Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een model van acuut longletsel na viscerale ischemie-reperfusie door supracoeliakie aortakruisklemming bij ratten

926 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66896

⸱

15 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie beschrijft een model van acuut longletsel na viscerale ischemie-reperfusie tijdens supra-coeliakie aorta-kruisklemming via laparotomie bij ratten. Het maakt het mogelijk om zowel de klinische als biologische effecten van aortaklemmen te onderzoeken, evenals de impact van ischemie-reperfusie op onderliggende organen en longletsels op afstand.

Samenvatting

Open chirurgie voor abdominale aorta-aneurysma's vereist een voorbijgaande onderbreking van de bloedcirculatie, waardoor ischemie-reperfusie van stroomafwaartse organen ontstaat. Nier-, mesenteriale en splanchnische slagaders kunnen hierbij betrokken zijn. Geen enkele therapie is effectief gebleken bij het voorkomen van longbeschadiging op afstand veroorzaakt door ischemie-reperfusie na supracoeliakie aortaklemming. Om de pathofysiologische routes van acuut longletsel en farmacologische behandelingen te bestuderen, is een experimenteel model van aortaklemming bij ratten ontwikkeld.

Subcutane analgesie met buprenorfine (0,05 mg/kg) wordt vóór de ingreep toegediend. Algemene anesthesie met spontane beademing wordt geïnduceerd met behulp van halogeengas (isofluraan 2,5%) via een masker. Een xypho-pubische laparotomie wordt uitgevoerd op een verwarmde tafel (temperatuur intrarectaal gecontroleerd). Het gastro-miltblok en de darmen worden teruggetrokken naar de rechterflank en de lever wordt gemobiliseerd naar de bovenbuik. Het middenrif en zijn pilaren worden geïdentificeerd om de supracoeliakie aorta stapsgewijs los te laten van de intradiafragmatische passage. Dissectie wordt voorzichtig uitgevoerd om omtrekcontrole van de aorta tussen de middenrifpijlers te bereiken. De onderliggende coeliakie stam en de superieure mesenteriale slagader worden zorgvuldig geïdentificeerd. Een microvasculaire klem kan worden gebruikt voor occlusie van de aorta boven de viscerale slagaders. De juiste klemming wordt geverifieerd door de afwezigheid van aortapulsatiliteit, geassocieerd met bleekheid van de dunne darm. De rat blijft gedurende de hele duur van de ischemie verdoofd. Aan het einde van de ischemieduur wordt de microklem verwijderd en wordt de aortapulsatiliteit en de darmverkleuring gecontroleerd. De buikwand wordt afgesloten met een hechtdraad, gevolgd door sluiting van de huid van de rat. Aan het einde van de reperfusieperiode wordt het dier op dezelfde manier verdoofd. Het wordt geëuthanaseerd door verbloeding tijdens bloedafname en de long kan vervolgens worden verzameld. Longbeschadiging kan worden beoordeeld door middel van bloedgasanalyse, longgravimetrie en histologisch onderzoek. Longmonsters kunnen ook worden gebruikt voor RT-PCR- en Western blot-analyses.

Inleiding

Een aorta-aneurysma is een focale en permanente verwijding van de aorta1. De evolutie van een aneurysma neigt naar ruptuur, geassocieerd met massale bloeding, die een aanzienlijke mortaliteit met zich meebrengt2. Daarom ligt de focus van de behandeling op het voorkomen van deze dramatische complicatie. Aorta-aneurysma's zijn meestal infrarenale en kunnen worden behandeld met aorta-endoprothese. Een aorto-bi-iliac endotransplantaat is een bedekte gespleten stent die op een minimaal invasieve manier via de dijbeenslagaders wordt ingebracht met behulp van een percutane benadering. Deze techniek vereist geen aortaklemming en vermijdt het veroorzaken van viscerale ischemie. Het kan worden uitgevoerd onder plaatselijke verdoving. Daarentegen zijn uitgebreidere aorta-aneurysma's, zoals thoraco-abdominale aneurysma's en complexe abdominale aorta-aneurysma's, een grotere uitdaging om te behandelen met behulp van endovasculaire technieken. Dit komt door de betrokkenheid van de nierslagaders, de superieure mesenteriale slagader en de coeliakie stam in het aneurysmatische segment (Figuur 1). Deze grote viscerale slagaders moeten naast de aorta zelf worden gereconstrueerd. De endovasculaire benadering vereist daarom een complexere procedure met het gebruik van gefenestreerde en/of vertakte endotransplantaten voor reconstructie van de viscerale slagader. De belangrijkste beperking van deze endotransplantaten is de lange productietijd - vaak enkele maanden - waardoor ze ongeschikt zijn voor spoedbehandeling. In dergelijke gevallen blijft conventioneel open chirurgisch herstel een haalbare en betrouwbare optie.

