Methodenartikel

Een veelzijdige pijplijn voor het analyseren van dynamische veranderingen in kernlichamen in verschillende celtypen

DOI:

10.3791/66874

⸱

28 juni 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), 2SEMM, European School of Molecular Medicine, 3Department of Biosciences, University of Milan, 4T-One Therapeutics Srl

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode beschrijft een immunofluorescentieprotocol en kwantificeringspijplijn voor het evalueren van eiwitdistributie met gevarieerde nucleaire organisatiepatronen in menselijke T-lymfocyten. Dit protocol biedt stapsgewijze begeleiding, beginnend bij de monstervoorbereiding en doorlopend door de uitvoering van semi-geautomatiseerde analyse in Fiji, eindigend met gegevensverwerking door een Google Colab-notebook.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende nucleaire processen, zoals transcriptionele controle, vinden plaats binnen discrete structuren die bekend staan als foci en die waarneembaar zijn door de immunofluorescentietechniek. Het onderzoeken van de dynamiek van deze foci onder verschillende cellulaire omstandigheden via microscopie levert waardevolle inzichten op in de moleculaire mechanismen die de cellulaire identiteit en functies bepalen. Het uitvoeren van immunofluorescentietests in verschillende celtypen en het beoordelen van veranderingen in de assemblage, diffusie en distributie van deze foci brengt echter tal van uitdagingen met zich mee. Deze uitdagingen omvatten de complexiteit van de monstervoorbereiding, de bepaling van parameters voor het analyseren van beeldvormingsgegevens en het beheer van aanzienlijke gegevensvolumes. Bovendien zijn bestaande beeldvormingsworkflows vaak op maat gemaakt voor bekwame gebruikers, waardoor de toegankelijkheid voor een breder publiek wordt beperkt.

In deze studie introduceren we een geoptimaliseerd immunofluorescentieprotocol dat op maat is gemaakt voor het onderzoeken van nucleaire eiwitten in verschillende menselijke primaire T-celtypen en dat kan worden aangepast voor elk interessant eiwit en celtype. Verder presenteren we een methode voor het onbevooroordeeld kwantificeren van eiwitkleuring, of ze nu afzonderlijke brandpunten vormen of een diffuse nucleaire verdeling vertonen.

Onze voorgestelde methode biedt een uitgebreide gids, van cellulaire kleuring tot analyse, waarbij gebruik wordt gemaakt van een semi-geautomatiseerde pijplijn die is ontwikkeld in Jython en uitvoerbaar is in Fiji. Bovendien bieden we een gebruiksvriendelijk Python-script om het gegevensbeheer te stroomlijnen, openbaar toegankelijk op een Google Colab-notebook. Onze aanpak heeft doeltreffendheid aangetoond bij het leveren van zeer informatieve immunofluorescentieanalyses voor eiwitten met diverse patronen van nucleaire organisatie in verschillende contexten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De organisatie van het eukaryote genoom wordt beheerst door meerdere lagen van epigenetische modificaties1, die verschillende nucleaire functies coördineren die kunnen voorkomen in gespecialiseerde compartimenten die nucleaire lichamen of condensaten worden genoemd2. Binnen deze structuren vinden processen plaats zoals transcriptie-initiatie3, RNA-verwerking 4,5,6, DNA-reparatie 7,8, ribosoombiogenese 9,10,11 en heterochromatineregulatie12,13. De regulatie van nucleaire lichamen past zich aan zowel ruimtelijke als temporele dimensies aan om aan de cellulaire vereisten te voldoen, geleid door principes van fasescheiding14,15. Bijgevolg functioneren deze lichamen als voorbijgaande fabrieken waar functionele componenten worden geassembleerd en gedemonteerd, waarbij veranderingen in grootte en ruimtelijke verdeling worden ondergaan. Daarom biedt het begrijpen van de kenmerken van nucleaire eiwitten door microscopie, inclusief hun neiging om lichamen te vormen en hun ruimtelijke rangschikking in verschillende cellulaire omstandigheden, waardevolle inzichten in hun functionele rollen. Fluorescentiemicroscopie is een veelgebruikte methode voor het bestuderen van nucleaire eiwitten, waardoor ze kunnen worden gedetecteerd door middel van fluorescerende antilichamen of door doelen direct tot expressie te brengen met een fluorescerende eiwitreporter16,17.

In deze context verschijnen nucleaire lichamen als heldere brandpunten of puncta, met een opmerkelijke mate van bolvormigheid, waardoor ze gemakkelijk te onderscheiden zijn van de omgeving16,18. Technieken met superresolutie, zoals STORM en PALM, zorgen voor een verbeterde resolutie (tot 10 nm)19 en maken een nauwkeurigere karakterisering van de structuur en samenstelling van specifieke condensaten mogelijk20. Hun toegankelijkheid wordt echter beperkt door de kosten van apparatuur en de gespecialiseerde vaardigheden die nodig zijn voor data-analyse. Daarom blijft confocale microscopie populair vanwege de gunstige balans tussen resolutie en breder gebruik. Een dergelijke populariteit wordt mogelijk gemaakt door de inherente verwijdering van onscherp licht, waardoor er minder uitgebreide nabewerkingsprocedures nodig zijn voor nauwkeurige segmentatie, de wijdverbreide beschikbaarheid in onderzoeksinstituten, de effectieve acquisitietijd en de monstervoorbereiding die doorgaans efficiënt is. Het nauwkeurig meten van eiwitdistributie, -assemblage of -diffusie met behulp van immunofluorescentietests in diverse cellulaire omstandigheden brengt echter uitdagingen met zich mee, aangezien veel bestaande methoden geen richtlijnen bieden voor het selecteren van geschikte parameters voor eiwitten met verschillende distributiepatronen21. Bovendien kan het verwerken van het resulterende grote gegevensvolume ontmoedigend zijn voor gebruikers met beperkte ervaring in gegevensanalyse, waardoor de biologische betekenis van de resultaten mogelijk in gevaar komt.

