Kwantificering van het niveau van 8-oxo-dG met behulp van ELISA-assay om oxidatieve DNA-schade in MCF-7-cellen te evalueren

Summary

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het kwantitatief detecteren van DNA-oxidatieve schade in MCF-7-cellen door middel van ELISA-technologie.

Abstract

8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) base is de overheersende vorm van vaak waargenomen DNA-oxidatieve schade. DNA-stoornissen hebben een grote invloed op de genexpressie en dienen als een cruciale factor bij het stimuleren van neurodegeneratieve aandoeningen, kanker en veroudering. Daarom is nauwkeurige kwantificering van 8-oxoG van klinisch belang bij het onderzoek naar methodologieën voor het opsporen van DNA-schade. Op dit moment vormen de bestaande benaderingen voor 8-oxoG-detectie echter uitdagingen op het gebied van gemak, doelmatigheid, betaalbaarheid en verhoogde gevoeligheid. We gebruikten de sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -techniek, een zeer efficiënte en snelle colorimetrische methode, om variaties in het 8-oxo-dG-gehalte te detecteren in MCF-7-celmonsters die werden gestimuleerd met verschillende concentraties waterstofperoxide (H₂O₂). We bepaalden de concentratie van H₂O₂ die oxidatieve schade veroorzaakte in MCF-7-cellen door de IC_50-waarde in MCF-7-cellen te detecteren. Vervolgens behandelden we MCF-7-cellen met 0, 0,25 en 0,75 mM H₂O₂ gedurende 12 uur en haalden we 8-oxo-dG uit de cellen. Ten slotte werden de monsters onderworpen aan ELISA. Na een reeks stappen, waaronder plaatspreiding, wassen, incubatie, kleurontwikkeling, beëindiging van de reactie en gegevensverzameling, hebben we met succes veranderingen gedetecteerd in het 8-oxo-dG-gehalte in MCF-7-cellen geïnduceerd door H₂O₂. Door middel van dergelijke inspanningen willen we een methode ontwikkelen om de mate van oxidatieve DNA-schade in celmonsters te evalueren en daarmee de ontwikkeling van meer geschikte en gemakkelijke benaderingen voor het opsporen van DNA-schade te bevorderen. Dit streven is klaar om een zinvolle bijdrage te leveren aan de verkenning van associatieve analyses tussen oxidatieve DNA-schade en verschillende domeinen, waaronder klinisch onderzoek naar ziekten en de detectie van giftige stoffen.

Introduction

DNA-oxidatieve schade is een gevolg van een onbalans tussen de aanmaak van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en het cellulaire^{antioxidantafweersysteem}. Het gaat voornamelijk om de oxidatie van DNA, purine en pyrimidinebasen ^2,3. Deze oxidatieve modificatie van DNA-basen brengt niet alleen de integriteit van het genoom in gevaar, maar omvat ook een breed scala aan pathologische problemen, waaronder kanker, neurodegeneratieve ziekten en hart- en vaatziekten ^4,5. De guaninebase in DNA heeft het laagste reductiepotentieel en is het meest vatbaar voor oxidatie⁶. Daarom dient 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) als een primaire marker voor het beoordelen van de mate van DNA-oxidatieve schade ^7,8. De nauwkeurige kwantificering van 8-oxo-dG is een cruciaal punt geworden bij het aanpakken van verschillende aspecten van het optreden en de progressie van de ziekte en de beoordeling van multifactoriële oxidatieve belasting^.

