In deze studie werden zenuwmimetische composiet hydrogels ontwikkeld en gekarakteriseerd die kunnen worden gebruikt om het pro-regeneratieve gedrag van van vet afgeleide stamcellen voor het herstel van ruggenmergletsel te onderzoeken en te benutten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ontwikkeling van combinatorische therapieën voor ruggenmergletsel met behulp van stamcelafgifte
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) veroorzaakt een permanent sensomotorisch tekort onder de plaats van het letsel. Het treft ongeveer een kwart miljoen mensen in de VS en het vormt een onmetelijk probleem voor de volksgezondheid. Er is onderzoek gedaan om effectieve therapie te bieden; dwarslaesie wordt echter nog steeds als ongeneeslijk beschouwd vanwege de complexe aard van de plaats van de verwonding. Een verscheidenheid aan strategieën, waaronder medicijnafgifte, celtransplantatie en injecteerbare biomaterialen, worden onderzocht, maar één strategie alleen beperkt hun werkzaamheid voor regeneratie. Als zodanig hebben combinatorische therapieën onlangs aandacht gekregen die zich kunnen richten op veelzijdige kenmerken van de verwonding. Het is aangetoond dat extracellulaire matrices (ECM) de werkzaamheid van celtransplantatie voor SCI kunnen verhogen. Daartoe werden 3D-hydrogels bestaande uit gedecellulariseerde ruggenmerg (dSC's) en heupzenuwen (dSN's) in verschillende verhoudingen ontwikkeld en gekarakteriseerd. Histologische analyse van dSC's en dSN's bevestigde de verwijdering van cellulaire en nucleaire componenten, en inheemse weefselarchitecturen werden behouden na decellularisatie. Daarna werden samengestelde hydrogels gemaakt in verschillende volumetrische verhoudingen en onderworpen aan analyses van troebelheid, gelatiekinetiek, mechanische eigenschappen en levensvatbaarheid van ingebedde menselijke vetstamcellen (hASC). Er werden geen significante verschillen in mechanische eigenschappen gevonden tussen de verschillende verhoudingen van hydrogels en gedecellulariseerde ruggenmergmatrices. Menselijke ASC's ingebed in de gels bleven levensvatbaar gedurende de 14-daagse cultuur. Deze studie biedt een middel om weefselgemanipuleerde combinatorische hydrogels te genereren die zenuwspecifieke ECM en pro-regeneratieve mesenchymale stamcellen presenteren. Dit platform kan nieuwe inzichten verschaffen in neuro-regeneratieve strategieën na SCI met toekomstig onderzoek.
Inleiding
Ongeveer 296.000 mensen lijden aan traumatische dwarslaesie en elk jaar doen zich ongeveer 18.000 nieuwe gevallen van niet-dwarslaesie voor in de VS1. Traumatische dwarslaesie wordt vaak veroorzaakt door vallen, schotwonden, auto-ongelukken en sportactiviteiten en veroorzaakt vaak permanent verlies van de sensomotorische functie onder de plaats van het letsel. De geschatte levenslange kosten voor de behandeling van dwarslaesie variëren van één tot vijf miljoen dollar per persoon met een aanzienlijk lagere levensverwachting1. Toch wordt dwarslaesie nog steeds slecht begrepen en grotendeel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De varkensweefsels werden commercieel verkregen, dus goedkeuring was niet vereist door de ethische commissie voor dieren.
