Methodenartikel

Beperkte bodembedekking en nesten als model voor tegenspoed in het vroege leven bij muizen

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66879

⸱

12 juli 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute, Georgia State University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een diermodel om te bestuderen hoe tegenspoed in het vroege leven, veroorzaakt door een verarmde omgeving en onvoorspelbare moederlijke zorg tijdens de vroege postnatale periode, de ontwikkeling van de hersenen en het toekomstige risico op psychische stoornissen beïnvloedt.

Samenvatting

Tegenspoed in het vroege leven (ELA), zoals misbruik, verwaarlozing, gebrek aan middelen en een onvoorspelbare thuisomgeving, is een bekende risicofactor voor het ontwikkelen van neuropsychiatrische stoornissen zoals depressie. Diermodellen voor ELA zijn gebruikt om de impact van chronische stress op de ontwikkeling van de hersenen te bestuderen en zijn meestal gebaseerd op het manipuleren van de kwaliteit en/of kwantiteit van de zorg voor moeders, aangezien dit de belangrijkste bron is van vroege levenservaringen bij zoogdieren, inclusief mensen. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor het gebruik van het Limited Bedding and Nesting (LBN) model bij muizen. Dit model bootst een omgeving met weinig middelen na, die gefragmenteerde en onvoorspelbare patronen van moederlijke zorg veroorzaakt tijdens een kritieke ontwikkelingsperiode (postnatale dagen 2-9) door de hoeveelheid nestmateriaal die aan de moeder wordt gegeven om een nest voor haar pups te bouwen te beperken en de muizen te scheiden van het beddengoed via een gaasplatform in de kooi. Representatieve gegevens worden verstrekt om de veranderingen in het gedrag van de moeder te illustreren, evenals de verminderde gewichten van de pup en langetermijnveranderingen in basale corticosteronspiegels, die het gevolg zijn van het LBN-model. Als volwassenen is aangetoond dat nakomelingen die in de LBN-omgeving zijn grootgebracht, een afwijkende stressrespons, cognitieve tekorten en anhedonie-achtig gedrag vertonen. Daarom is dit model een belangrijk hulpmiddel om te definiëren hoe de rijping van stressgevoelige hersencircuits wordt veranderd door ELA en resulteert in gedragsveranderingen op de lange termijn die kwetsbaarheid voor psychische stoornissen verlenen.

Inleiding

De vroege postnatale periode is een kritieke ontwikkelingsperiode waarin omgevingsinvloeden het ontwikkelingstraject kunnen verschuiven. Tegenspoed in het vroege leven (ELA) kan bijvoorbeeld de ontwikkeling van de hersenen veranderen om langdurige veranderingen in de cognitieve en emotionele functie uit te lokken. Voorbeelden van ELA zijn onder meer fysieke of emotionele mishandeling, verwaarlozing, ontoereikende middelen en een onvoorspelbare thuisomgeving die zich voordoet tijdens de kindertijd of adolescentie. Het is bekend dat ELA een risicofactor is voor het ontwikkelen van stoornissen zoals depressie, stoornis in het gebruik van middelen, posttraumatische stressstoornis (PTSS) en angst 2,3,4,5. Dit is belangrijk gezien het feit dat de armoede onder kinderen in de VS de laatste tijd meer dan verdubbeld is, van 5,2% in 2021 tot 12,4% in 20226, en hoewel armoede zelf niet noodzakelijkerwijs ELA is, verhoogt het wel de kans op verschillende soorten ELA7.

Diermodellen zijn al lang essentieel voor het begrijpen van de effecten van stress in het vroege leven op de ontwikkeling van de hersenen en de resultaten voor volwassenen. De twee belangrijkste diermodellen die de afgelopen jaren zijn gebruikt om dit fenomeen te ontleden, zijn maternale scheiding (MS) en een verarmde omgeving veroorzaakt door beperkt strooisel en nestmateriaal (LBN). MS is ontwikkeld als een model van ouderlijke deprivatie8. Daarin worden knaagdierdammen bij hun pups weggehaald, meestal gedurende enkele uren, elke dag tot het spenen8. Het is gebleken dat het MS-paradigma resulteert in depressief en angstachtig gedrag op volwassen leeftijd9, evenals een afwijkende reactie op chronische stress10,11. Aan de andere kant scheidt het LBN-model, voor het eerst ontwikkeld in het Baram-laboratorium12, de moeder niet van de pups, maar wijzigt het eerder de omgeving waarin de pups worden grootgebracht, waardoor een omgeving met weinig hulpbronnen wordt nagebootst 12,13. Het verminderen van de hoeveelheid nestmateriaal en het voorkomen van directe toegang tot het strooisel in dit model resulteert in een verstoorde moederzorg van de moederdieren3. Aangezien robuuste en voorspelbare maternale zorg nodig is voor de juiste ontwikkeling van cognitieve en emotionele hersencircuits14, kan gefragmenteerde maternale zorg van LBN resulteren in een reeks uitkomsten, waaronder een overactieve hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) -as, verschoven prikkelend-remmend evenwicht in meerdere hersengebieden, verhoogde niveaus van corticotropine-releasing hormoon (CRH) en depressief gedrag bijhet nageslacht. 15,16,17,18,19.

Het exacte mechanisme waardoor ELA leidt tot een verhoogd risico op neuropsychiatrische stoornissen is niet volledig begrepen. Men denkt dat het verband houdt met veranderingen in het circuit van de HPA-as19,20, en recent bewijs toont aan dat dit kan worden veroorzaakt door veranderingen in microgliale synaptische snoei19. Het is aangetoond dat het LBN-model een cruciaal hulpmiddel is voor het begrijpen van de impact van de perinatale omgeving op de ontwikkeling van de hersenen en gedragsresultaten op de lange termijn. Hoewel dit model in eerste instantie werd ontwikkeld voor ratten, is het ook aangepast voor muizen om te profiteren van de bestaande transgene hulpmiddelen12,13. Het model lijkt met name erg op elkaar in beide soorten en veroorzaakt zeer convergente resultaten, zoals veranderingen in de HPA-as, cognitieve tekorten en depressief gedrag, waardoor het soortoverschrijdende nut en het translationele potentieel ervan wordt benadrukt. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe het beperkte bedding- en nestmodel bij muizen kan worden gebruikt, waarbij het gedrag van de moeder en de resultaten van het nageslacht worden verzameld en geanalyseerd om de werkzaamheid van het model en de verwachte resultaten te valideren.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Georgia State University (goedkeuringsnummer A24011). De muizen werden gefokt en onderhouden in de Animal Facilities van de Georgia State University. De experimenten werden uitgevoerd op een C57BL/6J-stam tijdens de perinatale periode (postnatale dag [P] 2-10) en omvatten mannen en vrouwen. De reagentia en apparatuur die voor dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Materiaal instellen

