Methodenartikel

Ontwikkeling van combinatorische therapieën voor ruggenmergletsel met behulp van stamcelafgifte

DOI:

10.3791/66872

⸱

7 juni 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie werden zenuwmimetische composiet hydrogels ontwikkeld en gekarakteriseerd die kunnen worden gebruikt om het pro-regeneratieve gedrag van van vet afgeleide stamcellen voor het herstel van ruggenmergletsel te onderzoeken en te benutten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) veroorzaakt een permanent sensomotorisch tekort onder de plaats van het letsel. Het treft ongeveer een kwart miljoen mensen in de VS en het vormt een onmetelijk probleem voor de volksgezondheid. Er is onderzoek gedaan om effectieve therapie te bieden; dwarslaesie wordt echter nog steeds als ongeneeslijk beschouwd vanwege de complexe aard van de plaats van de verwonding. Een verscheidenheid aan strategieën, waaronder medicijnafgifte, celtransplantatie en injecteerbare biomaterialen, worden onderzocht, maar één strategie alleen beperkt hun werkzaamheid voor regeneratie. Als zodanig hebben combinatorische therapieën onlangs aandacht gekregen die zich kunnen richten op veelzijdige kenmerken van de verwonding. Het is aangetoond dat extracellulaire matrices (ECM) de werkzaamheid van celtransplantatie voor SCI kunnen verhogen. Daartoe werden 3D-hydrogels bestaande uit gedecellulariseerde ruggenmerg (dSC's) en heupzenuwen (dSN's) in verschillende verhoudingen ontwikkeld en gekarakteriseerd. Histologische analyse van dSC's en dSN's bevestigde de verwijdering van cellulaire en nucleaire componenten, en inheemse weefselarchitecturen werden behouden na decellularisatie. Daarna werden samengestelde hydrogels gemaakt in verschillende volumetrische verhoudingen en onderworpen aan analyses van troebelheid, gelatiekinetiek, mechanische eigenschappen en levensvatbaarheid van ingebedde menselijke vetstamcellen (hASC). Er werden geen significante verschillen in mechanische eigenschappen gevonden tussen de verschillende verhoudingen van hydrogels en gedecellulariseerde ruggenmergmatrices. Menselijke ASC's ingebed in de gels bleven levensvatbaar gedurende de 14-daagse cultuur. Deze studie biedt een middel om weefselgemanipuleerde combinatorische hydrogels te genereren die zenuwspecifieke ECM en pro-regeneratieve mesenchymale stamcellen presenteren. Dit platform kan nieuwe inzichten verschaffen in neuro-regeneratieve strategieën na SCI met toekomstig onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ongeveer 296.000 mensen lijden aan traumatische dwarslaesie en elk jaar doen zich ongeveer 18.000 nieuwe gevallen van niet-dwarslaesie voor in de VS1. Traumatische dwarslaesie wordt vaak veroorzaakt door vallen, schotwonden, auto-ongelukken en sportactiviteiten en veroorzaakt vaak permanent verlies van de sensomotorische functie onder de plaats van het letsel. De geschatte levenslange kosten voor de behandeling van dwarslaesie variëren van één tot vijf miljoen dollar per persoon met een aanzienlijk lagere levensverwachting1. Toch wordt dwarslaesie nog steeds slecht begrepen en grotendeels ongeneeslijk, voornamelijk als gevolg van complexe pathofysiologische gevolgen na het letsel2. Er zijn verschillende strategieën onderzocht, waaronder celtransplantatie en scaffolds op basis van biomaterialen. Hoewel transplantatie van cellen en biomaterialen potentieel heeft aangetoond, suggereert de veelzijdige aard van SCI dat combinatorische benaderingen gunstiger kunnen zijn3. Als gevolg hiervan zijn veel combinatorische strategieën onderzocht en hebben ze een betere therapeutische werkzaamheid aangetoond dan individuele componenten. Er zijn echter verdere studies nodig om nieuwe biomaterialen te leveren voor het afleveren van cellen en medicijnen3.

Een veelbelovende benadering voor het vervaardigen van natuurlijke hydrogels is weefseldecellularisatie. Het proces van decellularisatie maakt gebruik van ionische, niet-ionische, fysische en combinatorische methoden om alle of de meeste cellulaire en nucleïnematerialen te verwijderen met behoud van ECM-componenten. Door alle of de meeste cellulaire componenten te verwijderen, zijn ECM-afgeleide hydrogels minder immunoreactief voor de gastheer na implantatie/injectie4. Er zijn verschillende parameters die moeten worden gemeten om de kwaliteit van gedecellulariseerde weefsels te beoordelen: verwijdering van cellulaire/nucleïne-inhoud, mechanische eigenschappen en ECM-bewaring. De volgende criteria zijn vastgesteld om nadelige immuunresponsen te voorkomen: 1) minder dan 50 ng dubbelstrengs DNA (dsDNA) per mg ECM droog gewicht, 2) minder dan 200 bp DNA-fragmentlengte, en 3) bijna of geen zichtbaar nucleair materiaal gekleurd met 4'6-diamidino-2-fenuylindool (DAPI)5. Mechanische eigenschappen kunnen worden gekwantificeerd door middel van trek-, compressie- en/of reologietests en moeten vergelijkbaar zijn met het oorspronkelijke weefsel6. Bovendien kan eiwitconservering worden geëvalueerd door middel van proteomics of kwantitatieve tests die zich richten op de belangrijkste componenten van gedecellulariseerde weefsels, bijvoorbeeld laminine, glycosaminoglycaan (GAG) en chondroïtinesulfaatproteoglycaan (CSPG) voor het ruggenmerg 7,8. Geverifieerde ECM-afgeleide hydrogels kunnen opnieuw worden gecellulariseerd met verschillende soorten cellen om celgebaseerde therapie te ondersteunen9.

Een verscheidenheid aan celtypen, zoals Schwann-cellen, olfactorische omhullende cellen, van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) en neurale stam-/voorlopercellen, zijn bestudeerd voor SCI-reparatie 10,11,12. Het klinische gebruik van deze cellen is echter beperkt vanwege ethische bezwaren, schaarse integratie met naburige cellen/weefsels, gebrek aan weefselbronnen voor een hoge opbrengst, onvermogen om zichzelf te vernieuwen en/of beperkte proliferatieve capaciteit 13,14,15. In tegenstelling tot deze celtypen zijn van menselijk vet afgeleide MSC's (hASC's) een aantrekkelijke kandidaat omdat ze gemakkelijk op een minimaal invasieve manier kunnen worden geïsoleerd met behulp van lipoaspiraten, en een groot aantal cellen kan worden verkregen16. Bovendien hebben hASC's het vermogen om groeifactoren en cytokines af te scheiden die het potentieel hebben van neuroprotectieve, angiogenetische, wondgenezing, weefselregeneratie en immunosuppressie 17,18,19,20,21.