Om deze uitdagingen aan te pakken, introduceren we een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor immunofluorescentievoorbereiding en data-analyse, met als doel een onbevooroordeelde methode te bieden voor het kwantificeren van eiwitkleuring met verschillende organisatiepatronen (Figuur 1). Deze semi-geautomatiseerde pijplijn is ontworpen voor gebruikers met beperkte expertise op het gebied van computationele en beeldvormingsanalyse. Het combineert de functionaliteiten van twee gevestigde Fiji-plug-ins: FindFoci22 en 3D suite23. Door de nauwkeurige foci-identificatiemogelijkheid van FindFoci te integreren met de objectidentificatie- en segmentatiefuncties in de 3D-ruimte die worden aangeboden door 3D suite, genereert onze aanpak twee CSV-bestanden per kanaal voor elk acquisitiegebied. Deze bestanden bevatten aanvullende informatie die de berekening vergemakkelijkt van metrieken die geschikt zijn voor verschillende soorten signaaldistributie, zoals het aantal foci per cel, de afstand van foci tot het nucleaire zwaartepunt en de inhomogeniteitscoëfficiënt (IC), die we hebben geïntroduceerd voor diffuse eiwitkleuring. Bovendien erkennen we dat gegevensextrapolatie tijdrovend kan zijn voor gebruikers met beperkte vaardigheden op het gebied van gegevensverwerking. Om dit proces te stroomlijnen, bieden we een Python-script dat alle verzamelde metingen automatisch samenvoegt tot één bestand voor elk experiment. Gebruikers kunnen dit script uitvoeren zonder dat ze programmeertaalsoftware hoeven te installeren. We bieden een uitvoerbare code op Google Colab, een cloudgebaseerd platform waarmee Python-scripts rechtstreeks in de browser kunnen worden geschreven. Dit zorgt ervoor dat onze methode intuïtief en gemakkelijk toegankelijk is voor direct gebruik.

We demonstreren de effectiviteit van ons protocol bij het analyseren en kwantificeren van veranderingen in de signaalverdeling van twee nucleaire eiwitten: Bromodomein-bevattend eiwit 4 (BRD4) en Suppressor van zeste-12 (SUZ12). BRD4 is een goed gedocumenteerd coactivatoreiwit binnen het Mediator-complex waarvan bekend is dat het condensaten vormt die geassocieerd zijn met polymerase II-afhankelijke transcriptionele initiatie24,25. SUZ12 is een eiwitcomponent van het Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) dat verantwoordelijk is voor het reguleren van de afzetting van H3K27me3 histonmodificatie26,27. Deze eiwitten vertonen verschillende patronen binnen twee verschillende celtypen: vers geïsoleerde menselijke CD4+-naïeve T-cellen, die in rust zijn en trage transcriptionele activiteit vertonen, en in vitro gedifferentieerde TH1 CD4+-cellen, die gespecialiseerde, prolifererende effectorcellen zijn die een verhoogde transcriptie vertonen28.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van menselijke monsters voor onderzoeksdoeleinden werd goedgekeurd door de ethische commissies van het Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milaan), en er werd geïnformeerde toestemming verkregen van alle proefpersonen (autorisatienummers: 708_2020). Het protocol is georganiseerd in drie primaire secties: uitvoering van immunofluorescentie, beeldacquisitie en beeldanalyse. Gemiddeld duurt het 4 werkdagen om te worden voltooid (Figuur 1).

1. Voorbereiding op immunofluorescentie

OPMERKING: Dit immunofluorescentieprotocol kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende celtypen en eiwitdoelen door de fixatie- en permeabilisatievoorwaarden aan te passen. Het preparaat voor immunofluorescentie duurt doorgaans minder dan 3 dagen, waarbij de duur van de incubatie van primaire antilichamen varieert op basis van de kwaliteit van de antilichamen en het doeleiwit (Figuur 1).

