Methodenartikel

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

DOI:

10.3791/66881

⸱

24 juli 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Groeiend bewijs suggereert dat mRNA-translatie een sterk gecompartimenteerd proces binnen een cel is, en dat subcellulaire transport en lokalisatie van specifieke mRNA's essentieel is om ervoor te zorgen dat eiwitten met compartimentspecifieke functies in het ideale milieu en in passende hoeveelheden worden geproduceerd. Technieken voor subcellulaire isolatie en karakterisering van de ribosomen die deze mRNA's vertalen zijn echter tot op heden beperkt geweest, waardoor veel onbekend is over hoe de samenstelling van translationele machines bijdraagt aan de regulatie van gelokaliseerde mRNA-translatie.

Hier demonstreren we AviTag-specifieke locatiebeperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi), een methode die epitooptagging, een nieuw ontwikkeld optogenetisch geactiveerde split-biotineligase en affiniteitszuivering combineert om ribosomen die gelokaliseerd zijn in elk subcellulair compartiment van belang snel en specifiek te labelen en te isoleren. Ten eerste wordt CRISPR/Cas9-bewerking gebruikt om een AviTag-peptide, een tabaks-etchvirus (TEV) protease-splitsingsplaats en een FLAG-epitooptag te fuseren met een ribosomaal eiwit. De gespleten biotineligase, gefuseerd met een organel-doelgebied, wordt in deze cellijn tot expressie gebracht en is inactief onder normale biotine-concentraties. Bij activatie door aanvullende biotine- en blauwlichtverlichting biotinyleert de ligase AviTagged ribosomen in de directe omgeving, waardoor affiniteitszuivering van biotinyleerde ribosomen en bijbehorende eiwitten en mRNA's op streptavidine-gecoate kralen mogelijk is. Niet-denaturerende elusie via TEV-protease-splitsing levert monsters op die geschikt zijn voor downstream karakterisering van kern-ribosomale eiwitten, ribosoom-geassocieerde eiwitten en ribosoomgebonden mRNA's via RNA-sequencing of massaspectrometrie-proteomics.

In dit protocol bespreken we ontwerpprincipes voor het fuseren van AviTag met een ribosomaal eiwit en het richten op het gesplitste biotineligase-enzym op het organel van belang. We tonen activatie van het ALIBI-systeem, cellyse, affiniteitszuivering en monsterelusie aan. Tot slot bespreken we typische resultaten en probleemoplossing.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een belangrijke behoefte aan hulpmiddelen die biologische monsters uit specifieke subcellulaire compartimenten kunnen isoleren om beter te onderzoeken hoe subcellulaire organisatie en handel een rol spelen in cellulaire processen. mRNA-translatie is een belangrijk voorbeeld van zo'n proces: groeiend bewijs suggereert dat translatie sterk gecompartimenteerd is en dat veel mRNA's in het bijzonder gelokaliseerd zijn op de organellen waar hun gecodeerde eiwitten zich bevinden 1,2. Er is echter minder bekend over de subcellulaire lokalisatie van translatiemachines. Ribosomen beginnen hun bestaan in de nucleolus en kern, waar de assemblage van ribosomale eiwitten (RP's) en ribosomale RNA's (rRNA's) begint. Vervolgens worden ze naar het cytoplasma geëxporteerd voor de laatste assemblagefasen, waarna ze beginnen met het vertalen van mRNA's 3,4. Canonieke plaatsen van translatie zijn onder andere het cytoplasma en het endoplasmatisch reticulum; de laatste is waar integrale membraaneiwitten en eiwitten die bestemd zijn voor membraangebonden organellen of extracellulaire secretieworden gesynthetiseerd. Meer recent geïdentificeerde locaties van gelokaliseerde translatie zijn de mitochondriën, peroxisoom en neuronale processen 6,7,8,9,10,11,12. Interessant genoeg komt er ook bewijs naar voren dat translatiemachinekenmerken zoals ribosoom-geassocieerde eiwitten, posttranslationele modificaties, rRNA-modificaties en niet-canonieke stoichiometrie van kernribosomale eiwitten betrokken zijn bij regulerende mechanismen die de translatie van specifieke mRNA's en parameters zoals translatienauwkeurigheid en -snelheidbepalen 13,14,15,16,17, 18,19,20. Zo zijn er honderden eiwitten geïdentificeerd die met het ribosoom interageren en mogelijk kunnen leiden tot verschillen in subcellulaire ribosoomsamenstelling13. Technieken om subcellulaire ribosoompopulaties te isoleren zijn echter tot op heden beperkt geweest; daarom blijft veel onbekend over hoe de samenstelling van translationele machines bijdraagt aan de regulering van gelokaliseerde mRNA-translatie. De komst van veelzijdige methoden om subcellulaire ribosoompopulaties te isoleren, met name die compatibel zijn met zoogdiermodelsystemen, zal het mogelijk maken deze translatiemachinekenmerken op subcellulair niveau te verkennen.

