Dit protocol beschrijft methodologieën om een eenvoudig en efficiënt in-vitromodel voor embryo-implantatie op te zetten voor het evalueren van de relevante moleculen die het embryo-implantatieproces beïnvloeden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Opstelling van een embryo-implantatiemodel in vitro
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Embryo-implantatie is de eerste stap in het tot stand brengen van een succesvolle zwangerschap. Een in vitro model voor embryo-implantatie is van cruciaal belang voor fundamenteel biologisch onderzoek, de ontwikkeling van geneesmiddelen en screening. Dit artikel presenteert een eenvoudig, snel en zeer efficiënt in vitro model voor embryo-implantatie. In dit protocol introduceren we eerst de acquisitie van blastocysten bij muizen en de voorbereiding van menselijke endometriumadenocarcinoom (Ishikawa) op implantatie, gevolgd door de co-cultuurmethode voor muizenembryo's en Ishikawa-cellen. Ten slotte hebben we een studie uitgevoerd om de impact van variërende concentraties van 17-β-oestradiol (E2) en progesteron (P4) op de adhesiepercentages van embryo's te beoordelen op basis van dit model. Onze bevindingen toonden aan dat hoge concentraties E2 de hechting van het embryo aanzienlijk verminderden, terwijl de toevoeging van progesteron de hechtingssnelheid zou kunnen herstellen. Dit model biedt een eenvoudig en snel platform voor het evalueren en screenen van moleculen die betrokken zijn bij het adhesieproces, zoals cytokines, geneesmiddelen en transcriptiefactoren die de implantatie en endometriumontvankelijkheid regelen.
Inleiding
Embryo-implantatie, de eerste stap van een succesvolle zwangerschap, is cruciaal voor het begrijpen van de biologische basis en het aanpakken van de uitdagingen van onvruchtbaarheid. Ethische beperkingen vormen echter aanzienlijke beperkingen bij het verzamelen van menselijke klinische embryomonsters, wat onderzoek naar de ingewikkelde interacties tussen menselijke embryo's en het baarmoederslijmvlies tijdens devroege zwangerschap belemmert. Een diepgaand begrip van deze complexe mechanismen is van vitaal belang voor het bevorderen van fundamenteel biologisch onderzoek, de ontdekking van geneesmiddelen en reproductieve gezondheid.
Eerdere in vitro-modellen maakten gebruik van adhesiemodellen waarbij monolayer menselijke endometriumepitheelcellen (RL95-2)2 werden gekweekt samen met embryonale substituten, zoals BeWo-, JAr- of Jeg-3 3-choriocarcinoomcellen. Desalniettemin was de selectie van de grootte van de sferoïden, variërend van 70-100 μm, cruciaal, aangezien grotere of kleinere celaggregaten de nauwkeurigheid van het experiment in gevaar konden brengen. Opmerkelijk was dat slechts 25% van de sferoïden in elk preparaat voldeed aan de norm voor de geschikte maat4, en er waren significante verschillen in vergelijking met de fysiologische omstandigheden van blastocysten.
Bovendien bieden driedimensionale (3D) kweeksystemen voor het baarmoederslijmvlies en de blastocyst een fysiologisch relevantere omgeving5, maar ze vereisen een hoge technische expertise, langzame celgroei, hoge resource- en onderhoudskosten, moeilijkheid bij standaardisatie en lage reproduceerbaarheid6.
In dit protocol presenteren we een kosteneffectief en snel in vitro model van embryo-implantatie dat in de meeste laboratoria kan worden ontwikkeld en gebruikt. Het algemene doel van deze methode is om een betrouwbaar en reproduceerbaar platform te bieden voor het bestuderen van de interacties tussen embryo's en het baarmoederslijmvlies in een gecontroleerde omgeving. Door belangrijke gebeurtenissen van embryo-implantatie in vitro te simuleren, wil dit model de kloof tussen diermodellen en klinische omgevingen overbruggen, waardoor nauwkeuriger en gerichter onderzoek mogelijk wordt.
Vergeleken met embryonale substituten biedt het gebruik van blastocysten van muizen een fysiologisch relevantere weergave van het in vivo embryo-implantatieproces7. Bovendien bezit de Ishikawa-cellijn, afgeleid van humaan endometriumadenocarcinoom, gemengde kenmerken van glandulair epitheel en baarmoederlumenepitheel1, waardoor het enzymen, structurele eiwitten en functionele steroïdereceptoren tot expressie kan brengen die vergelijkbaar zijn met die in normaal baarmoederslijmvlies, waardoor een fysiologisch relevant substraat wordt geboden voor embryo-implantatie. De eenvoud en snelheid van het co-cultuursysteem maken high-throughput screening en drugstesten mogelijk 8,9,10. Door een robuust en reproduceerbaar platform te bieden, biedt deze methode de mogelijkheid om ons begrip van embryo-implantatie en de impact ervan op de menselijke gezondheid te vergroten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het hanteren van muizen en experimentele studies werden uitgevoerd volgens protocollen die waren goedgekeurd door het Animal Committee van het Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies. Zorg voor veiligheidsprocedures: Draag altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) bij het hanteren van chemicaliën of biologische materialen.
