Methodenartikel

Verbeterde extractie van DNA met een laag moleculair gewicht uit afvalwater voor uitgebreide beoordeling van antimicrobiële resistentie

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/66899

⸱

19 juli 2024

 ,  ,  ,  , 
1Ashoka University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een eenvoudige techniek om antimicrobiële resistentie in het milieu (AMR) te beoordelen door het aandeel extracellulair DNA met een laag moleculair gewicht te verbeteren. Voorafgaande behandeling met 20%-30% PEG en 1,2 M NaCl maakt detectie van zowel genomische als horizontaal overgedragen AMR-genen mogelijk. Het protocol leent zich voor een kit-vrij proces met extra optimalisatie.

Samenvatting

Milieutoezicht wordt erkend als een belangrijk instrument voor het beoordelen van de volksgezondheid in het post-pandemische tijdperk. Water, in het bijzonder afvalwater, is naar voren gekomen als de bron bij uitstek om pathogene ladingen in het milieu te bemonsteren. Afvalwater van open rioleringen en gemeenschappelijke waterzuiveringsinstallaties is een reservoir van zowel ziekteverwekkers als genen voor antimicrobiële resistentie (AMR) en komt vaak in contact met mensen. Hoewel er veel methoden zijn om AMR uit water te volgen, blijft het een uitdaging om DNA van goede kwaliteit met hoge opbrengsten te isoleren uit heterogene monsters. Om dit te compenseren moeten de monstervolumes vaak hoog zijn, wat praktische beperkingen met zich meebrengt. Bovendien is omgevings-DNA vaak gefragmenteerd en bestaan de bronnen van AMR (plasmiden, fagen, lineair DNA) uit DNA met een laag moleculair gewicht. Toch zijn er maar weinig extractieprocessen die zich hebben gericht op methoden voor extractie met een hoge opbrengst van lineair DNA en DNA met een laag moleculair gewicht. Hier wordt een eenvoudige methode gerapporteerd voor lineaire DNA-extractie met hoog rendement uit kleine hoeveelheden afvalwater met behulp van de precipitatie-eigenschappen van polyethyleenglycol (PEG). Deze studie pleit voor het verhogen van de totale DNA-opbrengst van watermonsters die zijn verzameld voor metagenomische analyses door het aandeel lineair DNA te verrijken. Bovendien overwint het verbeteren van DNA met een laag moleculair gewicht het huidige probleem van onderbemonstering van AMR in de omgeving als gevolg van een focus op DNA met een hoog moleculair gewicht en intracellulair DNA. Verwacht wordt dat deze methode vooral nuttig zal zijn wanneer extracellulair DNA bestaat, maar in lage concentraties, zoals bij afvalwater van zuiveringsinstallaties. Het moet ook de milieubemonstering van AMR-genfragmenten die zich verspreiden via horizontale genoverdracht verbeteren.

Inleiding

SARS-CoV-2 en de nasleep ervan onderstreepten het belang van milieutoezicht bij het monitoren en voorspellen van uitbraken van infectieziekten 1,2. Hoewel virale pandemieën duidelijk zijn, wordt de opkomst van antimicrobiële resistentie (AMR) vaak beschreven als een verraderlijke pandemie en een die wereldwijd een belangrijk probleem voor de volksgezondheid vormt 3,4. Er is dan ook dringend behoefte aan gecoördineerde strategieën om de evolutie en verspreiding van AMR te begrijpen. Waterlichamen, evenals afvalwater, kunnen dienen als reservoirs voor zowel ziekteverwekkers als AMR 5,6,7,8. Gedeelde waterbronnen zijn daarom een krachtige bron van ziekteoverdracht onder mensen, met name in lage- en middeninkomenslanden (LMIC) waar slechte hygiëne en overbevolking hand in hand gaan 9,10,11. Het testen van waterbronnen wordt al lang gebruikt om de gezondheid van de gemeenschap te beoordelen 12,13,14. Onlangs bleek afvalwater van stedelijke rioolwaterzuiveringsinstallaties een goede vooruitindicator van COVID-gevallen in de kliniek 1,2,15,16,17,18.