Zoals beschreven, zijn er meerdere onderzoeken uitgevoerd 22,23,24, en er is veel van geleerd, maar heterogene kenmerken van dwarslaesie hebben hun werkzaamheid bij het bevorderen van functioneel herstel beperkt. Als zodanig zijn combinatorische benaderingen voorgesteld om de werkzaamheid van de behandeling voor dwarslaesie te verhogen. In deze studie werden samengestelde hydrogels ontwikkeld door gedecellulariseerde ruggenmerg en heupzenuwen te combineren voor een driedimensionale (3D) hASC-cultuur. Succesvolle decellularisatie werd bevestigd door histologische en DNA-analyses, en verschillende verhoudingen van zenuwcomposiethydrogels werden gekarakteriseerd door geleerkinetiek en compressietests. De levensvatbaarheid van hASC's in de zenuwcomposiet hydrogels werd onderzocht om te bewijzen dat deze hydrogel kan worden gebruikt als een 3D-celkweekplatform.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De varkensweefsels werden commercieel verkregen, dus goedkeuring was niet vereist door de ethische commissie voor dieren.

1. Decellularisatie van het ruggenmerg van varkens (geschatte tijd: 5 dagen)

OPMERKING: Voer de decellularisatie uit met behulp van eerder vastgestelde protocollen met wijzigingen 25,26. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele bioveiligheidskast bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Alle oplossingen moeten steriel worden gefilterd met behulp van een flessendopfilter (0,2 μm poriegrootte) in geautoclaveerde flessen. Procedures die bij 37 °C moeten worden uitgevoerd, kunnen worden uitgevoerd in een incubator of een schone oven die is ingesteld op 37 °C.

  1. Bereiding van decellularisatieoplossingen
    OPMERKING: Alle oplossingen zijn berekend voor 1 L. Gebruikers moeten mogelijk het uiteindelijke vereiste volume aanpassen aan hun experimentele behoeften.
    1. Verdun 500 ml 0,05% trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met 500 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om 0,025% trypsine/EDTA te maken.
    2. Verdun 300 ml 10% Triton X-100 met 700 ml PBS om 3% Triton X-100 te maken. Meng 0,56 g NaCl, 1,31 g NaH2PO4H2O en 10,85 g HNa2O4P·7H2O in 1 L gedeïoniseerd water om 100 mM Na/50 mM phos-buffer te maken.
    3. Meng 32,4 g sucrose in 1 L gedeïoniseerd water om 1 M sucrose te maken. Meng 40 g natriumdeoxycholaat (SD) in 1 l gedeïoniseerd water om een 4% SD-oplossing te maken. Verdun 6,7 ml 15% perazijnzuur met 993,3 ml 4% ethanol.
  2. Voorbereiding van het ruggenmerg van varkens
    OPMERKING: Ruggenmerg werd diepgevroren verzonden zonder enige oplossing en tot gebruik bij -80 °C bewaard.
    1. Ontdooi het ruggenmerg bij 4 °C in de koelkast gedurende 18-24 uur voordat u het decellulariseert. Gebruik een steriele schaar om dura mater voorzichtig te verwijderen.
    2. Snijd het ruggenmerg in kleine stukjes (ongeveer 1 cm lang). Plaats een stuk in een tube van 15 ml of maximaal drie stuks in een tube van 50 ml.
  3. Decellularisatie van het ruggenmerg
    OPMERKING: Na elke stap worden decellularisatieoplossingen handmatig in een grote beker gegoten om te worden weggegooid. Kleine autoclaveerbare roestvrijstalen zeef kan worden gebruikt om decellularisatieoplossingen weg te gooien zonder de weefsels te verliezen die nodig zijn voor elke stap. Het ruggenmerg werd geagiteerd bij 83 tpm, tenzij anders vermeld.
    1. Spoel het ruggenmerg 18-24 uur af met gedeïoniseerd water bij 4 °C en 60 tpm.
    2. Spoel het ruggenmerg gedurende 1 uur met 0,025% trypsine/EDTA bij 37 °C en 40 rpm. Spoel vervolgens het ruggenmerg 2x 15 minuten lang met PBS.
    3. Spoel het ruggenmerg gedurende 2 uur af met 3% Triton X-100. Spoel het ruggenmerg 2x 15 minuten lang met 100 mM Na/50 mM fosbuffer.
    4. Spoel het ruggenmerg gedurende 1 uur af met 1 M sacharose. Spoel vervolgens het ruggenmerg gedurende 1 uur af met gedeïoniseerd water.
    5. Spoel het ruggenmerg gedurende 2 uur af met 4% SD. Spoel vervolgens het ruggenmerg 2x 15 minuten lang af met 100 mM Na/50 mM phos-buffer.
    6. Spoel het ruggenmerg gedurende 4 uur af met 0,1% perazijnzuur in 4% ethanol. Spoel vervolgens het ruggenmerg gedurende 1 uur af met PBS.
    7. Spoel het ruggenmerg 2x 1 uur lang af met gedeïoniseerd water. Spoel vervolgens het ruggenmerg gedurende 1 uur af met PBS.
    8. Vriesdroog het ruggenmerg gedurende 3 dagen bij 0,01 mbar en -56 °C en bewaar droog tot gebruik.

2. Decellularisatie van de heupzenuw van het varken (geschatte tijd: 5 dagen)

OPMERKING: Voer de decellularisatie uit met behulp van een vooraf vastgesteld protocol27. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele bioveiligheidskast bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Alle oplossingen moeten steriel worden gefilterd met behulp van een flessendopfilter (0,2 μm poriegrootte) in geautoclaveerde flessen. Ingrepen die bij 37 °C moeten worden uitgevoerd, kunnen worden uitgevoerd in een incubator of een schone oven die op 37 °C is ingesteld.