  1. Snijd de gaasverdeler volgens de afmetingen van de kooi en laat aan de langere zijden een overschot van 3 cm over.
    NOTITIE: Het gaas in de tabel met materialen is gesneden door de fabrikant.
  2. Vouw de randen, inclusief het overtollige, op een manier die een platform creëert dat precies aansluit op de randen van de kooi en met ~2,5 cm hoogte boven de vloer. Hierdoor kunnen urine en uitwerpselen door de gaasverdeler gaan zonder dat de dieren het strooisel van de maïskolf kunnen ophalen. Zorg er ten slotte voor dat alle scherpe randen naar beneden zijn gevouwen om schade aan de dieren te voorkomen.
    OPMERKING: De gaasverdelers zijn herbruikbaar en moeten tussen gebruik grondig worden gereinigd met heet water en zeep, gevolgd door sproeien met 70% ethanol.
  3. Plaats de camera's op statieven en bereid het opnamesysteem voor.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om videobeheersoftware te gebruiken. Deze opnames resulteren in .mp4 bestanden die automatisch worden samengevoegd in segmenten van 1 uur.
  4. Pas de instellingen aan naar continu opnemen.
    OPMERKING: Aanvullende aanbevolen instellingen zijn een resolutie van 1920 x 1080 en 30 frames/s.
  5. Stel de resulterende .mp4 bestanden in om te verdelen in segmenten van 1 uur als dit niet automatisch wordt gedaan door videobeheersoftware.
  6. Gebruik infraroodverlichting als u de periode van het licht uitschakelt.
    NOTITIE: Om de schittering van de opname aan de zijkant van de kooi te verminderen, wordt aanbevolen om het infrarood (IR) van de camera uit te schakelen. Gebruik in plaats daarvan IR-schijnwerpers in de kamer tijdens de opname in de donkere fase.

2. Paradigma van beperkte bedding en nesten (LBN)

  1. Koppel 1-4 vrouwtjes met een mannelijke fokker met één huis.
    OPMERKING: De aanbevolen leeftijd voor de eerste paring bij experimentele vrouwtjes is P75. Het gebruik van nulliparae vrouwtjes is ideaal, maar in situaties waarin dit niet haalbaar is, zoals met waardevolle transgene muizenlijnen, kunnen multipare vrouwtjes ongeveer vier maanden daarna blijven broeden. Het wordt aanbevolen, hoewel niet verplicht, om dagelijks te controleren op vaginale pluggen om de dag van paring te bevestigen (embryonale dag [E]0).
    1. Als de dammen eenmaal drachtig zijn, houd de verstoringen dan minimaal.
      OPMERKING: Vermenigvuldigende vrouwtjes kunnen over het algemeen worden hergebruikt om tot vijf nesten te produceren voordat de vruchtbaarheid afneemt. Als de dammen voor het experiment worden hergebruikt, moeten ze bij voorkeur elke keer voor dezelfde toestand worden gebruikt of alleen worden overgeschakeld van controle naar LBN, maar nooit andersom, om resterende langetermijneffecten van LBN op de dam te voorkomen.
  2. Op E17 (of als de pluggen niet zijn gecontroleerd, wanneer de vrouwtjes er duidelijk zwanger uitzien), scheid je de vrouwtjes in hun eigen standaard plexiglazen kooi en geef je ze een katoenen nestje (5 x 5 cm) om een nest te bouwen.
    OPMERKING: Het is optimaal om gescheiden vrouwtjes te verplaatsen naar een rustige, kleine kamer weg van de hoofdkoloniekamer met een licht/donker-cyclus van 12 uur en minimale verstoringen van het personeel voor de controle- en LBN-opstelling.
  3. Noteer de geboortedatum (rond E19).
  4. Bij P2 tel je de pups en geslacht je ze. Wijs willekeurig nesten toe aan LBN- of controleomstandigheden (als het het eerste nest van de moeder is). Deze interactie met de pups moet tussen 1 en 4 uur na het inschakelen van de lichten zijn voltooid.
    1. Plaats de pups voorzichtig in een nieuwe, schone kooi om op geslacht te worden gesorteerd. De anogenitale afstand tussen de anus en de geslachtsorganen is groter bij mannen dan bij vrouwen en kan als identificatiemiddel worden gebruikt.
    2. Verdeel mannetjes en vrouwtjes in groepen om ze te tellen.
    3. Ruimt nesten met meer dan 8 pups en gooit nesten met minder dan 4 terug. De optimale worpgrootte is 4-8 pups, omdat alles buiten dit bereik de verdeling van de moederlijke zorg tijdens het onderzoek kan verstoren.
      OPMERKING: De variabelen die kunnen worden beïnvloed door de worpgrootte zijn het gewicht van de jongen, de voedingsmogelijkheid en de interacties tussen moeder en pup, wat het experiment zou kunnen verwarren. Idealiter worden muizen niet gekruist, omdat ze minder kans hebben om te overleven dan ratten.
  5. Stel de Control- en LBN-condities in zoals weergegeven in afbeelding 1.
    1. Bediening: Gebruik een muizenschoenendooskooi van standaardformaat (19,4 cm x 13,0 cm x 38,1 cm) met ~220 g maïskolfstrooisel (afhankelijk van de afmetingen van de kooi, gericht op ~1 cm hoogte) en een standaard vierkant katoenen nestje (5 x 5 cm).
      1. Om de muizen te helpen acclimatiseren aan deze onbekende omgeving, plaatst u een van hun fecale korrels uit hun oude kooi in elke hoek van de nieuwe kooi. Plaats daarnaast een kleine hoeveelheid gebruikt katoennestje uit de vorige kooi over het nieuwe nestje.
    2. LBN: Plaats de eerder voorbereide gaasverdeler in een standaard schoenendooskooi met ~110 g maïskolfstrooisel (streef naar ~0,5 cm hoogte). Het gaas moet direct contact tussen de muizen en het strooisel van maïskolven voorkomen.
      1. Voeg als laatste de helft van een katoenen nestje vierkant (2,5 x 5 cm) toe. Herhaal alle bovenstaande stappen om te helpen bij het acclimatiseren.
        OPMERKING: Het wordt aanbevolen om schoenendooskooien op standaard, niet-geventileerde rekken te houden, omdat is aangetoond dat deze opstelling stil is en geen onderkoeling veroorzaakt bij pups die zijn grootgebracht in LBN-kooien21. Dit is echter mogelijk niet het geval met de verhoogde luchtstroom in geventileerde kooien; Daarom moeten onderzoekers het geluidsniveau en de kerntemperatuur van de jongen in hun systeem meten als ze geventileerde kooien gebruiken.
  6. Voeg de pups toe aan hun aangewezen kooi en plaats ze bovenop het nestje. Plaats vervolgens de moeder in de kooi met het gezicht naar de pups, omdat dit haar zal helpen sneller te merken dat ze aanwezig zijn. Zorg ervoor dat er voldoende voedsel en water wordt meegeleverd voor ten minste 8 dagen om te voorkomen dat de kooi wordt verstoord tot het einde van het experiment bij P10.
  7. Plaats een camera op een statief voor de kooi, zodat u een duidelijk zijaanzicht heeft van de dam en haar pups. Plaats eventueel spiegels rond de kooi om alle hoeken beter vast te leggen. Hoewel er slechts 1 uur video-opname per dag hoeft te worden geanalyseerd, is de camera zo ingesteld dat hij tijdens het experiment 24/7 continu opneemt, zodat verstoringen kunnen worden gemonitord.
    OPMERKING: Muizen kunnen ook persoonlijk worden geobserveerd en het gedrag van de moeder kan met de hand worden gescoord, hoewel het de voorkeur verdient om video-opnames te maken om verstoringen als gevolg van de aanwezigheid van de onderzoeker in de kamer te voorkomen. Als geventileerde rekken worden gebruikt, kan het ook nodig zijn om een andere procedure te gebruiken om camera's te plaatsen voor het opnemen van kraamzorg dan hier beschreven.
  8. Breng op de ochtend van P10 alle dieren terug naar de standaard kooiomstandigheden (idealiter identiek aan de controleconditie hierboven) en weeg de jongen.
  9. Behandel alle pups hetzelfde en spenen bij P21 in groepen van 2-5 nestgenoten van hetzelfde geslacht.
    OPMERKING: Probeer waar mogelijk nestgenoten van hetzelfde geslacht samen te huisvesten, maar indien nodig, huisvest nakomelingen van hetzelfde geslacht uit verschillende nesten in dezelfde toestand samen. Het wordt aanbevolen om huisvestingscontrole en LBN-nakomelingen samen te vermijden (zie Yang et al. voor het effect van de samenstelling van de kooi op gedragsfenotypes22).

