Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ontwikkeling van combinatorische therapieën voor ruggenmergletsel met behulp van stamcelafgifte

870 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66872

⸱

7 juni 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie werden zenuwmimetische composiet hydrogels ontwikkeld en gekarakteriseerd die kunnen worden gebruikt om het pro-regeneratieve gedrag van van vet afgeleide stamcellen voor het herstel van ruggenmergletsel te onderzoeken en te benutten.

Samenvatting

Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) veroorzaakt een permanent sensomotorisch tekort onder de plaats van het letsel. Het treft ongeveer een kwart miljoen mensen in de VS en het vormt een onmetelijk probleem voor de volksgezondheid. Er is onderzoek gedaan om effectieve therapie te bieden; dwarslaesie wordt echter nog steeds als ongeneeslijk beschouwd vanwege de complexe aard van de plaats van de verwonding. Een verscheidenheid aan strategieën, waaronder medicijnafgifte, celtransplantatie en injecteerbare biomaterialen, worden onderzocht, maar één strategie alleen beperkt hun werkzaamheid voor regeneratie. Als zodanig hebben combinatorische therapieën onlangs aandacht gekregen die zich kunnen richten op veelzijdige kenmerken van de verwonding. Het is aangetoond dat extracellulaire matrices (ECM) de werkzaamheid van celtransplantatie voor SCI kunnen verhogen. Daartoe werden 3D-hydrogels bestaande uit gedecellulariseerde ruggenmerg (dSC's) en heupzenuwen (dSN's) in verschillende verhoudingen ontwikkeld en gekarakteriseerd. Histologische analyse van dSC's en dSN's bevestigde de verwijdering van cellulaire en nucleaire componenten, en inheemse weefselarchitecturen werden behouden na decellularisatie. Daarna werden samengestelde hydrogels gemaakt in verschillende volumetrische verhoudingen en onderworpen aan analyses van troebelheid, gelatiekinetiek, mechanische eigenschappen en levensvatbaarheid van ingebedde menselijke vetstamcellen (hASC). Er werden geen significante verschillen in mechanische eigenschappen gevonden tussen de verschillende verhoudingen van hydrogels en gedecellulariseerde ruggenmergmatrices. Menselijke ASC's ingebed in de gels bleven levensvatbaar gedurende de 14-daagse cultuur. Deze studie biedt een middel om weefselgemanipuleerde combinatorische hydrogels te genereren die zenuwspecifieke ECM en pro-regeneratieve mesenchymale stamcellen presenteren. Dit platform kan nieuwe inzichten verschaffen in neuro-regeneratieve strategieën na SCI met toekomstig onderzoek.

Inleiding

Ongeveer 296.000 mensen lijden aan traumatische dwarslaesie en elk jaar doen zich ongeveer 18.000 nieuwe gevallen van niet-dwarslaesie voor in de VS1. Traumatische dwarslaesie wordt vaak veroorzaakt door vallen, schotwonden, auto-ongelukken en sportactiviteiten en veroorzaakt vaak permanent verlies van de sensomotorische functie onder de plaats van het letsel. De geschatte levenslange kosten voor de behandeling van dwarslaesie variëren van één tot vijf miljoen dollar per persoon met een aanzienlijk lagere levensverwachting1. Toch wordt dwarslaesie nog steeds slecht begrepen en grotendeels ongeneeslijk, voornamelijk als gevolg van complexe pathofysiologische gevolgen na het letsel2. Er zijn verschillende strategieën onderzocht, waaronder celtransplantatie en scaffolds op basis van biomaterialen. Hoewel transplantatie van cellen en biomaterialen potentieel heeft aangetoond, suggereert de veelzijdige aard van SCI dat combinatorische benaderingen gunstiger kunnen zijn3. Als gevolg hiervan zijn veel combinatorische strategieën onderzocht en hebben ze een betere therapeutische werkzaamheid aangetoond dan individuele componenten. Er zijn echter verdere studies nodig om nieuwe biomaterialen te leveren voor het afleveren van cellen en medicijnen3.