De behandeling door open reparatie vereist laparotomie en supra-viscerale klemming, d.w.z. tijdelijke viscerale ischemie. Het complicatiepercentage is hoog tijdens de behandeling van deze thoracoabdominale aneurysma's. De mortaliteit varieert van 5 tot 15%3. Longcomplicaties komen voor bij 60% en niercomplicaties bij 40%4. Deze complicaties, geassocieerd met een systemische ontstekingsreactie, kunnen zich ontwikkelen tot multivisceraal falen5. Deze morbimortaliteit is multifactorieel en omvat chirurgische agressie, anesthesie, analgesie, hemodynamische variaties, hemorragische shock en ischemie-reperfusieverschijnselen. Chirurgische agressie draagt bij aan de manifestatie van complicaties, of de benadering nu thoracotomie, frenotomie, lumbotomie of laparotomie omvat, door het ademhalingsmechanisme te wijzigen, met in het bijzonder een verslechtering van de middenriffunctie6.

De tijdelijke viscerale ischemie-reperfusie beïnvloedt stroomafwaartse organen, waaronder het spijsverteringskanaal, het splanchnische systeem, de nieren en de onderste ledematen7. Longcomplicaties zijn de meest voorkomende bijwerkingen na thoracoabdominale aortachirurgie. Hun oorsprong is multifactorieel. Supracoeliakie aortaklemming veroorzaakt niet direct pulmonale ischemie-reperfusie. Ischemie-reperfusie van de stroomafwaartse viscerale organen veroorzaakt echter een belangrijke systemische ontstekingsreactie. De hypothese van een causaal verband tussen viscerale ischemie-reperfusie en het optreden van letsel op afstand - met name longschade - wordt goed ondersteund. Pulmonale endotheliale disfunctie, een cruciaal onderdeel van het alveolair-capillaire membraan, lijkt centraal te staan bij de ontwikkeling van acuut longletsel (ALI). Een enorme systemische ontstekingsreactie en de activering van neutrofielen spelen een cruciale rol in dit proces.

ALI wordt vaak gedefinieerd op basis van histologische criteria in plaats van klinische presentatie. ALI verwijst naar een acute ontstekingsaandoening die wordt gekenmerkt door de verstoring van de pulmonale, endotheliale en epitheliale barrières. Het alveolair-capillaire membraan, de functionele eenheid van de long, bestaat uit drie componenten: het microvasculaire endotheel, de interstitiële ruimte en het alveolaire epitheel.

Een kenmerk van ALI is de verhoogde permeabiliteit van deze barrière, aangedreven door infiltratie van neutrofielen en het vrijkomen van cytotoxische pro-inflammatoire mediatoren. Alveolaire epitheelschade omvat zowel type I- als type II-pneumocyten. Type I-cellen, die 95% van het alveolaire oppervlak bedekken, zijn zeer gevoelig voor letsel en spelen een sleutelrol bij de gasuitwisseling. Type II-cellen, die talrijker zijn maar een kleiner gebied bestrijken, zijn essentieel voor de productie van oppervlakteactieve stoffen, epitheelherstel en ionentransport. Na letsel dragen type II-cellen bij aan het herstel van de alveolaire integriteit door hun regeneratieve vermogen en differentiatie tot type I-cellen.

Meerdere celdoodroutes zijn betrokken bij epitheelbeschadiging tijdens ALI, waarbij type I-cellen bijzonder kwetsbaar zijn. ALI wordt gewoonlijk beoordeeld door longoedeem te evalueren, met of zonder metingen van microvasculaire permeabiliteit om endotheeldisfunctie weer te geven.

Het doel van dit model is om het verband te onderzoeken tussen viscerale ischemie-reperfusie en de ontwikkeling van longbeschadiging op afstand, zowel op metabool als mechanistisch niveau, zoals geïllustreerd in Figuur 2. Dit specifieke verband blijft slechts gedeeltelijk begrepen. Ons aortaklemmodel vertegenwoordigt een visceraal ischemie-reperfusiescenario op een gezonde aorta, zonder de aanwezigheid van een abdominaal aorta-aneurysma bij ratten. Boven de coeliakiestam zijn er geen grote takken bij mensen of ratten. De aorta boven dit niveau komt overeen met de supra-cœliac aorta, die alleen aanleiding geeft tot kleine pariëtale takken die de thoracale wand voeden. Daarom is er geen significant verschil in de vasculaire anatomie van de belangrijkste bloedvaten op dit niveau tussen mensen en ratten.

Het gebruik van dit model maakt uitgebreide verkenning mogelijk. Het zal helpen bij het identificeren van vroege biomarkers bij de ontwikkeling van weefselbeschadiging op afstand. Bovendien maakt dit model de studie mogelijk van potentiële remmers, waaronder remmers van circulerende mediatoren of remmers van specifieke verwondingen aan afgelegen organen.

Andere ischemie-reperfusiemodellen worden gebruikt om verwondingen op afstand te bestuderen. Cerebrale, intestinale en renale ischemie-reperfusiemodellen zijn sterk vertegenwoordigd 8,9,10. Er is uitgebreid onderzoek gedaan naar longschade na intestinale ischemie-reperfusie als gevolg van voorbijgaande occlusie van de superieure mesenteriale slagader (SMA)11,12,13. Ischemie en reperfusieduur zijn zeer variabel, variërend van minuten tot enkele uren14,15. De grondgedachte voor de duur van ischemie is het induceren van voldoende agressie om een significante reactie op gang te brengen die leidt tot het optreden van verwondingen op afstand. Een te korte duur van ischemie veroorzaakt mogelijk geen significante verandering in de bestudeerde metabole route. Wat de duur van de reperfusie betreft, ligt de grondgedachte in het vroege begin van verwondingen op afstand en de mogelijk voorbijgaande aard van pathofysiologische veranderingen. Een ideale reperfusieduur mag niet te vroeg of te laat zijn om metabole stoornissen adequaat te karakteriseren.