De vroegste methoden om subcellulaire fracties met ribosomen te isoleren, waren gebaseerd op principes van sequentiële lyse en centrifugatie21,22. Gewoonlijk zijn deze methoden beperkt tot bepaalde organellen en vereisen ze vaak uitgebreide verwerkingstijden. Een recentere methode is gebaseerd op de biotineligase BirA, die specifiek een AviTag-peptidesubstraat 10,23,24 biotinyleert. De BirA kan genetisch worden gelokaliseerd op het organel van belang in cellen waar ribosomen met AviTag zijn getagd. Omdat BirA echter actief is bij fysiologische concentraties biotine, is het noodzakelijk om cellen te kweken onder omstandigheden van biotine-uitputting om constitutieve en niet-specifieke biotinylatie van AviTag-dragende ribosomen10,24 te voorkomen. Dit beperkt het gebruik van BirA in celtypen die gevoelig zijn voor biotine-uitputting25. Ten slotte zijn er promiscue biotinyleringsmethoden ontwikkeld die gebruikmaken van gemodificeerde enzymen zoals BioID, TurboID en APEX 26,27,28. Bij inductie produceren deze enzymen een reactief biotine-intermediair dat covalent alle lysineresiduen binnen een straal van het enzym modificeert. Promiscue biotinyleringsmethoden zijn zeer nuttig voor het in kaart brengen van subcellulaire proteomen, maar minder informatief om eiwitten in de algemene nabijheid van gelokaliseerde ribosomen te onderscheiden in tegenstelling tot eiwitten die dichter bij hen liggen.

Hier demonstreren we onze recent ontwikkelde methode voor het labelen en isoleren van subcellulaire ribosoompopulaties, genaamd AviTag-specifieke Locatiebeperkte Verlichtingsversterkte Biotinylatie (ALIBi). Deze methode maakt gebruik van een geïnstrueerde gesplitste BirA, gefuseerd met optogenetische versterkte Magnet (eMag) schakelaars (Figuur 1A) die heterodimeriseren onder blauwe lichtverlichting29; en een peptidetag bestaande uit FLAG-epitoop, tabaks-etchvirus (TEV) protease-splitsingsplaats en AviTag (FTA) die is gefuseerd met het Rpl31-ribosomeiwit (Figuur 1B). Het gesplitste enzym kan genetisch worden gericht op geselecteerde organellen, is inactief bij fysiologische concentraties biotine en kan binnen enkele minuten worden gereconstitueerd na blauw licht en toevoeging van aanvullende biotine (Figuur 1C-E). Latere cellyse, affiniteitszuivering en niet-denaturerende enzymatische eluatie via TEV-protease-splitsing leveren ribosomen en co-zuiverende moleculen zoals mRNA's en ribosoom-geassocieerde eiwitten op, die geschikt zijn voor downstream analytische methoden zoals RNA-sequencing en massaspectrometrie-proteomics (Figuur 1A). Deze methode onthult dus niet alleen de samenstelling van het ribosom, maar ook de mRNA's waaraan ribosomen gebonden zijn. In een recent artikel waarin de baanbrekende toepassing van ALIBi om subcellulaire ribosompopulaties te karakteriseren wordt beschreven, richtten we het gespleten enzym met succes op het cytoplasma, nucleolus, nucleus, endoplasmatisch reticulum, plasmamembraan en mitochondriën (Tabel 1)30. De resulterende vergelijking van de translatiemachine tussen deze subcellulaire compartimenten leidde tot nieuwe en onverwachte bevindingen met betrekking tot translatie in het endoplasmatisch reticulum en mitochondriën, evenals mogelijke aanwijzingen voor toekomstig onderzoek naar ribosoombiogenesefactoren in de kern en nucleolus.

Dit protocol bevat een gedetailleerde demonstratie van transfectie en activatie van het ALIBI-systeem, cellyse, affiniteitszuivering en monstereluatie. We bespreken ook hoe succesvolle affiniteitszuivering via western blot te verifiëren en doen aanbevelingen voor het uitvoeren van downstream RNA-sequencing of massaspectrometrie (MS) proteomische analyse (zie Supplemental File 1). Dit protocol is geschreven voor experimenten met muisembryonale stamcellen (mESC's) die Rpl31 homozyge tot expressie brengen met FTA (L31-FTA) vanuit het endogene Rpl31-locus; Deze cellijn is op verzoek beschikbaar bij de auteurs. De strategie voor het genereren van deze cellijn wordt beschreven in Supplemental File 1 en in Supplemental Figure S1 en Supplemental Figure S2. Plasmiden die de gesplitste enzymen coderen en gericht zijn op verschillende organellen zijn beschikbaar op Addgene (catalogusnummers #235608 tot 235643). De ontwerpprincipes voor het richten van de gespleten enzymen op deze organellen worden beschreven in Supplemental File 1. Het protocol gaat ervan uit dat elk monster afkomstig is van mESC's die in een 10 cm plaat zijn gekweekt. We hebben vastgesteld dat de schaal van 10 cm voldoende materiaal oplevert voor massaspectrometrie-proteomics, terwijl de schaal met 6 putten voldoende is voor westelijke blots of RNA-sequencing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. mESC-celkweek

OPMERKING: Voorafgaand aan activatie en cellyse van ALIBi moeten mESC's worden behandeld met standaard steriele techniek voor celkweek. Centrifugatie van intacte mESC's moet worden uitgevoerd bij 200 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, tenzij anders gespecificeerd. Verwarm het medium voorverwarmend tot 37 °C in een waterbad vóór gebruik, tenzij anders vermeld. mESC's moeten worden doorgebracht in een verse weefselkweekplaat die 's nachts gelatiniseerd is (zie stap 1.1).