Een veelbelovende benadering voor het vervaardigen van natuurlijke hydrogels is weefseldecellularisatie. Het proces van decellularisatie maakt gebruik van ionische, niet-ionische, fysische en combinatorische methoden om alle of de meeste cellulaire en nucleïnematerialen te verwijderen met behoud van ECM-componenten. Door alle of de meeste cellulaire componenten te verwijderen, zijn ECM-afgeleide hydrogels minder immunoreactief voor de gastheer na implantatie/injectie4. Er zijn verschillende parameters die moeten worden gemeten om de kwaliteit van gedecellulariseerde weefsels te beoordelen: verwijdering van cellulaire/nucleïne-inhoud, mechanische eigenschappen en ECM-bewaring. De volgende criteria zijn vastgesteld om nadelige immuunresponsen te voorkomen: 1) minder dan 50 ng dubbelstrengs DNA (dsDNA) per mg ECM droog gewicht, 2) minder dan 200 bp DNA-fragmentlengte, en 3) bijna of geen zichtbaar nucleair materiaal gekleurd met 4'6-diamidino-2-fenuylindool (DAPI)5. Mechanische eigenschappen kunnen worden gekwantificeerd door middel van trek-, compressie- en/of reologietests en moeten vergelijkbaar zijn met het oorspronkelijke weefsel6. Bovendien kan eiwitconservering worden geëvalueerd door middel van proteomics of kwantitatieve tests die zich richten op de belangrijkste componenten van gedecellulariseerde weefsels, bijvoorbeeld laminine, glycosaminoglycaan (GAG) en chondroïtinesulfaatproteoglycaan (CSPG) voor het ruggenmerg 7,8. Geverifieerde ECM-afgeleide hydrogels kunnen opnieuw worden gecellulariseerd met verschillende soorten cellen om celgebaseerde therapie te ondersteunen9.

Een verscheidenheid aan celtypen, zoals Schwann-cellen, olfactorische omhullende cellen, van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) en neurale stam-/voorlopercellen, zijn bestudeerd voor SCI-reparatie 10,11,12. Het klinische gebruik van deze cellen is echter beperkt vanwege ethische bezwaren, schaarse integratie met naburige cellen/weefsels, gebrek aan weefselbronnen voor een hoge opbrengst, onvermogen om zichzelf te vernieuwen en/of beperkte proliferatieve capaciteit 13,14,15. In tegenstelling tot deze celtypen zijn van menselijk vet afgeleide MSC's (hASC's) een aantrekkelijke kandidaat omdat ze gemakkelijk op een minimaal invasieve manier kunnen worden geïsoleerd met behulp van lipoaspiraten, en een groot aantal cellen kan worden verkregen16. Bovendien hebben hASC's het vermogen om groeifactoren en cytokines af te scheiden die het potentieel hebben van neuroprotectieve, angiogenetische, wondgenezing, weefselregeneratie en immunosuppressie 17,18,19,20,21.

Zoals beschreven, zijn er meerdere onderzoeken uitgevoerd 22,23,24, en er is veel van geleerd, maar heterogene kenmerken van dwarslaesie hebben hun werkzaamheid bij het bevorderen van functioneel herstel beperkt. Als zodanig zijn combinatorische benaderingen voorgesteld om de werkzaamheid van de behandeling voor dwarslaesie te verhogen. In deze studie werden samengestelde hydrogels ontwikkeld door gedecellulariseerde ruggenmerg en heupzenuwen te combineren voor een driedimensionale (3D) hASC-cultuur. Succesvolle decellularisatie werd bevestigd door histologische en DNA-analyses, en verschillende verhoudingen van zenuwcomposiethydrogels werden gekarakteriseerd door geleerkinetiek en compressietests. De levensvatbaarheid van hASC's in de zenuwcomposiet hydrogels werd onderzocht om te bewijzen dat deze hydrogel kan worden gebruikt als een 3D-celkweekplatform.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De varkensweefsels werden commercieel verkregen, dus goedkeuring was niet vereist door de ethische commissie voor dieren.

1. Decellularisatie van het ruggenmerg van varkens (geschatte tijd: 5 dagen)

OPMERKING: Voer de decellularisatie uit met behulp van eerder vastgestelde protocollen met wijzigingen 25,26. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele bioveiligheidskast bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Alle oplossingen moeten steriel worden gefilterd met behulp van een flessendopfilter (0,2 μm poriegrootte) in geautoclaveerde flessen. Procedures die bij 37 °C moeten worden uitgevoerd, kunnen worden uitgevoerd in een incubator of een schone oven die is ingesteld op 37 °C.

