Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van orthodontische tandbeweging (OTM), dat dient als een geschikt model voor het onderzoeken van de mechanismen van botaanpassing, wortelresorptie en de reactie van botcellen op mechanische stimuli. Deze uitgebreide gids biedt gedetailleerde informatie over het OTM-model, het verkrijgen van microcomputertomografie en de daaropvolgende analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Orthodontische tandbeweging bij muizen bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Orthodontische tandbeweging (OTM) vertegenwoordigt een dynamisch proces waarbij het alveolaire bot resorptie ondergaat op compressieplaatsen en afzetting op spanningsplaatsen, georkestreerd door respectievelijk osteoclasten en osteoblasten. Dit mechanisme dient als een waardevol model voor het bestuderen van verschillende aspecten van botaanpassing, waaronder wortelresorptie en de cellulaire reactie op mechanische krachtstimuli. Het hier beschreven protocol biedt een eenvoudige benadering om OTM te onderzoeken, waarbij 0,35 N wordt vastgesteld als de optimale kracht in een muismodel dat gebruik maakt van een nikkel-titanium (NiTi) spiraalveer. Met behulp van micro-computertomografie-analyse hebben we OTM gekwantificeerd door de discrepantie in de lineaire afstand bij de cement-email-overgang te beoordelen. De evaluatie omvatte ook een analyse van orthodontisch geïnduceerde inflammatoire wortelresorptie, waarbij parameters zoals de dichtheid van wortelmineralen en het percentage wortelvolume per totaal volume werden beoordeeld. Dit uitgebreide protocol draagt bij aan het vergroten van ons begrip van botremodelleringsprocessen en het verbeteren van het vermogen om effectieve orthodontische behandelstrategieën te ontwikkelen.
Inleiding
Botremodellering is een continu proces dat wordt georkestreerd door osteoclasten, osteoblasten, botbekledingscellen en osteocyten, essentieel voor het behoud van de integriteit van het volwassen skelet 1,2. Dit dynamische proces, dat voornamelijk wordt aangedreven door de differentiatie en activiteit van osteoclasten en osteoblasten, omvat de resorptie en afzetting van bot, veroorzaakt door mechanische stress en belasting 3,4,5.
Dierproeven spelen een cruciale rol bij het ophelderen van de ingewikkelde biologische en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan orthodontische tandbewegingen (OTM)6,7. Dit proces omvat een breed scala aan celtypen, zoals osteoblasten, osteoclasten, osteocyten, fibroblasten en immuuncellen zoals macrofagen en T-cellen, die zich in het kaakbot en het parodontale ligamentbevinden 7,8. Deze cellen reageren dynamisch op mechanische stimuli en veranderingen in het lokale milieu, waardoor de samenstelling en architectuur van het omliggende bot worden beïnvloed 7,8. Bovendien veroorzaken ze ook een ontstekingsreactie op cellulair niveau, ook al zijn er geen ziekteverwekkers aanwezig. Deze ontstekingsreactie speelt een rol bij het verhogen van de omzet van botweefsel9.
Verschillende diermodellen, waaronder muizen, ratten, konijnen, honden en apen, zijn gebruikt in experimentele studies van OTM 7,8,10. Hiervan zijn knaagdieren, met name muizen, favoriet voor het onderzoeken van de eerste fasen van tandbeweging en botremodellering6. Eerder onderzoek heeft de voordelen benadrukt van het gebruik van muismodellen ten opzichte van rattenmodellen, voornamelijk vanwege de wijdverbreide beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen, waardoor gedetailleerd onderzoek naar genetische invloeden inOTM 7,11 mogelijk is. Momenteel worden twee hoofdmodellen gebruikt om tandbeweging bij muizen te induceren. De eerste methode bestaat uit het inbrengen van een nikkel-titanium (NiTi) spiraalveer tussen de eerste bovenste kies en de bovenste snijtanden 4,12. De tweede benadering omvat het plaatsen van een elastische band in de interdentale ruimte tussen de eerste en tweede bovenmolaren13. De primaire geanalyseerde uitkomsten omvatten doorgaans de omvang van de tandbeweging en de botmicroarchitectuur, bij voorkeur geëvalueerd met behulp van microcomputertomografie (micro-CT)14. Idealiter is het beoordelen van de integriteit van tandwortels belangrijk om ervoor te zorgen dat de juiste krachten worden gebruikt om OTM4 te produceren.