  1. Bereiding van decellularisatieoplossingen
    OPMERKING: Alle oplossingen zijn berekend voor 1 L. Gebruikers moeten mogelijk het uiteindelijke vereiste volume aanpassen aan hun experimentele behoeften.
    1. Bereid 50 mM Na/10 mM phos-buffer door 1,86 g NaCl, 0,262 g d NaH2PO4H2O en 2,17 g HNa2O4P·7H2O te mengen in 1 L gedeïoniseerd water.
    2. Bereid 125 mM sulfobetaïne-10 (SB-10) oplossing door 38,4 g SB-10 te mengen in 1 L 50 mM Na/10 mM fosbuffer.
    3. Bereid 3 % SD/0,6 mM sulfobetaïne-16 (SB-16)-oplossing door 30 g SD en 0,24 g SB-16 te mengen in 1 l 50 mM Na/10 mM fosbuffer.
  2. Voorbereiding van de heupzenuw van het varken
    OPMERKING: Heupzenuwen werden ingevroren met PBS verzonden en tot gebruik bij -80 °C gehouden.
    1. Ontdooi de heupzenuw bij 4 °C in de koelkast 18-24 uur voor decellularisatie.
    2. Snijd de heupzenuw in kleine stukjes (ongeveer 1 cm lang). Plaats een stuk in een tube van 15 ml of maximaal drie stuks in een tube van 50 ml.
  3. Decellularisatie van de heupzenuw
    OPMERKING: Na elke stap worden decellularisatieoplossingen handmatig in een grote beker gegoten om te worden weggegooid, en een kleine autoclaveerbare roestvrijstalen zeef kan worden gebruikt om decellularisatieoplossingen weg te gooien zonder de weefsels te verliezen die nodig zijn voor elke stap. De heupzenuw werd bij 15 tpm geagiteerd, tenzij anders vermeld.
    1. Spoel de heupzenuw gedurende 7 uur af met gedeïoniseerd water. Spoel vervolgens de heupzenuw gedurende 18 uur af met 125 mM sulfobetaïne-10 (SB-10) in 50 mM Na/10 mM fosbuffer.
    2. Spoel de heupzenuw gedurende 15 minuten met 100 mM Na/50 mM phosbuffer. Spoel vervolgens de heupzenuw gedurende 2 uur met 3% SD/0,6 mM sulfobetaïne-16 (SB-16) in 50 mM Na/10 mM fosbuffer.
    3. Spoel de heupzenuw 3x 15 minuten lang met 100 mM Na/50 mM phos-buffer. Spoel vervolgens de heupzenuw af met 125 mM SB-10 in 50 mM Na/10 mM phos-buffer gedurende 7 uur.
    4. Spoel de heupzenuw gedurende 15 minuten met 100 mM Na/50 mM phosbuffer. Spoel vervolgens de heupzenuw af met 3% SD/0,6 mM SB-16 in 50 mM Na/10 mM fosbuffer gedurende 1,5 uur.
    5. Spoel de heupzenuw 3x 15 minuten lang af met 50 mM Na/10 mM fosbuffer. Spoel vervolgens de heupzenuw gedurende 3 uur zonder te agiteren met 75 E/ml deoxyribonuclease (DNase).
    6. Spoel de heupzenuw 3x 1 uur lang met 50 mM Na/10 mM phosbuffer. Spoel vervolgens de heupzenuw gedurende 16 uur zonder te roeren bij 37 °C met 0,2 E/ml Chondroitinase ABC.
    7. Spoel de heupzenuw 3x 3 uur lang met PBS. Vries de heupzenuw gedurende 3 dagen bij 0,01 mbar en -56 °C en bewaar droog tot gebruik.

3. Vertering van gedecellulariseerde weefsels en fabricage van composiet hydrogels (geschatte tijd: 4 dagen)

  1. Hak of vermaal de gedecellulariseerde weefsels tot poeder met behulp van een schaar of homogenisator. Steriliseer het gereedschap om de weefsels te hakken of te vermalen met behulp van een autoclaaf bij 121 °C gedurende 45 minuten. De ethyleenoxidemethode is ook van toepassing.
  2. Verteer de weefsels afzonderlijk in een zoutzuur (HCl)-oplossing van 0,01 N die 1 mg/ml pepsine bevat in een concentratie van 15 mg/ml. Het geschatte gewicht van gedecellulariseerd ruggenmerg en heupzenuw is respectievelijk 50-100 mg en 100-150 mg per stuk.
  3. Plaats de magnetische staaf en roer bij 500 tpm en 4 °C gedurende minimaal 4 dagen om pregel-oplossingen te genereren.
  4. Meng de heupzenuw en het ruggenmerg in de volgende volumetrische verhoudingen: 2:1, 1:1 en 1:2. Pas de pH 7,4 aan met 1 N natriumhydroxide (NaOH) en HCl en verdun tot de gewenste concentratie met behulp van M199-media en 1x PBS. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: Voeg NaOH 1 μL per keer toe. M199-media kunnen worden gebruikt als pH-indicator omdat ze lichtroze worden wanneer de pH 7.4 is, maar pH-strips moeten worden gebruikt om de pH-waarde te bevestigen.

4. Verificatie van decellularisatie

  1. Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E; Geschatte tijd: 8 dagen)
    OPMERKING: Na elke spoelstap worden de oplossingen handmatig in een groot bekerglas gegoten en weggegooid.
    1. Fixeer vers en gedecellulariseerd ruggenmerg en heupzenuw in 3,7% formaldehyde bij 4 °C gedurende 18 uur. Plaats een stuk in een tube van 15 ml.
    2. Verwijder formaldehyde en plaats de tissues gedurende 1 dag in 10% sucrose. Verwijder 10% sucrose en plaats de tissues gedurende 6 dagen in 30% sucrose.
    3. Vul een cryomold van de juiste grootte met een optimale snijtemperatuur (OCT) voor de helft. Plaats de gedecellulariseerde tissues, bedek ze met OCT en laat ze de OCT 1 dag absorberen.
    4. Vries de tissues na 1 dag een nacht in bij -80 °C. Cryosectie van de weefsels met een dikte van 10 μm met behulp van een cryostaat.
    5. Spoel met 1x PBS gedurende 5 min, 2x. Spoel vervolgens 5 minuten af met kraanwater.
    6. Kleur gedurende 1 minuut met hematoxylineoplossing. Spoel 3x 1 minuut af met kraanwater.
    7. Kleur 1 minuut met eosineoplossing. Spoel 2x 1 minuut met 95 % ethanol en 3x 3x 1 minuut met 100% ethanol.
    8. Spoel met xyleen gedurende 1 min, 2 minuten en vervolgens 1 minuut. Laat de dia's 5 minuten drogen.
    9. Gebruik een wattenstaafje om 3 - 4 druppels dibutylftalaatpolystyreenxyleen (DPX) montageoplossing op de objectglaasjes te druppelen. Plaats de dekglaasjes op de met DPX bedekte dia's. Laat de dia's een nacht drogen.
  2. DNA-analyse (Geschatte tijd: 1 uur)
    1. Weeg gedecellulariseerde en gevriesdroogde weefsels. Isoleer en kwantificeer DNA met behulp van in de handel verkrijgbare kits volgens de instructies van de fabrikant.