De traditionele methoden voor het detecteren van 8-oxo-dG, zoals hoogwaardige vloeistofchromatografie met elektrochemische detectie (HPLC-ECD), massaspectrometrie en gerelateerde technieken met koppeltekens, vertonen een hoge gevoeligheid en specificiteit 10,11,12. Deze technieken hebben echter vaak complexe operationele vereisten en hoge kosten, die hun wijdverbreide toepasbaarheid en bruikbaarheid bij monsteranalyse met hoge doorvoer belemmeren. Met de voortdurende vooruitgang van wetenschap en technologie is er een verscheidenheid aan nieuwe, efficiënte en nauwkeurige methoden ontstaan. De toepassing van deze nieuwe technologieën stelt ons in staat om het niveau van 8-oxo-dG nauwkeuriger te kwantificeren en biedt krachtigere instrumenten voor een diepgaande studie van het verband tussen oxidatieve stress en ziekte. Onderzoekers hebben bijvoorbeeld nanoporietechnologie toegepast om DNA¹³ kwantitatief te detecteren en te sequensen, DNA-schadetypes te identificeren met behulp van een single-click code-sequencing-strategie¹⁴, high-throughput sequencing-methoden te ontwikkelen en 8-oxoG-gebaseerde biosensoren te creëren door biotine-streptavidine te integreren met ELISA¹⁵. Onder hen is ELISA, met zijn erkende voordelen op het gebied van specificiteit, high-throughput screening en kosten, een van de ideale oplossingen voor 8-oxo-dG-detectie. Daarom is het van cruciaal belang om een hoge-doorvoer, zeer gevoelige, gemakkelijke en snelle methode te ontwikkelen voor het detecteren van 8-oxo-dG.

De ELISA-techniek (Enzyme-linked immunosorbent assay), ontwikkeld in 1971¹⁶, heeft zich de afgelopen 50 jaar snel ontwikkeld en is nu een van de meest gebruikte detectiemethoden op het gebied van biologie en geneeskunde geworden 17,18,19. ELISA-technologie vertoont een hoge gevoeligheid en specificiteit, heeft een korte reactietijd en is gemakkelijk te gebruiken, waardoor het een algemeen erkende keuze is voor grootschalige monstertests en high-throughput-analyse²⁰. Als gevolg hiervan is ELISA op grote schaal gebruikt voor kwantitatieve of semikwantitatieve analyse van verbindingen, eiwitten, antilichamen of moleculen in cellen 21,22,23. Het is bijvoorbeeld gebruikt bij de detectie van biomarkers die verband houden met verschillende ziekten, medicijnresten en biomoleculen²⁴. ELISA's kunnen worden onderverdeeld in vier hoofdtypen op basis van experimenteel ontwerp en principes²⁵. Deze methoden omvatten directe ELISA, indirecte ELISA, sandwich ELISA^en competitieve ELISA ^26,27. Hiervan werd sandwich ELISA, die twee specifieke antilichamen gebruikt, één voor het vangen van het doelmolecuul en de andere voor detectie, gekozen voor de studie in dit artikel. Het experimentele principe van sandwich ELISA is als volgt: eerst wordt een specifiek antilichaam geïmmobiliseerd in de putjes van een microplaat om de betreffende analyt vast te leggen. Nadat de standaard of het monster is toegevoegd, bindt de doelanalyt zich aan het geïmmobiliseerde antilichaam. Vervolgens wordt een gelabeld antilichaam toegevoegd dat een ander epitoop op het antigeen herkent, waardoor een sandwichstructuur wordt gevormd. Na verwijdering van ongebonden antilichamen wordt een substraat toegevoegd. Onder de katalytische werking van het secundaire antilichaam vindt een kleurreactie plaats en is de intensiteit van de kleur positief gecorreleerd met de concentratie van de doelanalyt in het monster. Ten slotte werd de optische dichtheid (OD) gemeten om de concentratie van het monster te bepalen. Sandwich ELISA heeft de voordelen van een verhoogde gevoeligheid en specificiteit voor doelmonsters, waardoor het geschikt is voor het detecteren van lage concentraties doelanalyten en complexe monsters²⁸. Bovendien kunnen de verkregen resultaten worden gekwantificeerd voor verdere analyse. Deze factoren maken sandwich ELISA tot een veelgebruikte detectiemethode in zowel wetenschappelijk onderzoek als klinische laboratoria²⁹.

