AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Groeiend bewijs suggereert dat mRNA-translatie een sterk gecompartimenteerd proces binnen een cel is, en dat subcellulaire transport en lokalisatie van specifieke mRNA's essentieel is om ervoor te zorgen dat eiwitten met compartimentspecifieke functies in het ideale milieu en in passende hoeveelheden worden geproduceerd. Technieken voor subcellulaire isolatie en karakterisering van de ribosomen die deze mRNA's vertalen zijn echter tot op heden beperkt geweest, waardoor veel onbekend is over hoe de samenstelling van translationele machines bijdraagt aan de regulatie van gelokaliseerde mRNA-translatie.
Hier demonstreren we AviTag-specifieke locatiebeperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi), een methode die epitooptagging, een nieuw ontwikkeld optogenetisch geactiveerde split-biotineligase en affiniteitszuivering combineert om ribosomen die gelokaliseerd zijn in elk subcellulair compartiment van belang snel en specifiek te labelen en te isoleren. Ten eerste wordt CRISPR/Cas9-bewerking gebruikt om een AviTag-peptide, een tabaks-etchvirus (TEV) protease-splitsingsplaats en een FLAG-epitooptag te fuseren met een ribosomaal eiwit. De gespleten biotineligase, gefuseerd met een organel-doelgebied, wordt in deze cellijn tot expressie gebracht en is inactief onder normale biotine-concentraties. Bij activatie door aanvullende biotine- en blauwlichtverlichting biotinyleert de ligase AviTagged ribosomen in de directe omgeving, waardoor affiniteitszuivering van biotinyleerde ribosomen en bijbehorende eiwitten en mRNA's op streptavidine-gecoate kralen mogelijk is. Niet-denaturerende elusie via TEV-protease-splitsing levert monsters op die geschikt zijn voor downstream karakterisering van kern-ribosomale eiwitten, ribosoom-geassocieerde eiwitten en ribosoomgebonden mRNA's via RNA-sequencing of massaspectrometrie-proteomics.
In dit protocol bespreken we ontwerpprincipes voor het fuseren van AviTag met een ribosomaal eiwit en het richten op het gesplitste biotineligase-enzym op het organel van belang. We tonen activatie van het ALIBI-systeem, cellyse, affiniteitszuivering en monsterelusie aan. Tot slot bespreken we typische resultaten en probleemoplossing.
Inleiding
Er is een belangrijke behoefte aan hulpmiddelen die biologische monsters uit specifieke subcellulaire compartimenten kunnen isoleren om beter te onderzoeken hoe subcellulaire organisatie en handel een rol spelen in cellulaire processen. mRNA-translatie is een belangrijk voorbeeld van zo'n proces: groeiend bewijs suggereert dat translatie sterk gecompartimenteerd is en dat veel mRNA's in het bijzonder gelokaliseerd zijn op de organellen waar hun gecodeerde eiwitten zich bevinden 1,2. Er is echter minder bekend over de subcellulaire lokalisatie van translatiemachines. Ribosomen ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. mESC-celkweek
OPMERKING: Voorafgaand aan activatie en cellyse van ALIBi moeten mESC's worden behandeld met standaard steriele techniek voor celkweek. Centrifugatie van intacte mESC's moet worden uitgevoerd bij 200 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, tenzij anders gespecificeerd. Verwarm het medium voorverwarmend tot 37 °C in een waterbad vóór gebruik, tenzij anders vermeld. mESC's moeten worden doorgebracht in een verse weefselkweekplaat die 's nachts gelatiniseerd is (zie stap 1.1).
- De dag vóór het ontdooien van L31-FTA mESC's, bedek de onderkant van een 1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Western blot (protocolsectie 6) is de meest efficiënte manier om voorlopig het succes van een experiment te beoordelen. Wanneer membranen worden onderzocht met streptavidine-HRP, moet lysaat uit cellen waar alle componenten van het systeem aanwezig waren, een band bevatten die overeenkomt met biotinyleerde L31-FTA (Figuur 2A, baan 20). Dezelfde band zou aanwezig moeten zijn, meestal bij grotere intensiteit, als cellen met volledige lengte BirA als positieve .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
ALIBi biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande technieken voor het bestuderen van subcellulaire vertaling en heeft potentiële toekomstige toepassingen in de ribosoombiologie en daarbuiten. Dit protocol vereist vergelijkbare of minder tijd dan sequentiële lysatie en centrifugatie21,22 en is mogelijk toepasbaar op elk subcellulair compartiment dat genetisch kan worden getarget met een lokaliserende peptidesequentie........