  1. Bereiding van decellularisatieoplossingen
    OPMERKING: Alle oplossingen zijn berekend voor 1 L. Gebruikers moeten mogelijk het uiteindelijke vereiste volume aanpassen aan hun experimentele behoeften.
    1. Verdun 500 ml 0,05% trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met 500 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om 0,025% trypsine/EDTA te maken.
    2. Verdun 300 ml 10% Triton X-100 met 700 ml PBS om 3% Triton X-100 te maken. Meng 0,56 g NaCl, 1,31 g NaH2PO4H2O en 10,85 g HNa2O4P·7H2O in 1 L gedeïoniseerd water om 100 mM Na/50 mM phos-buffer te maken.
    3. Meng 32,4 g sucrose in 1 L gedeïoniseerd water om 1 M sucrose te maken. Meng 40 g natriumdeoxycholaat (SD) in 1 l gedeïoniseerd water om een 4% SD-oplossing te maken. Verdun 6,7 ml 15% perazijnzuur met 993,3 ml 4% ethanol.
  2. Voorbereiding van het ruggenmerg van varkens
    OPMERKING: Ruggenmerg werd diepgevroren verzonden zonder enige oplossing en tot gebruik bij -80 °C bewaard.
    1. Ontdooi het ruggenmerg bij 4 °C in de koelkast gedurende 18-24 uur voordat u het decellulariseert. Gebruik een steriele schaar om dura mater voorzichtig te verwijderen.
    2. Snijd het ruggenmerg in kleine stukjes (ongeveer 1 cm lang). Plaats een stuk in een tube van 15 ml of maximaal drie stuks in een tube van 50 ml.
  3. Decellularisatie van het ruggenmerg
    OPMERKING: Na elke stap worden decellularisatieoplossingen handmatig in een grote beker gegoten om te worden weggegooid. Kleine autoclaveerbare roestvrijstalen zeef kan worden gebruikt om decellularisatieoplossingen weg te gooien zonder de weefsels te verliezen die nodig zijn voor elke stap. Het ruggenmerg werd geagiteerd bij 83 tpm, tenzij anders vermeld.
    1. Spoel het ruggenmerg 18-24 uur af met gedeïoniseerd water bij 4 °C en 60 tpm.
    2. Spoel het ruggenmerg gedurende 1 uur met 0,025% trypsine/EDTA bij 37 °C en 40 rpm. Spoel vervolgens het ruggenmerg 2x 15 minuten lang met PBS.
    3. Spoel het ruggenmerg gedurende 2 uur af met 3% Triton X-100. Spoel het ruggenmerg 2x 15 minuten lang met 100 mM Na/50 mM fosbuffer.
    4. Spoel het ruggenmerg gedurende 1 uur af met 1 M sacharose. Spoel vervolgens het ruggenmerg gedurende 1 uur af met gedeïoniseerd water.
    5. Spoel het ruggenmerg gedurende 2 uur af met 4% SD. Spoel vervolgens het ruggenmerg 2x 15 minuten lang af met 100 mM Na/50 mM phos-buffer.
    6. Spoel het ruggenmerg gedurende 4 uur af met 0,1% perazijnzuur in 4% ethanol. Spoel vervolgens het ruggenmerg gedurende 1 uur af met PBS.
    7. Spoel het ruggenmerg 2x 1 uur lang af met gedeïoniseerd water. Spoel vervolgens het ruggenmerg gedurende 1 uur af met PBS.
    8. Vriesdroog het ruggenmerg gedurende 3 dagen bij 0,01 mbar en -56 °C en bewaar droog tot gebruik.

2. Decellularisatie van de heupzenuw van het varken (geschatte tijd: 5 dagen)

OPMERKING: Voer de decellularisatie uit met behulp van een vooraf vastgesteld protocol27. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele bioveiligheidskast bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Alle oplossingen moeten steriel worden gefilterd met behulp van een flessendopfilter (0,2 μm poriegrootte) in geautoclaveerde flessen. Ingrepen die bij 37 °C moeten worden uitgevoerd, kunnen worden uitgevoerd in een incubator of een schone oven die op 37 °C is ingesteld.