  1. De dag vóór het ontdooien van L31-FTA mESC's, bedek de onderkant van een 10 cm plaat met 5 mL 0,1% gelatine. Broeden 's nachts bij 37 °C.
  2. Combineer mESC-mediacomponenten (Tabel 2) en laat het door een 0,2 μm-filter gaan. Bewaar tot 1 maand op 4 °C.
  3. Op de dag van ontdooien verwarm je een 5 ml aliquot medium om de ontdooide cellen te verdunnen en een 10 ml aliquot om ze te plateren.
  4. Haal een cryoviaal op met ~5 × 106 L31-FTA mESC's uit vloeibare stikstofopslag. Ontdooi direct door de bodem van het flesje te draaien in een waterbad van 37 °C.
  5. Meng voorzichtig 0,5–1 mL media van de 5 mL aliquot met de cryoviale inhoud zoals de buiscapaciteit het toelaat, en breng de cryoviale inhoud vervolgens terug naar de 5 mL media-aliquot.
  6. Pellet de cellen door middel van centrifugatie. Aspireer het supernatant.
  7. Suspendeer de celpellet opnieuw met de 10 mL media-aliquot.
  8. Aspireer de gelatine van de 10 cm plaat en breng onmiddellijk celsuspensie over in de plaat. Incubeer bij 37 °C.
  9. Elke 24 uur (behalve op passing-dagen) aspireer je oud medium van de plaat en vervang het door 10 mL vers medium.
  10. Wanneer kolonies 70%–80% confluent zijn (meestal 48 uur na het plateren), aspireer dan het oude medium en spoel twee keer met 10 mL fosfaatgebakken zoutoplossing (DPBS) van Dulbecco.
  11. Na het aspireren van de DPBS wordt de plaat bedekt met 2 mL 0,05% trypsine (Tabel 2). Incubeer 5 minuten op 37 °C.
  12. Neutraliseer de trypsine door 4 mL koud mESC-medium aan de plaat toe te voegen. Gebruik onmiddellijk een 5 of 10 mL serologische pipet om 15x op en neer in de plaat te pipeten om kolonies te dissociëren in een eencellige suspensie.
  13. Breng de suspensie over in een kegelvormige buis. Eventueel kunt u een aliquot verwijderen om cellen te tellen met een hemocytometer.
  14. Pellet de cellen door middel van centrifugatie. Aspireer het supernatant.
  15. Suspendeer de celpellet opnieuw in verse media. Plaat 5 × 106cellen (typisch 1:6 passageratio) in een verse, gelatiniseerde 10 cm plaat en incubeer bij 37 °C. Herhaal stappen 1.9–1.15 indien nodig totdat je klaar bent om te doorgaan met transfectie.
  16. Om bevroren celresten te maken, trypsiniseer je een plaat met mESC's (zoals in stappen 1.10–1.14). Sussen de celpellet opnieuw in vriesmedia (250–500 μL per 5 × 106 cellen), aliquot in cryovialen, en bevries langzaam in een celvriescontainer bij -80 °C 's nachts voordat het wordt overgebracht naar opslag van vloeibare stikstof.

2. Transfectie

OPMERKING: Voer transfectie uit op een dag dat mESC's klaar zijn voor passaging. Plasmiden kunnen al 3-5 uur na transfectie beginnen te expresseren. Na het uitdrukken raden we aan om cellen in het donker te behandelen en blootstelling aan temperaturen onder de 37 °C te minimaliseren om voortijdige activatie te voorkomen, aangezien eerder onderzoek heeft aangetoond dat magnetische optogenetische domeinen niet alleen dimeriseren onder blauw licht, maar ook bij blootstelling aan koude31. Bewaar platen in een speciale broedmachine of bescherm een plank in een gedeelde broedmachine tegen licht met aluminiumfolie. Bij het hanteren van cellen buiten de couveuse, doe dan vooraf alle kamerlampen en ramen uit of blokkeer ze en gebruik een roodlichtkoplamp om te zien. Laat de broedmachinedeur niet langer open dan nodig. Neem slechts kleine hoeveelheden platen tegelijk uit de broedmachine en leg platen op een isolerend oppervlak (dus een schoon piepschuimen deksel) tijdens het hanteren om contact met werkoppervlakken op kamertemperatuur te minimaliseren. Verwarm het medium volledig voor gebruik. Inspecteer geen platen onder een lichtstralende microscoop.