  1. Voorbereiding van het monster
    1. Isoleer menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) door middel van een dichtheidsgradiëntcentrifugatie via een medium met een dichtheid van ongeveer 1,077 g/ml volgens de instructies van de fabrikant (materiaaltabel).
    2. Isoleer CD4+ T-cellen van PBMC's met magnetische kralen, volgens de instructies van de fabrikant (Materiaaltabel).
    3. Kleurcellen met antilichamen voor CD4, CD45RA en CD45RO (Materiaaltabel) en ga verder met FACS-sortering van naïeve CD4+ T-cellen als CD4+/CD45RA+/CD45RO-cellen, zoals elders beschreven29,30.
      OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor specificaties van de FACS-sorteerder die in dit protocol wordt gebruikt.
    4. Induceren van de differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot T-helper 1 (T,H, 1, CD4+- cellen), zoals beschreven in 29. Kortom, kweek 1,5 x 106 cellen/ml FACS-gesorteerde naïeve CD4+ T-cellen in TH1-medium en stimuleer ze met anti-CD3/anti-CD28 magnetische kralen in een verhouding van 1:1. Tel de cellen en splits ze wanneer ze elke 2-3 dagen 1,5 ×10 6 cellen/ml bereiken (zie tabel 1 voor de samenstelling van TH1 medium).
    5. Evalueer de secretie van cytokinen van de effectorfunctie na 7 dagen differentiatie, zoals beschreven in 29.
  2. Celfixatie en permeabilisatie
    OPMERKING: Al deze procedures werden beschreven in 30,31 met kleine aanpassingen.
    1. Om een optimale celhechting te garanderen, behandelt u glazen dekglaasjes (10 mm, dikte 1,5 H) als volgt met een coatingoplossing (tabel 1):
      1. Reinig de glazen dekglaasjes door ze eerst te wassen met gedestilleerd water (ddH2O), gevolgd door ze te spoelen met 70% ethanol (EtOH) en ze aan de lucht te laten drogen.
      2. Plaats de gewassen dekglaasjes op een plaat met 24 multiwells voor de stappen 1.2.1.3-1.3.
      3. Breng een druppel van 200 μL coatingoplossing aan op het glazen dekglaasje. Verwijder na 5 minuten de druppel en laat deze aan de lucht drogen.
      4. Was de dekglaasjes door een druppel van 200 μL ddH2O aan te brengen. Verwijder na 5 minuten de druppel en laat deze aan de lucht drogen.
      5. Herhaal 3 x stappen 1.2.1.3-1.2.1.4.
    2. Resuspendeer naïeve CD4+ T-cellen en TH1 CD4+ -cellen in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij een concentratie van 2 × 106 cellen/ml.
      OPMERKING: De aangegeven concentratie wordt specifiek geadviseerd voor kleine cellen zoals menselijke primaire T-lymfocyten. Voor aanhangende cellen is een behandeling met glascoating niet nodig. Ga in plaats daarvan direct verder met het kweken van de cellen op het glasoppervlak met behulp van het juiste celkweekmedium.
    3. Breng een druppel van 200 μl van de celsuspensie aan op het glasdekglaasje. Laat de cellen 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) zaaien; Verwijder vervolgens de druppel.
    4. Fixeer de cellen met vers gefilterd 3% paraformaldehyde (PFA-oplossing, tabel 1) gedurende 10 minuten bij RT.
    5. Was het glazen dekglaasje met TPBS (tabel 1) gedurende 3 x 5 minuten op RT.
    6. Verwijder TPBS en voeg permeabilisatieoplossing toe (tabel 1) gedurende 10 minuten bij RT.
    7. Gooi de permeabilisatieoplossing weg en incubeer het monster in de opslagoplossing (tabel 1) van 1 uur tot een nacht (AAN) bij 4 °C.
      NOTITIE: In dit stadium kan het protocol veilig worden stopgezet en kunnen de glazen afdekglaasjes 3-4 weken in opslagoplossing worden bewaard in een 24-multiwell-plaat.
  3. Immunofluorescentie
    1. (Optioneel) Verwijder het dekglaasje van de 24-multiwells-plaat en vries het snel 30 s in op droogijs, ontdooi bij RT en was het glazen dekglaasje vervolgens in een voorgevuld putje met bewaaroplossing.
    2. (Optioneel) Herhaal 3 x stap 1.3.1.
    3. Wassen in permeabilisatie-oplossing gedurende 5 minuten bij RT. Was vervolgens 2 x 5 minuten met TPBS op RT.
    4. Incubeer in 0,1 N HCl gedurende 12 minuten bij RT.
    5. Voer twee snelle wasbeurten uit in 1x PBS.
      OPMERKING: De gespecificeerde celpermeabilisatieomstandigheden, inclusief vries- en dooistappen en HCl-behandeling, zijn optimaal voor het kleuren van nucleaire componenten in cellen die worden gekenmerkt door dicht opeengepakt chromatine. Bij het omgaan met cellen die worden gekenmerkt door minder verdicht chromatine, is het echter raadzaam om deze stappen te verminderen of te vermijden. Overweeg bovendien om de behandeling met HCl te verminderen of te elimineren voor het richten op cytoplasmatische componenten.
    6. Incubeer de cellen met primair antilichaam (BRD4, 1:500 of SUZ12, 1:100) verdund in antilichaamverdunningsbuffer (tabel 1) (200 μL voor elk glazen dekglaasje) AAN bij 4 °C.
      OPMERKING: Immunofluorescentie kan worden uitgevoerd door meer dan één primair antilichaam te multiplexen, afhankelijk van de experimentele behoeften, secundaire antilichamen en detectiesystemen.
    7. Was 3 x 5 min met PBS-T (tabel 1) op RT met mild schudden.
    8. Incubeer de cellen met secundair antilichaam verdund in antilichaamverdunningsbuffer (200 μL voor elk glazen dekglaasje) gedurende 1 uur bij RT.
      OPMERKING: Kies het secundaire antilichaam dat het beste past bij de experimentele behoeften en de beschikbare detectiesystemen. Zorg ervoor dat elk secundair antilichaam zich richt op de soort waarvan het primaire antilichaam is afgeleid. Selecteer bovendien fluoroforen die compatibel zijn met de filters en lichtbron van de microscoop. Het is van cruciaal belang om spectrale overlapping tussen de gekozen fluorofoor en het emissiespectrum van de nucleaire vlek te voorkomen.
    9. Was 3 x 5 min met PBS-T op RT met mild schudden.
    10. Kleuring met 1 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) verdund in 1x PBS gedurende 5 minuten bij RT.
      OPMERKING: Alternatieve kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor nucleaire kleuring, zolang ze niet overlappen met het emissiespectrum van secundaire antilichamen.
    11. Voer meerdere snelle wasbeurten uit in 1x PBS.
    12. Monteer het glazen dekglaasje op een microscopieglaasje met antifade montagemedia.

2. Acquisitie van afbeeldingen

OPMERKING: De duur van de beeldacquisitie is afhankelijk van het instrument en de geselecteerde instellingen.

  1. Confocale microscoop acquisitie
    1. Leg 3D-beelden vast met een confocale microscoop, stel een stapgrootte in van 0,25 μm in z en een pixelgrootte van 0,1-0,2 μm.
      OPMERKING: Om een optimale resolutie met beperkte lichtdiffractie te bereiken met ons 63x 1.4 NA Oil-objectief, stellen we de pinhole-grootte in op 0.8 AE, 2x lijngemiddelde en framegrootte 1024 × 1024 pixels. Zowel de excitatielaser als de kanaalacquisitiesequentie zijn bewust gekozen om interferentie of overspraak tussen de gebruikte fluoroforen te voorkomen. De aanpassing van de parameters moet echter worden afgestemd op de specifieke kenmerken van de microscoop en het monster. Zie de Materiaaltabel voor de specificaties van de confocale microscoop die in dit protocol wordt gebruikt.
    2. Verkrijg een consistent aantal willekeurige velden om ongeveer 50 cellen per biologische replica te omvatten.