figure-protocol-1
Figuur 1: Voorbeeld van het instellen van de kooi. De kooi aan de linkerkant van de afbeelding toont een standaard controlekooi (CTL) met een volledige hoeveelheid bodembedekking en een volledig nestje. De kooi aan de rechterkant toont een beperkte bedding en nestopstelling (LBN) met de helft van de hoeveelheid strooisel, een half nestje en een gaasverdeler om de dieren van het strooisel te scheiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Scoren van moederlijk gedrag

  1. Hoewel in deze opstelling continue opnames worden verzameld, analyseert u slechts 1 uur van P3 tot P6. Het wordt aanbevolen om video's te analyseren die niet eerder dan 1 uur na het wisselen van de lichten zijn opgenomen om gewenning mogelijk te maken en om video's elke dag op een consistent tijdstip te analyseren.
    LET OP: De periode van P3 tot P6 bevat doorgaans de grootste verschillen in kraamzorg als gevolg van LBN; Daarom is het alleen nodig om deze dagen te analyseren. De voorgestelde observatie-/registratietijd maakt het mogelijk om activiteit vast te leggen na de overgang van de actieve naar de inactieve cyclus of vice versa. De inactieve fase is echter de fase waarin de moeder het meest geneigd is om deel te nemen aan maternale zorg en eerder is aangetoond dat deze de grootste groepsverschillen in maternale gedragskenmerkenbevat3.
    OPMERKING: Leg P2-opnamen later vast dan op andere dagen, omdat muizen minstens 1 uur nodig hebben om aan de verandering van de kooi te wennen. Tenzij dit een variabele van belang is, moet u deze dag uit de analyse verwijderen.
  2. Scoor alle gedragingen zoals weergegeven in Tabel 1. Doorgaans wordt gedrag gescoord gedurende de eerste 50 minuten nadat de tijd voor het verzamelen van gegevens is begonnen.
    OPMERKING: Dit kan met de hand of elektronisch worden gedaan met behulp van de Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS, een open-source software) of een vergelijkbaar type software. De onderstaande instructies zijn voor het scoren van de hand en kunnen worden aangepast voor elke gekozen software.
  3. Noteer in een gedrukte tabel het waargenomen gedrag met behulp van de afkorting, de starttijd en duur van de wedstrijd en eventuele beschrijvende notities. Als de moeder bijvoorbeeld actief borstvoeding geeft en vervolgens het nest verlaat, maar de pups zijn nog steeds aan haar gehecht, noteer dit dan als AN, gevolgd door O. De beschrijving van de pups (en hoeveel) die er nog aan vastzitten, moet als een notitie aan de zijkant worden bewaard voor het geval dit later nodig is.
    OPMERKING: Elk gedrag van minder dan 3 s lang wordt niet geanalyseerd. Deze regel helpt bij het filteren van kortstondig gedrag als gevolg van verstoringen van buitenaf, zoals omgevingslawaai. Een uitzondering wordt gemaakt wanneer er een zichtbare onderbreking is van een AN-aanval (zoals door een grote beweging of rek) die snel wordt hervat. In dit geval is het genoteerde gedrag AN, gevolgd door N-AN, zoals beschreven in Tabel 1.
  4. In het geval dat er meerdere gedragingen tegelijk plaatsvinden, noteer dan de meest actieve. Een voorbeeld hiervan is als de moeder weinig borstvoeding geeft maar later begint te likken en te verzorgen, er wordt opgemerkt dat de lage borstvoeding stopt en het volgende gedrag moet worden gemarkeerd als LG met de opmerking dat dit gebeurde tijdens LN.
Soort gedragAfkortingBeschrijving
Likken / verzorgenLGDe moeder is bezig met het likken/verzorgen van haar pups.
Actieve verplegingEENDe moeder zoogt haar pups staand, terwijl haar rug gebogen is.
Nieuwe actieve verplegingN-ANDit gedrag wordt specifiek gebruikt wanneer de moeder de borstvoeding heeft onderbroken, maar snel wordt hervat. Dit is een uitzondering op de 3s-regel.
Lage verplegingLNDe moeder is actief bezig met het zogen, maar haar rug is laag of bijna plat. Dit gedrag volgt meestal AN na een bepaalde tijd.
Zijwaartse verplegingSNDe moeder ligt op haar zij tijdens de borstvoeding (ook wel passieve verpleging genoemd).
Uit nestODe moeder is niet op het nest en ze eet/drinkt niet. Dit is te zien aan haar wandeling door de kooi of op verkenning.
Eten/drinkenEDe moeder is van het nest aan het eten of drinken.
ZelfverzorgendSGDe moeder is zichzelf aan het verzorgen.
Het dragen van pupsCDe moeder draagt de pups, meestal om ze terug naar het nest te verplaatsen.
De bouw van het nestLet opDe dam is actief bezig met het bouwen of verplaatsen van het nest.
Verplaatsen op nestMDe dam beweegt op het nest. Dit presenteert zich met de moeder die op een andere manier met de pups omgaat dan LG of enige vorm van borstvoeding, zoals snuffelen, grootbrengen of op de pups stappen.