  1. Bereiding van decellularisatieoplossingen
    OPMERKING: Alle oplossingen zijn berekend voor 1 L. Gebruikers moeten mogelijk het uiteindelijke vereiste volume aanpassen aan hun experimentele behoeften.
    1. Bereid 50 mM Na/10 mM phos-buffer door 1,86 g NaCl, 0,262 g d NaH2PO4H2O en 2,17 g HNa2O4P·7H2O te mengen in 1 L gedeïoniseerd water.
    2. Bereid 125 mM sulfobetaïne-10 (SB-10) oplossing door 38,4 g SB-10 te mengen in 1 L 50 mM Na/10 mM fosbuffer.
    3. Bereid 3 % SD/0,6 mM sulfobetaïne-16 (SB-16)-oplossing door 30 g SD en 0,24 g SB-16 te mengen in 1 l 50 mM Na/10 mM fosbuffer.
  2. Voorbereiding van de heupzenuw van het varken
    OPMERKING: Heupzenuwen werden ingevroren met PBS verzonden en tot gebruik bij -80 °C gehouden.
    1. Ontdooi de heupzenuw bij 4 °C in de koelkast 18-24 uur voor decellularisatie.
    2. Snijd de heupzenuw in kleine stukjes (ongeveer 1 cm lang). Plaats een stuk in een tube van 15 ml of maximaal drie stuks in een tube van 50 ml.
  3. Decellularisatie van de heupzenuw
    OPMERKING: Na elke stap worden decellularisatieoplossingen handmatig in een grote beker gegoten om te worden weggegooid, en een kleine autoclaveerbare roestvrijstalen zeef kan worden gebruikt om decellularisatieoplossingen weg te gooien zonder de weefsels te verliezen die nodig zijn voor elke stap. De heupzenuw werd bij 15 tpm geagiteerd, tenzij anders vermeld.
    1. Spoel de heupzenuw gedurende 7 uur af met gedeïoniseerd water. Spoel vervolgens de heupzenuw gedurende 18 uur af met 125 mM sulfobetaïne-10 (SB-10) in 50 mM Na/10 mM fosbuffer.
    2. Spoel de heupzenuw gedurende 15 minuten met 100 mM Na/50 mM phosbuffer. Spoel vervolgens de heupzenuw gedurende 2 uur met 3% SD/0,6 mM sulfobetaïne-16 (SB-16) in 50 mM Na/10 mM fosbuffer.
    3. Spoel de heupzenuw 3x 15 minuten lang met 100 mM Na/50 mM phos-buffer. Spoel vervolgens de heupzenuw af met 125 mM SB-10 in 50 mM Na/10 mM phos-buffer gedurende 7 uur.
    4. Spoel de heupzenuw gedurende 15 minuten met 100 mM Na/50 mM phosbuffer. Spoel vervolgens de heupzenuw af met 3% SD/0,6 mM SB-16 in 50 mM Na/10 mM fosbuffer gedurende 1,5 uur.
    5. Spoel de heupzenuw 3x 15 minuten lang af met 50 mM Na/10 mM fosbuffer. Spoel vervolgens de heupzenuw gedurende 3 uur zonder te agiteren met 75 E/ml deoxyribonuclease (DNase).
    6. Spoel de heupzenuw 3x 1 uur lang met 50 mM Na/10 mM phosbuffer. Spoel vervolgens de heupzenuw gedurende 16 uur zonder te roeren bij 37 °C met 0,2 E/ml Chondroitinase ABC.
    7. Spoel de heupzenuw 3x 3 uur lang met PBS. Vries de heupzenuw gedurende 3 dagen bij 0,01 mbar en -56 °C en bewaar droog tot gebruik.

3. Vertering van gedecellulariseerde weefsels en fabricage van composiet hydrogels (geschatte tijd: 4 dagen)

  1. Hak of vermaal de gedecellulariseerde weefsels tot poeder met behulp van een schaar of homogenisator. Steriliseer het gereedschap om de weefsels te hakken of te vermalen met behulp van een autoclaaf bij 121 °C gedurende 45 minuten. De ethyleenoxidemethode is ook van toepassing.
  2. Verteer de weefsels afzonderlijk in een zoutzuur (HCl)-oplossing van 0,01 N die 1 mg/ml pepsine bevat in een concentratie van 15 mg/ml. Het geschatte gewicht van gedecellulariseerd ruggenmerg en heupzenuw is respectievelijk 50-100 mg en 100-150 mg per stuk.
  3. Plaats de magnetische staaf en roer bij 500 tpm en 4 °C gedurende minimaal 4 dagen om pregel-oplossingen te genereren.
  4. Meng de heupzenuw en het ruggenmerg in de volgende volumetrische verhoudingen: 2:1, 1:1 en 1:2. Pas de pH 7,4 aan met 1 N natriumhydroxide (NaOH) en HCl en verdun tot de gewenste concentratie met behulp van M199-media en 1x PBS. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: Voeg NaOH 1 μL per keer toe. M199-media kunnen worden gebruikt als pH-indicator omdat ze lichtroze worden wanneer de pH 7.4 is, maar pH-strips moeten worden gebruikt om de pH-waarde te bevestigen.