Hoewel micro-CT algemeen wordt erkend als de gouden standaard voor het evalueren van de microarchitectuur van gemineraliseerde weefsels14, vormt de afwezigheid van gestandaardiseerde methodologieën en protocollen voor het scannen, analyseren en rapporteren van gegevens vaak een uitdaging bij het onderscheiden van de precieze gebruikte procedures, het interpreteren van resultaten en het vergemakkelijken van vergelijkingen tussen verschillende OTM-modellen14,15.
Hier presenteren we een stapsgewijze handleiding voor het OTM-muismodel, inclusief micro-CT-acquisitie en analyse van OTM, botmicrostructuur en tandwortels. Deze methode omvat het uitoefenen van gecontroleerde mechanische kracht op de eerste kies om beweging in het kaakbot op te wekken. De keuze voor deze methode komt voort uit verschillende factoren, waaronder haalbaarheid, relevantie en precisie. Een dergelijke benadering maakt gedetailleerde kwantitatieve analyse mogelijk, wat waardevolle inzichten oplevert in de biologische processen die ten grondslag liggen aan orthodontische tandbeweging en de ontwikkeling van verbeterde orthodontische behandelingsstrategieën in de toekomst vergemakkelijkt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures worden strikt nageleefd volgens de ethische normen die zijn vastgesteld door de ethische commissie van de Universidade Federal de Minas Gerais (nr. 166/2022). Voorafgaand aan elk experiment is een berekening van de steekproefomvang verplicht. Gebruik 8-10 weken oude mannelijke C57BL6/J wildtype muizen met een gewicht van ongeveer 20-30 g. De muizen moeten worden gehuisvest in een kooi in een ruimte die op 25 °C wordt gehouden, volgens een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Na de bevestiging van de spoel moet het dier worden gevoed met een zacht dieet. Dagelijkse monitoring moet beoordelingen van het lichaamsgewicht en de algehele gezondheid omvatten.
1. Mechanisch geïnduceerde alveolaire botremodellering
- Knip met een distaal gesneden tang de 0.25 x 0.76 inch NiTi open-spiraalveer af tot de volgende afmetingen van zes lussen en twee lusvormige uiteinden die loodrecht op de veer zijn geplaatst met behulp van een orthodontische Weingart-tang.
- Vorm de ronde chroomnikkeldraad (CrNi) met een diameter van 0,20 mm in de gewenste configuratie met lusvormige uiteinden met behulp van een Mathieu-pincet en een rond instrument als maatreferentie.
- Zet de lusvormige uiteinden van de spoel en de 0,20 mm dikke ronde CrNi-draad in elkaar.
- Verdoof het dier met een intraperitoneale injectie van 0,2 ml oplossing met xylazine (10 mg/kg) en ketamine (100 mg/kg). Voordat u met de procedure begint, evalueert u de diepte van de anesthesie met behulp van de pedaalreflex. Knijp voorzichtig in een van de tenen van het dier met een pincet. De afwezigheid van een reflex duidt op een adequaat vlak van algemene anesthesie. Om hoornvliesletsel en postoperatieve pijn te voorkomen, brengt u een oculair glijmiddel aan nadat het dier is verdoofd.
- Plaats het dier in dorsale decubitus op een operatietafel en immobiliseer zijn ledematen om de beweging te beperken en intraorale toegang mogelijk te maken.
- Gebruik een mondopener, gemaakt van draad met een diameter van 0,50 mm en vastgezet met een draad van 0,08 mm, om volledige visualisatie te vergemakkelijken en tegelijkertijd hoofdbewegingen te voorkomen. Gebruik de rechterkant als de experimentele kant (OTM-kant) en de linkerkant als de controle zonder orthodontische spoel (controlezijde).
OPMERKING: Verbeterde visualisatie van intraorale structuren moet worden bereikt met behulp van een stereomicroscoop en een optisch lichtsysteem. - Reinig en ets de juiste eerste kies en snijtanden met respectievelijk aceton en een zelfetsende primer. Het systeem is zelfetsend, wat betekent dat het geen voorafgaande zuurconditionering vereist.