Tabel 1: Beschrijving van het zorggedrag van de moeder.

4. Gegevensanalyse van moederlijk gedrag

  1. Verzamel de scoreresultaten in een spreadsheet.
  2. Als de video's elektronisch zijn geanalyseerd, verwijdert u het gedrag met periodes korter dan 3 s, zoals beschreven in stap 3.
  3. Bereken de gemiddelde duur van de wedstrijd, de gemiddelde frequentie en de totale duur van likken en verzorgen voor elke observatiedag.
    OPMERKING: Beschrijvende statistieken kunnen worden uitgevoerd op elk van de gescoorde gedragingen, maar likken en verzorgen zullen doorgaans de meest voor de hand liggende verstoring vertonen in termen van fragmentatie door LBN (d.w.z. kortere, frequentere aanvallen). Deze variabelen kunnen worden geanalyseerd als een gemiddelde over P3-P6, of als herhaalde metingen per dag om te zoeken naar eventuele veranderingen in de loop van de tijd als dit van belang is.

5. Berekening van de entropie

OPMERKING: Entropie, of onvoorspelbaarheid, van maternale zorggedrag wordt berekend op basis van de methode voorgesteld door Vegetabile et al.23. Deze methode is gebaseerd op de veronderstelling dat maternale zorggedragingen fungeren als een Markov-keten, die kan worden gebruikt om de entropiesnelheid van een gedragssequentie te schatten. De opeenvolging van gedragingen van elke dam wordt gekarakteriseerd met behulp van de empirische overgangsmatrix ij> i,j = 1... 7 van de voorwaardelijke waarschijnlijkheden om van het ene gedrag (i) naar het andere gedrag (j) te gaan, en de entropiesnelheid wordt hieruit berekend zoals eerder beschreven 3,23 en als volgt:
figure-protocol-2
waarbij pij de voorwaardelijke kans is dat gedrag j vervolgens wordt waargenomen nadat een dam gedrag i heeft uitgevoerd, πi de frequentie is waarmee gedrag i wordt waargenomen, en M (=7) het totale aantal verschillende gedragingen is. De lezer wordt verwezen naar Vegetabile et al.23 voor een bespreking van de theoretische onderbouwing van de vergelijkingen; hier ligt de focus op het toepassen van de methode in het LBN-model.

  1. Om dit te berekenen, rangschikt u het formaat dat nodig is voor de analyse.
    1. Combineer AN, LN, SN en N-AN tot één variabele met de naam N door de tijden bij elkaar op te tellen, aangezien ze allemaal betrekking hebben op verpleging.
      OPMERKING: Raadpleeg Tabel 1 voor de beschrijving van het gedrag van de moederlijke zorg.
    2. Voeg de gedragingen die niet gerelateerd zijn aan zelf- of pupgericht gedrag (M en O) op in O.
    3. Voer LG, E, SG, C en NB afzonderlijk in om te resulteren in 7 totale gedragingen.
  2. Maak een spreadsheet met kolommen in deze volgorde: Muis-ID, Nest-ID, Nestje #, Behandeling, Dag, Tijd, Gedrag en Status.
    1. Voeg in de muis-ID de muislijn/het genotype van de moeder toe.
    2. Gebruik in de nest-ID de identificatiecode van het moederdier, gevolgd door het nestnummer.
    3. Geef bij nest # het aantal nesten aan dat het moederdier heeft gehad.
    4. Zorg ervoor dat de behandeling LBN of Control is, afhankelijk van de omstandigheden waarin de dieren zijn geplaatst.
    5. Geef de dag aan als de overeenkomstige geanalyseerde postnatale dag.
    6. Geef de tijd aan als de tijdstempel in de video wanneer het gedrag begon en eindigde (ten opzichte van het begin van de opname).
    7. Selecteer het gedrag uit de zeven eerder beschreven (N, O, LG, E, SG, C en NB) (Tabel 1).
    8. Markeer de twee soorten statussen, START en STOP. Daarom zal elk gedrag twee keer voorkomen; De eerste notatie markeert het begin en de tweede markeert het einde.
  3. Neem volgens dit formaat de informatie van alle geanalyseerde dagen op.
  4. Importeer in de R-omgeving de gegevenssets die zijn opgemaakt zoals hierboven.
  5. Installeer de pakketten die beschikbaar zijn bij https://github.com/bvegetabile/entropyRate.
    OPMERKING: Als u deze code uitvoert, wordt er een map met de naam LBN weergegeven; Ongeacht de voorwaarde bevat deze map de berekende entropie. Bovendien kan de entropie van elke dag dan door de proefpersoon worden gemiddeld voor P3-P6 en tussen de omstandigheden worden vergeleken.