  1. Gelatineer de dag voor transfectie een 10 cm lange plaat.
  2. Op de dag van transfectie aspireer je gelatine van de plaat en voeg je 7,5 ml medium toe om het voor te warmen bij 37 °C. Voorwarmen van gereduceerd serum medium bij 37 °C voor het resuspenderen van cellen.
  3. Verdun 18,75 μL van het transfectie-reagens in 250 μL gereduceerd serummedium. Tik zachtjes om te mengen en laat het 5 minuten op kamertemperatuur incuberen.
  4. Als twee plasmiden co-expressie worden gebruikt die de N- en C-fragmenten coderen, voeg dan 3,75 μg van elk plasmide toe aan 250 μL gereduceerd serummedium. Als men slechts één plasmide tot expressie brengt (d.w.z. een GFP-negatieve controle of een volledige BirA-positieve controle), voeg dan 7,5 μg van het enkele plasmide toe.
  5. Voeg de plasmide/gereduceerde serummedium toe aan het transfectie-reagens/gereduceerd serum medium mengsel en tap of keer om te mengen. Incubeer 15 minuten op kamertemperatuur.
  6. In de tussentijd trypsiniseren en pellet mESC's (stappen 1.10–1.14). Suspenseer de pellet opnieuw in verwarmd gereduceerd serummedium tot een concentratie van 10 × 106 cellen/mL.
  7. Voeg 7,5 × 106 (750 μL) resuspendeerde cellen toe aan het plasmide/transfectie-reagens/gereduceerd-serum medium-mengsel. Draai de buis om te mixen. Incubeer 10 minuten bij RT, waarbij je af en toe de buisjes omdraait om cellen sweefend te houden.
  8. Keer de buizen opnieuw kort om en voeg het mengsel van mESC/plasmide/transfectie-reagens/gereduceerd serum medium toe aan de plaat met verwarmde media. Wieg de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen.
  9. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 3–5 uur, zodat de cellen binnen deze tijd kunnen hechten.
    OPMERKING: Vanaf dit punt raden we aan om bovenstaande voorzorgsmaatregelen te volgen tegen blootstelling aan licht en temperaturen onder 37 °C.
  10. Aspireer voorzichtig het oude medium. Voeg vers verwarmd medium toe en pipetteer langs de zijkant van de plaat om te voorkomen dat cellen loskomen. Hervat de incubatie bij 37 °C.
  11. Als je 24 uur na transfectie activeert/lyseert, ga dan door naar sectie 3. Als je van plan bent te activeren/lyseren 48 uur na transfectie, verander dan het medium ~24 uur na het plateren van de getransfecteerde cellen.

3. ALIBI activatie en cellyse

OPMERKING: Blijf cellen/monsters in het donker verwerken tot het begin van de elusie (stap 5.4). Zodra cellen op ijs zijn gekoeld (stap 3.15), houd je monsters koud en gebruik je alleen gekoelde reagentia tot het begin van de elusie. Zorg ervoor dat werkoppervlakken, apparatuur, reagentia en kunststoffen RNAse-vrij zijn door vers geopende items te gebruiken en harde oppervlakken af te vegen of af te spoelen met een RNAse-decontaminatieoplossing en 70% ethanol. Draag handschoenen bij het hanteren van monsters of apparatuur. Voor monsters bedoeld voor MS-proteomics, minimaal ook de keratinebesmetting door de werkruimte stofvrij te houden; Bedek de blote huid en bind lang haar naar achteren.