- Breng de primer in één stap aan, die ook tegelijkertijd als zuur en lijm fungeert. Verzamel met een microborstel een kleine hoeveelheid zelfetsende primer en breng deze aan op het occlusale oppervlak van de bovenste eerste kies en snijtanden. Bij deze stap moet ervoor worden gezorgd dat de zelfetsende primer het proximale oppervlak tussen de eerste en tweede kiezen niet bereikt, omdat hierdoor de tandelementen aan elkaar kunnen blijven plakken, waardoor tandbeweging wordt voorkomen. Licht uitharden van de primer op het occlusale oppervlak van de kiezen en snijtanden gedurende 30 s.
- Verbind het distale uiteinde van een NiTi-veer met open spiraal met zes lussen aan het occlusale oppervlak van de rechter eerste maxillaire kies met lichtuitgeharde hars en lichtuitharding gedurende 30 s. Voeg extra harsstap toe aan de rand van de draad om schade aan de muizen te voorkomen en lichtuitharding gedurende 30 s.
- Activeer de spoel met behulp van een speciaal ontworpen apparaat dat bestaat uit een rail en een slingermechanisme dat aan de operatietafel is bevestigd. Hierdoor kan de langsbeweging heen en weer schuiven.
- Sluit het vrije lusvormige uiteinde van de ronde draad van 0,20 mm aan op de haak van de spanningsmeter.
- Beweeg na activering van de slinger de operatietafel langs de rail totdat de dynamometer een kracht van 0.35 N registreert.
- Bevestig de ronde draad van 0,20 mm aan beide bovenste snijtanden om de spoel te verankeren. Tijdens de experimentele periode wordt geen verdere reactivering uitgevoerd. Knip de draad door om het dier los te koppelen van de dynamometer. Voeg nog een stapje hars toe, zodat de metalen rand van het apparaat niet bloot komt te liggen en het dier geen pijn doet. Lichtuitharding gedurende 30 s. Haal het dier van de tafel.
- De eerste kies rechtsboven met een apparaat dat een kracht van 0,35 N in de mesiale richting oplegt, bestaat uit de experimentele kant. Gebruik de linkerkant van de bovenkaak (zonder orthodontisch apparaat) als controle 4,16.
- Onderhoud dit apparaat gedurende een periode van 12 dagen zonder dat enige activering vereist is. Gebruik geen pijnstillers. Orthodontische beweging vindt plaats door een ontstekingsproces en pijnstillende medicatie kan de arachidonzuurcascade negatief beïnvloeden, waardoor de snelheid van botremodellering wordt beïnvloed en de resultaten mogelijk ongeldig worden.
- Behandel de dieren na het einde van de operatie met een subcutane injectie met een zoutoplossing om uitdroging tijdens de aanpassingsperiode met het hulpmiddel te voorkomen. Houd het dier in een individuele kooi met verwarming totdat het volledig is hersteld en plaats het dier pas na deze periode in collectieve kooien.
- Euthanaseer de muis op de12e dag, uitgevoerd door sedatie met intraperitoneale injectie van een 0,2 ml oplossing met xylazine (10 mg/kg) en ketamine (100 mg/kg), gevolgd door onthoofding met een scherpe schaar.
2. Micro-CT metingen
- Oogst het kaakbeen met een scherpe schaar die al het zachte weefsel doorsnijdt, het jukbeen in het sagittale vlak en de frontonasale hechting en de spheno-occipitale synchondrose in het coronale vlak. Dompel het kaakbeen onder in 10% neutraal gebufferd formaline (pH=7,4) gedurende een fixatieperiode van 48 uur. Verander na deze periode de formaldehyde-oplossing in 70% alcohol.
- Voer een micro-CT-scan uit van het kaakbeen met de volgende parameters voor scans met hoge resolutie: isotrope voxelgrootte van 9 tot 18 μm, röntgeninstellingen van 50 kV, 0,5 mm aluminiumfilter en rotatiehoek van 0,5°. Er kan meer dan één kaak worden geplaatst tijdens de microCT-scan.
- Reconstrueer de verkregen beelden met behulp van het microtomografiereconstructieprogramma dat is aangegeven door de fabrikant van de gebruikte microcomputertomografie (microCT)17.