3. Analyse van het beeld

  1. Installatie van de software
    1. Download en installeer de laatst beschikbare versie van Fiji vanaf de officiële Fiji Downloadpagina (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
    2. Installeer 3D Suite via de Fiji-updatesite of handmatig volgens de instructies op de 3D Suite-website (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).
    3. Installeer GDSC (FindFoci) via de Fiji-updatesite of handmatig door de instructies op de GitHub-repository (https://github.com/aherbert/gdsc) te volgen.
  2. TIFF-conversie
    1. Download het script "convert_to_TIFF.py" (aanvullend bestand 1).
    2. Sleep het script naar Fiji en voer de code uit.
    3. Blader in het deelvenster dat wordt weergegeven naar het pad waar het experiment is opgeslagen. De submap met de geconverteerde TIFF-bestanden wordt in dezelfde experimentmap gemaakt.
  3. Initialiseer instellingen in 3D Manager.
    1. Open het optiepaneel van 3D Manager door te klikken op Plug-ins | 3DSuite | 3D Manager-opties.
    2. Schakel in het optievenster van 3D Manager de selectievakjes in die overeenkomen met de volgende metingen: Volume (eenheid), Gemiddelde grijswaarde, Begrenzingsvak (pix), Std Dev Grijswaarde, Zwaartepunt (pix) en Zwaartepunt (eenheid).
    3. Vink de volgende opties aan: Objecten aan randen XY uitsluiten en Objecten aan randen Z uitsluiten en klik op OK.
      OPMERKING: Deze stap hoeft slechts één keer te worden uitgevoerd om de metrische gegevens te configureren die worden opgeslagen in de ruimtelijke en kwantitatieve informatiebestanden. De geselecteerde metrieken zijn essentieel voor het waarborgen van een goede werking van de pijplijn. Optionele aanvullende metrische gegevens kunnen in deze stap worden opgenomen, zoals verder wordt beschreven in de sectie Discussie.
  4. Stel parameters in op de FindFoci GUI.
    OPMERKING: Deze stap hoeft slechts één keer te worden uitgevoerd om de semi-geautomatiseerde pijplijn te configureren met optimale parameters, die vervolgens in de scripts worden opgenomen.
    1. Open de testafbeelding. Dupliceer het eiwitkanaal, inclusief de stapel (Ctrl + Shift + D), vink het selectievakje hyperstack aan en geef het juiste kanaalnummer op in het vak Kanalen (c) en hernoem het dienovereenkomstig.
    2. Start de Fiji-macrorecorder door naar Plug-ins te navigeren | Macro's | Opnemen.
    3. Open de FindFoci-plug-in (klik op Plug-ins | GDSC | VindFoci | FindFoci GUI) en selecteer de afbeelding die moet worden geanalyseerd in het vervolgkeuzemenu "Afbeelding".
    4. Stel de parameters als volgt in (Figuur 2A): Gaussiaanse vervaging = 1,5; achtergrondmethode = SD boven gemiddelde; achtergrond param = 9; zoekmethode = fractie van piek - achtergrond; zoekparameter = 0,7; piekmethode = relatief boven achtergrond; piek param = 0,2; minimale grootte = 5; Max pieken = 1.000.000.
      OPMERKING: De aangegeven parameters zijn geselecteerd op basis van onze casestudy's en zijn mogelijk niet geschikt voor andere kleuringsprocedures.
    5. Pas de volgende parameters aan om de identificatie van de brandpunten te verbeteren:
      1. Gaussiaanse vervaging definieert de mate van afvlakking om brandpunten beter te segmenteren. Houd het dicht bij de diameter van de brandpunten (pixel).
      2. Achtergrondparameter stelt een drempel in om het achtergrond- van het brandpuntssignaal te onderscheiden. Verhoog de waarden om strengere drempels op te leggen.
      3. Zoekparameter definieert het percentage fluorescentie vanaf de piek dat wordt opgenomen in signaalherkenning. Verlaag de waarden om gebieden op te nemen die verder weg zijn van de fluorescentiepiek.
      4. Piekparameter bepaalt de mate waarin twee signaalpieken als continu of gescheiden worden beschouwd. Het verlagen van de waarde zal resulteren in de scheiding van pieken.
      5. Max pieken geeft het maximale aantal identificeerbare brandpunten aan. Stel hoge getallen in om alle brandpunten in de afbeelding op te nemen.
    6. Voer FindFoci uit en kopieer de tekenreeks die verschijnt in het recordervenster (stap 3.4.2, figuur 2B) die de geselecteerde parameters bevat, met uitzondering van de aanhalingstekens. Raadpleeg voor meer informatie over de instellingen de handleiding van de plug-in 22.
  5. Pijplijn voor kwantificering van nucleair eiwit
    1. Download het script "nuclear_prot_q.py" (Aanvullend bestand 2).
    2. Sleep het script naar Fiji en klik op uitvoeren om de code uit te voeren.
    3. Volg de instructies in het weergegeven dialoogvenster om de afbeeldingen te verwerken.
      1. Nucleuskanaal: voer het nummer in dat overeenkomt met het kanaal van DAPI (of een nucleaire kleuring).
      2. Nucleus Gaussiaanse vervaging: voer de waarde van sigma in die nodig is om de afbeelding te vervagen voor segmentatie.
        OPMERKING: Houd deze parameter dichter bij de diameter van de kern (d.w.z. 5-6 μm). Hogere sigma-waarden zijn geïndiceerd voor inhomogene kleuring.
      3. Eiwitkanaal: voer het nummer in dat overeenkomt met het kanaal van de kleuring van belang.
      4. FindFoci Parameter: plak de tekenreeks die is verkregen uit de macro-opnamestap in passage 3.4.6 (Figuur 2B).
      5. (Optioneel) Kwaliteitscontrole: controleer de kwaliteit van de gesegmenteerde kernen. Hierdoor wordt het script gepauzeerd en kan elke gegenereerde nucleaire regio van belang (ROI) handmatig worden gecontroleerd.
      6. Selecteer een afbeeldingsmap: klik op de knop Bladeren om naar de map te navigeren met de TIFF-bestanden die moeten worden geanalyseerd.
    4. Zodra alle vakken zijn samengesteld, klikt u op OK om door te gaan met de uitvoering.
    5. Als een kern niet correct is gesegmenteerd en niet aan de kwaliteitseisen voldoet, verwijder of wijzig deze dan zoals aangegeven in figuur 2C.
      1. Controleer de ROI-lijst in het ROIManager3D-venster; als de lijst leeg is, selecteert u het samenvoegvenster en klikt u op 3D kwantificeren om de manager te vernieuwen. Sluit vervolgens de tabel met 3D-resultaten van Quantify. Selecteer het nuclei-kanaal en klik op Live-ROI naar AAN.
      2. Selecteer de ROI die bij dezelfde kern hoort en druk op Samenvoegen of druk op Delete in het geval van ongewenste kernen.
      3. Klik op alles selecteren en ga verder met de analyse door op OK te klikken in het controlevenster Maskeren .
      4. Kijk voor resultaten in de map Kwantificering binnen het bestandspad aangegeven in stap 3.5.3.6, met een txt-bestand met records van de parameter die voor de analyse is gebruikt.
  6. Pijplijn op Google Colab
    1. Download het notitieblok "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (aanvullend bestand 3).
    2. Open het notitieblok op Google Colab (https://colab.research.google.com/).
    3. Upload alle mappen met de .csv bestanden van elk afbeeldingsveld naar een map naar voorkeur in Google Drive.
    4. Geef in het notitieblok het pad aan van de map waar de resulterende submappen zijn opgeslagen en voer alle cellen uit. Wanneer de code klaar is met compileren, wordt het uiteindelijke spreadsheetbestand met alle gecompileerde gegevens gemaakt in dezelfde map waarin de .csv bestanden zijn geüpload.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het geschetste protocol in deze methode vergemakkelijkt de visualisatie en kwantificering van veranderingen in nucleaire eiwitkleuring in menselijke primaire T-cellen, en het kan worden aangepast voor verschillende celtypen en eiwitdoelen. Als casestudy's hebben we de kleuring van BRD4 en SUZ12 in naïeve en TH1 CD4+- cellen uitgevoerd en geanalyseerd.