  1. Koel de centrifuge voor tot 4 °C.
  2. Met het licht uit, verplaats u de getransfecteerde platen naar een tijdelijke incubator van 37 °C zodat ze niet worden blootgesteld aan temperatuurschommelingen in de hoofdincubator nadat de transilluminator erin is geplaatst.
  3. Veeg de blauwe lichttransilluminator af met 70% ethanol en sluit hem aan op stroom. Plaats de transilluminator in de hoofdincubator en laat de omstandigheden van de broedmachine herstellen terwijl de installatie wordt voortgezet.
  4. Verwarm een aliquot medium dat wordt gedoseerd met biotine en cycloheximide (CHX) (10 mL medium per 10 cm plaat) tot 37 °C. Als je controlemonsters zonder aanvullende biotine gebruikt, verwarm dan ook een aparte aliquot die alleen met CHX wordt gedoseerd.
    OPMERKING: Sommige buffercomponenten kunnen de dag voor gebruik worden gemengd en een nacht worden opgeslagen bij 4 °C (zie Tabel 2). Let op dat verschillende lysis- en wash buffer-recepten werden gebruikt voor experimenten bedoeld voor western blot- of MS-proteomics en voor RNA-sequencing.
  5. Koel een aliquot DPBS af om te doseren met CHX (20 mL per 10 cm plaat).
  6. Bereid de RNAse-verwijderingsbuffer, zoutspoeling, lysisbuffer en washbuffers voor (zie Tabel 2). Voor buffers met dichte/viskeuze componenten zoals glycerol en Triton X-100, pipeer je de voltooide buffer om een gelijkmatige menging te garanderen. Koel buffers op ijs voordat je ze gebruikt.
    OPMERKING: Voor het wassen van de kralen laat je de buis met de kralen kort draaien in hun stroombuffer in een pocketcentrifuge om de inhoud aan de onderkant op te vangen. Plaats de buis 1 minuut in een magnetisch rek of totdat de kralen volledig zijn getransformeerd. Aspiraat het supernatant zonder de kraalpellet aan te raken. Zonder de korrelpellet te laten drogen, voeg je de volgende buffer toe. Om de kraalpellet opnieuw op te hangen, pipete je voorzichtig of rolde je de gesloten buis tussen de vingers terwijl je hem tegen het magnetische rek hield, zodat de kralen snel in meerdere richtingen door de magneet worden getrokken. Draai tenslotte de opnieuw gesuspendeerde kralen meerdere keren om te zorgen dat de binnenwanden van de buis worden gewassen.
  7. Hang de standaard fles streptavidine-kralen weer op door zacht te pipetteren of te wiegen. Breng 450 μL kralen over naar een eiwit-laagbindende buis voor elke 10 cm plaat mESC's.
  8. Na bovenstaande OPMERKING over het wassen van de parel, verwijder je de kraalopslagbuffer en was je de kralen 2x met 900 μL RNAse-verwijderingsbuffer.
    OPMERKING: Ga zonder uitstel door naar de volgende stap; een verlengde tijd in RNAse-verwijderingsbuffer kan de bindingscapaciteit van de kralen verminderen.
  9. Wash beads 1x met 900 μL zout wash.
  10. Wash beads 2x met 900 μL Wash I Buffer. Na het opnieuw suspenderen van de kralen in de tweede ronde van Wash I-buffer, bewaar je de kralen in de Wash I-buffer op 4 °C tijdens activatie en cellysie.
  11. Voeg biotine (50 μM eindconcentratie; 1:1.000 verdunning van 50 mM voorraad) en CHX (100 μg/mL eindconcentratie; 1:1.000 verdunning van 100 mg/mL voorraad) toe aan de verwarmde aliquot(s) van het medium. Houd het op 37 °C tot gebruik.
  12. Voeg CHX (100 μg/mL eindconcentratie; 1:1.000 verdunning van 100 mg/mL voorraad) toe aan de koude aliquot van DPBS en houd het gekoeld tot gebruik.
    OPMERKING: De volgende twee stappen beschrijven activatie van ALIBi via aanvullende biotine en blauwlichtverlichting. Een ideale activatieduur is lang genoeg om voldoende ribosoombiotinylatie te leveren voor downstream assays, maar kort genoeg om ruimtelijke tijdsresolutie te behouden. De ideale activatietijd kan variëren op basis van parameters zoals het celtype, de schaal van het experiment, het expressieniveau van de gesplitste enzymen, de hoeveelheid ribosomen nabij het organel van interesse en de gevoeligheid van de analysetechniek. We raden 15 minuten aan als startpunt, wat de activatietijd is die wordt gebruikt in onze representatieve resultaten (Figuur 2) en in ons bijbehorende werk30.
  13. Aspiraat media van de getransfecteerde platen. Voeg onmiddellijk 10 ml van het warme medium met CHX ± biotine per plaat toe.
  14. Plaats negatieve controleplaten die niet verlicht zijn, in een donkere broedmachine. Voor de verlichte platen plaats je ze direct bovenop de transilluminator, zet je de transilluminator aan en breng je ze 15 minuten uit.
  15. Wanneer de verlichting voltooid is, was je de platen onmiddellijk 2x met 10 mL koude DPBS + CHX per plaat. Leg de platen op ijs tussen en na de wasbeurten. Na het aspireren van de tweede wash, kantel je de plaat en aspireer je eventuele resterende DPBS.
  16. Houd elke plaat zo plat mogelijk op ijs, en ga dan over tot de lysis door 2 mL ijskoude lysisbuffer toe te voegen. Breng de plaat 5 minuten op ijs uit en tik de plaat 2–3 keer om cellen los te maken gedurende die tijd.
    OPMERKING: als platen donker worden gehouden onder folie en op ijs, kunnen ze tijdens deze tijd uit het celkweekgebied naar een andere donkere ruimte worden verplaatst.
  17. Verwijder eventuele resterende cellen door een micropipet te gebruiken om het lysaat op en neer te pipeteren op het plaatoppervlak zonder bellen te vormen, en vervolgens het lysaat over te brengen naar een gekoelde en gelabelde eiwitbuis met lage binding.
    OPMERKING: OPTIONEEL: Voor sommige moeilijk te lyseren organellen zoals de kern en nucleolus kan sonicatie helpen.
  18. In het geval van moeilijk te lyseren organellen, sonicaat alle monsters in het experiment gedurende 45 seconden bij 4 °C (vermogensinstelling van 3 watt). Als het ontwerp van de sonicator vereist dat een sonde in een open monsterbuis wordt geplaatst, breng dan het lysaat eerst van de plaat naar een grotere buis om overloop tijdens de sonicatie te voorkomen; doe het vervolgens over in een 2 mL buis.
  19. Incubeer het lysaat 15 minuten op ijs.
  20. Centrifugeer het lysaat op 17.000 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant (geklaard lysaat) over in een gekoeld eiwitbuisje met weinig binding zonder de pellet celresten te verstoren.
    OPMERKING: Als RNA-seq-analyse bedoeld is, kan een aliquot van het geklaarde lysaat nu worden verzameld als de totale RNA-fractie (zie Supplemental File 1, "Recommendations for RNA sequencing" stap 1.1) voor details.
    OPMERKING: Als de celhoeveelheden, transfectie-/kweekcondities en lysiscondities uniform zijn geweest voor alle monsters, gaan we doorgaans ervan uit dat de lysaatconcentraties vergelijkbaar zijn tussen monsters en gaan we verder zonder de totale eiwitconcentratie te kwantificeren. Dit minimaliseert de verstreken tijd tussen activatie en affiniteitszuivering.

