Hier rapporteren we een goedkope en reproduceerbare methode die het membraantransport van histidine in een geitendarm aantoont. Dit proces vindt plaats door co-transport van histidine en natriumionen, mogelijk gemaakt door de natriumgradiënt over het enterocytmembraan. Deze methode maakt gebruik van ervaringslerenpedagogiek om de beweging van opgeloste stoffen over biologische membranen beter te begrijpen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Demonstratie van membraantransport van histidine met behulp van omgekeerde darmzakken van geiten: een ervaringsgericht pedagogisch hulpmiddel voor studenten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Histidine is een essentieel aminozuur dat ook een voorloper is van metabolieten die betrokken zijn bij het immuunsysteem, longventilatie en vasculaire circulatie. De absorptie van histidine via de voeding is grotendeels afhankelijk van het natriumgekoppelde neutrale aminozuurtransport door de brede neutrale aminozuurtransporter (B0AT) die aanwezig is op het apicale membraan van de enterocyt. Hier demonstreren we de absorptie van histidine door de darmvlokken enterocyten uit het lumen met behulp van omgekeerde geitenblaasjes. De jejunale zakjes die werden blootgesteld aan verschillende concentraties natrium en histidine werden getest om de concentratie van histidine in de zakjes te bepalen als functie van de tijd. De resultaten tonen actieve histidine-absorptie. Het verhogen van de zoutconcentratie resulteerde in een hogere absorptie van histidine, wat wijst op een symport van natrium- en histidine-absorptie in omgekeerde zakjes van geitendarm. Dit protocol kan worden toegepast om de intestinale mobiliteit van aminozuren of andere metabolieten met de juiste aanpassingen te visualiseren. We stellen dit experiment voor als een ervaringsgericht pedagogisch hulpmiddel dat niet-gegradueerde studenten kan helpen het concept van membraantransport te begrijpen.
Inleiding
Biologische cellen zijn omgeven door een membraanlipidedubbellaag die het intracellulaire cytosol scheidt van de extracellulaire inhoud. Het membraan dient als een semipermeabele barrière die de beweging van opgeloste stoffen reguleert1. Het transport over biologische membranen wordt beïnvloed door de permeabiliteitscoëfficiënt van een opgeloste stof, die afhankelijk is van verschillende factoren, waaronder de concentratie en lading van de opgeloste stof. Over het algemeen bewegen opgeloste stoffen door het membraan met behulp van drie mechanismen (Figuur 1): Passieve diffusie, gefaciliteerde diffusie en actief transport2. Eenvoudige diffusie is het proces waarbij oplosbare, ongeladen en niet-polaire opgeloste stoffen hun concentratiegradiënt doorgeven door een semipermeabel membraan (Figuur 1A). Membraaneiwitten helpen niet bij dit proces, omdat het gaat om de verplaatsing van opgeloste stoffen van een gebied met een hogere concentratie naar een gebied met een lagere concentratie. De diffusiesnelheid is gebaseerd op de wet van Fick3. Aan de andere kant is gefaciliteerde diffusie een eiwitafhankelijk transport waarbij het membraan alleen selectieve opgeloste stoffen langs een concentratiegradiënt laat passeren zonder het verbruik van energie (Figuur 1B). Dit soort transport is specifiek en verschilt van eenvoudige diffusie door het vertonen van verzadigingskinetiek.
Actief transport is een eiwitafhankelijk transport van moleculen tegen hun concentratiegradiënt in, d.w.z. van het gebied met een lagere concentratie naar een gebied met een hogere concentratie met behulp van ATP- of ionengradiënten (Figuur 1C). Wanneer de transporter ATP hydrolyseert, wordt het transport primair actief transport genoemd (Figuur 1C; linkerpaneel). Een andere vorm van actief transport is secundair actief transport (Figuur 1C; rechterpaneel). Bij secundair actief transport worden opgeloste stoffen verplaatst op basis van een elektrochemische gradiënt. Het vindt plaats wanneer een transporteiwit de beweging van een ion (meestal Na+) langs zijn concentratiegradiënt koppelt aan de beweging van een ander molecuul of een ion tegen zijn concentratiegradiënt. Dit soort beweging van opgeloste stoffen kan een co-transport (Symport) zijn waarbij zowel de opgeloste stof als het ion in dezelfde richting bewegen of een uitwisseling (Antiport), in welk geval de opgeloste stof en het ion in tegengestelde richting bewegen.