Deze studie was gericht op het kwantitatief detecteren van 8-oxo-dG in MCF-7-cellen om de mate van DNA-oxidatieve schade in de cellen te bepalen. Deze studie bestaat uit twee hoofdonderdelen: het construeren van een MCF-7-cel DNA-oxidatief schademodel en het detecteren van 8-oxo-dG met behulp van ELISA. Eerst werden MCF-7-cellen in vitro gekweekt en behandeld met verschillende concentraties H₂O₂ voor verschillende duur. De levensvatbaarheid van de cellen werd geëvalueerd met behulp van een CCK-8-test om de halfmaximale remmende concentratie (IC₅₀) van H₂O₂ in MCF-7-cellen te bepalen. Op basis van de IC_50-waarden is een geschikte H₂O₂ behandeltijd en inductieconcentratie gekozen. Om monsters van MCF-7-cellen te extraheren die door oxidatie waren beschadigd, werden celmonsters en supernatanten verkregen en toegevoegd aan enzymgekoppelde putten die eerder waren gecoat met 8-oxo-dG-antilichamen. De 8-oxo-dG die in het monster aanwezig is, zal zich binden aan de antilichamen die aan de vastefasedrager zijn gebonden. Vervolgens werden 8-oxo-dG-antilichamen gelabeld met mierikswortelperoxidase toegevoegd. Het reactiemengsel werd bij een constante temperatuur geïncubeerd om een volledige binding van het monster en het antilichaam te garanderen. Het ongebonden enzym werd verwijderd door te wassen en vervolgens werd het colorimetrische substraat toegevoegd, wat een blauwe kleur opleverde. Onder invloed van zuur werd de oplossing geel. Ten slotte werd de OD-waarde van de monsters van de reactieputjes gemeten bij 450 nm en was de concentratie van 8-oxo-dG in het monster evenredig met de OD-waarde. Door een standaardcurve te genereren, kan de concentratie van 8-oxo-dG in het monster worden berekend.

