., Zheng, X., Ma, L. Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery. Int J Biol Macromol. 254 (2), 127649(2024).
- Lei, L., et al. Antimicrobial hydrogel microspheres for protein capture and wound healing. Mater Design. 215, 110478(2022).
- Ju, Y., et al. Zn2+ incorporated composite polysaccharide microspheres for sustained growth factor release and wound healing. Mater Today Bio. 22, 100739(2023).
- El-Sayed, N. S., Hashem, A. H., Khattab, T. A., Kamel, S. New antibacterial hydrogels based on sodium alginate. Int. J Biol Macromol. 248, 125872(2023).
- Olukman Şahin, M., Şanlı, O. In vitro 5-fluorouracil release properties investigation from pH sensitive sodium alginate coated and uncoated methyl cellulose/chitosan microspheres. Int J Biol Macromol. 258 (1), 128895(2024).
- Chi, H., Qiu, Y., Ye, X., Shi, J., Li, Z. Preparation strategy of hydrogel microsphere and its application in skin repair. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1239183(2023).
- Yang, L., et al. Bio-inspired dual-adhesive particles from microfluidic electrospray for bone regeneration. Nano Res. 16 (4), 5292-5299 (2022).
- Zheng, H., et al. Celastrol-encapsulated microspheres prepared by microfluidic electrospray for alleviating inflammatory pain. Biomater Adv. 149, 213398(2023).
- Yang, L., Yang, W., Xu, W., Zhao, Y., Shang, L. Bio-inspired Janus microcarriers with sequential actives release for bone regeneration. Chem Eng J. 476, 146797(2023).
- Yang, L., Sun, L., Zhang, H., Bian, F., Zhao, Y. Ice-inspired lubricated drug delivery particles from microfluidic electrospray for osteoarthritis treatment. ACS Nano. 15 (12), 20600-20606 (2021).
- Li, S., et al. Ultra-flexible stretchable liquid metal circuits with antimicrobial properties through selective laser activation for health monitoring. Chem Eng J. 482, 149173(2024).
- Sukhodub, L., Kumeda, M., Sukhodub, L., Bielai, V., Lyndin, M. Metal ions doping effect on the physicochemical, antimicrobial, and wound healing profiles of alginate-based composite. Carbohydr Polym. 304, 120486(2023).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).
- Bertsch, P., Diba, M., Mooney, D. J., Leeuwenburgh, S. C. G. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
- Yang, L., et al. Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair. Nanomicro Lett. 14 (1), 4(2021).
- Wu, D., et al. NK-Cell-Encapsulated porous microspheres via microfluidic electrospray for tumor immunotherapy. ACS Appl Mater. 11 (37), 33716-33724 (2019).
- Nan, L., Zhang, H., Weitz, D. A., Shum, H. C. Development and future of droplet microfluidics. LOC. 24 (5), 1135-1153 (2024).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