Resultaten

De representatieve resultaten tonen aan hoe ELA, opgelegd door een verarmde omgeving in LBN-kooien, de fysiologische resultaten van de moederlijke zorg van moederdieren en nakomelingen beïnvloedt. De dagelijkse entropie in maternale zorggedrag is hoger in LBN over de dagen P3-P6 (F1,58 = 7,21, p = 0,0094; Figuur 2A), evenals de gemiddelde entropie van elke dam uit deze periode (t15 = 3,03, p = 0,0085; Figuur 2B). Er is met name geen significant verschil in gemiddelde entropiesnelheid tussen verschillende nesten van dezelfde moeder wanneer ze binnen dezelfde behandelingsgroep worden gehouden (F1.699,4.247 = 0.57, p = 0.58; Figuur 2C), wat suggereert dat de entropiesnelheid een enigszins stabiele eigenschap kan zijn voor elke dam. Van alle gedragingen is likken en verzorgen degene waarvan is aangetoond dat deze het meest gefragmenteerd is door LBN3. De LBN-moederdieren vertonen een hogere frequentie van likken en verzorgen van hun pups (LG) (t16 = 4,04, p = 0,0010; Figuur 2D) en in kortere periodes (t16 = 3,25, p = 0,0050; Figuur 2E). Er is echter geen significant verschil in de totale duur van LG tussen de Control- en LBN-dammen (t16 = 1,52, p = 0,15; Figuur 2F).

figure-results-1
Figuur 2: Analyse van maternale gedrags. (A) De dagelijkse entropiesnelheid is hoger bij dammen met beperkte bedding en nesten (LBN) vs. controle (CTL) zoals geanalyseerd door het mixed-effects-model (F1,58 = 7,21, p = 0,0094). (B) De gemiddelde entropiesnelheid is hoger in LBN-dammen vs. CTL (t15 = 3,03, p = 0,0085). (C) De gemiddelde entropiesnelheid (P3-P6) is niet significant verschillend tussen meerdere nesten binnen dezelfde moeder wanneer deze in dezelfde behandelingsgroep worden gehouden (F1,699,4,247 = 0,57, p = 0,58). Elke lijn vertegenwoordigt een enkele dam. (D) De cumulatieve frequentie van lik- en verzorgingsgebeurtenissen (LG) is hoger voor LG-moederdieren vs. CTL (t16 = 4,04, p = 0,0010). (E) De gemiddelde lengte van de LG-bout is korter voor LG-dammen vs. CTL (t16 = 3,25, p = 0,0050). (F) De cumulatieve tijd die aan LG wordt doorgebracht, verschilt niet significant als gevolg van LBN (t16 = 1,52, p = 0,15). De gegevens zijn gemiddeld ± SEM, * p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Pups die in LBN-omstandigheden zijn grootgebracht, zijn bij P10 significant kleiner (t61 = 6,30, p < 0,0001; Figuur 3A). Dit verschil houdt meestal aan bij de speenleeftijd (t62 = 6,29, p = <0,0001; Figuur 3B) maar wordt niet langer waargenomen op volwassen leeftijd (t38 = 1,08, p = 0,29; Figuur 3C). De corticosteronspiegels zijn echter verhoogd bij aanvang in de volwassenheid (t18,79 = 2,23, p = 0,038; Figuur 3D), wat wijst op blijvende fysiologische effecten van LBN. Dit zijn de verwachte verschillen in een succesvolle experimentele opstelling. In het geval van een suboptimale opstelling kunnen de waarden van LG bout lengte, entropie en pupgewichten geen verschillen vertonen, waarschijnlijk als gevolg van een gestreste "Controle" -groep. Voor de doeleinden van dit artikel werd geslacht samengevouwen bij het analyseren van de uitkomsten van nakomelingen, omdat sekseverschillen doorgaans niet worden waargenomen in de fysiologische uitkomsten die hier worden beschreven; Sekseverschillen in andere soorten uitkomsten, zoals cognitief en emotioneel gedrag, worden echter vaak gerapporteerd in dit model en moeten verder worden onderzocht4.

figure-results-2
Figuur 3: Uitkomsten van de nakomelingen. (A) Beperkt strooisel en nesten (LBN) vermindert het gewicht van de jongen gemeten op P10, net voor de terugkeer naar de standaardkooien (t61 = 6,30, p < 0,0001). (B) Het gewicht is nog steeds afgenomen met LBN op de speenleeftijd (t62 = 6,29, p < 0,0001). (C) Het gewicht van de volwassene verschilt niet meer als gevolg van LBN (t38 = 1,08, p = 0,29). (D) De baselineconcentratie van corticosteron op volwassen leeftijd wordt verhoogd door LBN, zoals geanalyseerd door de t-test van Welch (t18,79 = 2,23, p = 0,038). Voor alle grafieken worden vrouwen weergegeven met cirkels en mannen met driehoeken. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM, *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om het LBN-model bij muizen toe te passen. Dit model is een belangrijk hulpmiddel om te begrijpen hoe een ethologisch en translationeel relevante vorm van chronische stress in het vroege leven bijdraagt aan de ontwikkeling van neuropsychiatrische stoornissen bij het nageslacht. Het is ook nuttig voor het bestuderen van maternale gedrag en eventuele veranderingen in de hersenen van de moeders vanuit een moleculair, neuro-endocrien of circuitgebaseerd perspectief24. Voor dit soort vragen kan multipariteit een belangrijkere variabele zijn om te overwegen. We hebben waargenomen dat de entropiescores van het moedergedrag consistent blijven over meerdere nesten binnen dezelfde moeder (Figuur 2C), wat suggereert dat entropie een enigszins stabiele eigenschap kan zijn voor elke moeder. Deze bevinding kan het gebruik van multipare vrouwelijke muizen rechtvaardigen wanneer het niet haalbaar is om alleen nulliparae vrouwtjes te gebruiken, zoals in het geval van dure of zeldzame transgene muizen. Vanwege de mogelijke onbedoelde effecten van multipariteit op andere variabelen (bijv. intra-uteriene omgeving), wordt aanbevolen dat de onderzoeker statistisch controleert op het gebruik van multipare vrouwtjes tijdens gegevensanalyse.