Protocol

1. Constructie van een H₂O₂ -geïnduceerd DNA oxidatief schademodel in MCF-7 cellen

1. Herstel van MCF-7-cellen
   1. Breng de cryogene buis van de celcultuur, die 3,5 x 10⁶ MCF-7-cellen bevat en wordt bewaard in een koelkast van -80 °C, snel over in een schuimdoos met vloeibare stikstof. Pak de buis met een tang op en plaats deze ongeveer 1 minuut in een waterbad van 37 °C met constante temperatuur om de geconserveerde cellen te ontdooien.
      OPMERKING: Tijdens het ontdooiproces in een waterbad, schudt u de cellen met tussenpozen om een gelijkmatige verwarming van de cryovial te garanderen.
   2. Plaats de cryovial in een centrifuge en centrifugeer bij kamertemperatuur bij 150 x g gedurende 5 minuten.
   3. Gebruik een pipet om het supernatans uit de cryogene bewaarbuis weg te gooien en voeg 1 ml volledig kweekmedium toe. Meng goed en breng over naar een kweekschaal van 10 mm, vul een extra 7 ml compleet kweekmedium aan.
   4. Schud de kweekschaal kriskras door elkaar om een gelijkmatige menging te garanderen en kweek in een CO₂ -incubator bij 37 °C met 5% CO_{2 .}
      OPMERKING: Het volledige kweekmedium bestaat uit DMEM-kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline en streptomycine.
2. Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen
   1. Selecteer MCF-7-cellen in de logaritmische groeifase met een goede cellulaire status voor het experiment. Tijdens de logaritmische groeifase vertonen cellen doorgaans een kortere delingscyclus en een hoge frequentie van celdeling.
      1. Observeer de morfologie en groeisnelheid van MCF-cellen met behulp van een elektronenmicroscoop. Wanneer de cellen een uniforme en dicht opeengepakte monolaagmorfologie vertonen en celproliferatie duidelijk is, kan worden vastgesteld dat de cellen zich in wezen in de logaritmische groeifase bevinden.
   2. Cellen wassen: Gebruik een pipet om het kweekmedium uit de kweekschaal te verwijderen, voeg 1 ml PBS-buffer toe om de cellen te wassen en gooi de PBS vervolgens weg.
   3. Celloslating: Voeg 1 ml trypsine toe om de cellen te wassen, wacht ongeveer 1 minuut totdat trypsine de cellen volledig heeft losgemaakt van de kweekschaal. Tik zachtjes op het kweekschaaltje; Observatie van celbeweging
      in vellen duidt op grondige celloslating.
   4. Beëindiging van celloslating en celtelling: Voeg 8 ml volledig kweekmedium toe om de onthechting te beëindigen, pipetteer voorzichtig cellen en bepaal de concentratie van de celsuspensie met behulp van een celtelapparaat.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de celsuspensie homogeen is voordat u gaat tellen door voorzichtig op en neer te pipetteren.
   5. Celzaaien: Pas de verdunde celsuspensie aan om een celdichtheid van 5.000 cellen per 100 μl te bereiken. Inoculeer de celsuspensie in 21 putjes van een plaat met 96 putjes met behulp van een pipetpistool en doseer 100 μl in elk putje. Voeg 100 μL PBS-buffer toe aan de omliggende putjes van de gezaaide putjes om overmatige verdamping van het kweekmedium te voorkomen.
   6. Bereiding van H₂O_2-bevattend medium: Kies 9 putjes op de celkweekplaat met 12 putjes en wijs labels toe op basis van de gradiënt van H₂O_{2-concentraties} (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 mM). Voeg 720 μL compleet medium toe aan de putjes gelabeld als 2,0 mM en 1,5 mM en voeg 360 μL volledig medium toe aan de resterende putjes.
      1. Doseer met behulp van een pipet 1,63 μl en 1,22 μl 3% H₂O 2-reagens in de putjes die zijn gelabeld als respectievelijk 2,0 mM en 1,5 mM. Meng de oplossing grondig. Breng met een pipet 360 μL 2,0 mM H₂O₂ over in de goed geëtiketteerde 1,0 mM en meng; breng vervolgens 360 μL 1,0 mM H₂O₂ over in het aangegeven putje van 0,5 mM en meng; en breng ten slotte 360 μL van 0,5 mM H₂O₂ over in de goed gemarkeerde 0,25 mM. Pipetteer 360 μL van 1,5 mM H₂O₂ in de met het label aangeduide put 0,75 mM om te verdunnen en de gewenste concentratie te bereiken. (Figuur 1).
         OPMERKING: Zorg ervoor dat de H₂O_{2-voorraadoplossing} in de pipet volledig in de putjes wordt overgebracht om resten van de oplossing te voorkomen. Zorg ervoor dat de oplossingen grondig worden gemengd voordat u doorgaat met de verdunning.
   7. Incubatie: Gebruik na ongeveer 24 uur celzaaien een pipet om het kweekmedium van de plaat met 96 putjes te verwijderen zodra de cellen zich aan de oppervlakken hebben gehecht. Voeg volgens de concentratiegradiënt het respectieve H₂O_2-bevattende medium toe aan elk putje. Zet de plaat 12 uur terug in de couveuse.
   8. Toevoeging van CCK-8-reagens: Gebruik na de aangegeven behandelingsperiode van 12 uur een pipet om het kweekmedium van de plaat met 96 putjes te verwijderen, voeg 100 μL volledig kweekmedium en 10 μL CCK-8-reagens toe aan elk putje en voeg drie blanco controleputjes toe. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 2 uur.
      OPMERKING: Vermijd tijdens het toevoegen van monsters de vorming van luchtbellen om interferentie met de OD-waardeaflezing te voorkomen.
   9. Absorptiemeting: Haal de plaat met 96 putjes uit de incubator, meet de absorptie op een golflengte van 450 nm met behulp van een microplaatlezer en noteer de resultaten.
   10. Volgens de berekeningsformule van IC₅₀ ,
       remmingspercentage (%) = (OD van geneesmiddelexperimentele groep - gemiddelde OD van geneesmiddelcontrolegat)/ (gemiddelde OD van celcontrolegat - gemiddelde OD van geneesmiddelcontrolegat) x 100%
       Bereken de resultaten als percentage van de absorptie in controleculturen.
   11. Importeer de verwerkte experimentele gegevens in statistische analysesoftware, selecteer het analysetype Niet-lineaire regressie, construeer het logistieke model met vier parameters en klik vervolgens op de knop Curve aanpassen voor curveaanpassing. Na het aanpasproces berekent de software automatisch de IC_50-waarde .
3. H₂O 2-geïnduceerd MCF-7 cel oxidatie experiment
   1. Haal MCF-7-cellen op in de logaritmische groeifase met een goede celstatus voor experimenten.
   2. Was, voer celloslating uit, beëindig de onthechting en tel de cellen (zie stap 1.2 voor specifieke methoden).
   3. Cell seeding: Pas de dichtheid van de celsuspensie aan tot 1 x 10⁶ cellen per schaaltje, met 4 ml van de suspensie per schaaltje met een diameter van 6 cm.
   4. Label twee microcentrifugebuisjes van 5 ml als 0,25 mM en 0,75 mM 3% H₂O₂. Voeg 4 ml volledig medium toe aan elke buis en voeg vervolgens respectievelijk 1,13 μl en 3,40 μl 3% H₂O_{2 toe}. Schud de buisjes voorzichtig om een grondige menging te garanderen. Vervang het kweekmedium in de drie schaaltjes door een compleet medium met H₂O₂ concentraties van 0, 0,25 en 0,75 mM.
   5. Incubeer de culturen: Zet de gerechten 12 uur terug in de broedmachine.