1. Decellularisatie van het ruggenmerg van varkens (geschatte tijd: 5 dagen)
OPMERKING: Voer de decellularisatie uit met behulp van eerder vastgestelde protocollen met wijzigingen 25,26. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele bioveiligheidskast bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Alle oplossingen moeten steriel worden gefilterd met behulp van een flessendopfilt....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Gedecellulariseerde weefsels werden geprepareerd met behulp van eerder vastgestelde protocollen met kleine wijzigingen26,27. Na decellularisatie, vriesdrogen en spijsvertering werden zenuwcomposiethydrogels in verhoudingen van SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 en hydrogels met alleen ruggenmerg gefabriceerd (Figuur 1). De verwijdering van nucleaire componenten werd bevestigd door H&E-kleuring (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er wordt algemeen aangenomen dat de pathofysiologie van dwarslaesie complex en veelzijdig is. Hoewel enkelvoudige therapieën zoals celtransplantatie, medicijnafgifte en biomaterialen elk waardevolle inzichten hebben opgeleverd in SCI, kan de gecompliceerde aard van SCI hun individuele werkzaamheid beperken 28,29,30,31. Daarom zijn de inspanningen om effectieve .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de PhRMA Foundation en de National Institutes of Health via het prijsnummer P20GM139768 en R15NS121884 toegekend aan YS. We willen Dr. Kartik Balachandran en Dr. Raj Rao van de afdeling Biomedische Technologie van de Universiteit van Arkansas bedanken voor het feit dat we hun apparatuur mochten gebruiken. We willen ook Dr. Jin-Woo Kim en de heer Patrick Kuczwara van de afdeling Biologische en Landbouwtechniek van de Universiteit van Arkansas bedanken voor het geven van training over rheometer.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonaat binnenzout | Sigma-Aldrich | D4266 | Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus, SB-10 |
| 3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propaansulfonaat | Sigma-Aldrich | H6883 | Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus, SB-16 |
| AlamarBlue reagens | Fisher Scientific | DAL1100 | Gebruikt tijdens AlamarBlue celviabiliteitstest |
| Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C3667 | Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Deoxyribonuclease | Sigma-Aldrich | D4263 | Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus |
| Diwaterstoffosfaat diwaterstof zevenwaterstof | VWR | BDH9296 | Chemisch voor 100 mM Na/50 mM phos en 50 mM Na/10 mM phos buffer |
| DNeasy Blood & Tissue kit | Qiagen | 69506 | Gebruikt tijdens DNA-analyse |
| Dpx Mountant voor histologie, middel voor het plaatsen van glazen platen | Sigma-Aldrich | 6522 | Gebruikt tijdens H&E-kleuring |
| Eosine | Sigma-Aldrich | HT110216 | Gebruikt tijdens H&E-kleuring |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | Gebruikt tijdens H&E-kleuring |
| Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich | G6257 | Gebruikt tijdens functionele behandeling van PDMS-oppervlakken |
| hASC-groeimedium | Lonza | PT-4505 | Gebruikt om hASC's te kweken, bevat foetaal bovien serum en penicilline/streptomycine |
| Hematoxyline | VWR | 26041-06 | Gebruikt tijdens H&E-kleuring |
| menselijke afkomstige stamcel uit vetweefsel | Lonza | PT-5006 | |
| Zoutzuur (HCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | Gebruikt om gedecellulariseerde weefsels te verteren en pregels-oplossingen aan te passen |
| M199 medium | Sigma-Aldrich | M0650 | Gebruikt om pregels te verdunnen tot gewenste concentratie |
| Optimale snijtemperatuurcompound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Pepsine | Sigma-Aldrich | P7000 | Gebruikt om gedecellulariseerde weefsels te verteren |
| Perazijnzuur | Lab Alley | PAA1001 | Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | VWR | 97062-948 | |
| Plate reader | BioTek Instruments | Synergy Mx | |
| Polyethyleenimion (PEI) | Sigma-Aldrich | 181978 | Gebruikt tijdens functionele behandeling van PDMS-oppervlakken |
| Varkensnervus ischiadicus | Tissue Source LLC | Levende varkens, zonder identificeerbare informatie en zonder traceerbaarheidsdetails | |
| Varkensruggenmerg | Tissue Source LLC | Levende varkens, zonder identificeerbare informatie en zonder traceerbaarheidsdetails | |
| QuantiFluor dsDNA systeem | Promega | E2670 | Gebruikt om DNA-inhoud te analyseren |
| Reometer | TA Instruments | DHR 2 | |
| Rugged rotator | Glas-co | 099A RD4512 | Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg |
| Natriumchloride (NaCl) | VWR | BDH9286 | Chemisch voor 100 mM Na/50 mM phos en 50 mM Na/10 mM phos buffer |
| natriumdeoxycholaat | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Natriumdihydrogeenfosfaat monohydraat | VWR | BDH9298 | Chemisch voor 100 mM Na/50 mM phos en 50 mM Na/10 mM phos buffer |
| Natriumhydroxide-oplossing (NaOH) | Sigma-Aldrich | 415443 | Gebruikt om pregels-oplossingen aan te passen |
| SU-8 | Kayaku advnaced materials | SU8-100 | Gebruikt om siliconenwafers te coaten |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg |
| Sylgard 184 siliconenelastomeerkit | DOW | 1317318 | Polydimethylxilooxaan (PDMS) basis en uithardingsmiddel |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg |
| Trypsine-EDTA (0,05%), fenolrood | Thermo Fisher | 25300062 | Gebruikt tijdens werk met hASC en tijdens decellularisatie van het ruggenmerg |
| Tube revolver rotator | Thermo Fisher | 88881001 | Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus |
| XYleen | VWR | MK866816 | Gebruikt tijdens H&E-kleuring |
Referenties
- National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , Univ. of Alabama at Birmingham. Birmingham, AL. (2017).
- Anjum, A., et al. Spinal cord in....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