5. Karakterisering van composiet hydrogels

  1. Geleertest voor troebelheid (geschatte tijd: 1 uur)
    1. Breng 100 μL pregel-oplossingen aan in elk putje van een plaat met 96 putjes op ijs. Afleesinterginctie bij 405 nm elke 2 minuten gedurende 45 minuten met behulp van een plaatlezer.
    2. Bereken de genormaliseerde extinctie met behulp van de volgende vergelijking:
      (Absorptie -Initiële absorptie) / (AbsorptieMaximaal -Initiële absorptie)
    3. Bereken de helling van de curve en de tijd om respectievelijk 50% en 95% geleering te bereiken, t1/2 en t95.
  2. Compressietest (Geschatte tijd: 1 min per hydrogel)
    1. Fabriceer composiet hydrogels in een concentratie van 12 mg/ml met een diameter van 8 mm en een hoogte van 2 mm.
    2. Gebruik een reometer om de monsters met een belasting van 250 N tussen roestvrijstalen parallelle platen samen te persen met een reksnelheid van 10% van de monsterhoogte/min. De software die reometermetingen levert, zorgt voor een spanning-rekcurve door de kracht uit te oefenen en de spanning te meten totdat de hydrogels breken.
    3. Bereken de modulus van Young uit de helling van het lineaire gebied van de spanning-rekcurves.

6. Driedimensionale cultuur van menselijke ASC's in zenuwcomposiet hydrogels

  1. Voorbereiding van het driedimensionale (3D) platform (geschatte tijd: 3 uur)
    1. Ets siliciumwafel met SU-8 fotoresist om cirkelvormige patronen te genereren met een diepte van 200 μm en een diameter van 4 mm.
    2. Meng de basis van polydimethylsiloxaan (PDMS) en het verharder in een verhouding van 10:1. Giet het mengsel op de siliciumwafel en laat het 20 minuten staan om alle luchtbellen te verwijderen die ontstaan door het mengen van de PDMS-basis en het uithardingsmiddel.
    3. Zet het in de oven en laat 2 uur uitharden op 70 °C. Ontvorm de uitgeharde PDMS-plaat en pons deze uit met behulp van een biopsiepons met een diameter van 8 mm om PDMS-microwells te maken.
    4. Plaats microwells in een plaat met 96 putjes en plaats de putplaat in een luchtplasmareiniger om PDMS-microwells te steriliseren.
    5. Functionaliseer PDMS-microwells met 1% polyethyleenimine (PEI) en 0,1% glutaaraldehyde (GA) gedurende respectievelijk 10 minuten en 20 minuten. Was microwells 2x met gedestilleerd water.
  2. Bereiding van hASC's (Geschatte tijd: 7 dagen)
    1. Kweek passagecellen voor 2-5 passages in hASC's groeimedia (hASC's basale media aangevuld met foetaal runderserum (FBS) en penicilline/streptomycine (Pen-streptokok)) tot confluent. Passage en bereken het aantal cellen met behulp van een hemacytometer of cellenteller.
  3. ASC-beladen hydrogels van zenuwcomposiet (Geschatte tijd: 2 uur)
    1. Meng de heupzenuw en het ruggenmerg pregel in een volumetrische verhouding van 2:1, 1:1, 1:2 en bereid hydrogel met alleen het ruggenmerg zonder enige heupzenuwpregel te mengen.
    2. Voeg M199-media toe en pas de pH 7,4 aan met 1 N NaOH en HCl. Resuspendeer hASC's met groeimedia in de pregel met een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml.
      OPMERKING: De hoeveelheid M199 en celsuspensie moet 10% van de pregel zijn.
    3. Verdun de pregel tot 12 mg/ml met 1x PBS. Plaats de pregel op microwells en incubeer gedurende 30 minuten. Cultuur ASC-beladen hydrogels in hASC's groeimedia.
  4. Cellevensvatbaarheidstest (geschatte tijd: 4 uur per dag)
    1. Bereid oplossingen voor levensvatbaarheidstests voor met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Zuig media aan op dag 1, 4, 7 en 14. Voeg reagens toe aan de putjes en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Lees fluorescentie af bij excitatie/emissie van 560/590 nm met behulp van een plaatlezer. Bereken het procentuele verschil met behulp van de volgende vergelijking:
      [(fluorescentiemonster - fluorescentie-blanco) / fluorescentie-blanco] x 100

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gedecellulariseerde weefsels werden geprepareerd met behulp van eerder vastgestelde protocollen met kleine wijzigingen26,27. Na decellularisatie, vriesdrogen en spijsvertering werden zenuwcomposiethydrogels in verhoudingen van SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 en hydrogels met alleen ruggenmerg gefabriceerd (Figuur 1). De verwijdering van nucleaire componenten werd bevestigd door H&E-kleuring (Figuur 2A). Om de decellularisatie kwantitatief te beoordelen, werd rest-DNA gemeten in ECM. Het dsDNA-gehalte in de verse dura mater was 132,6 ± 21,3 ng dsDNA/mg droog weefsel, terwijl vers en gedecellulariseerd ruggenmergparenchym respectievelijk 22,6 ± 8,3 ng dsDNA/mg droog weefsel en 23,74 ± 6,69 ng dsDNA/mg droog weefsel bevatte (Figuur 2B). Het gaf aan dat de dura mater vóór de decellularisatie moest worden verwijderd. De hoeveelheid dsDNA van verse en gedecellulariseerde heupzenuw was respectievelijk 222,5 ± 42,65 en 0,63 ng dsDNA/mg droog weefsel (Figuur 2C).

De geleerkinetiek van zenuwcomposiet hydrogels werd geëvalueerd om de geleringssnelheid (S) en de tijden te bepalen om 50% en 95% van de uiteindelijke troebelheid te bereiken (t1/2 en t95). De geleerkinetiek vertoonde een sigmoïdale vorm voor alle hydrogelgroepen (Figuur 3A). De snelheid van gelering (S) in alle hydrogelgroepen verschilde niet significant van elkaar. De tijd die nodig was om de helft van de uiteindelijke troebelheid, t1/2, te bereiken, was 11,32 ± 0,57 min, 13,33 ± 0,6 min en 15,7 ± 0,92 min, en 17,23 ± 1,13 min voor respectievelijk SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 en hydrogels met alleen ruggenmerg. De tijd die nodig was om 95% van de uiteindelijke troebelheid, t95, te bereiken, was 13,8 ± 0,83 min, 15,53 ± 0,83 min, 18,38 ± 0,79 min en 19,62 ± 1,27 voor respectievelijk SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 en hydrogels met alleen ruggenmerg. Deze resultaten geven aan dat hydrogels met meer inhoud van de heupzenuw sneller de stabiele toestand bereiken en dat ECM van de heupzenuw de hydrogelassemblage kan bevorderen. Het resultaat van de compressietest toonde een trend dat hydrogels met meer inhoud aan het ruggenmerg zorgen voor meer stijfheid; niettemin was het niet significant verschillend tussen alle verschillende verhoudingen van composiet hydrogels (Figuur 3B).