De modellen komen voornamelijk voor bij knaagdieren. Voordelen van knaagdieren zijn onder meer hun kleine formaat, onderhoudsgemak, korte levenscyclus en overvloedige genetische hulpbronnen16. Het gebruik van grote dieren zoals varkens, honden of primaten lijkt niet gerechtvaardigd bij gebrek aan extra voordelen, wat in overeenstemming is met de ethische regels voor dierproeven met betrekking tot verfijning. Bovendien maken knaagdieren, vanwege hun anatomische, fysiologische en genetische gelijkenis met mensen, translationele studies mogelijk16.

Een van de belangrijkste beperkingen van SMA-klemmodellen is dat in de klinische praktijk het begin van de intestinale ischemieperiode niet aanwijsbaar is. Dit maakt extrapolatie naar klinische situaties bij de mens onzekerder. Daarentegen worden tijdens complexe aortachirurgie de ischemie- en reperfusieperioden van verschillende organen duidelijk geïdentificeerd. Bovendien bevinden tijdens supracoeliakie aortaklemming alle onderliggende ingewanden zich in een ischemische periode (spijsverteringskanaal, lever, milt, nieren, bekkenorganen en onderste ledematen). Al deze organen ondergaan het fenomeen ischemie-reperfusie. Omgekeerd zijn modellen van ischemie-reperfusie gericht op een specifiek orgaan (darm, nier, lever, enz.), modellen van aortaklemming en dus van ischemie-reperfusie van meerdere organen met metabole pathofysiologie minder bestudeerd. Evenzo zijn verwondingen op afstand, zoals longlaesies na het afklemmen van de aorta, slecht bestudeerd in termen van metabolisme17,18.

Bestaande aortaklemmodellen zijn voornamelijk gericht op het afklemmen van de abdominale aorta onder de nierslagaders. De beperking van dit model is dat het geen viscerale ischemie-reperfusie induceert. Daarom is het niet mogelijk om een verband aan te tonen tussen viscerale ischemie-reperfusie en mogelijke verwondingen op afstand18,19. Bovendien bestaat er geen in vitro model dat de studie van ischemie-reperfusie door middel van aortaklemmen mogelijk maakt, daarom blijft analyse met behulp van in vivo modellen noodzakelijk.

Daarom vergemakkelijkt dit experimentele model van supra-coeliakie aortaklemming bij ratten een uitgebreid onderzoek naar de pathofysiologische mechanismen en farmacologische interventies gericht op longletsel op afstand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De creatie van dit model voldoet aan de richtlijnen voor de verzorging en experimenten van dieren, evenals aan de Franse en Europese wetgeving. Dit model is gevalideerd in een experimentele dierstudie die werd goedgekeurd door de Regionale Universitaire Ethische Commissie in Normandië, Rouen, Frankrijk (n°APAFIS: #18974).

1. Diermodel en acclimatisatie

  1. Aanpassingsperiode diermodel
    OPMERKING: Het model voldoet aan de principes van verfijning.
    1. Huisvesting van dieren in niet-overvolle faciliteiten gedurende een week om aanpassing vóór de operatie mogelijk te maken.
    2. Huisvest de ratten twee per kooi met ad libitum toegang tot water en voedsel, die dagelijks worden gecontroleerd door ervaren personeel.
    3. Controleer dagelijks de netheid van het beddengoed (papieren strips) en vervang het systematisch door ervaren personeel, twee keer per week of indien nodig meer.
    4. Na een acclimatisatieperiode van een week, waarin ze dagelijks contact hebben met de onderzoeker en worden blootgesteld aan 12-uurs verlichtingscycli, vinden de procedures plaats in een aparte, stille ruimte met dezelfde onderzoeker.
  2. Diermodelsoorten
    1. Gebruik mannelijke Wistar- of Sprague Dawley-ratten om hormonale invloeden, zoals oestradiol, te vermijden op de analyse van viscerale ischemie-reperfusiefysiopathologie van een geaccrediteerde en gecertificeerde fokkerij11,20.
    2. Bepaal vooraf de proefgroepen en het aantal dieren per groep.
    3. Kies de leeftijd, ratten van 6-10 weken oud (350 g) worden aanbevolen voor gebruik.