- Plaats de gereconstrueerde beelden met behulp van het 3D-inspectieprogramma dat is aangegeven door de fabrikant van de gebruikte microtomografie.
- Kwantificeer OTM door het verschil in lineaire afstand te meten tussen de cement-emaille overgang (CEJ) van de eerste en tweede molaren van de rechter hemi-maxilla (OTM-zijde) ten opzichte van de linker hemi-maxilla (controlezijde). Gebruik de juiste microCT-analysesoftware met het lijngereedschap voor deze meting 17,18,19,20.
- Controleer de monsters op de aanwezigheid van orthodontisch geïnduceerde inflammatoire wortelresorptie (OIIRR). Selecteer het interessegebied (ROI) van de disto-vestibulaire wortel van de eerste maxillaire molaar met behulp van een onregelmatig, anatomisch interessegebied dat handmatig wordt getekend met contouren. Meet de volgende parameters: de dichtheid van wortelmineralen (RMD; g/cm3) en het percentage van het wortelvolume per totaal volume (RV/TV; %). Gebruik de juiste microCT-analysesoftware met de 3D-volumetrische tool voor deze meting16,21.
- Voer de reconstructie van de eerste maxillaire kies uit met behulp van Mimics-software en analyseer de verkregen gegevens om conclusies te trekken met betrekking tot OTM en OIIRR in het experimentele model16,21.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol maakt het mogelijk om een OTM-muismodel te onderzoeken met behulp van een NiTi-spiraalveer. Met een uitgeoefende kracht van 0,35 N bedroeg de gemiddelde CEJ-afstand aan de controlezijde tussen de eerste en tweede molaren 243,69 μm (Figuur 1A, regel A), terwijl aan de OTM-zijde werd gemeten op 284,66 μm (Figuur 1A, lijn B). Het verschil tussen de OTM- en controlezijde was 40,97 μm (Figuur 1B). De lineair...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier beschrijven we een gestandaardiseerd protocol dat is ontworpen om de cellulaire en moleculaire mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan botremodellering tijdens OTM. Een grondig begrip van deze mechanismen bij muizen vereist een zorgvuldig gepland protocol om nauwkeurigheid en betrouwbaarheid te garanderen 7,11. Studies uitgevoerd door onze onderzoeksgroep hebben aangetoond dat dit protocol de variabiliteit van de operator effectief vermindert...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Wij willen onze oprechte waardering uitspreken voor mevrouw Beatriz M. Szawka voor haar bijdrage aan het schematische diagram en voor mevrouw Ilma Marçal de Souza voor haar technische ondersteuning. J.A.A.A. is de ontvanger van een fellowship toegekend door Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, E-26/200.331/2024), Brazilië. Deze studie werd ondersteund door Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (406928/2023-1), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Financieringscode 001), Brazilië. De auteurs danken Prof. Dr. Eduardo H. M. Nunes van LabBio/UFMG voor de röntgenmicrotomografie-analyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | |
| Distal cut pliers | Quinelato | QO.700.00 | |
| Dynamometer | SHIMPO | FGE-5XY | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole-Parmer | N/A | |
| ketamine | Syntec | 100477-72-3 | |
| NiTi open-coil spring 0.25 x 0.76 | Lancer Orthodontics | ||
| Ø 0.20 mm round chrome-nickel (CrNi) | Morelli | 55.01.208 | |
| Round CrNi Hard Elastic Orthodontic Wire Ø0.50 mm (.020 inch) | Morelli | 55.01.050 | |
| Round CrNi Tie Wire Ø0.20 mm (.008 inch) | Morelli | 55.01.208 | |
| Stereomicroscope | Quimis | Q7740SZ | |
| Transbond Plus Self Etching Primer | 3M | LE-Q100-1004-7 | |
| Weingart Plier | Quinelato | QO.120.00 | |
| Xylazine | Syntec | 23076-35-9 | |
| MicroCT Analysis | |||
| Skyscan 1174v2 | Bruker | 1174v2 | |
| Software | |||
| NRecon | Skyscan | N/A | |
| DataViewer | Skyscan | N/A | |
| CTAn | Skyscan | N/A | |
| Mimics | Materialise | N/A |
Referenties
- Kohli, N., et al. Bone remodelling in vitro: Where are we headed?: -A review on the current understanding of physiological bone remodelling and inflammation and the strategies for testing biomaterials in vitro. Bone. 110, 38-46 (2018).