De voedingsaminozuren en monosacchariden uit voedselbronnen worden opgenomen in de dunne darm. De dunne darm kan functioneel worden onderverdeeld in drie segmenten: twaalfvingerige darm, jejunum en ileum (figuur 2). Absorptie van opgeloste stof vindt plaats in de dunne darm, met maximale absorptie aan het jejunum en aan het proximale uiteinde van het ileum. De intestinale enterocyten zijn gepolariseerde cellen en de tight junctions die twee aangrenzende cellen verbinden, creëren twee verschillende membraanplaatsen - de basolaterale en de apicale membraanplaats (Figuur 2). De absorptie van luminale opgeloste stoffen die door vertering worden gegenereerd, vindt plaats op de plaats van het apicale membraan4.
Histidinetransport in de darmenterocyten bij het apicale membraan is een voorbeeld van een secundair actief symport dat natriumafhankelijk is. Aan het basolaterale uiteinde beweegt het histidine dat de enterocyt binnenkomt langs de concentratiegradiënt naar de hepatische portale circulatie. De intracellulaire concentraties van natrium in de enterocyt worden gehandhaafd op 12 mmole/L1, wat lager is dan de extracellulaire/luminale concentraties, dankzij het actief pompen van natrium uit de cel door Na+ K+ATPase op het basolaterale membraan (Figuur 3). Bij het apicale membraan van enterocyten zijn de B0AT en de natriumneutrale aminozuurtransporter (SNAT) 5 de belangrijkste transporters die niet alleen histidine transporteren, maar ook aminozuren zoals asparagine en glutamine in een natriumafhankelijk cotransport 5,6. Een ander transporteiwit genaamd Large Amino acid Transporter (LAT)1 dat aanwezig is op het basolaterale membraan van enterocyten, transporteert grote neutrale aminozuren zoals leucine, tryptofaan, tyrosine en fenylalanine over het membraan7.
Met als doel het concept van membraantransport te onderwijzen geïntegreerd met technieken zoals spectrofotometrie en routinematige biochemische tests door middel van ervaringslerenpedagogiek, is het absoluut noodzakelijk om methodologieën te ontwikkelen die niet alleen het concept in gemakkelijk te begrijpen termen kunnen demonstreren, maar ook participatief leren voor niet-gegradueerde studenten mogelijk maken. Momenteel zijn er beperkte middelen beschikbaar voor de studenten voor hands-on betrokkenheid om dergelijke concepten van biochemie te leren. Hier rapporteren we een eenvoudig protocol voor het aantonen van Histidine-transport door het darmmembraan van geiten dat gemakkelijk te reproduceren is in niet-gegradueerde laboratoria en kan worden aangepast voor het evalueren van het transport van andere metabolieten. Wat nog belangrijker is, de methode maakt gebruik van goedkope materialen in een niet-gegradueerd laboratorium, waardoor ervaringsleren mogelijk wordt, zelfs in de eenvoudigste laboratoriumomgevingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het hele protocol met alle stappen is weergegeven als een schematisch diagram in figuur 4. De methode is een bewerking van een eerdere studie met behulp van rattendarmen8. Het experiment werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling. De monsters die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn verkregen van een commerciële verkoper.
LET OP: Draag handschoenen tijdens dit experiment.
1. Bereiding van omgekeerde Jejunum-zakjes
- Geitenjejunum voorbehandelen en schoonmaken.
- Koop de ingewanden van een vers geofferde gezonde geit van een erkende verkoper.
- Plaats de ingewanden in voldoende 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) zodat ze volledig worden ondergedompeld voor reiniging.