Om de cellevensvatbaarheid van hASC's in alle hydrogelgroepen te bepalen, werden ten slotte 3D-culturen opgezet met behulp van microgefabriceerde PDMS-microwells, zoals weergegeven in figuur 4. Gedurende de 14-daagse kweek werd de levensvatbaarheid van ASC gemeten met behulp van een in de handel verkrijgbare celkweekmedia-gebaseerde colorimetrische en fluorescentiemetabole test, waarbij procentuele verschillen met de uitlezingen werden berekend op vier verschillende tijdstippen: dag 1, dag 4, dag 7 en dag 14 (Figuur 5). De waarde van het procentuele verschil nam toe naarmate de tijdstippen toenamen, en die van hydrogel met alleen ruggenmerg was lager dan de rest van de groepen op dag 1, 4 en 14. Alles bij elkaar suggereren deze gegevens dat de levensvatbaarheid van hASC tijdens de kweekperiode toenam als gevolg van celproliferatie en toename van de celmetabolische activiteit.

figure-results-1
Figuur 1: Fabricage van zenuwcomposiet hydrogels. Het ruggenmerg en de heupzenuwen van het varken werden gedecellulariseerd, gevriesdroogd en verteerd om pregel-oplossingen te verkrijgen. Oplossingen voor heupzenuw en ruggenmerg pregel werden gemengd in een verhouding van 2:1, 1:1 en 1:2, en er werd ook pregel met alleen ruggenmerg bereid. Alle pregel-oplossingen werden geïncubeerd bij 37 °C om zenuwcomposiethydrogels te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Verificatie van decellularisatie. (A) H&E-kleuring van vers en gedecellulariseerd ruggenmerg en heupzenuwen. Pijlen geven de aanwezigheid van cellen in weefsels aan. Schaalbalken = 1 mm voor breedbeeldbeelden en 500 μm voor ingezoomde beelden (200 μm alleen voor ingezoomde gedecellulariseerde heupzenuwbeelden). (B) DNA-analyse van verse dura mater, parenchym en gedecellulariseerd ruggenmerg (respectievelijk n=10, 16 en 6). (C) DNA-analyse van verse en gedecellulariseerde heupzenuwen (respectievelijk n=8 en 3). Foutbalken geven standaarddeviaties weer. Statistische analyse werd gedaan via eenrichtings-ANOVA met een Tukey's post-hoctest voor (B) en een t-test voor (C). Afkortingen: ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Karakteriseringen van zenuwcomposiet hydrogels. (A) Genormaliseerde absorptie van zenuw composiet hydrogels (n = 5). (B) Young's modulus van gedecellulariseerde ruggenmerg- en zenuwcomposiethydrogels (n = 4 voor respectievelijk gedecellulariseerd ruggenmerg en 3 voor elke samengestelde hydrogelgroep). Foutbalken geven standaarddeviaties weer. Statistische analyse werd gedaan via eenrichtings-ANOVA met de post-hoctest van Tukey. Afkortingen: ns = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Schematisch beeld van 3D-cultuur. (A) PDMS-microwells werden gefabriceerd op een SU-8-gecoate siliciumwafel. Elke microwell werd uitgeponst met behulp van een biopsiepons van 8 mm. (B) Gedecellulariseerd ruggenmerg en heupzenuw in verschillende verhoudingen, pas de pH aan op 7,4, suspendeer opnieuw met hASC's, plaats de pregel op de microwell en incubeer gedurende 30 minuten bij 37°C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Test op de levensvatbaarheid van cellen. Het procentuele verschil van hASC's gekweekt in zenuwcomposiethydrogels op dag 1, 4, 7 en 14 (n = 3). Foutbalken geven standaarddeviaties weer. Statistische analyse werd gedaan via eenrichtings-ANOVA met de post-hoctest van Tukey. * blz<0,05; ** blz<0,01; blz<0,005; blz<0,001; NS: Niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er wordt algemeen aangenomen dat de pathofysiologie van dwarslaesie complex en veelzijdig is. Hoewel enkelvoudige therapieën zoals celtransplantatie, medicijnafgifte en biomaterialen elk waardevolle inzichten hebben opgeleverd in SCI, kan de gecompliceerde aard van SCI hun individuele werkzaamheid beperken 28,29,30,31. Daarom zijn de inspanningen om effectieve combinatorische therapieën te ontwikkelen toegenomen. De zenuwcomposiethydrogels die in deze studie worden beschreven, kunnen dienen als een effectief toedieningsmiddel voor cellen of medicijnen. Met betrekking tot cellen zijn ASC's een van de veelbelovende kandidaten voor celtransplantatie. ASC's scheiden immunomodulerende factoren af, zoals interleukine-10 (IL-10) en transformerende groeifactor bèta (TGF-β), evenals neurotrofe factoren zoals zenuwgroeifactor (NGF), van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF), gliale-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) en neurotrofine-3 (NT-3) die leiden tot verhoogde uitgroei van dorsale wortelganglia-neuriet in vitro en functieherstel in vivo 17,19,32,33, 34. okt. ASC's geleverd in waterige oplossingen bevorderden functioneel herstel na SCI bij ratten en mensen; er werden echter uitdagingen opgemerkt met het bemiddelen van migratie, differentiatie, overleving en differentiatie van ASC's 35,36,37. Daarnaast zijn er tegenstrijdige berichten over het tumorigene potentieel van getransplanteerde ASC's; terwijl sommige onderzoeken aangaven dat ASC's kunnen bijdragen aan de proliferatie en metastase van verschillende soorten kanker, hebben andere onderzoeken ook antitumorigene mogelijkheden aangetoond 38,39,40,41 Daarom moet in de toekomst een veiligheidsprofiel op lange termijn van ASC's in zenuwcomposiethydrogels worden onderzocht. Hier zijn gedecellulariseerde ruggenmerg en heupzenuwen afzonderlijk bestudeerd voor SCI-herstel.