2. Bereiding van cellulaire monsters en bereiding van ELISA-reagentia

1. Verzameling van monsters van celextracten
   1. Monsterafname: Gooi MCF-7 celcultuursupernatant weg, spoel, voer celloslating uit, beëindig de onthechting en verzamel cellen. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuisje van 15 ml.
   2. Centrifugeren: Centrifugeer op 800 x g gedurende 5 minuten om de celpellet op te vangen. Voeg 200 μL PBS toe om elk celmonster te resuspenderen en de cellen te verstoren door herhaalde vries-dooicycli. Centrifugeer het cellysaat bij 1.500 x g gedurende 10 minuten en gebruik een pipet om het supernatans op te vangen voor analyse.
      OPMERKING: Als de hoeveelheid cellen laag is, verminder dan het volume PBS dat wordt gebruikt voor resuspensie. Monsters kunnen maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard als onmiddellijke analyse niet mogelijk is. Voor langdurige opslag worden de monsters gealiquoteerd op basis van hoeveelheden voor eenmalig gebruik en worden ze opgeslagen bij -80 °C om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.
2. Bereiding van ELISA-reagentia
   1. Ontdooien van reagentia: Laat de ELISA-reagentia, inclusief afdichtingsfilms, voorgecoate platen, standaarden, monsterverdunningsmiddel, detectie-antilichaam-HRP, chromogeensubstraat, stopoplossing, geconcentreerde wasbuffer (20x) en de testmonsters gedurende 20 minuten op kamertemperatuur komen (18-25 °C) voordat u met de test begint. Open de ELISA-lezer 15 minuten voor gebruik voor.
   2. Bereiding van de wasbuffer: Bereken het benodigde volume verdunde wasbuffer en verdun vervolgens 20x geconcentreerde wasbuffer met gedestilleerd of gedeïoniseerd water tot 1x werkoplossing. Doe de ongebruikte geconcentreerde wasbuffer terug in de koelkast van 4 °C.
      NOTITIE: De wasbuffer moet voor gebruik vers worden bereid. Als er kristallen aanwezig zijn in de geconcentreerde wasbuffer die in de koelkast wordt bewaard, laat deze dan op kamertemperatuur komen en schud deze voorzichtig totdat de kristallen volledig zijn opgelost voordat u deze gebruikt.
   3. Opstellen van de norm
      1. Bereid werkoplossingen voor van standaardmonsters met concentraties van respectievelijk 1,25, 2,5, 5, 10, 20 en 40 ng/ml. Om de nauwkeurigheid van de experimentele resultaten te garanderen, moet u de standaardmonsters voor gebruik zorgvuldig op en neer mengen om de vorming van luchtbellen tijdens het oplosproces te voorkomen.