- Scheid de dunne darm van de dikke darm en zorg ervoor dat het uitwendige bindweefsel met een schaar wordt verwijderd.
- Spoel de dunne darm voorzichtig met 1x PBS met behulp van een spuit van 10 ml, zorg ervoor dat onverteerd voedselmateriaal wordt verwijderd om een holle zak dunne darm te verkrijgen. Herhaal dit proces minstens drie keer voor een effectieve reiniging.
NOTITIE: Vermijd het gebruik van overmatige kracht of naalden tijdens het spoelen. Het gebruik van kracht kan leiden tot het doorboren van de darmwanden en zo de darmenterocyten beschadigen. - Meet de volledige lengte van de dunne darm met behulp van een liniaal om de drie delen te verkrijgen: twaalfvingerige darm (1/4e van de dunne darm) en de rest gelijkmatig verdeeld in Jejunum en Ileum.
- Ga verder met het experiment met behulp van het Jejunum-gedeelte.
- Bereid omgekeerde Jejunum voor.
- Reinig het jejunum-gedeelte door al het bindweefsel met een mes te verwijderen.
- Snijd de jejunum in porties van 12-15 cm lang, was met 1x PBS en doe ze in een petrischaaltje met PBS.
- Keer de jejunum-delen om met een glazen staaf zodat het villi-gedeelte aan de buitenkant zichtbaar is.
LET OP: Vermijd het gebruik van een glazen staaf met scherpe randen. Bovendien mag de diameter van de glazen staaf niet groter zijn dan de diameter van de zak.
OPMERKING: Op dit punt kan men de villi visualiseren onder een lichtmicroscoop (Figuur 4). - Spoel de omgekeerde jejunumporties voorzichtig door met 1x PBS.
- Controleer op lekken aan de zijkanten van het omgekeerde jejunum.
- Snijd de omgekeerde jejunumporties in zakjes van 5 cm lang.
- Bind het ene uiteinde vast met touw en controleer opnieuw op visuele lekken aan het vastgebonden uiteinde door de zakjes te vullen met PBS.
- Bind het andere uiteinde vast om een lege omgekeerde zak te maken met villi op het buitenoppervlak.
- Controleer opnieuw op externe lekken door de omgekeerde zak op filtreerpapier te deppen.
- Breng de omgekeerde zakjes in evenwicht in 1x PBS.
- Ga dezelfde dag verder met het experiment of bewaar de zakjes een nacht in 1x PBS bij 4 °C.
2. Experimentele opstelling voor Histidine transport
- Stel twee sets van drie buisjes van 50 ml samen volgens verschillende concentraties natriumchloride zoals aangegeven in tabel 1.
- Dompel de voorbereide darmzakjes in de gespecificeerde buisjes gedurende 30 minuten en 60 minuten voor elk van de sets.
- Leeg de oplossing na de aangegeven tijd in de zak in een aparte microcentrifugebuis van 1,5 ml en bepaal het volume.
- Zuig de vloeistof in de zak op met een spuit van 2 ml. U kunt ook het ene uiteinde van de zak losmaken en de inhoud opvangen in een vers buisje van 1,5 ml.
- Analyseer 0,1 ml van de verzamelde monsters voor histidineschatting en bereken de concentratie met behulp van de standaardgrafiek.
3. Schatting van histidine met behulp van de reactie van Pauly
- Bereid een standaardcurve voor histidine voor.
- Bereid oplossingen met wisselende concentraties histidine zoals aangegeven in tabel 2 met behulp van stockoplossingen van histidine (5 mM) en water.
- Voeg sulfanilzuur (0,5 ml) en natriumnitraat (0,5 ml) toe aan elke buis.
- Incubeer de buisjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en voeg vervolgens 1 ml natriumcarbonaat en ethanol toe aan elke buis.
- Incubeer de buizen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (~20 °C) en noteer de absorptie bij een golflengte van 490 nm.
- Plot een standaardcurve van absorptie versus histidineconcentratie.