Het is belangrijk op te merken dat dit model zeer gevoelig is voor omgevingsverstoringen. Meerdere factoren kunnen de dieren verstoren en problemen en suboptimale resultaten veroorzaken, zoals overstroming van de kooi of harde geluiden zoals van nabijgelegen constructies. Meestal zullen deze verstoringen ertoe leiden dat controledieren gestrest raken en daarom zullen er geen verschillen zijn tussen de controle- en LBN-omstandigheden. Een indicator van deze problemen kan zijn dat het gewicht van controle- en LBN-pups op P10 vergelijkbaar is en dat de entropiewaarden in het zorggedrag van de moeder vergelijkbaar zijn. Daarom is de ideale opstelling een kraamkamer die alleen voor dit doel wordt gebruikt, rustig en weg van de kolonie en ander laboratoriumpersoneel. Verstoringen kunnen ook leiden tot kannibalisme van pups, vooral bij moederdieren jonger dan P75. Het risico om pups te verliezen aan kannibalisme is lager bij moederdieren na P75 en vaak na het eerste nest. Een alternatieve versie van deze methode verschuift de timing van de experimentele manipulatie naar P4-P11 om het risico op kannibalisme nog verder te verkleinen25,26; hoewel dit in de huidige laboratoriumomstandigheden niet nodig is. Een andere versie van LBN maakt geen gebruik van een gaasverdeler, maar beperkt nog steeds de hoeveelheid strooisel en nestmateriaal voor de gehele postnatale periode vóór het spenen27. Het is belangrijk op te merken dat het veranderen van de tijdlijn kan leiden tot verschillende resultaten, zoals beledigend moederlijk gedrag, wat op zijn beurt kan resulteren in verschillende resultaten voor het nageslacht, zoals angstachtig gedrag25,28. Andere veel voorkomende problemen zijn onder meer het verliezen van gegevens over het gedrag van de moeder als gevolg van de camerahoek en de grote nestgrootte; Om hierbij te helpen, is het aan te raden om een spiegel achter in de kooi te plaatsen en ervoor te zorgen dat er in de controletoestand slechts één nestje is om te voorkomen dat het nest te groot wordt en de pups voor de camera verbergt. Ten slotte is het essentieel om ervoor te zorgen dat het gaas goed in de kooi past om te voorkomen dat pups vast komen te zitten of gewond raken.

Een voordeel van het LBN-model is dat het gemakkelijk kan worden aangepast en gecombineerd met andere experimentele factoren. Voorbeelden van de variabelen die aan dit protocol kunnen worden toegevoegd zijn dieet29,30, immuunuitdagingen30,31, verschillende transgene lijnen32,33 en chemogenetica19. Bovendien gebruiken sommige versies van dit model een P10-P17-tijdsbestek en combineren dit met maternale scheiding (MS)34,35,36. Dit paradigma is ook aangepast als een prenatale stressor, waarbij moederdieren worden gehuisvest in de LBN-omgeving van E14 tot E1937,38, maar de pups worden nooit direct blootgesteld aan de stress. Ten slotte gebruiken sommige onderzoeken een twee-hit-model waarbij ELA wordt gecombineerd met verschillende stresstests op het nageslacht wanneer ze de volwassenheid bereiken19,39.

Een van de beperkingen van deze methode is dat deze geen hoge doorvoer heeft. De hoeveelheid gegevens die het produceert, wordt beperkt door het aantal camera's en de beschikbare ruimte tegelijk, hoewel de nesten gemakkelijk in de loop van de tijd kunnen worden gespreid. Het handmatig scoren van moederlijk gedrag is bijzonder tijdrovend en kan vooringenomenheid van waarnemers introduceren, maar geautomatiseerde scores worden momenteel ontwikkeld40, dankzij de komst van op machine learning gebaseerde benaderingen. Als de gegevens met de hand worden gescoord, wordt aanbevolen dat dezelfde persoon alle video's voor één experiment beoordeelt om de variabiliteit tussen waarnemers te verminderen. Een andere beperking is dat dit model is ontworpen voor knaagdieren die voornamelijk afhankelijk zijn van maternale zorg, waardoor het moeilijk is om biparentale zorg te bestuderen. Sommige groepen hebben echter vaderlijke deprivatie aangenomen als alternatief voor MS bij biparentale soorten zoals de Californische muis41,42, dus het is denkbaar dat LBN ook voor deze soorten kan worden aangepast.

Afgezien van LBN is maternale scheiding het andere meest prominente model voor ELA, omdat andere vormen van stress die bij volwassenen worden gebruikt (d.w.z. fixatiestress) niet ethologisch relevant zijn en pups niet op dezelfde manier beïnvloeden. LBN verschilt van MS omdat het een vorm van chronische stress is die gefragmenteerd en onvoorspelbaar moederlijk gedrag veroorzaakt, terwijl bij MS deprivatie intermitterend is en meestal op voorspelbare tijden per dag optreedt43. Interessant is dat beide modellen veranderingen in de HPA-as en depressief gedrag bij knaagdieren kunnen veroorzaken, hoewel LBN een meer reproduceerbaar protocol kan zijn met minder interactie tussen onderzoekers en een hogere consistentie in laboratoria 1,11,13,16. Hoewel dit protocol nuttig is bij het verminderen van sommige bronnen van variabiliteit (zoals experimentatorgerelateerd), kunnen andere aspecten, zoals verschillen in dierfaciliteiten, herkomst van de dieren of stam, de resultaten beïnvloeden. Het is bijvoorbeeld bekend dat BALB/c-muizen een meer uitgesproken respons hebben op chronische fixatiestress en mogelijk differentieel gevoelig zijn voor ELA dan C57BL/6J27,44.