3. ELISA-experiment

1. Plaatcoating: Ontwerp vooraf het totale aantal putjes voor standaarden, monsters en blanco/controles en verwijder de benodigde plaatstrips. Voeg 50 μL standaard werkoplossing en detectiemonsters met verschillende concentraties toe aan de reactieputjes. Voer normen in drievoud uit en voeg geen monsters toe aan de blanco-/controleputjes²⁵.
   OPMERKING: De experimentele stappen van de ELISA-test zijn schematisch weergegeven in figuur 2. Als de monsterconcentratie het detectiebereik overschrijdt, moet het monster vóór de bemonstering worden verdund met monsterverdunningsmiddel. Wanneer u monsters toevoegt, voeg ze dan toe aan de bodem van de plaat, vermijd het aanraken van de putwanden, schud voorzichtig om te mengen en vermijd de vorming van luchtbellen. Om de nauwkeurigheid van het experiment te garanderen, moet elke monstertoevoeging binnen 10 minuten worden voltooid.
2. Incubatie: Met uitzondering van de lege putjes, voeg 100 μL mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd detectieantilichaam toe aan elk reactieputje, sluit de putjes af met een plaatafdichting en incubeer bij 37 °C gedurende 60 minuten in een incubator met constante temperatuur.
3. Wassen: Gooi de vloeistof weg, schud de vloeistof in de plaatkuiltjes af, dep droog op absorberend papier, voeg 350 μL wasbuffer toe aan elk reactieputje, laat het 1-2 minuten staan en gooi dan de wasbuffer weg. Herhaal het wasproces 5x.
   OPMERKING: Grondig wassen is cruciaal omdat het rechtstreeks van invloed is op de nauwkeurigheid van de experimentele resultaten. Zorg ervoor dat de wasbuffer na elke wasbeurt volledig is afgeschud. Veeg eventuele resten op de bodem van de plaat na het wassen voorzichtig weg om te voorkomen dat de absorptiemeting wordt beïnvloed.
4. Kleurreactie: Voeg 50 μL substraat A en 50 μL substraat B toe aan elk reactieputje, sluit de plaat af en incubeer bij 37 °C in het donker gedurende 15 min.
   OPMERKING: Observeer na het toevoegen van het kleurreagens onmiddellijk de kleurverandering in de reactieputjes. Als de kleur te donker is, voeg dan de stopoplossing toe om de reactie eerder te beëindigen.
5. Beëindig de reactie en meet de extinctie: Voeg 50 μL stopoplossing toe aan elk reactieputje en meet onmiddellijk de OD-waarde bij een golflengte van 450 nm met een ELISA-lezer (binnen 15 minuten).
6. Gegevensanalyse: Importeer de verwerkte experimentele gegevens in de statistische analysesoftware, selecteer het analysetype Lineaire regressie. Construeer een kalibratiecurve door de concentratie van de standaarden op de X-as uit te zetten tegen de optische dichtheidswaarden (OD) op de Y-as. Gebruik de vastgestelde kalibratiecurve om de concentratie van 8-oxo-dG in de monsters vast te stellen. Construeer een logistiek wiskundig model en klik vervolgens op de knop Curve aanpassen voor curveaanpassing. Na het aanpasproces berekent de software automatisch de standaardcurve en P-waarde.
   OPMERKING: De standaardcurve kan niet opnieuw worden gebruikt en moet voor elk experiment opnieuw worden bepaald.

Results

Zoals geïllustreerd in figuur 3, geeft de X-as de concentratie van H₂O₂ aan die wordt toegepast op MCF-7-cellen, terwijl de Y-as de levensvatbaarheid van de cel aangeeft. Behandeling met 0,75 mM gedurende 12 uur verminderde de levensvatbaarheid van MCF-7-cellen tot 67%. Gelijktijdig met de toename van de concentratie was er een significante afname van de levensvatbaarheid van MCF-7-cellen, met name bij een concentratie van 1,5 mM, waar de levensvatbaarheid afnam tot minder dan 3% (tabel 1). De experimentele resultaten suggereerden een IC₅₀ van 0,7655 mM voor de MCF-7-cellen.

In deze reeks experimenten gebruikten we een verbeterde ELISA-techniek voor de kwantificering van 8-oxo-dG-niveaus. Door middel van data-analyse is de regressievergelijking van de standaardcurve:

Y = 23,66 × x + 0,07038.