BRD4 vertoont een goed gestippeld kleuringspatroon in zowel rustige naïeve als gedifferentieerde TH1 CD4+-cellen, waardoor het gebruik van ontworpen parameters voor foci-identificatie voor beide celtypen mogelijk is (Figuur 3A). Onze pijplijn maakt de kwantificering van verschillende parameters mogelijk, waaronder het aantal, het volume, het fluorescentiesignaal (uitgedrukt als gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI)), de dekking en de ruimtelijke rangschikking van BRD4-brandpunten in de kern (figuur 3B-F). Daarnaast hebben we een automatische berekening geïntroduceerd om het percentage van het kernvolume van de brandpunten te bepalen, waardoor een vergelijking tussen cellen met verschillende kerngroottes mogelijk wordt (Figuur 3E).

Ten slotte hebben we de mogelijkheid geboden om de afstanden van de brandpunten tot het nucleaire centrum in kaart te brengen, wat helpt bij het begrijpen van hun nucleaire positionering (Figuur 3F). De resultaten van de kwantificering markeren opmerkelijke veranderingen in BRD4-foci tussen TH1 en slapende CD4+ T-cellen, waaronder een toename van het aantal foci's, de grootte, de helderheid en het volume, evenals verschillen in hun distributie en lokalisatie. Deze bevindingen komen overeen met de verhoogde transcriptionele activiteit van geactiveerde/prolifererende T-cellen in vergelijking met hun rustige tegenhanger28.

SUZ12 daarentegen neemt niet deel aan condensaatvorming. In ons onderzoek zagen we een significant verschil in het kleuringspatroon van SUZ12 tussen de twee cellulaire toestanden: een puntig patroon in naïeve T-cellen gaat over in een diffuus patroon in TH1 CD4+-cellen (Figuur 4A). Deze significante verschuiving in eiwitgedrag belemmert de vergelijkbaarheid van foci-kenmerken met behulp van identieke parameters, aangezien puntidentificatie in TH1 CD4+-cellen grotendeels onsuccesvol is (Figuur 4A). Hoewel het over het algemeen wordt aanbevolen om consistentie te behouden in zowel acquisitie- als analyseparameters bij het vergelijken van immunofluorescentiekleuring over verschillende cellulaire omstandigheden, worden aanpassingen noodzakelijk in geval van substantiële veranderingen in het doel van belang.

In dit specifieke scenario, zoals geïllustreerd in figuur 4B, ondervindt FindFoci, ondanks het experimenteren met verschillende parametercombinaties, waaronder aanpassing aan achtergrondparameters, Gaussiaanse vervaging en zoekparameters (zoals voorgesteld in protocolstap 3.4.5), moeilijkheden bij het onderscheiden van echte signaalpieken van onbeduidende vanwege de inherente distributieaard van het eiwit. Bovendien benadrukken we dat conventionele metingen zoals nucleaire MFI misleidend kunnen zijn (Figuur 4C), waarbij geen rekening wordt gehouden met veranderingen in de signaalverdeling.

Om dergelijke veranderingen te meten, stellen we daarom het gebruik van de variatiecoëfficiënt voor, een metriek die we in dit protocol hebben geïntroduceerd om eiwitdiffusie te karakteriseren, ook wel de inhomogeniteitscoëfficiënt (IC) genoemd. Het IC legt nauwkeurig de diffusie van SUZ12-foci in TH1 CD4+- cellen vast zonder hun identificatie te forceren met onjuiste segmentatiebenaderingen (zie figuur 4D). Ten slotte valideren we de werkzaamheid van deze parameter verder door DAPI als controle te gebruiken, die uniform verdeeld blijft over beide celcondities (Figuur 4E).