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken leden van het Barna Lab voor de nuttige discussies.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| -80 °C opslag | Voor celcultuur | ||
| 0,1% gelatine in water | MilliporeSigma | ES-006-B | Voor celcultuur |
| 0,2 µm filtereenheden | Fisher | 04-977-158 | Voor celcultuur |
| 0,5% trypsine-EDTA (10X) | ThermoFisher | 15400-054 | Voor celcultuur |
| 1 M MgCl2 | ThermoFisher | AM9010 | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| 1 M Tris pH 7,5 | ThermoFisher | 15567027 | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| 1 M Tris pH 8 | ThermoFisher | AM9855G | Optioneel: voor het invoegen van FTA in een endogeen ribosomaal eiwitlocus |
| 1,5 en 2 mL microcentrifugebuizen, geautoclaveerd | Voor transfectie | ||
| 1,5, 2 mL en 5 mL proteïnelage-bindende microcentrifugebuizen | Eppendorf | 022431081, 022431102, 0030108302 | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| 10 cm weefselkweekplaten | Voor celcultuur | ||
| 10 M NaOH | MilliporeSigma | 72068-100ML | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| 10x Tris/glycine/SDS running buffer concentraat | Bio-Rad | 1610772 | Voor Western blot |
| 37 °C weefselkweekincubator x 2 | Voor celcultuur. Een hiervan dient als de belangrijkste incubatie voor celcultuur en verlichting van getransfecteerde cellen. Tijdelijke ruimte is nodig in een tweede incubatie op de dag van ALIBi-activering om getransfecteerde cellen te huisvesten terwijl de transilluminator in de hoofdincubator wordt ingesteld. | ||
| 37 °C waterbad | Voor celcultuur | ||
| 5 M NaCl | ThermoFisher | AM9010 | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| 50 mM biotin | ThermoFisher | B20656 | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| 6x Laemmli buffer | FIsher | 50-196-784 | Voor Western blot |
| 70% ethanol | Voor desinfectie | ||
| Acetonitril | Fisher | A955 | Optioneel: voor monstervoorbereiding voor massaspectrometrie |
| AcTEV proteasekit | ThermoFisher | 12575015 | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| ALIBi C-fragment plasmide | Addgene | #235615, 235636 – 235641 | Midi-prep schaal vereist voor transfectie |
| ALIBi N-fragment plasmide | Addgene | #235614, 235635, 235642, 235643 | Midi-prep schaal vereist voor transfectie |
| Aluminiumfolie | Voor lysis & affiniteitszuivering | ||
| ammoniumbicarbonaat | MilliporeSigma | 5.3305 | Optioneel: voor monstervoorbereiding voor massaspectrometrie |
| anti-FLAG antilichaam | MilliporeSigma | F3165 | Voor Western blot |
| anti-GAPDH antilichaam | Cell Signaling | 5174 | Voor Western blot |
| anti-muis secundair antilichaam | GE Healthcare | NA931V | Voor Western blot |
| anti-konijn secundair antilichaam | GE Healthcare | NA934V | Voor Western blot |
| anti-Rpl12 antilichaam | Abcam | ab175219 | Voor Western blot |
| anti-Rpl31 antilichaam | Abcam | ab103991 | Voor Western blot |
| anti-Rpl5 antilichaam | ProteinTech | 15430-1-AP | Voor Western blot |
| anti-V5 antilichaam | ThermoFisher | R960-25 | Voor Western blot |
| Apyrase | NEB | M0398L | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| Beta-mercaptoethanol (55 mM) | ThermoFisher | 21985-023 | Voor celcultuur |
| Blauw licht transilluminator | Clare Research Chemical | DR46B (klein) of DR196 (groot) | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| Rundserumalbumine (BSA) | Fisher | BP1600-100 | Voor Western blot |
| C18 tips (OMIX C18 tips) | Agilent | A57003100 | Optioneel: voor monstervoorbereiding voor massaspectrometrie |
| Celvriescontainer | Voor celcultuur | ||
| Centrifuge geschikt voor 15 mL en/of 50 mL conische buizen | Voor celcultuur | ||
| Centrifuge voor 1,5-2 mL microcentrifugebuizen | Voor lysis & affiniteitszuivering. Moet in staat zijn tot koeling tot 4 C en snelheden tot 17.000 g. Idealiter bevindt het zich in een kamer die tijdelijk kan worden verduisterd tijdens het overbrengen van buizen in en uit. | ||
| Clarity ECL kit | Bio-Rad | 170-5061 | Voor Western blot |
| Criterion geltank | Bio-Rad | 1656001 | Voor Western blot |
| Criterion TGX voorgevormde gels, 4-20% | Bio-Rad | 5671095 | Voor Western blot. Aanvullende welformaten en lay-outs beschikbaar |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | C7698-5G | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| Deoxycholaat | MilliporeSigma | S1827 | Voor lysis & affiniteitszuivering |
| Dithiothreitol | ThermoFisher | PIA39255 | Optioneel: voor monstervoorbereiding voor massaspectrometrie |
| DPBS, zonder calcium, zonder magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | Voor celcultuur |
| ES-gekwalificeerd FBS | MilliporeSigma | ES-009-B | Voor celcultuur |
| Ethanol | Gold Shield | 412828 |
Referenties
- Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.
- Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.
- Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.
- Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.
- Aviram N, Schuldiner M. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