2. Anesthesie en analgesie

  1. Analgesie
    1. Weeg elk dier op de dag van de ingreep.
    2. Buprenorfine (0,05 mg/kg) subcutaan toedienen ter hoogte van de huid van de ratten 1 uur voor de ingreep voor pijnstillende doeleinden met een naald van 25 G en een spuit van 2 ml.
    3. Breng lidocaïne hydrochloride gel 1% aan op de huid van de buik ter hoogte van de toekomstige huidincisie. Beoordeel de pijn regelmatig (minstens twee keer per dag) postoperatief met behulp van een schaal om de gezichtsuitdrukkingen van pijn bij de rat te beoordelen21.
    4. Dien gedurende de eerste 24 uur elke 8 uur systematische subcutane injecties met buprenorfine (0,01 tot 0,05 mg/kg) toe.
    5. Dien vervolgens buprenorfine-injecties toe (0,01 tot 0,05 mg/kg) op basis van de aangezichtspijnschaal van het National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research, en herhaal indien nodig elke 8 uur21.
  2. Algemene anesthesie
    1. Gebruik gehalogeneerde gassen (isofluraan) voor algemene anesthesie22.
    2. Gebruik een geventileerde kamer met isofluraan (5 %) bij een luchtdebiet van 2 l/min gedurende 2 minuten voor de inductiefase.
    3. Voor het behoud van de anesthesie schakelt u de rat over op een op maat gemaakt masker voor spontane beademing met isofluraan (2-2,5%) met een luchtdebiet van 2 l/min tijdens de operatie.
    4. Maak de bovenste luchtwegen vrij door de tong uit de mondholte te bewegen om ventilatie via het masker mogelijk te maken.
    5. Controleer continu de anesthesiediepte tijdens de procedure en pas de isofluraanconcentratie indien nodig aan.

3. Ratten plaatsen tijdens de ingreep

  1. Plaats de rat in dorsale lighouding met de voorste en achterpoten geïmmobiliseerd met plakband, met inachtneming van het fysiologische bewegingsbereik van de rat.
  2. Plaats de rat op een warmhoudkussen dat is ingesteld op 37 °C en controleer de rectale temperatuur.
  3. Bescherm de ogen door dacryogel aan te brengen. Scheer de buikvacht en desinfecteer de buik grondig met povidon-jodiumoplossing.

4. Chirurgische ingreep

  1. Toestand van de chirurgische ingreep
    1. Voer de procedure uit onder een microchirurgische loep om delicate manoeuvres te vergemakkelijken, hoewel dit niet onmisbaar is.
  2. Incisie
    1. Na palpatie van het processus xiphoid aan de bovenrand van de incisie, snijdt u de huid in het midden van de buik in, waardoor de linea alba van de buikspieren zichtbaar wordt.
    2. Centreer incisie van de buikspier op de linea alba om bloedingen uit de buikspieren te voorkomen.
  3. Intra-abdominale expositie
    1. Onderhoud de buikwand aan beide zijden met zelfborgende oprolmechanismen.
    2. Zorg voor de afwezigheid van anomalieën (tumoren), mobiliseer de ingewanden, maag, milt en lever naar de rechterkant van de buik en leg vervolgens de aorta supra-coeliakie bloot.
    3. Houd alle ingewanden zoveel mogelijk in de buik door een klein kompres dat in de lengte is gevouwen en gedrenkt in een warme (37 °C) zoutoplossing.
    4. Bedek alle ingewanden met een kompres gedrenkt in een zoutoplossing die is verwarmd tot 37 °C, om onderkoeling en uitdroging te voorkomen.
  4. Identificatie van belangrijke intra-abdominale bloedvaten
    1. Identificeer de supracoeliakie aorta aan de hand van zijn pulsaties en zijn locatie tussen de middenrifpijlers.
    2. Controle van de aorta tussen de middenrifpilaren met zachte en zorgvuldige dissectie met behulp van applicators met wattenstaafjes en een ontleedtang om de aorta zo atraumatisch mogelijk los te maken.
    3. Omcirkel de supra-coeliakie aorta met behulp van een 5-0 monofilament hechtdraad met een dissectie- en ligatuurtang.
    4. Controleer de oorsprong van de coeliakie stam en de onderliggende mesenteriale slagader. De duur van deze chirurgische ingreep is 10 tot 15 minuten per rat.
    5. De onderliggende identificatie van de subrenale inferieure vena cava is eenvoudig dankzij de transparantie van het retroperitoneum.
    6. Laat de subrenale inferieure vena cava alleen op het voorste oppervlak los, waardoor directe intraveneuze toediening van een farmacologisch middel mogelijk is.
  5. Intraveneuze injectie
    1. Gebruik hiervoor een naald van 30 G voor injectie en plaats een paar millimeter hemostatisch kompres om hemostase te bereiken.
    2. Als u farmacologische preconditionering uitvoert, dien dan de injectie toe vóór het afklemmen van de aorta. Voor een behandeling na de conditionering dient u het toe tijdens of na het afklemmen van de aorta.
    3. Dit protocol bestudeerde farmacologische preconditionering, dus 5 minuten voor het afklemmen van de aorta toedienen.
  6. Ischemische periode
    1. Klem de coeliakie aorta vast met een atraumatische microvasculaire klem gedurende de gehele ischemische periode van 40 minuten. Controleer de effectiviteit van de klem door het verdwijnen van de onderliggende aortapulsaties en het meerdere keren verkleuren van de ingewanden en ledematen tijdens het afklemmen.
    2. Sluit de buik gedeeltelijk af met drie eenvoudige 5-0 gevlochten resorbeerbare hechtingen om water- en warmteverlies te beperken. Bedek de chirurgische incisie met een steriel kompres gedrenkt in een warme zoutoplossing voor de gehele duur van ischemie.
  7. Reperfusie periode
    1. Aan het einde van de ischemische periode wordt de buik weer geopend en wordt de aorta blootgelegd op dezelfde manier als eerder beschreven.
    2. Verwijder de vasculaire klem en controleer of de onderliggende aortapulsatiliteit wordt hervat en of de ingekleuring van de ingewanden en ledematen wordt verkleurd. De reperfusieperiode begint onmiddellijk na het verwijderen van de microklem.
  8. Buik sluit zich
    1. Breng de ingewanden terug naar hun oorspronkelijke positie en sluit de buik met een 5-0 gevlochten resorbeerbare hechtdraad op de linea alba en de huid met een 5-0 monofilament resorbeerbare hechtdraad.
  9. Dieren ontwaken
    1. Plaats de rat in een linker laterale decubituspositie om te voorkomen dat de inferieure vena cava wordt samengedrukt door de viscerale massa en de context van hypovolemie. Plaats de rat in een individuele kooi met een warmtelamp om de temperatuur op peil te houden tot hij ongeveer 10 minuten later wakker wordt.
  10. Tweede algemene anesthesie
    1. Aan het einde van de reperfusieperiode van 180 minuten verdooft u de rat met dezelfde gasanesthesie door een geventileerde kamer met isofluraan (5%) met een luchtdebiet van 2 l/min gedurende 2 minuten voor de inductiefase.
    2. Voor het behoud van de anesthesie schakelt u de rat over op een op maat gemaakt masker voor spontane beademing met isofluraan (2-2,5%) met een luchtdebiet van 2 l/min gedurende de weefselverzamelingsperiode.