OPMERKING: Deze test voor histidine is gebaseerd op de eigenschap van histidine om een diazoverbinding te vormen (Figuur 5).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De experimentele workflow voor het aantonen van de intestinale mobiliteit van histidine door absorptie van histidine door darmvlokken in het lumen van de omgekeerde zakjes wordt geïllustreerd in figuur 4, tabel 1 en tabel 2. Er werden drie onafhankelijke experimentele opstellingen uitgevoerd en representatieve gegevens zijn weergegeven in figuur 6.
Onder de gegeven ex...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Membraantransport is een van de meest fundamentele concepten die worden onderwezen aan niet-gegradueerde studenten van alle belangrijke biologische wetenschappelijke disciplines, fundamenteel of toegepast. Traditioneel wordt beweging over membranen gevisualiseerd met behulp van metabolieten die zijn gelabeld met radioactieve isotopen. Deze methoden zijn echter uiterst gevaarlijk en niet haalbaar voor lesgeven of leren. Hoewel ervaringsleren de beste pedagogische techniek is om dergelijke...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door het Department of Biochemistry, Sri Venkateswara College, University of Delhi. De auteurs danken de laboratoriummedewerkers voor hun steun.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | TARSONS | 500020 | |
| 10 mL Test Tubes | BOROSIL | 9800U04 | |
| 50 mL Sterile Falcon Tubes | TARSONS | 546041 | |
| 500 mL Beaker | BOROSIL | 10044977 | |
| 500 mL Conical Flask | BOROSIL | 691467 | |
| D-Glucose | SRL | 42738 | |
| Digital Spectrophotometer | SYSTRONICS | 2710 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009831000 | |
| Finpipettes | THERMOFISHER | 4642090 | |
| Glass Stirrer Rod | BOROSIL | 9850107 | |
| L-Histidine | SRL | 17849 | |
| NaCl | SRL | 41721 | |
| Nitrile Gloves | KIMTECH | 112-4847 | |
| Petri Dish | TARSONS | 460090 | |
| Phosphate Buffered Saline (ph 7.4) | SRL | 95131 | |
| Pipette Tips | ABDOS | P10102 | |
| Sodium Carbonate | SRL | 89382 | |
| Sodium Nitrate | SRL | 44618 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous) | SRL | 53046 | |
| Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) | SRL | 22249 | |
| Sulphanilic Acid | SRL | 15354 |
Referenties
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. 7th Edition. , W.H. Freeman and Company. (2017).
- Stillwell, W. Membrane Transport. An Introduction to Biological Membranes. , Elsevier Science. (2013).
- Fick, A. V. On liquid diffusion. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 10 (63), 30-39 (1855).
- Sherwood, L. Introduction to Human Physiology. , Brooks/Cole Cengage Learning. (2013).
- Bröer, S. Intestinal amino acid transport and metabolic health. Annu Rev Nutr. 43, 73-99 (2023).
- Avissar, N. E., Ryan, C. K., Ganapathy, V., Sax, H. C. Na+-dependent neutral amino acid transporter ATB0 is a rabbit epithelial cell brush-border protein. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (3), C963-C971 (2001).
- Bröer, S. Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia. Physiol Rev. 88 (1), 249-286 (2008).
- Agar, W. T., Hird, F. J. R., Sidhu, G. S. The uptake of amino acids by the intestine. BBA - Biochim Biophys Acta. 14 (1), 80-84 (1954).
- Pauly, H. Über die Konstitution des Histidins. I. Mitteilung. Biological Chemistry. 42 (5-6), 508-518 (1904).
- Wilson, T. H., Wiseman, G. The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface. J Physiol. 123 (1), 116-125 (1954).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 23 (2), 313-323 (1998).
- Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: Limitations and applications. J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).
- Pento, J. T., Mousissian, G. K. Time-dependent deterioration of active transport in duodenal segments of rat intestine. J Pharmacol Methods. 20 (1), 9-14 (1988).
- Williams, L., Sembiante, S. F. Experiential learning in U.S. undergraduate teacher preparation programs: A review of the literature. Teach Teach Educ. 112, 103630(2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