4. Verificatie van decellularisatie

  1. Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E; Geschatte tijd: 8 dagen)
    OPMERKING: Na elke spoelstap worden de oplossingen handmatig in een groot bekerglas gegoten en weggegooid.
    1. Fixeer vers en gedecellulariseerd ruggenmerg en heupzenuw in 3,7% formaldehyde bij 4 °C gedurende 18 uur. Plaats een stuk in een tube van 15 ml.
    2. Verwijder formaldehyde en plaats de tissues gedurende 1 dag in 10% sucrose. Verwijder 10% sucrose en plaats de tissues gedurende 6 dagen in 30% sucrose.
    3. Vul een cryomold van de juiste grootte met een optimale snijtemperatuur (OCT) voor de helft. Plaats de gedecellulariseerde tissues, bedek ze met OCT en laat ze de OCT 1 dag absorberen.
    4. Vries de tissues na 1 dag een nacht in bij -80 °C. Cryosectie van de weefsels met een dikte van 10 μm met behulp van een cryostaat.
    5. Spoel met 1x PBS gedurende 5 min, 2x. Spoel vervolgens 5 minuten af met kraanwater.
    6. Kleur gedurende 1 minuut met hematoxylineoplossing. Spoel 3x 1 minuut af met kraanwater.
    7. Kleur 1 minuut met eosineoplossing. Spoel 2x 1 minuut met 95 % ethanol en 3x 3x 1 minuut met 100% ethanol.
    8. Spoel met xyleen gedurende 1 min, 2 minuten en vervolgens 1 minuut. Laat de dia's 5 minuten drogen.
    9. Gebruik een wattenstaafje om 3 - 4 druppels dibutylftalaatpolystyreenxyleen (DPX) montageoplossing op de objectglaasjes te druppelen. Plaats de dekglaasjes op de met DPX bedekte dia's. Laat de dia's een nacht drogen.
  2. DNA-analyse (Geschatte tijd: 1 uur)
    1. Weeg gedecellulariseerde en gevriesdroogde weefsels. Isoleer en kwantificeer DNA met behulp van in de handel verkrijgbare kits volgens de instructies van de fabrikant.

5. Karakterisering van composiet hydrogels

  1. Geleertest voor troebelheid (geschatte tijd: 1 uur)
    1. Breng 100 μL pregel-oplossingen aan in elk putje van een plaat met 96 putjes op ijs. Afleesinterginctie bij 405 nm elke 2 minuten gedurende 45 minuten met behulp van een plaatlezer.
    2. Bereken de genormaliseerde extinctie met behulp van de volgende vergelijking:
      (Absorptie -Initiële absorptie) / (AbsorptieMaximaal -Initiële absorptie)
    3. Bereken de helling van de curve en de tijd om respectievelijk 50% en 95% geleering te bereiken, t1/2 en t95.
  2. Compressietest (Geschatte tijd: 1 min per hydrogel)
    1. Fabriceer composiet hydrogels in een concentratie van 12 mg/ml met een diameter van 8 mm en een hoogte van 2 mm.
    2. Gebruik een reometer om de monsters met een belasting van 250 N tussen roestvrijstalen parallelle platen samen te persen met een reksnelheid van 10% van de monsterhoogte/min. De software die reometermetingen levert, zorgt voor een spanning-rekcurve door de kracht uit te oefenen en de spanning te meten totdat de hydrogels breken.
    3. Bereken de modulus van Young uit de helling van het lineaire gebied van de spanning-rekcurves.

6. Driedimensionale cultuur van menselijke ASC's in zenuwcomposiet hydrogels

  1. Voorbereiding van het driedimensionale (3D) platform (geschatte tijd: 3 uur)
    1. Ets siliciumwafel met SU-8 fotoresist om cirkelvormige patronen te genereren met een diepte van 200 μm en een diameter van 4 mm.
    2. Meng de basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) en het verharder in een verhouding van 10:1. Giet het mengsel op de siliciumwafel en laat het 20 minuten staan om alle luchtbellen te verwijderen die ontstaan door het mengen van de PDMS-basis en het uithardingsmiddel.
    3. Zet het in de oven en laat 2 uur uitharden op 70 °C. Ontvorm de uitgeharde PDMS-plaat en pons deze uit met behulp van een biopsiepons met een diameter van 8 mm om PDMS-microwells te maken.
    4. Plaats microwells in een plaat met 96 putjes en plaats de putplaat in een luchtplasmareiniger om PDMS-microwells te steriliseren.
    5. Functionaliseer PDMS-microwells met 1% polyethyleenimine (PEI) en 0,1% glutaaraldehyde (GA) gedurende respectievelijk 10 minuten en 20 minuten. Was microwells 2x met gedestilleerd water.
  2. Bereiding van hASC's (Geschatte tijd: 7 dagen)
    1. Kweek passagecellen voor 2-5 passages in hASC's groeimedia (hASC's basale media aangevuld met foetaal runderserum (FBS) en penicilline/streptomycine (Pen-streptokok)) tot confluent. Passage en bereken het aantal cellen met behulp van een hemacytometer of cellenteller.
  3. ASC-beladen hydrogels van zenuwcomposiet (Geschatte tijd: 2 uur)
    1. Meng de heupzenuw en het ruggenmerg pregel in een volumetrische verhouding van 2:1, 1:1, 1:2 en bereid hydrogel met alleen het ruggenmerg zonder enige heupzenuwpregel te mengen.
    2. Voeg M199-media toe en pas de pH 7,4 aan met 1 N NaOH en HCl. Resuspendeer hASC's met groeimedia in de pregel met een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml.
      OPMERKING: De hoeveelheid M199 en celsuspensie moet 10% van de pregel zijn.
    3. Verdun de pregel tot 12 mg/ml met 1x PBS. Plaats de pregel op microwells en incubeer gedurende 30 minuten. Cultuur ASC-beladen hydrogels in hASC's groeimedia.
  4. Cellevensvatbaarheidstest (geschatte tijd: 4 uur per dag)
    1. Bereid oplossingen voor levensvatbaarheidstests voor met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Zuig media aan op dag 1, 4, 7 en 14. Voeg reagens toe aan de putjes en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Lees fluorescentie af bij excitatie/emissie van 560/590 nm met behulp van een plaatlezer. Bereken het procentuele verschil met behulp van de volgende vergelijking:
      [(fluorescentiemonster - fluorescentie-blanco) / fluorescentie-blanco] x 100