5. Bemonstering

  1. Bloedmonsters
    1. Verzamel bloedmonsters met behulp van een naald van 23 G en een spuit van 5 ml door middel van directe punctie in de inferieure vena cava onder de nieraderen.
    2. Bereik hemostase na punctie door een klein stukje hemostatisch kompres aan te brengen.
    3. Gebruik een kleine hoeveelheid (100 μL) van het totale bloed voor gas- en standaard bloedanalyse op een enkele testkaart voor kamertemperatuur.
    4. Verzamel het resterende volbloed in een EDTA-buisje van 4 ml en centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 1.000 × g bij +4 °C.
    5. Bevor het plasma in cryobuisjes in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C tot analyse.
  2. Weefselmonsters
    1. Weefselbemonstering
      1. Verzamel weefselmonsters (long, darm, nier, lever en hart) tijdens de euthanasie van het dier. Voer euthanasie uit door bloedafname die leidt tot verbloeding na algehele anesthesie met isofluraan volgens hetzelfde protocol als eerder vermeld.
      2. Oogst via de open buik 50 mg van elk weefsel: de bovenpool van de linker nier, de linker leverkwab en de distale dunne darm 1 cm voor de blindedarm.
      3. Voer vervolgens snel een mediane sternotomie uit om het hart en de longen te identificeren.
      4. Maak de linkerlong vrij van zijn ligament en verwijder deze volledig voor histologische analyse. Bevrijd de rechter multilobische long van zijn ligamenten. Scheid de voorkwab voor nucleïnezuur- en eiwitanalyses, bewaar de rest enkele minuten in een kopje met fysiologisch serum bij 37 °C om vervolgens gravimetrie uit te voeren.
      5. Extraheer het hart als een heel blok met delen van de aorta, de longslagader en beide vena cavae. Bemonster een stuk van de linker hartkamer voor nucleïnezuur- en eiwitanalyses, bewaar de rest enkele minuten in een kopje met fysiologisch serum bij 37 °C om vervolgens gravimetrie uit te voeren.
    2. Nucleïnezuur analyse
      1. Verzamel voor nucleïnezuuranalyse onmiddellijk een portie van 50 g weefsel. Vries het in vloeibare stikstof in en bewaar het vervolgens bij -80 °C tot analyse.
      2. Extraheer totaal RNA met kant-en-klaar reagens voor de isolatie van hoogwaardig totaal RNA volgens het protocol van de fabrikant.
      3. Bepaal de RNA-concentratie en -zuiverheid met een spectrofotometer. Meet de RNA-concentratie met behulp van 2 μL monster, met 2 μL RNase-vrij water als blanco referentie. Gebruik de extinctie bij 260 nm om de RNA-concentratie te bepalen.
        OPMERKING: Aanvaardbare RNA-zuiverheid werd gedefinieerd als een absorptieverhouding van 260/280 en 260/230 tussen 1,7 en 2,0.
      4. Gebruik 1 μg van elk RNA-monster voor omgekeerde transcriptie.
      5. Meet de mRNA-niveaus van pro-inflammatoire cytokines (IL-1beta, TNF-alfa, IL-6) en een interne referentie (bèta2-microglobuline), door real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) in een snelle, op platen gebaseerde, thermische blokcycler met geïntegreerde realtime, online detectiemogelijkheden met behulp van kant-en-klare hotstart-reactiemix (primers worden vermeld in tabel 1).
      6. Bereken het relatieve mRNA-niveau met behulp van de 2-ΔΔCT-methode.
    3. Eiwit analyse
      1. Plaats voor eiwitanalyse 50 mg weefsel in een lyseerbuis van 2 ml met vijftig keramische korrels van 2,8 mm zirkoniumoxide. Deze lysingbuis bevat 1 ml radioimmunoprecipitatietest (RIPA) lysisbuffer met een proteaseremmertablet en een fosfataseremmertablet.