Gedecellulariseerde ruggenmerg werd geïnjecteerd in een rattenmodel van SCI en stimuleerde axonale ingroei in de laesie en verhoogd functioneel herstel; Als gevolg van snelle afbraak werd echter een cyste gevormd en nam het herstel af na 4-8 weken behandeling4, 42. Acellulair gedecellulariseerde heupzenuwhydrogel werd geïnjecteerd bij SCI-ratten en bevorderde neurale regeneratie, maar de werkzaamheid van hydrogel was beperkt vanwege de snelle afbraak24. Daarom hebben combinatorische benaderingen met behulp van gedecellulariseerde weefsels de laatste tijd aan aandacht gewonnen. Er werd gemeld dat gedecellulariseerde ruggenmerghydrogels de proliferatie, migratie en differentiatie van neurale stamcellen/voorlopercellen in neuronen bevorderden4. Het vergemakkelijkte ook de uitgroei van 3D-neurieten uit N1E-115 neuroblastoomcellen, wat aangeeft dat de gedecellulariseerde ruggenmerghydrogels een aantrekkelijke steiger kunnen zijn om axonale regeneratie te bevorderen26. Gedecellulariseerde heupzenuwen zijn bestudeerd met Schwann-inkapseling en vertoonden potentieel als zenuwtransplantaat na SCI43. Alles bij elkaar wordt verwacht dat een combinatie van gedecellulariseerd ruggenmerg en heupzenuwen zowel axonale regeneratie als weefselherstel bevordert. De huidige studie omvat ook geen beoordeling van de therapeutische effecten van met ASC beladen zenuwhydrogels. Daarom is het essentieel om het regeneratieve potentieel, zoals pro-angiogene en neurotrofe effecten, van het platform te evalueren via in vitro en in vivo studies. Bovendien kunnen zenuwcomposiethydrogels gemakkelijk worden aangebracht om andere celtypen in te kapselen, zoals Schwann-cellen, olfactorische stamcellen en neurale stamcellen, om de therapeutische werkzaamheid van celtransplantatie te verbeteren. Het zou intrigerend zijn om de veiligheid en werkzaamheid van verschillende celtypen in de zenuwcomposiethydrogel in verschillende stadia van dwarslaesie te onderzoeken.

Een van de cruciale stappen bij het maken van composiethydrogels is het voorbereiden van een voldoende hoeveelheid weefsel, met name ruggenmerg. De opbrengst van gedecellulariseerd ruggenmerg is significant laag, zoals vermeld in het protocol (50-100 mg ruggenmergstuk en 100-150 mg heupzenuwstuk); Het oogsten of verkrijgen van ruggenmerg van kleine dieren zoals muizen en ratten wordt dus niet aanbevolen. Er wordt gesuggereerd dat ten minste middelgrote dieren, zoals konijnen, een aanzienlijke hoeveelheid ruggenmergmatrices krijgen. Het is ook belangrijk om de pH te controleren bij het verteren van gedecellulariseerde weefsels, aangezien de toevoeging van weefsel de pH kan verschuiven tot voorbij het vereiste pepsine-activeringsbereik, dat ongeveer 1.5-2 is. Agitatietijden voor decellularisatie van het ruggenmerg zijn langer dan de eerder vastgestelde methode26 omdat de agitatiesnelheid in het huidige protocol langzamer is. De rotator die in dit protocol wordt gebruikt, biedt tot 83 tpm, terwijl bij de eerder vastgestelde methoden een maximum van 200 tpm werd gebruikt. Daarom werden de roertijden twee keer verlengd om al het cellulaire vuil grondig te wassen. Om ervoor te zorgen dat alle decellularisatieoplossingen de weefsels kunnen binnendringen en alle cellulaire en nucleaire inhoud kunnen wassen, moeten de roertijden en -snelheid worden geoptimaliseerd met behulp van histologie of DNA-analyse aan de kant van de gebruiker. Er wordt gesuggereerd dat de verhouding tussen de weefsels en de decellularisatieoplossing minimaal 1:15 [w/v] is. Gedecellulariseerde weefsels in het eerder vastgestelde protocol26 werden bij kamertemperatuur verteerd/geroerd; in dit protocol werden ze echter gedurende 4 dagen verteerd met een magnetische staaf op een roerplaat bij 4 °C en 500 tpm. De motor van de roerplaat kan warmte genereren en deze in de pregel-oplossing brengen. Daarom wordt aanbevolen om bij lage temperaturen te verteren of een temperatuurregelbare roerplaat te gebruiken.

Zoals opgemerkt in DNA-analyse (Figuur 2B), is het van cruciaal belang om de dura mater van het ruggenmerg te verwijderen, omdat er een aanzienlijke hoeveelheid DNA in de dura mater kan worden gevonden. Dura mater bestaat, in tegenstelling tot het parenchym van het ruggenmerg, uit vezelig weefsel; Daarom moeten verschillende decellularisatiemethoden worden gebruikt, zoals eerder gedocumenteerd44,45. H&E-kleuring en DNA-analyse van gedecellulariseerde weefsels zijn gebruikt om de effectiviteit van het decellularisatieproces te verifiëren. Aan de volgende criteria moet worden voldaan om de doelstellingen van succesvolle decellularisatie te bereiken: 1. Minder dan 50 ng dsDNA/mg ECM droog gewicht, 2. Minder dan 200 bp DNA-fragmentlengte, 3. Gebrek aan nucleair materiaal in weefselsecties of H&E5. Kwalitatieve analyse van H&E-kleuring na decellularisatie toonde een gebrek aan kernkleuring, wat wijst op een succesvolle verwijdering van cellen. Bovendien bleven componenten van ECM, zoals collageen en andere matrixeiwitten, behouden en werd de kleuringsintensiteit verminderd na decellularisatie, als gevolg van de verwijdering van het celmateriaal. Na de decellularisatie was het DNA-gehalte 0,63 ng in de heupzenuw en 23,74 ± 6,69 ng in het ruggenmerg per mg ECM droog gewicht, wat onder de aanvaardbare drempel voor in vivo toepassing ligt.

Reologische metingen van composiet hydrogels moeten zorgvuldig worden ontworpen, aangezien reometers met hoge compressiekracht of trektesters niet kunnen worden gebruikt om de mechanische eigenschappen van zachte materialen zoals zenuwcomposiet hydrogels die in dit onderzoek zijn gemaakt, te analyseren. Monsters worden uit elkaar gescheurd/gescheurd wanneer ze op de trekbank worden gegrepen, en compressie met hoge kracht levert geen gegevens op die gevoelig genoeg zijn om te analyseren. In deze studie werd een reometer met een compressiekracht van 250 N gebruikt, en het wordt aangeraden om een apparaat te vinden met een vergelijkbare of juiste kracht voor gebruikersdoeleinden. Als alternatief kunnen verschillende reologische metingen, zoals oscillerende afschuifmeting, helpen bij het bepalen van opslag- en verliesmoduli. Verminderde mechanische eigenschappen na decellularisatie zijn een beperking in deze studie. Hoewel Young's modulus van alle hydrogelgroepen vergelijkbaar is met die van gedecellulariseerd ruggenmerg, verschilt deze significant van vers ruggenmerg (gegevens niet getoond). Neurale stamcellen en MSC's gekweekt op relatief zachte materialen vertoonden respectievelijk verhoogde neuronale differentiatie en expressie van β-III tubuline, 46,47. Het is echter mogelijk om de gedecellulariseerde materialen te versterken of te verknopen met andere materialen zoals alginaat, poly (ethyleenglycol), genipin en glutaaraldehyde 48,49,50,51. Optimalisatie zal nodig zijn om ervoor te zorgen dat deze strategieën om de mechanische eigenschappen van de hydrogels te verbeteren het cellulaire gedrag of de levensvatbaarheid niet beïnvloeden.