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Gedecellulariseerde weefsels werden geprepareerd met behulp van eerder vastgestelde protocollen met kleine wijzigingen26,27. Na decellularisatie, vriesdrogen en spijsvertering werden zenuwcomposiethydrogels in verhoudingen van SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 en hydrogels met alleen ruggenmerg gefabriceerd (Figuur 1). De verwijdering van nucleaire componenten werd bevestigd door H&E-kleuring (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er wordt algemeen aangenomen dat de pathofysiologie van dwarslaesie complex en veelzijdig is. Hoewel enkelvoudige therapieën zoals celtransplantatie, medicijnafgifte en biomaterialen elk waardevolle inzichten hebben opgeleverd in SCI, kan de gecompliceerde aard van SCI hun individuele werkzaamheid beperken 28,29,30,31. Daarom zijn de inspanningen om effectieve ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de PhRMA Foundation en de National Institutes of Health via het prijsnummer P20GM139768 en R15NS121884 toegekend aan YS. We willen Dr. Kartik Balachandran en Dr. Raj Rao van de afdeling Biomedische Technologie van de Universiteit van Arkansas bedanken voor het feit dat we hun apparatuur mochten gebruiken. We willen ook Dr. Jin-Woo Kim en de heer Patrick Kuczwara van de afdeling Biologische en Landbouwtechniek van de Universiteit van Arkansas bedanken voor het geven van training over rheometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonaat binnenzoutSigma-AldrichD4266Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propaansulfonaatSigma-AldrichH6883Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus, SB-16
AlamarBlue reagensFisher ScientificDAL1100Gebruikt tijdens AlamarBlue celviabiliteitstest
Chondroitinase ABCSigma-AldrichC3667Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus
CryostatLeicaCM1860
DeoxyribonucleaseSigma-AldrichD4263Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus
Diwaterstoffosfaat diwaterstof zevenwaterstofVWRBDH9296Chemisch voor 100 mM Na/50 mM phos en 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kitQiagen69506Gebruikt tijdens DNA-analyse
Dpx Mountant voor histologie, middel voor het plaatsen van glazen platenSigma-Aldrich6522Gebruikt tijdens H&E-kleuring
EosineSigma-AldrichHT110216Gebruikt tijdens H&E-kleuring
EthanolVWR89125-172
FormaldehydeSigma-Aldrich252549Gebruikt tijdens H&E-kleuring
Glutaraldehyde (GA)Sigma-AldrichG6257Gebruikt tijdens functionele behandeling van PDMS-oppervlakken
hASC-groeimediumLonzaPT-4505Gebruikt om hASC's te kweken, bevat foetaal bovien serum en penicilline/streptomycine
HematoxylineVWR26041-06Gebruikt tijdens H&E-kleuring
menselijke afkomstige stamcel uit vetweefselLonzaPT-5006
Zoutzuur (HCl)Sigma-Aldrich320331Gebruikt om gedecellulariseerde weefsels te verteren en pregels-oplossingen aan te passen
M199 mediumSigma-AldrichM0650Gebruikt om pregels te verdunnen tot gewenste concentratie
Optimale snijtemperatuurcompoundTissue-Tek4583
PepsineSigma-AldrichP7000Gebruikt om gedecellulariseerde weefsels te verteren
PerazijnzuurLab AlleyPAA1001Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)VWR97062-948
Plate readerBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polyethyleenimion (PEI)Sigma-Aldrich181978Gebruikt tijdens functionele behandeling van PDMS-oppervlakken
Varkensnervus ischiadicusTissue Source LLCLevende varkens, zonder identificeerbare informatie en zonder traceerbaarheidsdetails
VarkensruggenmergTissue Source LLCLevende varkens, zonder identificeerbare informatie en zonder traceerbaarheidsdetails
QuantiFluor dsDNA systeemPromegaE2670Gebruikt om DNA-inhoud te analyseren
ReometerTA InstrumentsDHR 2
Rugged rotatorGlas-co099A RD4512Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg
Natriumchloride (NaCl)VWRBDH9286Chemisch voor 100 mM Na/50 mM phos en 50 mM Na/10 mM phos buffer
natriumdeoxycholaatSigma-AldrichD6750
Natriumdihydrogeenfosfaat monohydraatVWRBDH9298Chemisch voor 100 mM Na/50 mM phos en 50 mM Na/10 mM phos buffer
Natriumhydroxide-oplossing (NaOH)Sigma-Aldrich415443Gebruikt om pregels-oplossingen aan te passen
SU-8Kayaku advnaced materialsSU8-100Gebruikt om siliconenwafers te coaten
SucroseSigma-AldrichS8501Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg
Sylgard 184 siliconenelastomeerkitDOW1317318Polydimethylxilooxaan (PDMS) basis en uithardingsmiddel
Triton X-100Sigma-AldrichX100Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg
Trypsine-EDTA (0,05%), fenolroodThermo Fisher25300062Gebruikt tijdens werk met hASC en tijdens decellularisatie van het ruggenmerg
Tube revolver rotatorThermo Fisher88881001Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus
XYleenVWRMK866816Gebruikt tijdens H&E-kleuring