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van immunofluorescentievoorbereiding en data-analyse. Het protocol voor het kleuren en analyseren van immunofluorescentie van nucleair eiwit bestaat uit drie primaire fasen: monstervoorbereiding, beeldacquisitie en analyse, die ongeveer 4 werkdagen beslaan. Het script maakt gebruik van twee plug-ins, 3D Suite om segmentatie van kernen uit te voeren en FindFoci om het eiwitkanaal te verwerken. Ruimtelijke en kwantitatieve informatie over de foci en de kern worden verzameld in afzonderlijke csv-bestanden. Een uitvoerbaar script op Google Colab koppelt foci-metingen aan overeenkomstige kernen met behulp van het nucleusbegrenzingsvak en berekent afgeleide metingen op basis van verzamelde gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Weergave van de pijplijninstellingen voor de kwantificering van nucleair eiwit. (A) FindFoci-pop-upvenster dat parameters voor foci-identificatie illustreert (protocolparagraaf 3.4.3). (B) Pop-upvenster dat de macro vertegenwoordigt die de geselecteerde parameters van FindFoci opneemt. De gekopieerde tekenreeks wordt in het opstartvenster geplakt (protocolstappen 3.4.6-3.5.3.4). (C) Paneel met de kwaliteitscontrolestap voor de segmentatie van kernen voor het handmatig verwijderen of wijzigen van nucleaire regio's van belang met behulp van de 3D-manager (protocolstappen 3.5.5.1 -3.5.5.3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Vergelijkingen tussen verschillende cellulaire condities op basis van BRD4-foci-analyses. (A) Representatieve confocale fluorescentiemicroscopiebeelden van immunofluorescentiekleuring van BRD4 (grijs) in menselijke primaire naïeve CD4+ T-cellen en TH1 CD4+- cellen. Kernen worden tegengekleurd met DAPI (blauw). Originele vergroting 63x; schaalbalk = 5 μm. Bodem, BRD4-brandpunten, geïdentificeerd door de pijpleiding, zijn gemarkeerd met witte pijlpunten en gecounterd in geel (onderkant). (B) Boxplot die het BRD4-foci-nummer/kern vertegenwoordigt in naïeve en TH1 CD4+- cellen (n = 2 individuen). (C) Boxplot-weergave van het volume (μm3) van BRD4-foci in naïeve en TH1 CD4+- cellen (n = 2 individuen). (D) Boxplot-weergave van foci MFI van BRD4-foci in naïeve en TH1 CD4+- cellen (n = 2 individuen). (E) Boxplot die het percentage van het nucleaire volume weergeeft dat wordt ingenomen door BRD4-foci in verhouding tot het totale nucleusvolume (n = 2 individuen). (F) Weergave van de afstandsfrequenties van BRD4-foci van nucleair zwaartepunt tot nucleaire periferie (n = 2 individuen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Inhomogeniteitscoëfficiënt, een maatstaf voor het kwantificeren van de overgang van een puntvormig naar een verspreid patroon in SUZ12-immunofluorescentiesignalen. (A) Representatieve confocale fluorescentiemicroscopiebeelden van immunofluorescentiekleuring voor SUZ12 (magenta) in menselijke primaire naïeve CD4+ T-cellen en TH1 CD4+ Cellen. Kernen worden tegengekleurd met DAPI (blauw). Originele vergroting 63x; schaalbalk = 5 μm. Onderaan worden SUZ12-brandpunten die door de pijpleiding worden geïdentificeerd, gemarkeerd met een witte pijlpunt en tegengegaan in oranje (B). Voorbeelden van verkeerde identificatie van brandpunten in TH1 CD4+- cellen weergegeven door witte pijlen en een oranje masker met twee verschillende parameterinstellingen. (C) Boxplot-weergave van nucleaire MFI van SUZ12 in naïeve en TH1 CD4+- cellen (n = 2 individuen). (D) Boxplot-weergave van SUZ12 IC in naïeve en TH1 CD4+- cellen (n = 2 individuen). (E) Boxplot-weergave van DAPI IC in naïeve en TH1 CD4+- cellen (n = 2 individuen). Afkortingen: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; MFI = gemiddelde fluorescentie-intensiteit; IC = inhomogeniteitscoëfficiënt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OplossingCompositieOpmerkingen/Beschrijving
TH1 gemiddeldRPMI met GlutaMAX-I, 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS), 1% (v/v) niet-essentiële aminozuren, 1 mM natriumpyruvaat, 50 IE/ml penicilline, 50 μg/ml streptomycine, 20 IE/ml recombinant IL-2, 10 ng/ml recombinant IL-12, 2 mg/ml neutraliserende anti-IL-4.Stap 1.1.4.
Coating oplossing0,1% poly-L-lysine in ddH2OStap 1.2.1.
PBS-T1x PBS/0,1% TWEEN 20 pH 7,0Stap 1.3.
PFA-oplossing voor fixatie3% paraformaldehyde (PFA) verdund in 0,1% PBS-TWEENStap 1.2.4.
TPBS0,05% Triton X-100 verdund in 1x PBSStap 1.2., 1.3.
Permeabilisatie-oplossing0,5% TPBS verdund in 1x PBSStap 1.2., 1.3.
Opberg oplossing20% glycerol/1x PBSStap 1.2.7., 1.3.1.
Buffer voor verdunning van antilichamen0,1% PBS-TWEEN/2% Geitenserum/1% BSAStap 1.3.6., 1.3.8.

Tabel 1: Samenstelling van media en buffers die in dit protocol worden gebruikt.

Aanvullend bestand 1: "convert_to_TIFF.py". Dit bestand bevat het script voor het converteren van elk afbeeldingsbestand (bijv. ND2, LIF, enz.) naar TIFF-bestanden die nodig zijn voor nauwkeurige kwantificeringsprocessen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: "nuclear_prot_q.py". Dit bestand bevat het script dat het mogelijk maakt om afbeeldingen te meten en te kwantificeren die ten minste twee kanalen bevatten (nucleeuze kleuring, nucleaire eiwitkleuring). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: "final_nuclear_protein metrics.ipynb". Dit bestand bevat een Jupyter-notebook dat een samenvatting van alle relevante parameters extraheert en compileert in een enkel Excel-bestand, met behulp van de uitvoer van "nuclear_prot_q.py" als invoer. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie presenteren we een methode voor het uitvoeren van immunofluorescentie-experimenten op nucleaire eiwitten in menselijke T-lymfocyten. Deze methode biedt flexibiliteit voor gebruik met verschillende celtypen door kleine aanpassingen in fixatie- en permeabilisatiestappen, zoals eerder beschreven 30,31.

Onze beeldvormingsworkflow bouwt voort op gevestigde technieken die in de literatuur worden beschreven, met name FindFoci en 3D Suite22,23. In tegenstelling tot eerdere publicaties, bieden we een uitvoerbare Jython-code die in Fiji is geïntegreerd voor een semi-geautomatiseerde pijplijn, waardoor nauwgezette parametertracking en visuele kwaliteitscontroles mogelijk zijn. Met name introduceerden we de optionele mogelijkheid om de kwaliteit van kernsegmentatie te reguleren in protocolsectie 3.5.3.5 en implementeerden we een corrigerende stap in protocolsectie 3.5.5. Met het uitvoerbare script op Google Colab kunnen gebruikers uitgebreide metingen ophalen en de meest geschikte kiezen voor hun specifieke biologische scenario's.