      2. Extraheer eiwit uit de monsters door homogenisatie op de laboratoriumbuizenmolen met 3 herhalingen van 5-s controle, gevolgd door een rustperiode van 10 s.
      3. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 10.000 g bij +4 °C en bewaar de bovenstaande middelen in cryobuisjes bij -20 °C tot analyse.
      4. Bepaal de eiwitconcentraties met een eiwittest volgens de Bradford-methode en bewaar de monsters bij -80 °C.
      5. Scheid een gelijke hoeveelheid eiwitten van elk monster met behulp van SDS-PAGE.
      6. Breng gescheiden eiwitten over op 0,2 μm nitrocellulosemembranen.
      7. Incubeer het membraan na blokkering met 5% TBS-Tween magere droge melk gedurende 1 uur, met een primair antilichaam tegen het specifieke eiwit naar keuze. Gebruik voor het onderzoeken van heparanase bijvoorbeeld een polyklonaal primair antilichaam van konijnen tegen humaan heparanase (verdunning 1:2000) en een controle-eiwit in de vorm van GAPDH, gebruik een monoklonaal primair antilichaam van een geit tegen GAPDH (verdunning 1:5000) 's nachts bij 4 °C.
      8. Was de vlekken drie keer met TBST-Tween 0,1% buffer.
      9. Incubeer met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam gericht tegen het primaire antilichaam bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur in blokkeeroplossing. Om bijvoorbeeld heparanase te onderzoeken, gebruikt u het secundaire antilichaam van de geit tegen konijn (verdunning 1:5000) en om GAPDH te onderzoeken, gebruikt u het secundaire antilichaam van konijn tegen de geit (verdunning 1:10000).
      10. Detecteer de immuuncomplexen met behulp van een verbeterd chemiluminescentie (ECL) detectiesysteem.
      11. Analyseer de membranen met behulp van speciale software om de densitometrische waarden van de doelbanden te bepalen, met behulp van GAPDH als interne controle. Voer een densitometrische analyse uit van de band die overeenkomt met heparanase (50 kDa) en normaliseer deze naar de GAPDH-eiwitband (35 kDa) om de relatieve signaalintensiteit te bepalen.
    4. Histologische analyse
      1. Neem voor histologische analyse de linker unilobaire long bij het hilum en breng vervolgens via de linker hoofdbronchiën een cryopreservatieoplossing met behulp van een 16 G-katheter. Vries het in vloeibare stikstof in en bewaar het bij -80 °C.
    5. Gravimetrie analyse
      1. Na de monsters voor nucleïnezuur- en eiwitanalyse, analyseer het resterende deel van het hart en de rechter multilobulaire long door middel van gravimetrie, met uitdroging in ovens bij 70°C, waardoor de verhouding nat/droog gewicht een schatting van weefseloedeem kan geven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol bleek veilig te zijn, met minimale dierverliezen (minder dan 5%) tijdens anesthesie en operaties, en effectief voor de inductie van acuut longletsel. Anesthesie met isofluraan was veiliger dan ketamine in combinatie met xylazine-anesthesie (verlies ongeveer 15%), met snel ontwaken en beter herstel van ratten (gegevens niet weergegeven). Alle verdoofde dieren konden met deze methode een veilige en effectieve aortaklemming ondergaan. Alle dieren (100%) met een effectieve aorta...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit chirurgische model van aorta-kruisklemming biedt het voordeel dat het een uitgebreide analyse mogelijk maakt, zowel op weefselbasis als op basis van plasma, van het acute longletsel na viscerale ischemie-reperfusie. Het biedt ook de mogelijkheid om farmacologische moleculen te testen met intraperitoneale, enterale of intraveneuze toediening voor of na de conditionering.