4. Affiniteitszuivering

  1. Pellet de gewassen streptavidine-kralen met behulp van het magnetische rek. Aspiraat de Wash I-buffer.
  2. Breng 1.200 μL geklaard lysaat over op de buis met de gewassen kralen. Pipete voorzichtig om de kralen opnieuw te laten hangen. Bewaar de rest van het geklaarde lysaat bij -80 °C.
  3. Incubeer het lysaat met kralen bij 4 °C in het donker gedurende 1 uur op de buisrotator.
  4. Tijdens deze incubatie bereid je de TEV-elusiebuffer voor (Tabel 2).

5. Elutie

  1. Volg de aantekeningen over kralenwassen in sectie 3, pellet de kralen op een magnetisch rek en breng het supernatant over in een gekoeld eiwitbuisje met weinig binding. Bewaar het supernatant bij -80 °C.
  2. Wash beads 2x met 900 μL Wash I buffer.
  3. Wash beads 1x met 900 μL Wash II buffer.
    OPMERKING: Na voltooiing van deze stap hoeven samples niet langer in het donker te worden behandeld.
  4. Voeg 450 μL TEV elutiebuffer toe aan de kralen.
  5. Incubeer kralen in een TEV-elutiebuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de buisrotator. Voor experimenten op kleinere schaal met lage volumes TEV-elutionbuffer, incubeer je de buizen op een shaker bij 1.000–2.000 tpm per minuut.
  6. Pellet de kralen op het magnetische rek. Breng het eluaat over naar een eiwitbuis met weinig binding. Als proteomics-analyse of western blot bedoeld is, bewaar dan het eluaat bij -80 °C. Als RNA-seq analyse bedoeld is, zie Supplemental File 1 "Recommendations for RNA sequencing" stap 1.2 voor eluate opslaginstructies.
  7. OPTIONEEL: Om voorlopig vast te stellen of de affiniteitszuivering aanzienlijke rRNA/mRNA heeft opgeleverd (wat aangeeft dat ribosomen zijn geïsoleerd), analyseer je eluaten op een microvolumespectrofotometer met TEV-elutiebuffer als blank.
    OPMERKING: Eluates van cellen die het geactiveerde systeem bevatten, zouden bij 260 nm een grotere absorptie moeten hebben dan eluaten van cellen zonder de gesplitste enzymen, blauw licht/biotine of L31-FTA.

6. Westelijk blot

OPMERKING: Totdat lysaat- en doorstroommonsters zijn gedenatureerd in de Laemmli-buffer, raden wij aan lichtblootstelling te blijven vermijden. We gebruiken prefabgels, commercieel verkrijgbare transferbuffer en loopbuffer, en een halfdroog transfersysteem (zie de Materiaaltabel). SDS-PAGE en western blot worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant voor deze componenten, tenzij anders hieronder vermeld.