Referenties

  1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , Univ. of Alabama at Birmingham. Birmingham, AL. (2017).
  2. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 1-35 (2020).
  3. Führmann, T., Anandakumaran, P. N., Shoichet, M. S. Combinatorial therapies after spinal cord injury: How can biomaterials help. Adv Healthcare Mater. 6 (10), 1-21 (2017).
  4. Xu, Y., et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury. Biomaterials. 268, November 2020 120596(2021).
  5. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  6. Franko, R., et al. Mechanical properties of native and decellularized reproductive tissues: insights for tissue engineering strategies. Sci Rep. 14 (1), 1-14 (2024).
  7. Rowlands, D., Sugahara, K., Kwok, J. C. F. Glycosaminoglycans and glycomimetics in the central nervous system. Molecules. 20 (3), 3527-3548 (2015).
  8. Silver, D. J., Silver, J. Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment, injury, and cancer. Curr Opinion Neurobiol. 27, 171-178 (2014).
  9. Porzionato, A., et al. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 19 (12), 4117(2018).
  10. Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNFoverexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  11. Tabakow, P., et al. Transplantation of autologous olfactory ensheathing cells in complete human spinal cord injury. Cell Transpl. 22 (9), 1591-1612 (2013).
  12. Hawryluk, G. W. J., et al. An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury. Stem Cells Dev. 21 (12), 2222-2238 (2012).
  13. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  14. Mackay-Sim, A., et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: A 3-year clinical trial. Brain. 131 (9), 2376-2386 (2008).
  15. Suzuki, H., et al. Current concepts of neural stem/progenitor cell therapy for chronic spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 15, 794692(2022).
  16. Kokai, L. E., Marra, K., Rubin, J. P. Adipose stem cells: Biology and clinical applications for tissue repair and regeneration. Trans Res. 163 (4), 399-408 (2014).
  17. Kingham, P. J., Kolar, M. K., Novikova, L. N., Novikov, L. N., Wiberg, M. Stimulating the neurotrophic and angiogenic properties of human adipose-derived stem cells enhances nerve repair. Stem Cells Dev. 23 (7), 741-754 (2014).
  18. Song, Y. H., Shon, S. H., Shan, M., Stroock, A. D., Fischbach, C. Adipose-derived stem cells increase angiogenesis through matrix metalloproteinase-dependent collagen remodeling. Integr Biol (United Kingdom). 8 (2), 205-215 (2016).
  19. Ribeiro, C. A., et al. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther. 3 (3), 18(2012).
  20. Salgado, J. B. O. G., et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 5 (2), 103-110 (2010).
  21. Kapur, S. K., Katz, A. J. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie. 95 (12), 2222-2228 (2013).
  22. Xu, X. M., Chen, A., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  23. Guest, J. D., et al. Influence of IN-1 antibody and acidic FGF-fibrin glue on the response of injured corticospinal tract axons to human Schwann cell grafts. J Neurosci Res. 50 (5), 888-905 (1997).
  24. Cornelison, R. C., et al. Injectable hydrogels of optimized acellular nerve for injection in the injured spinal cord. Biomed. Mater. 13 (3), 034110(2018).
  25. Crapo, P. M., et al. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 33 (13), 3539-3547 (2012).
  26. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  27. McCrary, M. W., et al. Novel sodium deoxycholate-based chemical decellularization method for peripheral nerve. Tissue Eng Part C. 26 (1), 23-36 (2020).
  28. Shahemi, N. H., et al. Application of conductive hydrogels on spinal cord injury repair: A Review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (7), 4045-4085 (2023).
  29. Huang, L. Y., et al. Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on bone marrow mesenchymal stem cells: Advances and challenges. World J Stem Cells. 15 (5), 385-399 (2023).