Een van de kritieke stappen blijft het afklemmen van de supracoeliakie aorta tijdens de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 µm nitrocellulose membranes Trans-Blot Turbo Transfert PackBio-Rad16201500.2 µm nitrocellulose membranes precut
1cc Luer Slip syringe w/o NeedleTerumoMDSS01SE1cc Luer Slip syringe w/o Needle
2cc Luer Slip syringe w/o NeedleBecton Dinckinson2cc Luer Slip syringe w/o Needle
4 mL EDTA tube BD K3 13 mm x75 mmBD VacutainerBD3688605 mL EDTA tube BD K3 13 mm x 75 mm
5-0 braided suture / Vicryl 5-0 (Ethicon) or Novosyn (B. Braun)Ethicon - Johnson and JohnsonV7970EVicryl 5-0 Needle Taper Point 1/2 circle 13 mm Lenght 45 cm
5-0 monofilament absorbable suture / Monocryil PoliglecaproneEthicon - Johnson and JohnsonY493GNeedle 3/8 circle Lenght 18in
5cc Luer Slip syringe w/o NeedleTerumoSS-05LE15cc Luer Slip syringe w/o Needle
Atraumatic microvascular clamp/Disposable vessel clamps for veinAROSurgicalTKF-1-20gAtraumatic microvascular clamp for vein use in order to clamp the rat aorta
BD Microlance 3 23 G x 1 0.6 x 25 mmBD Vacutainer300800BD Microlance 3 23 G x 1 0.6 x 25 mm
BD Microlance 3 25 G x 5/8 0.5 x 16 mmBD Vacutainer300600BD Microlance 3 25 G x 5/8 0.5 x 16 mm
BD Microlance 3 30 G x 1/2 0.3 x 13 mmBD Vacutainer304000BD Microlance 3 30 G x 1/2 0.3 x 13 mm
beta-actine InvitrogenCarlsbad, USA15G5A11/E2
Bradford-based method protein assayBiorad, Marnes-la-Coquette, France5000201
BuprenorphineBuprenorfine
Centrifugator Sigma 3-30Sigma, Germany10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014Centrifugator voor eppendorf
cOmplete MiniRoche11836153001protease inhibitor cocktail 25 tablets
Cotton swab
Dacryogel /  Ocular gel Lubrithal 10 gDechra Veterinary productsCode ACL7376464Ocular gel Lubrithal 10 g
Disposable scalpelParamountPDSS11Disposable scalpel blade n°11
ElectrocauteryDentRMedEMB/87400Hemostatische pen met hoge temperatuur
Enhanced ECL Detection SystemBiorad, Hercules, California, USA1705060S
Fisherbrand Bead Mill 24Fisher scientific15515799Gebruikt voor  malen, lysis en homogenisatie van biologische monsters voorafgaand aan moleculaire extractie
Gauze swabs Raffin.010106Gauze swabs 
ImageLabTM softwareBioradop USB-drive of licentie
Isoflurane 5%Isoflurane 5%
Lidocaine Prilocaine gel 5% Aguettant, Lyon, FrankrijkLidocaine Prilocaine gel 5% 
LightCycler 480 InstrumentRoche, Bâle, Zwitserland5015243001thermocyclus
Lubricating Jelly Sterile K-Y 82 gRECKITT BENCKISERLubricating Jelly Sterile K-Y 82 g
NanoDrop 2000TermoScientific, Waltham, Massachusetts, USAND-2000spectrofotometer
Peha Pince anatomicHartmann991063Anatomische pincet
PhosSTOPRoche4906837001fosfatase-remmer 20 tablet 
Plaster/Adhesive TapeAnapore135320Chirurgisch kleefpleister/pleister
Povione-iodine solution / Vétédine SolutionVétoquinolAntiseptische oplossing voor uitwendig gebruik
Precellys Lysing Kit tube Hard tissue homogenizing CK28, BertinCK28Precellys Lysing Kit tube 
Prolène Prolypropylene sutureEthicon - Johnson and Johnson7472HProlène 5-0 Needle Taper cut 3/8 circle 13 mm Lenght 75 cm
Safe-Lock tubes 1.5 mLEppendorf.0030120086Safe-Lock tubes 1.5cc zonder kleur 1000 tubes voor centrifugatie
Safe-Lock tubes 2 mLEppendorf.0030120094Safe-Lock tubes 2.0cc zonder kleur 1000 tubes voor centrifugatie
Safe-Lock Tubes 5 mLEppendorf.0030119401Safe-Lock tubes 5.0cc zonder kleur 200 tubes voor centrifugatie
Saline solution NaCl 0,9%Aguettant, Lyon, Frankrijk600502Zoutoplossing 0,9% 500 mL
SDS-PAGESigma-Alrich
Surflash IV Catheter 16 GTerumoSR*FF1651
SurgicelEthicon - Johnson and JohnsonHemostatische resorbeerbare tampons
Suture set n°12Hartmann4701762Steriele hechtset met adhesine-champ, schaar, Adson-pincet, naaldhouder
SYBR Green KIT Light Cycler 480 SYBR Green I MasternRoche4707516001SYBR Green
TBST-Tween 0.1% buffer Sigma-Alrich
Test-Cards Epoc 24 cards 13 parametersSiemens-Healthineers
Tissue TEKSakura FinetecCryopreserveringsoplossing 
TRIzol reagent InvitrogenThermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA

Referenties

  1. Johnston, K. W., Rutherford, R. B., Tilson, M. D., Shah, D. M., Hollier, L., Stanley, J. C. Suggested standards for reporting on arterial aneurysms. Subcommittee on Reporting Standards for Arterial Aneurysms, Ad Hoc Committee on Reporting Standards, Society for Vascular Surgery and North American Chapter, International Society for Cardiovascular Surgery. J Vasc Surg. 13 (3), discussion 245-247 452-458 (1991).
  2. Johansen, K., Kohler, T. R., Nicholls, S. C., Zierler, R. E., Clowes, A. W., Kazmers, A. Ruptured abdominal aortic aneurysm: the Harborview experience. J Vasc Surg. 13 (2), 245-247 (1991).
  3. Cambria, R. P., Clouse, W. D., Davison, J. K., Dunn, P. F., Corey, M., Dorer, D. Thoracoabdominal aneurysm repair: Results with 337 operations performed over a 15-year interval. Ann Surgery. 236 (4), 471-479 (2002).
  4. Feezor, R. J., et al. Genomic and proteomic determinants of outcome in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. J Immunol. 172 (11), 7103-7109 (2004).
  5. Welborn, M. B., et al. The relationship between visceral ischemia, proinflammatory cytokines, and organ injury in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Crit Care Med. 28 (9), 3191-3197 (2000).
  6. Money, S. R., et al. Risk of respiratory failure after repair of thoracoabdominal aortic aneurysms. Am J Surg. 168 (2), 152-155 (1994).
  7. Collange, O., et al. Compartmentalization of inflammatory response following gut ischemia reperfusion. Eur J Vasc Endovasc Surg. 49 (1), 60-65 (2015).
  8. Shi, Y., Han, L., Zhang, X., Xie, L., Pan, P., Chen, F. Selenium alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury by regulating oxidative stress, mitochondrial fusion and ferroptosis. Neurochem Res. 47 (10), 2992-3002 (2022).
  9. Wang, Q., et al. Empagliflozin protects against renal ischemia/reperfusion injury in mice. Sci Rep. 12 (1), 19323(2022).
  10. Wu, M. -B., Ma, B., Zhang, T. -X., Zhao, K., Cui, S. -M., He, S. -C. Propofol improves intestinal ischemia-reperfusion injury in rats through NF-κB pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 24 (11), 6463-6469 (2020).
  11. Breithaupt-Faloppa, A. C., et al. Acute effects of estradiol on lung inflammation due to intestinal ischemic insult in male rats. Shock. 41 (3), 208-213 (2014).
  12. Klausner, J. M., et al. Thromboxane A2 mediates increased pulmonary microvascular permeability following limb ischemia. Circ Res. 64 (6), 1178-1189 (1989).
  13. James, I. A. O., Chen, C. -L., Huang, G., Zhang, H. -Y., Velten, M., Besner, G. E. HB-EGF protects the lungs after intestinal ischemia/reperfusion injury. J Surg Res. 163 (1), 86-95 (2010).
  14. Kannan, K. B., et al. Hypoxia-inducible factor plays a gut-injurious role in intestinal ischemia reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (5), G853-G861 (2011).
  15. Li, Y., et al. Enteral supplementation of alanyl-glutamine attenuates the up-regulation of beta-defensin-2 protein in lung injury induced by intestinal ischemia reperfusion in rats. Int J Surg. 12 (11), 1181-1186 (2014).
  16. Bryda, E. C. The mighty mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
  17. Palmier, M., et al. A supraceliac aortic cross clamping model to explore remote lung injury and the endothelial glycocalyx. Ann Vasc Surg. 93, 18-28 (2022).
  18. Ak, E., Ak, K., Ustandag, U. V., Kervancioglu-Demirci, E., Emekli-Alturfan, E., Çetinel, S. Milrinone attenuates heart and lung remote injury after abdominal aortic cross-clamping. Ann Vasc Surg. 69, 391-399 (2020).
  19. Kurt, A., Kalkan, Y., Turut, H., Cure, M. C., Tumkaya, L., Cure, E. Topiramate reduces aortic cross-clamping-induced lung injury in male rats. Acta Medica (Hradec Kralove). 61 (4), 144-149 (2018).
  20. Fantozzi, E. T., et al. Estradiol mediates the long-lasting lung inflammation induced by intestinal ischemia and reperfusion. J Surg Res. 221, 1-7 (2018).
  21. Sotocina, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55(2011).
  22. Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
  23. Annecke, T., et al. Sevoflurane preserves the endothelial glycocalyx against ischaemia-reperfusion injury. Brit J Anaesth. 104 (4), 414-421 (2010).
  24. Pararajasingam, R., Weight, S. C., Bell, P. R. F., Nicholson, M. L., Sayers, R. D. Pulmonary nitric oxide metabolism following infrarenal aortic cross-clamp-induced ischaemia-reperfusion injury. Eur J Vasc Endovasc Surg. 19 (1), 47-51 (2000).
  25. Nielsen, V. G., Baird, M. S., McAdams, M. L., Freeman, B. A. Desflurane increases pulmonary alveolar-capillary membrane permeability after aortic occlusion-reperfusion in rabbits: evidence of oxidant-mediated lung injury. Anesthesiology. 88 (6), 1524-1534 (1998).
  26. Axon, R. N., Baird, M. S., Lang, J. D., Brix, A. E., Nielsen, V. G. PentaLyte decreases lung injury after aortic occlusion-reperfusion. Am J Respir Crit Care Med. 157 (6), 1982-1990 (1998).
  27. Fujimura, N., et al. Neutrophil elastase inhibitor improves survival rate after ischemia reperfusion injury caused by supravisceral aortic clamping in rats. J Surg Res. 180 (1), e31-e36 (2013).
  28. Spanos, K., et al. Transition from open repair to endovascular aneurysm repair for rupture aortic aneurysms throughout a 16-year period of time in a single tertiary center. Ann Vasc Surg. 100, 120-127 (2024).
  29. Hansen, L. W., et al. Sirtuin1 activator SRT1720 protects against organ injury induced by intestinal ischemia-reperfusion. Shock. 45 (4), 359-366 (2016).
  30. Thais Fantozzi, E., et al. Acute lung injury induced by intestinal ischemia and reperfusion is altered in obese female mice. Pulm Pharmacol Ther. 49, 54-59 (2018).
  31. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society Workshop report: Features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol. 44 (5), 725-738 (2011).
  32. Michel, J. -B., et al. Novel aspects of the pathogenesis of aneurysms of the abdominal aorta in humans. Cardiovasc Res. 90 (1), 18-27 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Chirurgisch ratmodelsupra-coeliacale aortapulmonale ontstekingbloedgasanalyselonghistologielongoedeemneutrofiele infiltratie
Een model van acuut longletsel na viscerale ischemie-reperfusie door supracoeliakie aortakruisklemming bij ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.