  1. Voeg 6x Laemmli-buffer toe aan het lysaat, doorstroom- en/of eluaatmonsters tot een uiteindelijke concentratie van 1x Laemmli-buffer. Verwarm op 95 °C in een warmteblok of thermocycler gedurende 10 minuten. Als er condens ontstaat op het deksel of de wanden van de buis, draai dan kort de buizen omlaag.
  2. Zet een gel met loopbuffer in de geltank, volgens de instructies van de fabrikant van de tank. Laad de monsters en de ladder.
  3. Laat de gel 45–75 minuten op 125 V draaien totdat de verfvoorkant de onderkant van de gel nadert. Bereid ondertussen PBST en blokkeringsbuffers voor (Tabel 2).
  4. Voer een halfdroge overdracht uit volgens de instructies van de fabrikant van het transfersysteem.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het membraan volledig onder water is en plaats de membraanbak op een orbitale of kantelbare rocker. Voor een tray van 10 x 15 cm is hiervoor 25–50 mL buffer nodig.
  5. Verwijder het membraan uit de transferstapel en ga direct door met de volgende stap om te voorkomen dat het membraan uitdroogt.
    OPMERKING: OPTIONEEL: Droge plekken op het membraan kunnen leiden tot ongelijkmatige blokkade of probe-binding, vooral bij sondes met korte incubaties zoals streptavidine-mierikswortelperoxidase. Om dit probleem te voorkomen, maken we membranen na overdracht opnieuw nat in 100% methanol gedurende 30 seconden, daarna 5 minuten in water. Deze maatregel lijkt op algemene aanbevelingen voor het opnieuw bevochtigen van PVDF-membranen die na overdracht zijn opgedroogd32,33.
  6. Was het membraan 3 x 10 minuten op kamertemperatuur met PBST.
  7. Volgens de in Tabel 3 gespecificeerde voorwaarden voert u voor elke western blot-sonde blokken, wassen, probe-incubatie en secundaire antistofincubaties uit.
  8. Na de laatste wasbeurt in stap 6.7 meng je de ECL-substraatcomponenten volgens de instructies van de fabrikant en bedek je het membraan er gelijkmatig mee. Leg het beeld vast met een chemiluminescence gel-imagingsysteem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot (protocolsectie 6) is de meest efficiënte manier om voorlopig het succes van een experiment te beoordelen. Wanneer membranen worden onderzocht met streptavidine-HRP, moet lysaat uit cellen waar alle componenten van het systeem aanwezig waren, een band bevatten die overeenkomt met biotinyleerde L31-FTA (Figuur 2A, baan 20). Dezelfde band zou aanwezig moeten zijn, meestal bij grotere intensiteit, als cellen met volledige lengte BirA als positieve ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALIBi biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande technieken voor het bestuderen van subcellulaire vertaling en heeft potentiële toekomstige toepassingen in de ribosoombiologie en daarbuiten. Dit protocol vereist vergelijkbare of minder tijd dan sequentiële lysatie en centrifugatie21,22 en is mogelijk toepasbaar op elk subcellulair compartiment dat genetisch kan worden getarget met een lokaliserende peptidesequentie....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken leden van het Barna Lab voor de nuttige discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
-80 °C opslagVoor celcultuur
0,1% gelatine in waterMilliporeSigmaES-006-BVoor celcultuur
0,2 µm filtereenhedenFisher04-977-158Voor celcultuur
0,5% trypsine-EDTA (10X)ThermoFisher15400-054Voor celcultuur
1 M MgCl2ThermoFisherAM9010Voor lysis & affiniteitszuivering
1 M Tris pH 7,5ThermoFisher15567027Voor lysis & affiniteitszuivering
1 M Tris pH 8ThermoFisherAM9855GOptioneel: voor het invoegen van FTA in een endogeen ribosomaal eiwitlocus
1,5 en 2 mL microcentrifugebuizen, geautoclaveerdVoor transfectie
1,5, 2 mL en 5 mL proteïnelage-bindende microcentrifugebuizenEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		Voor lysis & affiniteitszuivering
10 cm weefselkweekplatenVoor celcultuur
10 M NaOHMilliporeSigma72068-100MLVoor lysis & affiniteitszuivering
10x Tris/glycine/SDS running buffer concentraatBio-Rad1610772Voor Western blot
37 °C weefselkweekincubator x 2Voor celcultuur. Een hiervan dient als de belangrijkste incubatie voor celcultuur en verlichting van getransfecteerde cellen. Tijdelijke ruimte is nodig in een tweede incubatie op de dag van ALIBi-activering om getransfecteerde cellen te huisvesten terwijl de transilluminator in de hoofdincubator wordt ingesteld.
37 °C waterbadVoor celcultuur
5 M NaClThermoFisherAM9010Voor lysis & affiniteitszuivering
50 mM biotinThermoFisherB20656Voor lysis & affiniteitszuivering
6x Laemmli bufferFIsher50-196-784Voor Western blot
70% ethanolVoor desinfectie
AcetonitrilFisherA955Optioneel: voor monstervoorbereiding voor massaspectrometrie
AcTEV proteasekitThermoFisher12575015Voor lysis & affiniteitszuivering
ALIBi C-fragment plasmideAddgene#235615, 235636 – 235641Midi-prep schaal vereist voor transfectie
ALIBi N-fragment plasmideAddgene#235614, 235635, 235642, 235643Midi-prep schaal vereist voor transfectie
AluminiumfolieVoor lysis & affiniteitszuivering
ammoniumbicarbonaatMilliporeSigma5.3305Optioneel: voor monstervoorbereiding voor massaspectrometrie
anti-FLAG antilichaamMilliporeSigmaF3165Voor Western blot
anti-GAPDH antilichaamCell Signaling5174Voor Western blot
anti-muis secundair antilichaamGE HealthcareNA931VVoor Western blot
anti-konijn secundair antilichaamGE HealthcareNA934VVoor Western blot
anti-Rpl12 antilichaamAbcamab175219Voor Western blot
anti-Rpl31 antilichaamAbcamab103991Voor Western blot
anti-Rpl5 antilichaamProteinTech15430-1-APVoor Western blot
anti-V5 antilichaamThermoFisherR960-25Voor Western blot
ApyraseNEBM0398LVoor lysis & affiniteitszuivering
Beta-mercaptoethanol (55 mM)ThermoFisher21985-023Voor celcultuur
Blauw licht transilluminatorClare Research ChemicalDR46B (klein) of DR196 (groot)Voor lysis & affiniteitszuivering
Rundserumalbumine (BSA)FisherBP1600-100Voor Western blot
C18 tips (OMIX C18 tips)AgilentA57003100Optioneel: voor monstervoorbereiding voor massaspectrometrie
CelvriescontainerVoor celcultuur
Centrifuge geschikt voor 15 mL en/of 50 mL conische buizenVoor celcultuur
Centrifuge voor 1,5-2 mL microcentrifugebuizenVoor lysis & affiniteitszuivering. Moet in staat zijn tot koeling tot 4 C en snelheden tot 17.000 g. Idealiter bevindt het zich in een kamer die tijdelijk kan worden verduisterd tijdens het overbrengen van buizen in en uit.
Clarity ECL kitBio-Rad170-5061Voor Western blot
Criterion geltankBio-Rad1656001Voor Western blot
Criterion TGX voorgevormde gels, 4-20%Bio-Rad5671095Voor Western blot. Aanvullende welformaten en lay-outs beschikbaar
CycloheximideMilliporeSigmaC7698-5GVoor lysis & affiniteitszuivering
DeoxycholaatMilliporeSigmaS1827Voor lysis & affiniteitszuivering
DithiothreitolThermoFisherPIA39255Optioneel: voor monstervoorbereiding voor massaspectrometrie
DPBS, zonder calcium, zonder magnesiumThermoFisher14190-250Voor celcultuur
ES-gekwalificeerd FBSMilliporeSigmaES-009-BVoor celcultuur
EthanolGold Shield412828