Zoals weergegeven in figuur 4A, vertoonde de kalibratiecurve een hoge lineariteit (R² = 0,978), en figuur 4B laat zien dat de relaties tussen de gemeten concentraties van 8-oxo-dG in de monsters en de bijbehorende toegevoegde hoeveelheden sterk gecorreleerd waren, wat wijst op een goede precisie (de variatiecoëfficiënt was minder dan 5%). Bovendien geeft de consistentie van de verkregen resultaten over meerdere replicaten de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de experimentele methode aan.

Samenvattend geven de experimentele gegevens aan dat onze geoptimaliseerde ELISA-methode in staat is om fluctuaties in 8-oxo-dG-niveaus onder goed gecontroleerde omstandigheden met succes te detecteren. Dit heeft belangrijke implicaties voor toekomstige toepassingen van deze techniek in een breder scala aan monstertypes om DNA-schade veroorzaakt door oxidatieve stress te monitoren. Ondanks bepaalde beperkingen lijken de toepassingsperspectieven van de methode veelbelovend bij optimalisatie van de experimentele omstandigheden.

Figuur 1: Bereiding van H₂O₂ verdunningen. Het schematische diagram schetst de methode voor het bereiden van waterstofperoxide (H₂O₂) verdunningen, waarbij de minutieuze combinatie van oplossingen en de nauwkeurige overdracht van gevarieerde H₂O_{2-concentraties} in buizen met het label 1,0 mM, 0,5 mM en 0,25 mM dienovereenkomstig worden gebruikt. De beoogde concentratie wordt bereikt door 1,5 mM H₂O₂ over te brengen in de buis die wordt aangeduid als 0,75 mM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) voor antigeendetectie. Deze schematische illustratie toont de opeenvolgende stappen van een enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) voor antigeendetectie: toevoeging van monsters en voorbereiding van blanco's; HRP-gelabelde antigeenincubatie; wassen en bordbereiding; substraattoevoeging en incubatie; reactiebeëindiging en meting van optische dichtheid (OD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: H₂O₂ remde de proliferatie van MCF-7-cellen. De levensvatbaarheid van de cellen werd geëvalueerd door middel van een CCK-8-test behandeld met verschillende concentraties van H₂O₂ (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 of 2,0 mM) gedurende 12 uur en IC₅₀ werd berekend voor de aangegeven toestand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Kwantitatieve analyse van 8-oxo-dG in MCF-7 cellen na behandeling met H₂O₂ . (A) ELISA-standaardcurve voor 8-oxo-dG. Geeft de relatie weer tussen bekende concentraties van 8-oxo-dG (1,25, 2,5, 5, 10, 20 en 40 ng/ml) en hun respectieve absorptiewaarden. De regressievergelijking van de standaardcurve is Y = 23,66 × X + 0,07038. (n=3, R²=0,978). (B) 8-oxo-dG-concentratie in met H₂O₂ behandelde MCF-7-cellen. De grafiek toont de niveaus van 8-oxo-dG in MCF-7-cellen die worden blootgesteld aan verschillende concentraties van H₂O₂ (0, 0,25 en 0,75 mM). Elk datapunt vertegenwoordigt het gemiddelde ± SE (standaardfout) van drie onafhankelijke experimenten (n=3), die de impact van oxidatieve stress op DNA-schade illustreren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Parameter
H2O2 concentratie, mM	0	0.25	0.5	0.75	1	2
Levensvatbaarheid van MCF-7-cellen, %	100	82.8	81.37	61.07	13.4	2.77

Tabel 1: Cellevensvatbaarheid van MCF-7-cellen behandeld met H₂O₂.

Discussion

De ontwikkeling van ELISA-methoden is van groot belang voor zowel bestaande als nieuwe methoden voor het opsporen van DNA-schade. In vergelijking met traditionele HPLC- en massaspectrometrietechnieken is deze aanpak niet alleen gebruiksvriendelijk, maar vertoont het ook een hoge gevoeligheid en voldoet het aan de eisen van high-throughput screening³⁰. Dit maakt het mogelijk om 8-oxo-dG te monitoren in grootschalige ziektescreeningsstudies, waardoor een beter begrip van de correlatie tussen deze biomarker en verschillende ziekten wordt vergemakkelijkt.