1. Verwerving van muizenembryo's
OPMERKING: In dit gedeelte wordt het proces van het verkrijgen van muizenembryo's beschreven. Volwassen vrouwelijke muizen (6-8 weken oud, hybride C57BL/6 en DBA/2) werden onderhouden onder standaard omgevingsomstandigheden van 12 uur licht en 12 uur donker bij 20-25 °C en een luchtvochtigheid van 40-60%, waarbij voedsel en water ad libitum werden verstrekt.
- Injecteer vrouwelijke muizen intraperitoneaal met 10 IE serumgonadotrofine van drachtige merries (PMSG) en vervolgens geïnjecteerd met 10 IE humaan choriongonadotrofine (HCG) met een interval van 42-48 uur.
- Koppel elke vrouwelijke muis aan een mannetje van vergelijkbare leeftijd en controleer de volgende ochtend of er een vaginale plug is.
OPMERKING: Vaginale plug is een lichtgele klomp zetpil die wordt gevormd nadat het sperma stolt bij de vaginale opening. - Euthanaseer de vrouwelijke muizen met vaginale pluggen door CO2 -inhalatie.
- Open de buik en zoek de vrouwelijke geslachtsorganen; rek de eileider, eierstok en vetkussentjes uit met een pincet; knip de eileider en eierstok met een schaar; en snijd vervolgens de eileider en baarmoeder door (Figuur 1).
- Breng de verkregen eileider over in een petrischaal van 35 mm die is voorgevuld met M2-medium.
OPMERKING: M2 medium moet worden voorverwarmd in een incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 30 minuten. - Prik met een naald van 25 G in de vergrote ampulla van de eileider om het cumulus-zygote-complex los te maken of te knijpen (Figuur 2).
- Gebruik een pincet om het cumulus-zygote-complex over te brengen naar een M2-oplossing met 0,5 mg/ml hyaluronidase en incubeer gedurende enkele minuten totdat de cumuluscellen dissociëren (figuur 3).
- Verzamel de zygoten met behulp van een eiertransferpipet en was ze in M2-medium met 4 mg/ml BSA om resterende hyaluronidase, cumuluscellen en onzuiverheden te verwijderen.
2. In-vitrocultuur van muizenembryo's
OPMERKING: In dit gedeelte wordt het proces beschreven van het in vitro kweken van muizenembryo's van zygoten tot blastocysten. KSOM kweekmicrodruppels moeten 24 uur van tevoren worden bereid om de temperatuur en het gasevenwicht te garanderen.
- Bereid 12 microdruppels KSOM medium, elk met een inhoud van 20 μl, op de bodem van een petrischaal van 35 mm. Bedek de microdruppels met 3-5 ml minerale olie (figuur 4) en plaats de petrischaaltjes in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 voor evenwicht.
- Breng de muizenembryo's over van M2 medium naar KSOM medium met behulp van een transferpipet voor grondig wassen.
OPMERKING: Voor deze stap is een stereomicroscoop met een verwarmingsfase van 37 °C vereist. Minimaliseer de duur van de behandeling van embryo's buiten de couveuse. - Plaats de gewassen embryo's in de voorbereide KSOM-microdruppels en broed ze gedurende 4 dagen uit bij 37 °C met 5% CO2 .
OPMERKING: Om voldoende voeding te garanderen, kweekt u 5-10 embryo's per microdruppel van 20 μL. - Selecteer voordelige blastocysten op basis van hun grootte (100-130 μm), binnenste celmassa (de binnenste celmassa bestaat uit vele cellen die allemaal samengeperst zijn), aantal trofoblastcellen (de trophectodermis bestaat uit vele cellen die samenhangend en samengepakt zijn) en de mate van expansie (blastocoel beslaat 80-100% van het embryo).
3. Bereiding van endometriumcellen
- Aspireer in een bioveiligheidskast 1 ml 2% gelatine op met behulp van een pipet en doseer deze in een kweekplaat met 12 putjes. Draai de plaat voorzichtig om ervoor te zorgen dat de bodem volledig bedekt is met de gelatine. Plaats de plaat 30 minuten in een incubator van 37 °C. Zuig daarna de overtollige gelatine op en laat de bodem van de plaat volledig drogen.
- Nadat het coatingproces is voltooid, kweekt u menselijke endometriumadenocarcinoomcellen (Ishikawa) met DMEM/F12 (zie de materiaaltabel voor details), 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine, 100 μg/ml streptomycine en 100 IE/ml penicilline, zaai ze in de met gelatine beklede platen met 12 putjes (2 × 105cellen/putje) en incubeer gedurende 24 uur.
4. Aanhechting van embryo's
- Plaats voorzichtig 5-15 verse blastocysten in elk putje van de plaat met 12 putjes met Ishikawa-cellen die in de vorige stap zijn voorbereid voor co-cultuur (Figuur 5).