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.
  2. Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.
  3. Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.
  4. Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.
  5. Aviram N, Schuldiner M. Targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum at a glance. J Cell Sci. 2017;130(24):4079-85.
  6. Dahan N, et al. Peroxisome function relies on organelle-associated mRNA translation. Sci Adv. 2022;8(2):eabk2141.
  7. Koppers M, et al. Receptor-specific interactome as a hub for rapid cue-induced selective translation in axons. Elife. 2019;8:e48718.
  8. Hafner AS, et al. Local protein synthesis is a ubiquitous feature of neuronal pre- and postsynaptic compartments. Science. 2019;364(6441):eaau3644.
  9. Biever A, et al. Monosomes actively translate synaptic mRNAs in neuronal processes. Science. 2020;367(6477):eaay4991.
  10. Williams CC, Jan CH, Weissman JS. Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):748-51.
  11. Lesnik C, et al. OM14 is a mitochondrial receptor for cytosolic ribosomes that supports co-translational import into mitochondria. Nat Commun. 2014;5:5711.
  12. Gold VA, Chroscicki P, Bragoszewski P, Chacinska A. Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo-tomography. EMBO Rep. 2017;18(10):1786-800.
  13. Simsek D, et al. The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell. 2017;169(6):1051-65.e18.
  14. Kondrashov N, et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 2011;145(3):383-97.
  15. Shi Z, et al. Heterogeneous ribosomes preferentially translate distinct subpools of mRNAs genome-wide. Mol Cell. 2017;67(1):71-83.e7.
  16. Genuth NR, et al. A stem cell roadmap of ribosome heterogeneity reveals a function for RPL10A in mesoderm production. Nat Commun. 2022;13(1):5491.
  17. Li H, et al. A male germ-cell-specific ribosome controls male fertility. Nature. 2022;612(7941):725-31.
  18. Milenkovic I, et al. Dynamic interplay between RPL3- and RPL3L-containing ribosomes modulates mitochondrial activity in the mammalian heart. Nucleic Acids Res. 2023;51(11):5301-24.
  19. Sloan KE, et al. Tuning the ribosome: the influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol. 2017;14(9):1138-52.
  20. Simsek D, Barna M. An emerging role for the ribosome as a nexus for post-translational modifications. Curr Opin Cell Biol. 2017;45:92-101.
  21. Baghirova S, Hughes BG, Hendzel MJ, Schulz R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2015;2:440-5.
  22. Jagannathan S, Nwosu C, Nicchitta CV. Analyzing mRNA localization to the endoplasmic reticulum via cell fractionation. Methods Mol Biol. 2011;714:301-21.
  23. Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 2015;1266:171-84.
  24. Jan CH, Williams CC, Weissman JS. Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):1257521.
  25. Dakshinamurti K, Chalifour L, Bhullar RP. Requirement for biotin and the function of biotin in cells in culture. Ann N Y Acad Sci. 1985;447:38-55.
  26. Roux KJ, Kim DI, Raida M, Burke B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 2012;196(6):801-10.
  27. Branon TC, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 2018;36(9):880-7.
  28. Rhee HW, et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 2013;339(6125):1328-31.
  29. Benedetti L, et al. Optimized Vivid-derived Magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife. 2020;9:e63230.
  30. Zhang Z, et al. A subcellular map of translational machinery composition and regulation at the single-molecule level. Science. 2025;387(6738):eadn2623.
  31. Weinberg BH, et al. High-performance chemical- and light-inducible recombinases in mammalian cells and mice. Nat Commun. 2019;10(1):4845.
  32. Goldman A, Harper S, Speicher DW. Detection of proteins on blot membranes. Curr Protoc Protein Sci. 2016;86:10.8.1-10.8.11.
  33. Gravel P. Protein blotting by the semidry method. In: Walker JM, editor. The protein protocols handbook. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 321-34.
  34. Kirkeby S, Moe D, Bog-Hansen TC, Van Noorden CJ. Biotin carboxylases in mitochondria and the cytosol from skeletal and cardiac muscle as detected by avidin binding. Histochemistry. 1993;100(6):415-21.
  35. Chandler CS, Ballard FJ. Multiple biotin-containing proteins in 3T3-L1 cells. Biochem J. 1986;237(1):123-30.
  36. Jaaro H, Rubinfeld H, Hanoch T, Seger R. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(8):3742-7.
  37. Dang CV, Lee WM. Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal. Mol Cell Biol. 1988;8(10):4048-54.
  38. Snaar S, et al. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J Cell Biol. 2000;151(3):653-62.
  39. Shibata Y, et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 2008;283(27):18892-904.
  40. Palmer AE, et al. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol. 2006;13(5):521-30.
  41. Seth RB, Sun L, Ea CK, Chen ZJ. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF3. Cell. 2005;122(5):669-82.
  42. Collins JC, et al. Biotin-dependent expression of the asialoglycoprotein receptor in HepG2. J Biol Chem. 1988;263(23):11280-3.
  43. Moskowitz M, Cheng DK, Moscatello DK, Otsuka H. Growth stimulation of BHK cells in culture by free biotin in serum. J Natl Cancer Inst. 1980;64(3):539-44.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BiologieEditie 233Editie 233Deze maand in JoVEEditie

Gerelateerde artikelen