Variabiliteit van batch tot batch van zenuwcomposiethydrogels kan deels worden waargenomen als gevolg van verschillen in leeftijd, geslacht, gewicht en soort van dieren. Gecontroleerd en consequent gebruik van dezelfde soort dieren kan helpen om de variabiliteit te verminderen. Het samenvoegen van de weefselmonsters van verschillende dieren kan ook helpen de variabiliteit tussen batches te verminderen52. Een van de potentiële uitdagingen bij het vertalen van deze studie naar klinische toepassingen is schaalbaarheid. De lage opbrengst van decellularisatie van het ruggenmerg zou de productie van een grote hoeveelheid gedecellulariseerde weefsels belemmeren. Er zouden nieuwe methoden moeten worden ontwikkeld/geoptimaliseerd om meer weefsels te genereren, of dura mater zou samen kunnen worden gedecellulariseerd om de opbrengst na decellularisatie te verhogen. Een andere mogelijke uitdaging is de goedkeuring door de regelgevende instanties. In de VS is de FDA verantwoordelijk voor de wettelijke goedkeuring van celgebaseerde therapieën53. De regelgevende instantie van de Republiek Korea heeft de marktintroductie goedgekeurd van CARTISTEM, een op MSC gebaseerd product dat bestaat uit allogene MSC's afkomstig van navelstrengbloed en 4% hyaluronaathydrogel voor de behandeling van kniekraakbeendefecten54. Precedentgevallen zoals deze kunnen helpen bij het stroomlijnen van het beoordelingsproces van de regelgeving door gegevens over veiligheid en efficiëntie te verstrekken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de PhRMA Foundation en de National Institutes of Health via het prijsnummer P20GM139768 en R15NS121884 toegekend aan YS. We willen Dr. Kartik Balachandran en Dr. Raj Rao van de afdeling Biomedische Technologie van de Universiteit van Arkansas bedanken voor het feit dat we hun apparatuur mochten gebruiken. We willen ook Dr. Jin-Woo Kim en de heer Patrick Kuczwara van de afdeling Biologische en Landbouwtechniek van de Universiteit van Arkansas bedanken voor het geven van training over rheometer.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonaat binnenzoutSigma-AldrichD4266Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propaansulfonaatSigma-AldrichH6883Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus, SB-16
AlamarBlue reagensFisher ScientificDAL1100Gebruikt tijdens AlamarBlue celviabiliteitstest
Chondroitinase ABCSigma-AldrichC3667Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus
CryostatLeicaCM1860
DeoxyribonucleaseSigma-AldrichD4263Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus
Diwaterstoffosfaat diwaterstof zevenwaterstofVWRBDH9296Chemisch voor 100 mM Na/50 mM phos en 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kitQiagen69506Gebruikt tijdens DNA-analyse
Dpx Mountant voor histologie, middel voor het plaatsen van glazen platenSigma-Aldrich6522Gebruikt tijdens H&E-kleuring
EosineSigma-AldrichHT110216Gebruikt tijdens H&E-kleuring
EthanolVWR89125-172
FormaldehydeSigma-Aldrich252549Gebruikt tijdens H&E-kleuring
Glutaraldehyde (GA)Sigma-AldrichG6257Gebruikt tijdens functionele behandeling van PDMS-oppervlakken
hASC-groeimediumLonzaPT-4505Gebruikt om hASC's te kweken, bevat foetaal bovien serum en penicilline/streptomycine
HematoxylineVWR26041-06Gebruikt tijdens H&E-kleuring
menselijke afkomstige stamcel uit vetweefselLonzaPT-5006
Zoutzuur (HCl)Sigma-Aldrich320331Gebruikt om gedecellulariseerde weefsels te verteren en pregels-oplossingen aan te passen
M199 mediumSigma-AldrichM0650Gebruikt om pregels te verdunnen tot gewenste concentratie
Optimale snijtemperatuurcompoundTissue-Tek4583
PepsineSigma-AldrichP7000Gebruikt om gedecellulariseerde weefsels te verteren
PerazijnzuurLab AlleyPAA1001Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)VWR97062-948
Plate readerBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polyethyleenimion (PEI)Sigma-Aldrich181978Gebruikt tijdens functionele behandeling van PDMS-oppervlakken
Varkensnervus ischiadicusTissue Source LLCLevende varkens, zonder identificeerbare informatie en zonder traceerbaarheidsdetails
VarkensruggenmergTissue Source LLCLevende varkens, zonder identificeerbare informatie en zonder traceerbaarheidsdetails
QuantiFluor dsDNA systeemPromegaE2670Gebruikt om DNA-inhoud te analyseren
ReometerTA InstrumentsDHR 2
Rugged rotatorGlas-co099A RD4512Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg
Natriumchloride (NaCl)VWRBDH9286Chemisch voor 100 mM Na/50 mM phos en 50 mM Na/10 mM phos buffer
natriumdeoxycholaatSigma-AldrichD6750
Natriumdihydrogeenfosfaat monohydraatVWRBDH9298Chemisch voor 100 mM Na/50 mM phos en 50 mM Na/10 mM phos buffer
Natriumhydroxide-oplossing (NaOH)Sigma-Aldrich415443Gebruikt om pregels-oplossingen aan te passen
SU-8Kayaku advnaced materialsSU8-100Gebruikt om siliconenwafers te coaten
SucroseSigma-AldrichS8501Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg
Sylgard 184 siliconenelastomeerkitDOW1317318Polydimethylxilooxaan (PDMS) basis en uithardingsmiddel
Triton X-100Sigma-AldrichX100Gebruikt tijdens decellularisatie van het ruggenmerg
Trypsine-EDTA (0,05%), fenolroodThermo Fisher25300062Gebruikt tijdens werk met hASC en tijdens decellularisatie van het ruggenmerg
Tube revolver rotatorThermo Fisher88881001Gebruikt tijdens decellularisatie van de nervus ischiadicus
XYleenVWRMK866816Gebruikt tijdens H&E-kleuring