Vergeleken met het monitoren van specifieke ziekten, vormt het detecteren en volgen van AMR in de omgeving een complexer probleem. Het grote aantal antibiotica dat wordt gebruikt, de diverse resistentiegenen, de verschillende lokale selectiedrukken en de horizontale genoverdracht tussen bacteriën maken het moeilijk om de werkelijke AMR-belasting te beoordelen en, eenmaal beoordeeld, te correleren met klinische observaties 19,20,21,22. Als gevolg hiervan wordt er door verschillende organisaties over de hele wereld gecoördineerd toezicht op klinische AMR uitgevoerd 3,23,24, maar staat de monitoring van AMR in het milieu nog in de kinderschoenen, beoordeeld in 19,25,26.

In de afgelopen jaren zijn verschillende methoden voor het volgen van AMR in het milieu gerapporteerd 5,27, beoordeeld in28,29. Het uitgangspunt van de meeste hiervan is de extractie van DNA van goede kwaliteit uit heterogene omgevingsmonsters, op zich al een uitdaging. Bovendien is het DNA in de omgeving meestal gefragmenteerd vanwege blootstelling aan een vijandige omgeving. Gefragmenteerd extracellulair DNA wordt al lang erkend als een belangrijk reservoir van AMR-genen (besproken in 30,31,32), met het extra potentieel om bacteriën binnen te komen en te verlaten via horizontale genoverdracht. Daarom is het belangrijk dat elk protocol dat tot doel heeft de AMR-belasting in het milieu te meten, zo goed mogelijk lineair DNA met een laag moleculair gewicht bemonstert. Verrassend genoeg is er weinig aandacht besteed aan het ontwikkelen van methoden die specifiek zijn voor extractie met hoge opbrengst van lineair DNA en DNA met een laag moleculair gewicht: dit werk richt zich op het aanpakken van de kloof.

Een veelgebruikte en eenvoudige methode om DNA neer te slaan is het combineren van polyethyleenglycol (PEG) en zouten zoals natriumchloride (NaCl)33. PEG is een macromoleculair verdringingsmiddel dat wordt gebruikt om groottespecifieke precipitatie van DNA-fragmentente bereiken 34,35. Hoe lager de PEG-concentratie, hoe hoger het molecuulgewicht van DNA dat efficiënt kan worden neergeslagen. Veel studies hebben PEG gebruikt tijdens milieu-extractie van DNA en RNA 1,2 (samengevat in Tabel 1 17,33,36,37,38,39) hetzij in de laatste stap 33,36,37 of om grote watermonsters te concentreren voor extractie van virale deeltjes zoals bij SARS-CoV-2 15,40. In het huidige werk wordt vastgesteld dat de PEG-concentraties die eerder werden gebruikt voor DNA-extracties in het milieu (grotendeels bepaald door virale surveillanceprotocollen) geen lineair DNA met een laag moleculair gewicht vastleggen. Daarom verliezen ze het bemonsteren van korte DNA-fragmenten en zijn ze ongeschikt om het AMR-gehalte nauwkeurig te beoordelen. Deze studie heeft de eigenschappen van polyethyleenglycol en natriumchloride benut om lineaire DNA-fragmenten met een laag moleculair gewicht effectief neer te slaan met een hoge opbrengst die in de toekomst kan leiden tot een kosteneffectieve DNA-extractiemethode. Deze methode kan worden gebruikt om het aandeel gefragmenteerd DNA met een laag moleculair gewicht uit complexe natuurlijke monsters te verrijken, waardoor een nauwkeuriger beeld wordt verkregen van AMR in het milieu. Met een beetje verdere verfijning leent de techniek zich voor een gemakkelijke en goedkope toepassing door lokale gemeentelijke bedrijven en andere overheidsinstanties om te gebruiken als bewakingsinstrument met minimale technische training.

Protocol

1. Bemonstering van afvalwater

  1. Dompel een bekerglas van 500 ml polypropyleen in het reservoir van de open afvoer of rioolwaterzuiveringsinstallatie (STP) en verzamel ~300 ml afvalwatermonster.
  2. Breng ~250 ml van het monster over in een geautoclaveerde polypropyleen fles van 250 ml.
  3. Schroef de dop van de fles erop en sluit deze af met een plastic folie. Houd de fles rechtop in een gesloten zak.
  4. Transporteer het monster rechtop in een gesloten container bij kamertemperatuur.
  5. Verhit het monster bij 70 °C in een heteluchtoven gedurende 4 uur voordat u het verwerkt voor DNA-extractie.