  30. Chakraborty, A., Ciciriello, A. J., Dumont, C. M., Pearson, R. M. Nanoparticle-based delivery to treat spinal cord injury - a mini- review. AAPS PharmSciTech. 22 (3), 101(2022).
  31. Upadhyay, R. K. Drug delivery systems, CNS protection, and the blood brain barrier. BioMed Res Int. , d869269(2014).
  32. Liu, G., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair. Int J Mol Med. 28 (4), 565-572 (2011).
  33. Sun, T., et al. Adipose-derived stem cells in immune-related skin disease: a review of current research and underlying mechanisms. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 1-14 (2024).
  34. Lewis, M., et al. Materials today bio neuro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells in aligned collagen I hydrogels. Mater Today Bio. 22, 100762(2023).
  35. Thuret, S., Moon, L. D. F., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 628-643 (2006).
  36. Ohta, Y., et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy. 19 (7), 839-848 (2017).
  37. Hur, J. W., et al. Intrathecal transplantation of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for treating spinal cord injury: A human trial. J Spinal Cord Med. 39 (6), 655-664 (2016).
  38. Muehlberg, F. L., et al. Tissue-resident stem cells promote breast cancer growth and metastasis. Carcinogenesis. 30 (4), 589-597 (2009).
  39. Ji, S. Q., et al. Adipose tissue-derived stem cells promote pancreatic cancer cell proliferation and invasion. Brazilian J Med Biol Res. 46 (9), 758-764 (2013).
  40. Zhu, Y., et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 23 (5), 925-933 (2009).
  41. Cousin, B., et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PLoS ONE. 4 (7), 31-34 (2009).
  42. Tukmachev, D., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. 22 (3-4), 306-317 (2016).
  43. Bousalis, D., et al. Decellularized peripheral nerve as an injectable delivery vehicle for neural applications. Biomed Mater Res Part A. 110, 595-611 (2022).
  44. Sharma, A., Liao, J., Williams, L. N. Structure and mechanics of native and decellularized porcine cranial dura mater. Eng. 4 (2), 205-213 (2023).
  45. Ozudogru, E., et al. Decellularized spinal cord meninges extracellular matrix hydrogel that supports neurogenic differentiation and vascular structure formation. J Tissue Eng Regen Med. 15 (11), 948-963 (2021).
  46. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  47. Saha, K., et al. Substrate modulus directs neural stem cell behavior. Biophys J. 95 (9), 4426-4438 (2008).
  48. Jiang, T., et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds. Mater Sci Eng C. 33 (6), 3514-3521 (2013).
  49. Gao, S., et al. Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci. Mater Sci Eng C. 71, 891-900 (2017).
  50. Zhou, J., et al. Tissue engineering of heart valves: PEGylation of decellularized porcine aortic valve as a scaffold for in vitro recellularization. BioMe Eng Onl. 12 (1), 1-12 (2013).
  51. Sun, D., et al. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int J Biol Macromol. 109, 1154-1163 (2018).
  52. Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization orotocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tiss Engi C. 24 (12), 697-708 (2018).
  53. Mendicino, M., Fan, Y., Griffin, D., Gunter, K. C., Nichols, K. Current state of U.S. Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products: potential cures on the horizon. Cytotherapy. 21 (7), 699-724 (2019).
  54. Lim, H. C., et al. Allogeneic umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell implantation versus microfracture for large, full-thickness cartilage defects in older patients: A multicenter randomized clinical trial and extended 5-year clinical follow-up. Ortho J Sports Med. 9 (1), 1-15 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Gedecellulariseerde hydrogelsextracellulaire matrixceltransplantatiemenselijke adipose stamcellenweefseltechniekneuro-regeneratiehydrogelkarakterisering
Ontwikkeling van combinatorische therapieën voor ruggenmergletsel met behulp van stamcelafgifte
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.