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , Univ. of Alabama at Birmingham. Birmingham, AL. (2017).
  2. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 1-35 (2020).
  3. Führmann, T., Anandakumaran, P. N., Shoichet, M. S. Combinatorial therapies after spinal cord injury: How can biomaterials help. Adv Healthcare Mater. 6 (10), 1-21 (2017).
  4. Xu, Y., et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury. Biomaterials. 268, November 2020 120596(2021).
  5. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  6. Franko, R., et al. Mechanical properties of native and decellularized reproductive tissues: insights for tissue engineering strategies. Sci Rep. 14 (1), 1-14 (2024).
  7. Rowlands, D., Sugahara, K., Kwok, J. C. F. Glycosaminoglycans and glycomimetics in the central nervous system. Molecules. 20 (3), 3527-3548 (2015).
  8. Silver, D. J., Silver, J. Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment, injury, and cancer. Curr Opinion Neurobiol. 27, 171-178 (2014).
  9. Porzionato, A., et al. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 19 (12), 4117(2018).
  10. Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNFoverexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  11. Tabakow, P., et al. Transplantation of autologous olfactory ensheathing cells in complete human spinal cord injury. Cell Transpl. 22 (9), 1591-1612 (2013).
  12. Hawryluk, G. W. J., et al. An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury. Stem Cells Dev. 21 (12), 2222-2238 (2012).
  13. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  14. Mackay-Sim, A., et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: A 3-year clinical trial. Brain. 131 (9), 2376-2386 (2008).
  15. Suzuki, H., et al. Current concepts of neural stem/progenitor cell therapy for chronic spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 15, 794692(2022).
  16. Kokai, L. E., Marra, K., Rubin, J. P. Adipose stem cells: Biology and clinical applications for tissue repair and regeneration. Trans Res. 163 (4), 399-408 (2014).
  17. Kingham, P. J., Kolar, M. K., Novikova, L. N., Novikov, L. N., Wiberg, M. Stimulating the neurotrophic and angiogenic properties of human adipose-derived stem cells enhances nerve repair. Stem Cells Dev. 23 (7), 741-754 (2014).
  18. Song, Y. H., Shon, S. H., Shan, M., Stroock, A. D., Fischbach, C. Adipose-derived stem cells increase angiogenesis through matrix metalloproteinase-dependent collagen remodeling. Integr Biol (United Kingdom). 8 (2), 205-215 (2016).
  19. Ribeiro, C. A., et al. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther. 3 (3), 18(2012).
  20. Salgado, J. B. O. G., et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 5 (2), 103-110 (2010).
  21. Kapur, S. K., Katz, A. J. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie. 95 (12), 2222-2228 (2013).
  22. Xu, X. M., Chen, A., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  23. Guest, J. D., et al. Influence of IN-1 antibody and acidic FGF-fibrin glue on the response of injured corticospinal tract axons to human Schwann cell grafts. J Neurosci Res. 50 (5), 888-905 (1997).
  24. Cornelison, R. C., et al. Injectable hydrogels of optimized acellular nerve for injection in the injured spinal cord. Biomed. Mater. 13 (3), 034110(2018).
  25. Crapo, P. M., et al. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 33 (13), 3539-3547 (2012).
  26. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  27. McCrary, M. W., et al. Novel sodium deoxycholate-based chemical decellularization method for peripheral nerve. Tissue Eng Part C. 26 (1), 23-36 (2020).
  28. Shahemi, N. H., et al. Application of conductive hydrogels on spinal cord injury repair: A Review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (7), 4045-4085 (2023).
  29. Huang, L. Y., et al. Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on bone marrow mesenchymal stem cells: Advances and challenges. World J Stem Cells. 15 (5), 385-399 (2023).
  30. Chakraborty, A., Ciciriello, A. J., Dumont, C. M., Pearson, R. M. Nanoparticle-based delivery to treat spinal cord injury - a mini- review. AAPS PharmSciTech. 22 (3), 101(2022).
  31. Upadhyay, R. K. Drug delivery systems, CNS protection, and the blood brain barrier. BioMed Res Int. , d869269(2014).
  32. Liu, G., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair. Int J Mol Med. 28 (4), 565-572 (2011).
  33. Sun, T., et al. Adipose-derived stem cells in immune-related skin disease: a review of current research and underlying mechanisms. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 1-14 (2024).
  34. Lewis, M., et al. Materials today bio neuro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells in aligned collagen I hydrogels. Mater Today Bio. 22, 100762(2023).
  35. Thuret, S., Moon, L. D. F., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 628-643 (2006).
  36. Ohta, Y., et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy. 19 (7), 839-848 (2017).
  37. Hur, J. W., et al. Intrathecal transplantation of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for treating spinal cord injury: A human trial. J Spinal Cord Med. 39 (6), 655-664 (2016).
  38. Muehlberg, F. L., et al. Tissue-resident stem cells promote breast cancer growth and metastasis. Carcinogenesis. 30 (4), 589-597 (2009).
  39. Ji, S. Q., et al. Adipose tissue-derived stem cells promote pancreatic cancer cell proliferation and invasion. Brazilian J Med Biol Res. 46 (9), 758-764 (2013).
  40. Zhu, Y., et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 23 (5), 925-933 (2009).
  41. Cousin, B., et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PLoS ONE. 4 (7), 31-34 (2009).
  42. Tukmachev, D., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. 22 (3-4), 306-317 (2016).
  43. Bousalis, D., et al. Decellularized peripheral nerve as an injectable delivery vehicle for neural applications. Biomed Mater Res Part A. 110, 595-611 (2022).
  44. Sharma, A., Liao, J., Williams, L. N. Structure and mechanics of native and decellularized porcine cranial dura mater. Eng. 4 (2), 205-213 (2023).
  45. Ozudogru, E., et al. Decellularized spinal cord meninges extracellular matrix hydrogel that supports neurogenic differentiation and vascular structure formation. J Tissue Eng Regen Med. 15 (11), 948-963 (2021).
  46. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  47. Saha, K., et al. Substrate modulus directs neural stem cell behavior. Biophys J. 95 (9), 4426-4438 (2008).
  48. Jiang, T., et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds. Mater Sci Eng C. 33 (6), 3514-3521 (2013).
  49. Gao, S., et al. Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci. Mater Sci Eng C. 71, 891-900 (2017).
  50. Zhou, J., et al. Tissue engineering of heart valves: PEGylation of decellularized porcine aortic valve as a scaffold for in vitro recellularization. BioMe Eng Onl. 12 (1), 1-12 (2013).
  51. Sun, D., et al. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int J Biol Macromol. 109, 1154-1163 (2018).
  52. Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization orotocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tiss Engi C. 24 (12), 697-708 (2018).
  53. Mendicino, M., Fan, Y., Griffin, D., Gunter, K. C., Nichols, K. Current state of U.S. Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products: potential cures on the horizon. Cytotherapy. 21 (7), 699-724 (2019).
  54. Lim, H. C., et al. Allogeneic umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell implantation versus microfracture for large, full-thickness cartilage defects in older patients: A multicenter randomized clinical trial and extended 5-year clinical follow-up. Ortho J Sports Med. 9 (1), 1-15 (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gedecellulariseerde hydrogelsextracellulaire matrixceltransplantatiemenselijke adipose stamcellenweefseltechniekneuro regeneratiehydrogelkarakterisering

Gerelateerde artikelen