2. DNA-extractie uit afvalwatermonsters

  1. Zodra het afvalwatermonster is afgekoeld, wervelt u de monsters op maximale snelheid en laat u het puin/slib bezinken.
  2. Decanteer 27,5 ml afvalwater in centrifugebuisjes van 50 ml en voeg er 13,5 g PEG-8000 (eindconcentratie 30%) en 3 g NaCl (eindconcentratie 1,2 M) aan toe en meng goed tot het volledig is opgelost.
  3. Incubeer het monster een nacht (~16-18 uur) bij 4 °C.
  4. Centrifugeer het monster bij 15.500 x g bij 4 °C gedurende 30 minuten.
  5. Gooi het supernatant weg.
    OPMERKING: PEG-8000 bij 30% is zeer stroperig en de pellet kan losraken tijdens het weggooien van het supernatant. Het supernatans moet langzaam en voorzichtig worden gedecanteerd om ervoor te zorgen dat de pellet niet verloren gaat. Stappen 2.6 tot 2.23 worden uitgevoerd met behulp van de bodem-DNA-extractiekit volgens de instructies van de kit met enkele aanpassingen.
  6. Los de pellet op in 800 μL van de lysisoplossing van de kit en voeg de oplossing toe aan de gemengde zirkoniumparelbuis.
    OPMERKING: Als u grotere volumes verwerkt, bundelt u de pellets uit het gewenste aantal buizen. Als u bijvoorbeeld 160 ml monster verwerkt; er komen vier buisjes van 50 ml met afvalwater met PEG en NaCl. Na het centrifugeren van alle vier de buisjes bij 15.500 x g bij 4 °C gedurende 30 min, gooi het supernatant van alle vier de buisjes weg. Voeg aan elk 200 μL CD1-oplossing toe, suspendeer de pellets opnieuw en voeg ze samen in één parelbuis.
  7. Zet de hielbuis horizontaal vast op een draaikolk. Draai de buis 20-30 minuten op maximale snelheid.
    OPMERKING: Langdurige vortexen zorgen voor volledige lysis en homogenisatie van de monsters, wat de DNA-opbrengst verbetert.
  8. Draai de buisjes gedurende 15 s rond op 8.000 x g om de korrels op de bodem te laten bezinken, verwijder het schuim en breng het supernatans volledig over van de buis naar een microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Sommige kralen kunnen tijdens deze stap ook worden overgedragen.
  9. Centrifugeer het supernatans op 15.000 x g gedurende 1 min.
  10. Breng het supernatans over in een schone microcentrifugebuis van 2 ml. Het supernatans kan nog enkele zwevende deeltjes bevatten.
  11. Voeg 200 μL neerslagoplossing toe en draai gedurende 5 s op maximale snelheid. Incubeer bij 4 °C gedurende 5 min.
    OPMERKING: Incubatie bij 4 °C verhoogt de efficiëntie van de precipitatie van eiwitten en cellulair afval terwijl DNA in oplossing blijft. Het is mogelijk om het protocol bij deze stap tot 2 uur te pauzeren zonder een significante afname van de opbrengst en kwaliteit van het geëxtraheerde DNA.
  12. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT). Vermijd de pellet en breng het heldere supernatans over in een schone microcentrifugebuis van 2 ml.
  13. Voeg 600 μL bindingsbuffer toe per 700 μL supernatans en vortex met maximale snelheid gedurende 5 s.
  14. Laad 700 μL van het lysaat op een silica-spinkolom, incubeer gedurende 2 minuten en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 15.000 x g .