Tijdens experimentele procedures zijn verschillende kritische stappen essentieel om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de resultaten te garanderen. Aanvankelijk beoordeelde het experiment vakkundig de gevoeligheid van MCF-7-cellen voor H₂O₂, met een IC_50-waarde van 0,7655 mM om 12 uur, waarbij het tolerantieniveau van MCF-7-cellen werd benadrukt. Deze uitkomst is van groot wetenschappelijk belang voor het begrijpen van de antioxidantafweermechanismen van MCF-7-cellen en hun overleving onder oxidatieve stress, terwijl het een belangrijke referentie-indicator biedt voor toekomstige screening van antioxidanten of gerelateerde behandelingsmechanismen³¹. Bovendien is de selectie en koppeling van 8-oxo-dG-antilichamen van vitaal belang voor ELISA-detectie en heeft het een directe invloed op de specificiteit en gevoeligheid van het ELISA-detectiesysteem. Bovendien zijn het optimaliseren van de signaalversterkingsstrategie en de stappen voor de verwerking van monsters belangrijke factoren die van invloed zijn op de nauwkeurigheid van de detectie. We ontdekten dat het gebruik van een stabiel substraatreactiesysteem achtergrondfouten kan verminderen en het gevoeligheidsbereik van detectie kan vergroten.

Tijdens het experimentele proces kunnen technische problemen optreden, zoals onstabiele antilichamen, signaalfluctuaties en kruisreactiviteit van reactanten. Om deze problemen aan te pakken, hebben we een stabieler experimenteel protocol aangenomen, dat het gebruik van stabiele antilichaamoplosmiddelen omvatte om de stabiliteit van antilichamen te verbeteren en de optimalisatie en aanpassing van experimentele omstandigheden. Om de fout veroorzaakt door signaalfluctuaties aan te pakken, hebben we het experiment bovendien gestandaardiseerd met behulp van standaard 8-oxo-dG-monsters om consistentie van de resultaten te garanderen.

Wat de beperkingen van de experimentele methode betreft, biedt ELISA weliswaar een high-throughput-benadering, maar deze kan nog steeds worden beperkt door de specifieke antilichaamdekking en de onvermijdelijke kruisreactiviteit van het substraat³². Daarom kunnen aanvullende stappen voor monsterzuivering of voorbewerking nodig zijn voor complexe monsters. Bovendien kan de detectie van monsters met lagere concentraties een verdere optimalisatie van de antilichaamactiviteit noodzakelijk maken om aan de onderzoeksvereisten te voldoen.

Concluderend kan worden gesteld dat de ELISA-detectiemethode voor 8-oxo-dG belangrijke implicaties heeft voor specifieke onderzoeksgebieden. Het heeft potentiële toepassingswaarde bij milieumonitoring, ziekterisicobeoordeling en vroege diagnose en biedt een nieuwe detectiebenadering voor 8-oxo-dG in de landbouw, voedselveiligheid en screening van geneesmiddelen³³. Bij biomonitoring van het milieu kan bijvoorbeeld de detectie van oxidatieve DNA-schadestress veroorzaakt door milieutoxines in organismen helpen om potentiële risico's tijdig te identificeren³⁴. In de toekomst, met verdere optimalisatie van de detectietechnologie en de toepassing ervan in meerdere disciplines, wordt verwacht dat deze methode een belangrijkere rol zal spelen in biowetenschappelijk onderzoek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Cell Counting Plate	QiuJing	XB-K-25
CO2 incubator	Thermo	51032872
DMEM basic(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		statistical analysis software
high-speed centrifuge	Thermo	9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA Kit	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ Pipettes	Rainin	17014382
L-20XLS+ Pipettes	Rainin	17014392
liquid nitrogen tank	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC microplate photometer	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Beyotime	C0222
Trinocular live cell microscope	Motic	1.1001E+12
Ultra-low temperature freezer	Haire	V118574