De meegeleverde analysepijplijn is geschreven in Jython (Java + Python) en vereist de installatie van Fiji voor uitvoering, samen met twee verschillende plug-ins: 3D Suite en FindFoci (Afbeelding 1). De pijplijn begint met beeldconversie naar TIFF-formaat en voorbewerking van het kanaal met de kernen met een Gaussiaans vervagingsfilter om de segmentatie van kernen te verbeteren. We sturen 3D Suite aan om zowel i) ruimtelijke informatie vast te leggen, zoals coördinaten van het nucleaire volume, het zwaartepunt en het begrenzende vak (dat het kleinste vak vertegenwoordigt dat het object omsluit en wordt gebruikt om brandpunten aan de rechterkern te koppelen), en ii) kwantitatieve informatie, waaronder MFI en standaarddeviatie van het signaal. Vervolgens maakt de pijplijn gebruik van FindFoci om lokale maxima in het foci-signaal te identificeren, waardoor de afhankelijkheid van wereldwijde drempelmethoden (die vaak afhankelijk zijn van de discretie van de gebruiker en mogelijk niet nauwkeurig zijn) wordt geëlimineerd, en registreert zowel ruimtelijke als kwantitatieve informatie ten opzichte van foci. De uitvoermap bevat dus twee CSV-bestanden per kanaal, die ruimtelijke ("M_.csv") en kwantitatieve ("Q_.csv") metrieken omvatten.

Het uiteindelijke bestand, met daarin alle verzamelde en afgeleide metingen, wordt gegenereerd door een Python-script uit te voeren op Google Colab. Dit bestand bevat metrische gegevens zoals het aantal brandpunten per kern, foci MFI, inhomogeniteitscoëfficiënt (IC), nucleaire MFI, foci-afstand tot het nucleaire zwaartepunt en percentage van het bezette nucleaire volume. We schatten een verwerkingstijd van ongeveer 1 minuut per beeld, inclusief stappen voor visuele kwaliteitscontrole. Deze verwerkingstijd kan verder worden versneld door de optimalisatie van immunofluorescentie-instellingen en analyseparameters.

De pijplijn berekent parameters voor nucleaire eiwitten die zowel goed gestippelde als diffuse patronen vertonen, waardoor gebruikers de meest geschikte parameter kunnen selecteren. We raden aan om de inhomogeniteitscoëfficiënt te gebruiken om het oplossen van eiwithaarden te beschrijven.

Een cruciale stap om een goede identificatie van brandpunten te garanderen, is het instellen van parameters om echte signaalpieken te onderscheiden van achtergrondruis. Het is van cruciaal belang om grondige tests uit te voeren op willekeurige afbeeldingen voordat de pijplijn wordt uitgevoerd. Hoewel onze studie zich voornamelijk richt op een enkel kanaal, ondersteunt de pijplijn de introductie van verschillende kleurstofcombinaties gericht op verschillende eiwitten in immunofluorescentie-experimenten. Het biedt geen ondersteuning voor gelijktijdige analyse van meerdere kanalen en moet voor elk kanaal afzonderlijk worden uitgevoerd. Verder hebben we ervoor gekozen om specifieke metingen in dit protocol te presenteren; Aanvullende maatstaven, zoals geïntegreerde intensiteit voor het beoordelen van absolute veranderingen in het fluorescentiesignaal of fysische parameters zoals circulariteit en compactheid, kunnen echter ook in de pijplijn worden opgenomen in punt 3.3.2. Het opnemen van metrische gegevens die momenteel niet in deze pijplijn zijn geïntegreerd, vereist vaardigheid in Python-programmering om ze in het uiteindelijke metrische bestand te integreren; Anders worden ze automatisch opgenomen in de ruimtelijke ("M_.csv") en kwantitatieve ("Q_.csv") informatiebestanden.

De timing van deze pijplijn is afhankelijk van factoren zoals de grootte en hoeveelheid van het beeld, het aantal kanalen per analyse en microscoopinstellingen. Bovendien zijn de prestaties van de machine van invloed op de uitvoeringstijd, waarbij visuele stappen het proces mogelijk vertragen.

Het is vermeldenswaard dat, hoewel confocale microscopie waardevolle inzichten biedt, het een diffractiebeperkte technologie blijft die de precisie van waargenomen nucleaire structuren of eiwithaarden kan beperken. Om de robuustheid van de analyse te vergroten, stellen we voor om het aantal onderzochte kernen en biologische monsters te verhogen. Naarmate het aantal geanalyseerde kernen toeneemt, worden eventuele opmerkelijke veranderingen in de nucleaire morfologie of eiwitverdeling duidelijker, ongeacht de resolutiebeperkingen.