    OPMERKING: Incubatie van lysaat op de silicakolom verbetert de binding van DNA aan de kolom, wat resulteert in een betere DNA-opbrengst.
  15. Gooi de doorstroming weg en herhaal stap 2.14 totdat al het lysaat door de spinkolom is gegaan.
  16. Plaats de centrifugekolom voorzichtig in een schone opvangbuis van 2 ml. Zorg ervoor dat er geen doorstroming op de centrifugekolom wordt gespetterd.
  17. Voeg 500 μL wasbuffer toe aan de centrifugekolom en centrifugeer de centrifugeerkolom op 15.000 x g gedurende 1 min.
  18. Gooi de doorstroom weg en plaats de centrifugekolom terug in dezelfde opvangbuis van 2 ml.
  19. Voeg 500 μL ethanolwasbuffer toe aan de centrifugekolom. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 min.
  20. Gooi de doorstroom weg en plaats de centrifugekolom in een nieuwe opvangbuis van 2 ml.
  21. Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 2 minuten om de resterende ethanol te verwijderen. Plaats de centrifugekolom in een nieuw buisje van 1,5 ml.
  22. Voeg 100 μL elutiebuffer (voorverwarmd tot 55 °C) toe aan het midden van het witte filtermembraan en incubeer gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Verwarmde elutiebuffer, samen met incubatie op het membraan, verhoogt de efficiëntie van DNA-elutie, met name DNA met een hoog moleculair gewicht.
  23. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 min. Gooi de spinkolom weg.
  24. Voeg aan het geëlueerde DNA 10 μL 3 M NaCl (1/10 volume DNA-eluaat) en 250 μL gekoelde absolute ethanol (2,5 volume DNA-eluaat) toe. Keer om om goed te mengen en draai de inhoud gedurende 15 s af op 8.000 x g .
  25. Incubeer het DNA-ethanolmengsel bij -20 °C gedurende ten minste 1 uur.
    OPMERKING: De incubatie van het DNA-ethanolmengsel kan worden verhoogd tot 16 uur zonder een significante afname van de opbrengst of kwaliteit van het geëxtraheerde DNA.
  26. Centrifugeer bij 19.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min. Gooi het supernatans weg door te decanteren.
  27. Voeg 500 μL gekoelde 70% ethanol toe aan de pellet.
  28. Centrifugeer bij 19.000 x g bij 4 °C gedurende 15 min. Gooi het supernatans weg door te decanteren.
  29. Keer de buis om en tik zachtjes op tissuepapier om de resterende ethanol te verwijderen door capillaire werking.
  30. Droog de DNA-pellet volledig door de buisjes 5-10 minuten open te houden op een verwarmingsblok bij 37 °C tot alle ethanol is verdampt.
  31. Resuspendeer de DNA-pellet in 30-50 μl geautoclaveerd dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Incubeer bij 37 °C gedurende 5-10 min.
  32. Draai het DNA af op 8.000 x g gedurende 15 s.
  33. Selecteer de dsDNA-toepassing onder de instellingen voor nucleïnezuren in een Nanodrop-spectrofotometer.
    1. Reinig het voetstuk met pluisvrij tissuepapier en water. Gebruik ddH2O om het instrument leeg te maken en laad vervolgens 2 μL van het DNA-monster op het voetstuk.
    2. Meet de concentratie- en absorptieverhoudingen (A260/280 en A260/230) om de zuiverheid te bepalen.
  34. Bewaar het DNA-monster bij -20 °C.