- Observeer de embryo's na 48 uur incubatie onder een microscoop om hun aanhechtingsstatus te beoordelen. Om de aanhechting van het embryo te observeren, verplaatst u de plaat snel drie keer. Niet-gehechte embryo's vertonen een zwevende of rollende beweging over het oppervlak van de Ishikawa-cellen.
- Bereken de implantatiesnelheid van het embryo met behulp van vergelijking (1); Gebruik de hechtingssnelheid van het embryo om het implantatie-effect weer te geven.
Embryo-implantatiepercentage = (Bijgevoegde embryo's/Totaal aantal geïmplanteerde embryo's) × 100% (1)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In het proces van geassisteerde voortplantingstechnieken is gecontroleerde ovariële hyperstimulatie (COH) een cruciale stap, die leidt tot aanzienlijk verhoogde oestrogeenspiegels bij patiënten met meer dan 10-20 keer in vergelijking met natuurlijke cycli11. Gezien deze context vroegen we of hoge oestrogeenconcentraties in het serum van invloed zijn op de implantatie van embryo's tijdens de terugplaatsing van verse embryo's. Op basis van dit embryo-implantatiemodel hebben we de effecten van versch...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De eenvoud en snelheid van het voorgestelde in-vitromodel voor embryo-implantatie bieden opmerkelijke voordelen voor het screenen van geneesmiddelen in een vroeg stadium en andere onderzoekstoepassingen. Het eenvoudige protocol, in combinatie met de high-throughput aard van Ishikawa-cellijnen, maakt het een ideale kandidaat voor grootschalige schermen, vooral in de vroege stadia van de ontdekking van geneesmiddelen. Liang13 ontdekte dat TAGLN2 knockdown het invasievermogen van trofoblastc...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van financiële of andere belangen te melden.
Dankbetuigingen
Onze studies werden ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82171603), de Foundation of Shanghai Municipal Health Commission (202140341), de Science and Technology Commission van de gemeente Shanghai (23JC1403803) en het Innovation Promotion Program van NHC en Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 17-β-estradiol | SIGMA | 3301 | Krachtigste zoogdier oestrogene hormoon |
| BD Falcon | BD | 353001 | Bacteriologische Petri-schijven 35 x 10 mm met strakke deksel, kristallijne maagdelijke polystyreen, steriel |
| Biosafety Cabinet | ESCO | class  BSC | Aseptische operaties, het maken van kweekschalen, het verdelen van reagentia, enz |
| CO2 Incubator | Thermo | 8000DH | Embryocultuur |
| Culture plate | Corning | 3506 | Celcultuur |
| DMEM/F12 | Gibco | 1133032 | DMEM/F12 (1x), vloeibaar 1:1,Bevat L-glutamine en 15 mM HEPES-buffer |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141 | Fetaal bovien serum, gekwalificeerd, Australische oorsprong |
| Gelatin | SIGMA | G9391 | Type B, poeder, BioReagent, geschikt voor celcultuur |
| HCG | Nanjing Aibei | M2520 | Sterisatie reagens, intraperitoneale injectie, 50 IU/mL |
| Hyaluronidase | SIGMA | V900833 | Reagens kwaliteit, poeder |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x), Poeder, zonder Fenol Rood, 5 x 10 mL |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | L-glutamine-200 mM (100x), vloeibaar |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 Medium (1x), Vloeibaar, met Fenol Rood |
| Mineral oil | SIGMA | M8410 | Mineralolie is geschikt voor gebruik als dekkingslaag om verdamping en kruisbesmetting in verschillende moleculaire biologietoepassingen te beheersen |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Gibco | 15140122 | 10.000 eenheden penicilline (basis) en 10.000 eenheden streptomycine (basis), gebruikmakend van penicilline G (natriumzout) en streptomycinesulfaat in 0,85% zoutoplossing |
| PMSG | Nanjing Aibei | M2620 | Sterisatie reagens, intraperitoneale injectie, 50 IU/mL |
| Progesterone | SIGMA | 5341 | Steroïdhormoon uitgescheiden door het corpus luteum tijdens de laatste helft van de menstruatiecyclus |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Natriumpyrovaat wordt vaak toegevoegd aan celcultuurmedia als koolstofbron naast glucose |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX7 | Embryo-retrieval en observatie van embryo-ontwikkeling |
Referenties
- Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines. Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).
- Li, H. Y., et al. Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).
- Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines. Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).
- Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. A high-throughput in vitro model of human embryo attachment. Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).
- Karvas, R. M., et al. Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens. Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques. Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).
- Berneau, S. C., et al. Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation. Cells. 8 (5), 432(2019).
- Jiang, R., et al. Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure. Cell Death Discov. 3, 17057(2017).
- Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models. Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).
- Duan, C. C., et al. Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study. J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).
- Chen, G., et al. Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer. J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).
- Liang, X., et al. Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization. FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).
- Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro. Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).
- Kang, Y. J., et al. MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R. J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).
- Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
- Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).
- Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).
- Ahn, J., et al. Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip. Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).
- Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation. Cells. 10 (8), 2008(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