In termen van mogelijke toekomstige toepassingen vertoont deze methode veelzijdigheid en aanpasbaarheid aan verschillende celtypen en kleuringsprotocollen. Het kan bijvoorbeeld gemakkelijk worden gebruikt in radiobiologische experimenten, waar nauwkeurige kwantificering van door ioniserende straling geïnduceerde foci (IRIF's) dient als een directe indicator vanDNA-schade. Hoewel onze primaire nadruk ligt op nucleaire analyse, kan het protocol eenvoudig worden aangepast door een cytoplasmatische kleurstof op te nemen en deze te vervangen door het nucleaire kanaal in het script. Bovendien kan de analyse naadloos worden geïntegreerd in andere experimentele methodologieën zoals DNA en RNA FISH30,31, waarbij gebruik wordt gemaakt van standaardparameters voor nucleaire topologieanalyse.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.V. heeft een wetenschappelijke samenwerking met de startup T-One Therapeutics Srl; B.B. en F.M. zijn medeoprichters van de startup T-One Therapeutics Srl; E.P. is momenteel in dienst van T-One Therapeutics Srl; Alle andere auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij zijn erkentelijk voor de wetenschappelijke en technische bijstand van de INGM Imaging Facility, in het bijzonder C. Cordiglieri en A. Fasciani, en de INGM FACS-sorteerfaciliteit in het bijzonder M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM), Milaan, Italië). We danken M. Giannaccari voor zijn technische informatica-ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de volgende subsidies: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, subsidie nr 2018-0321) en Fondazione AIRC (grant nr MFAG 29165) aan F.M. Ricerca Finalizzata, (grant nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (grant nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (grant nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018,) Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (grant nr G43C22002620007) en Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (grant nr 2022PKF9S) to B. B.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL Safe-Lock TubesEppendord#0030121503Protocol section 1
10 mL Serologische pipettenVWR#612-3700Protocol section 1
20 µL barrière pipette tipThermo Scientific#2149P-HRProtocol section 1
50 mL Polypropyleen KegelbuisFalcon#352070Protocol section 1
200 µL barrière pipette tipThermo Scientific#2069-HRProtocol section 1
antifade oplossing - ProlongGlass - montagemediaInvitrogen#P36984Stap 1.3.12
BSA (Bovine Serum Albumin)Sigma#A7030Stap 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T CelisolatiekitMiltenyi Biotec#130-096-533Stap 1.1.2.
DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindole)InvitrogenCat#D1306Stap 1.3.10.
Droge ijzerStap 1.3.1.
Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 kraalLife Technologies#1131Dmagnetische kralen stap 1.1.4.
EtOHCarlo Erba#4146320Stap 1.2.1.1.
FACSAria SORPBD BioscencesStap 1.1.3. Uitgerust met BD FACSDiva Software versie 8.0.3
FBS (Fetal Bovine Serum)Life Technologies#10270106Stap 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUSEurocloneGEH17144003F32Stap 1.1.1.
FIJI Versie 2.14.0--Protocol sectie 3
Glazen dekglas (10 mm, dikte 1.5 H)Electron Microscopy Sciences#72298-13Stap 1.2.1.
GlycerolSigma#G5516Stap 1.2.7-1.3.1.
Geit anti-Konijn AF568 secundair antilichaamInvitrogenA11036Stap 1.3.8.
HClSigma#320331Stap 1.3.4.
menselijk neutraliserend anti-IL-4Miltenyi BiotecCat#130-095-753Stap 1.1.4.
menselijk recombinant IL-12Miltenyi BiotecCat#130-096-704Stap 1.1.4.
menselijk recombinant IL-2Miltenyi BiotecCat#130-097-744Stap 1.1.4.
Leica TCS SP5 Confocal microscoopLeica Microsystems-Protocol sectie 2, Uitgerust met HCX PL APO 63x, 1.40 NA olie-immersie objectief, met een extra 3x zoom. Pinhole grootte : 0.8 AU. Lijn gemiddelde 2×. Frame grootte 1024×1024 pixel.
MEM Non-Essentiële Aminozuren OplossingLife Technologies#11140035Stap 1.1.4.
MicroscoopglazenVWR#631-1552Stap 1.3.12.
Muis monoklonaal anti-Mens CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)BD Bioscience#557871Stap 1.1.3.
Muis monoklonaal anti-Mens CD45RA PECy5 (5H9 clone)BD Bioscience#552888Stap 1.1.3.
Muis monoklonaal anti-Mens CD45RO APC (UCHL1 clone)Miltenyi Biotec#130-113-546Stap 1.1.3.
Multiwell 24 wellFalcon#353047Protocol sectie 1
Normaal GeitenserumInvitrogenPCN5000Stap 1.3.6., 1.3.8.
PBSLife Technologies#14190094Protocol sectie 1
Penicilline/Streptomycine oplossingLife Technologies#15070063Stap 1.1.4.
PFASigma#P6148Stap 1.2.4.
poly-L-lysineSigma#P89201.2.1.
Primair antilichaam - BRD4Abcam#ab128874Stap 1.3.6.
Primair antilichaam - SUZ12Cel SignallingmAb #3737Stap 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-ILife Technologies#61870010Stap 1.1.4.
Natrium PyruvaatLife Technologies#11360039Stap 1.1.4.
Triton X-100Sigma#T8787Stap 1.2., 1.3.
TWEEN 20Sigma#P9416Stap 1.3.
Pincet--Protocol sectie 1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
  2. Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation. Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).
  3. Henninger, J. E., et al. RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates. Cell. 184 (1), 207-225 (2021).
  4. Guo, Y. E., et al. Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates. Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).
  5. Bhat, P., et al. 3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency. bioRxiv. , (2023).
  6. Spector, D. L., Lamond, A. I. Nuclear speckles. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a000646(2011).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. EMBO J. 38 (16), e101379(2019).
  8. Parker, M. W., et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly. Elife. 8, e48562(2019).
  9. Feric, M., et al. Coexisting liquid phases underlie nucleolar subcompartments. Cell. 165 (7), 1686-1697 (2016).
  10. Yoneda, M., Nakagawa, T., Hattori, N., Ito, T. The nucleolus from a liquid droplet perspective. J Biochem. 170 (2), 153-162 (2021).
  11. Alberti, S., Carra, S. Nucleolus: A liquid droplet compartment for misbehaving proteins. Curr Biol. 29 (19), R930-R932 (2019).
  12. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  13. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  14. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 39-58 (2014).
  15. Feric, M., Misteli, T. Phase separation in genome organization across evolution. Trends Cell Biol. 31 (8), 671-685 (2021).
  16. Mitrea, D. M., et al. Methods for physical characterization of phase-separated bodies and membrane-less organelles. J Mol Biol. 430 (23), 4773-4805 (2018).
  17. Fetter, J., et al. Endogenous gene tagging with fluorescent proteins. Methods Mol Biol. 1239, 231-240 (2015).
  18. Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates. Cell. 176 (3), 419-434 (2019).
  19. Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124 (10), 1607-1611 (2011).
  20. Scalisi, S., Ahmad, A., D'Annunzio, S., Rousseau, D., Zippo, A. Quantitative analysis of PcG-associated condensates by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Methods Mol Biol. 2655, 183-200 (2023).
  21. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  22. Herbert, A. D., Carr, A. M., Hoffmann, E. FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis. PLoS One. 9 (12), e114749(2014).
  23. Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization. Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).
  24. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), 3958(2018).
  25. Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).
  26. Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity. EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).
  27. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  28. Peng, Z., et al. Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation. Front Immunol. 12, 728082(2021).
  29. Marasca, F., et al. LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion. Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).
  30. Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. 3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH. Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).
  31. Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells. J Vis Exp. (155), (2020).
  32. Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nuclear Body DynamicsImmunofluorescence AssayChromatin OrganizationProtein Staining QuantificationHuman T LymphocytesFiji Image AnalysisFindFoci Plugin3D Image SegmentationNuclear Protein MetricsCellular Plasticity

Gerelateerde artikelen