Concluderend maakt het LBN-model gebruik van een omgeving met weinig middelen en onvoorspelbare moederzorg en is het een nuttige benadering om te begrijpen hoe stress in het vroege leven een breed scala aan processen beïnvloedt, zoals fysiologische aanpassingen aan stress, moederlijk gedrag en hersenontwikkeling. Dit model is met name gebruikt om te begrijpen hoe en waarom ELA een risicofactor is voor neuropsychiatrische stoornissen 1,5,9,12. In de toekomst zal het gebruik van LBN ons begrip van de biologische basis van zowel mentale als fysieke aandoeningen vergroten en helpen bij het ophelderen van nieuwe therapeutische doelen om de effecten van stress tijdens de gevoelige perinatale periode te behandelen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIMH K99/R00 Pathway to Independence Award #MH120327, Whitehall Foundation Grant #2022-08-051 en NARSAD Young Investigator Grant #31308 van de Brain & Behavior Research Foundation en The John and Polly Sparks Foundation. De auteurs willen de afdeling Dierlijke Hulpbronnen van de Georgia State University bedanken voor het verlenen van uitzonderlijke zorg aan onze dieren., en Ryan Sleeth voor zijn uitstekende technische ondersteuning bij het opzetten en onderhouden van ons videobeheersysteem. Dr. Bolton wil ook Dr. Tallie Z. Baram bedanken voor de uitstekende training in de juiste implementatie van het LBN-model tijdens haar postdoctorale fellowship.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-inch 4 MP 4x Zoom IR Mini PT Dome Network CameraHikvisionDS-2DE2A404IW-DE3(S6)
Amazon Basics Aluminium lichtfotografie-statief met tas - pakket van 2, 2,8 - 6,7 voet, 3,66 pond, zwartAmazonVan Amazon
Blue IrisBlue Iris SecurityOptionele videobeheersoftware
CAMVATE 1/4"-20 Mini kogelkop met plafondmontage voor CCTV & Video Wall Monitors Mount - 1991CamvateVan Amazon
MaïskolpbeddingThe Andersons4B
Katoenen nestjeAncareNES3600
GaasverdelerMcNICHOLS4700313244Standaard, Aluminium, Legering 3003-H14, 3/16" Nr..032 Standaard (Verhoogd), 70% Open Gebied
Tendelux DI20 IR-verlichterTendeluxVan Amazon