- Epsley, S., et al. The effect of inflammation on bone. Front Physiol. 11, 511799(2021).
- Bolamperti, S., Villa, I., Rubinacci, A. Bone remodeling: an operational process ensuring survival and bone mechanical competence. Bone Res. 10 (1), 48(2022).
- Taddei, S. R., et al. Experimental model of tooth movement in mice: a standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. J Biomech. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Guerrero, J. A., et al. Maxillary suture expansion: A mouse model to explore the molecular effects of mechanically-induced bone remodeling. J Biomech. 108, 109880(2020).
- Ibrahim, A. Y., Gudhimella, S., Pandruvada, S. N., Huja, S. S. Resolving differences between animal models for expedited orthodontic tooth movement. Orthod Craniofac Res. 20, Suppl 1 72-76 (2017).
- Kirschneck, C., Bauer, M., Gubernator, J., Proff, P., Schröder, A. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Sci Rep. 10 (1), 12154(2020).
- Huang, H., Williams, R. C., Kyrkanides, S. Accelerated orthodontic tooth movement: molecular mechanisms. Am J Orthod Dentofac Ortho. 146 (5), 620-632 (2014).
- Ariffin, S. H. Z., Yamamoto, Z., Abidin, I. Z., Wahab, R. A. M., Ariffin, Z. Cellular and molecular changes in orthodontic tooth movement. Sci World J. 11, 1788-1803 (2011).
- Alhasyimi, A. A., Pudyani, P. P., Asmara, W., Ana, I. D. Enhancement of post-orthodontic tooth stability by carbonated hydroxyapatite-incorporated advanced platelet-rich fibrin in rabbits. Orthod Craniofac Res. 21, 112-118 (2018).
- Klein, Y., et al. Immunorthodontics: in vivo gene expression of orthodontic tooth movement. Sci Rep. 10 (1), 8172(2020).
- Fujimura, Y., et al. Influence of bisphosphonates on orthodontic tooth movement in mice. Eur J Orthod. 31 (6), 572-577 (2009).
- Waldo, C. M., Rothblatt, J. M. Histologic response to tooth movement in the laboratory rat; procedure and preliminary observations. J Dental Res. 33 (4), 481-486 (1954).
- Chavez, M. B., et al. Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues. JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).
- Trelenberg-Stoll, V., Wolf, M., Busch, C., Drescher, D., Becker, K. Standardized assessment of bone micromorphometry around teeth following orthodontic tooth movement: A µCT split-mouth study in mice. J Orofac Ortho. 83 (6), 403-411 (2022).
- Santos, M. S., et al. Targeting phosphatidylinositol-3-kinase for inhibiting maxillary bone resorption. J Cell Physiol. 238 (11), 2651-2667 (2023).
- Macari, S., et al. Oestrogen regulates bone resorption and cytokine production in the maxillae of female mice. Arch Oral Biol. 60 (2), 333-341 (2015).
- Macari, S., et al. Lactation induces increases in the RANK/RANKL/OPG system in maxillary bone. Bone. 110, 160-169 (2018).
- Pereira, L. J., et al. Aerobic and resistance training improve alveolar bone quality and interferes with bone-remodeling during orthodontic tooth movement in mice. Bone. 138, 115496(2020).
- Silva, F. R. F., et al. Protective effect of bovine milk extracellular vesicles on alveolar bone loss. Mol Nutri Food Res. 68 (3), 2300445(2024).
- Amaro, E. R. S., et al. Estrogen protects dental roots from orthodontic-induced inflammatory resorption. Arch Oral Biol. 117, 104820(2020).
- Xu, X., Zhou, J., Yang, F., Wei, S., Dai, H. Using micro-computed tomography to evaluate the dynamics of orthodontically induced root resorption repair in a rat model. PLoS One. 11 (3), e0150135(2016).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Mineral Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Kanou, K., et al. Effect of age on orthodontic tooth movement in mice. J Dent Sci. 19 (2), 828-836 (2024).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