Referenties

  1. Warhaftig, G., Almeida, D., Turecki, G. Early life adversity across different cell- types in the brain. Neurosci Biobehav Rev. 148, 105113(2023).
  2. Duffy, K. A., Mclaughlin, K. A., Green, P. A. Early life adversity and health-risk behaviors: Proposed psychological and neural mechanisms. Ann N Y AcadSci. 1428 (1), 151-169 (2018).
  3. Molet, J., et al. Fragmentation and high entropy of neonatal experience predict adolescent emotional outcome. Transl Psychiatry. 6 (1), e702(2016).
  4. Garvin, M. M., Bolton, J. L. Sex-specific behavioral outcomes of early-life adversity and emerging microglia-dependent mechanisms. Front Behav Neurosci. 16, 1013865(2022).
  5. Andersen, S. L. Neuroinflammation, early-life adversity, and brain development. Harv Rev Psychiatry. 30 (1), 24-39 (2022).
  6. Shrider, E. A., Creamer, J. Poverty in the United States: 2022. , Washington, DC. 60(2023).
  7. Roos, L. L., Wall-Wieler, E., Lee, J. B. Poverty and early childhood outcomes. Pediatrics. 143 (6), e20183426(2019).
  8. Ader, R., Tatum, R., Beels, C. C. Social factors affecting emotionality and resistance to disease in animals: I. Age of separation from the mother and susceptibility to gastric ulcers in the rat. J Comp Physiol Psychol. 53 (5), 446-454 (1960).
  9. Nishi, M. Effects of early-life stress on the brain and behaviors: Implications of early maternal separation in rodents. Int J Mol Sci. 21 (19), 7212(2020).
  10. Trujillo, V., Durando, P. E., Suárez, M. M. Maternal separation in early life modifies anxious behavior and fos and glucocorticoid receptor expression in limbic neurons after chronic stress in rats: Effects of tianeptine. Stress. 19 (1), 91-103 (2016).
  11. Yu, S., et al. Early life stress enhances the susceptibility to depression and interferes with neuroplasticity in the hippocampus of adolescent mice via regulating miR-34c-5p/SYT1 axis. J Psychiatr Res. 170, 262-276 (2023).
  12. Walker, C. D., et al. Chronic early life stress induced by limited bedding and nesting (LBN) material in rodents: Critical considerations of methodology, outcomes and translational potential. Stress. 20 (5), 421-448 (2017).
  13. Rice, C. J., Sandman, C. A., Lenjavi, M. R., Baram, T. Z. A novel mouse model for acute and long-lasting consequences of early life stress. Endocrinology. 149 (10), 4892-4900 (2008).
  14. Glynn, L. M., Baram, T. Z. The influence of unpredictable, fragmented parental signals on the developing brain. Front Neuroendocrinol. 53, 100736(2019).
  15. Karst, H., et al. Acceleration of GABA-switch after early life stress changes mouse prefrontal glutamatergic transmission. Neuropharmacology. 234, 109543(2023).
  16. Demaestri, C., et al. Resource scarcity but not maternal separation provokes unpredictable maternal care sequences in mice and both upregulate CRH-associated gene expression in the amygdala. Neurobiol Stress. 20, 100484(2022).
  17. Breton, J. M., et al. Early life adversity reduces affiliative behavior with a stressed cagemate and leads to sex-specific alterations in corticosterone responses in adult mice. Horm Behav. 158, 105464(2023).
  18. Bath, K. G., Manzano-Nieves, G., Goodwill, H. Early life stress accelerates behavioral and neural maturation of the hippocampus in male mice. Horm Behav. 82, 64-71 (2016).
  19. Bolton, J. L., et al. Early stress-induced impaired microglial pruning of excitatory synapses on immature CRH-expressing neurons provokes aberrant adult stress responses. Cell Rep. 38 (13), 110600(2022).
  20. Dahmen, B., et al. Effects of early-life adversity on hippocampal structures and associated HPA axis functions. Dev Neurosci. 40 (1), 13-22 (2018).
  21. Bolton, J. L., Short, A. K., Simeone, K. A., Daglian, J., Baram, T. Z. Programming of stress-sensitive neurons and circuits by early-life experiences. Front Behav Neurosci. 13, 30(2019).
  22. Yang, M., Lewis, F., Foley, G., Crawley, J. N. In tribute to Bob Blanchard: Divergent behavioral phenotypes of 16p11.2 deletion mice reared in same-genotype versus mixed-genotype cages. Physiol Behav. 146, 16-27 (2015).
  23. Vegetabile, B. G., Stout-Oswald, S. A., Davis, E. P., Baram, T. Z., Stern, H. S. Estimating the entropy rate of finite Markov chains with application to behavior studies. J Educ Behav Stat. 44 (3), 282-308 (2019).
  24. Rincón-Cortés, M., Grace, A. A. Postpartum scarcity-adversity disrupts maternal behavior and induces a hypodopaminergic state in the rat dam and adult female offspring. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 488-496 (2022).
  25. Gallo, M., et al. Limited bedding and nesting induces maternal behavior resembling both hypervigilance and abuse. Front behav neurosci. 13, 167(2019).
  26. Manzano Nieves, G., Bravo, M., Baskoylu, S., Bath, K. G. Early life adversity decreases pre-adolescent fear expression by accelerating amygdala pv cell development. eLife. 9, e55263(2020).
  27. Johnson, F. K., et al. Amygdala hyper-connectivity in a mouse model of unpredictable early life stress. Transl Psychiatry. 8 (1), 49(2018).
  28. Demaestri, C., et al. Type of early life adversity confers differential, sex-dependent effects on early maturational milestones in mice. Horm Behav. 124, 104763(2020).
  29. Reemst, K., et al. Molecular underpinnings of programming by early-life stress and the protective effects of early dietary ω6/ω3 ratio, basally and in response to LPS: Integrated mRNA-miRNAs approach. Brain Behav Immun. 117, 283-297 (2024).
  30. Reemst, K., et al. Early-life stress and dietary fatty acids impact the brain lipid/oxylipin profile into adulthood, basally and in response to LPS. Front Immunol. 13, 967437(2022).
  31. Reemst, K., et al. Early-life stress lastingly impacts microglial transcriptome and function under basal and immune-challenged conditions. Transl Psychiatry. 12 (1), 507(2022).
  32. Wang, T., et al. The nucleus accumbens CRH-CRHR1 system mediates early-life stress-induced sleep disturbance and dendritic atrophy in the adult mouse. Neurosci Bull. 39 (1), 41-56 (2023).
  33. Knop, J., Van, I. M. H., Bakermans-Kranenburg, M. J., Joëls, M., Van Der Veen, R. Maternal care of heterozygous dopamine receptor d4 knockout mice: Differential susceptibility to early-life rearing conditions. Genes Brain Behav. 19 (7), e12655(2020).
  34. Bennett, S. N., Chang, A. B., Rogers, F. D., Jones, P., Peña, C. J. Thyroid hormones mediate the impact of early-life stress on ventral tegmental area gene expression and behavior. Horm Behav. 159, 105472(2024).
  35. Parel, S. T., et al. Transcriptional signatures of early-life stress and antidepressant treatment efficacy. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (49), e2305776120(2023).
  36. Julie-Anne, B., et al. Reactivation of early-life stress-sensitive neuronal ensembles contributes to lifelong stress hypersensitivity. J Neurosci. 43 (34), 5996(2023).
  37. Bolton Jessica, L., et al. Maternal stress and effects of prenatal air pollution on offspring mental health outcomes in mice. Environ Health Perspect. 121 (9), 1075-1082 (2013).
  38. Block, C. L., et al. Prenatal environmental stressors impair postnatal microglia function and adult behavior in males. Cell Rep. 40 (5), 111161(2022).
  39. Peña, C. J., et al. Early life stress alters transcriptomic patterning across reward circuitry in male and female mice. Nat Commun. 10 (1), 5098(2019).
  40. Lapp, H. E., Salazar, M. G., Champagne, F. A. Automated maternal behavior during early life in rodents (amber) pipeline. Sci Rep. 13 (1), 18277(2023).
  41. Madison, F. N., Palin, N., Whitaker, A., Glasper, E. R. Sex-specific effects of neonatal paternal deprivation on microglial cell density in adult California mouse (Peromyscus californicus) dentate gyrus. Brain, Behav. Immun. 106, 1-10 (2022).
  42. Walker, S. L., Sud, N., Beyene, R., Palin, N., Glasper, E. R. Paternal deprivation induces vigilance-avoidant behavior and accompanies sex-specific alterations in stress reactivity and central proinflammatory cytokine response in California mice (Peromyscus californicus). Psychopharmacology. 240 (11), 2317-2334 (2023).
  43. Molet, J., Maras, P. M., Avishai-Eliner, S., Baram, T. Z. Naturalistic rodent models of chronic early-life stress. Dev Psychobiol. 56 (8), 1675-1688 (2014).
  44. Tsuchimine, S., et al. Comparison of physiological and behavioral responses to chronic restraint stress between C57BL/6J and balb/c mice. Biochem Biophys Res Commun. 525 (1), 33-38 (2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Beperkt NestmateriaalMoederlijke ZorgMuismodelStressresponsMicrogliale Synaptische SnoeiCorticotropine Releasing HormoonParaventriculaire KernGedragsveranderingenNeuropsychiatrische Stoornissen

Gerelateerde artikelen