3. Precipitatie van polymerasekettingreactie (PCR)-geamplificeerd lineair DNA om DNA-herstel over een reeks molecuulgewichten te controleren

  1. Gebruik genoom-DNA van E. coli MG155 om genfragmenten te amplificeren met PCR om een pool van lineaire fragmenten te genereren van de volgende genen: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (zie tabel 2 voor primersequenties en PCR-omstandigheden).
  2. Zuiver de PCR-producten met behulp van de PCR-zuiveringskit en voeg de PCR-producten samen.
  3. Verdeel de gepoolde amplicons in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml met gelijke volumes - label één buisje als 'Input DNA'.
  4. Voeg PEG en NaCl toe volgens de gewenste omstandigheden (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) aan elk van de buisjes, behalve die met het label 'Input DNA', en vul het uiteindelijke volume aan tot 1 ml.
  5. Incubeer de buisjes een nacht (~16-18 uur) bij 4 °C.
    LET OP: Voor de rest van de stappen tot 3.16 blijft 'Input DNA' ongewijzigd in de koelkast.
  6. Draai de buisjes in een tafelmodel microcentrifuge volgens de gewenste snelheid (15.000 x g of 20.000 x g) gedurende 1 uur bij 4 °C.
  7. Verwijder voorzichtig 900 μl van het supernatans van de kant tegenover de pellet met behulp van een micropipet.
  8. Eerste wasbeurt met ethanol: Voeg 900 μL gekoelde 70% ethanol toe aan de pellet en meng door de buizen voorzichtig om te keren.
  9. Draai de buizen met dezelfde snelheid als gebruikt in stap 3.6 (15.000 x g of 20.000 x g) gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  10. Verwijder het supernatans door te decanteren.
  11. Tweede ethanolwasbeurt: Voeg 500 μL gekoelde 70% ethanol toe aan de pellet.
  12. Draai de buizen met dezelfde snelheid als gebruikt in stap 3.6 (15.000 x g of 20.000 x g) gedurende 30 minuten bij 4°C. Gooi het supernatans weg door te decanteren.
  13. Keer de buis om en tik zachtjes op tissuepapier om de resterende ethanol te verwijderen door capillaire werking.
  14. Droog de DNA-pellet volledig door de buisjes 5-10 minuten open te houden op een verwarmingsblok bij 37 °C totdat alle ethanol is verdampt.
  15. Resuspendeer de pellet in 20 μl geautoclaveerd dubbel gedestilleerd water.
  16. Meet de concentratie van DNA dat door de verschillende omstandigheden wordt neergeslagen en het 'Input DNA' met behulp van een Nanodrop-spectrofotometer of fluorometer.
  17. Laad het neergeslagen DNA op een 1% agarosegel voor DNA-visualisatie.

  

Resultaten

Opstellen van een protocol voor extractie van DNA met hoge opbrengst uit afvalwatermonsters
Een aangepaste versie van eerder vastgestelde protocollen werd gebruikt voor de extractie van hoogwaardig DNA en RNA uit watermonsters17. De monsters waren afkomstig van open rioleringen en rioolwaterzuiveringsinstallaties in de regio Delhi-NCR in Noord-India. Na voorbewerking met behulp van PEG en NaCl (figuur 1) werden de monsters verwerkt via kits voor extractie van DNA uit grond en water. In alle gevallen werd een prominente band met een hoog moleculair gewicht waargenomen die waarschijnlijk overeenkomt met intracellulair bacterieel DNA en een achtergronduitstrijkje, zoals typerend is voor milieumonsters37 (figuur 2).

Gebrek aan efficiënte DNA-extractie uit afvalwater van rioolwaterzuiveringsinstallaties (STP)
Hoewel een redelijke opbrengst van het totale DNA werd verkregen uit open drains en STP-influenten (tabel 3), kon er geen DNA worden verkregen uit het uiteindelijke behandelde effluent; problemen met een lage opbrengst zijn ook beschreven in eerder werk41 (Figuur 3). Na de behandeling, die chlorering van afvalwater omvat en, in sommige gevallen, zowel UV- als ultrafiltratiebehandelingen42, wordt verwacht dat de microbiële belasting laag zal zijn en dat eventueel achtergebleven DNA (bestaande uit extracellulair en gefragmenteerd DNA) zou worden verdund. De aanvankelijke lage concentratie PEG die wordt gebruikt in monsterconcentratie en nucleïnezuurprecipitatie zou mogelijk DNA met een laag moleculair gewicht kunnen uitsluiten. Met andere woorden, het gefragmenteerde DNA kan verloren gaan in de eerste concentratiestap.

Toenemende concentraties van PEG en NaCl leiden tot de precipitatie van DNA met een lager moleculair gewicht
Om te testen of het verhogen van de PEG-concentratie helpt bij het verrijken van DNA met een lager moleculair gewicht, werd een laboratoriumstandaard van PCR-fragmenten van verschillende lengtes gegenereerd, waardoor een reeks lineaire DNA-fragmenten ontstond (Figuur 4). De norm werd onderworpen aan vier verschillende neerslagomstandigheden: 9% PEG-8000 + 0,3 M NaCl (de oorspronkelijke combinatie), 9% PEG-8000 + 1,2 M NaCl (alleen rijszout), 30% PEG-8000 + 0,3 M NaCl (alleen opvoerbare PEG) en 30% PEG-8000 + 1,2 M NaCl (verhogen van zowel zout als PEG). De voorwaarden werden gekozen op basis van het standaardprotocol dat wordt gebruikt voor SARS-CoV-2-surveillance17 en op basis van omstandigheden die werden gerapporteerd in een onderzoek naar modulaire methoden voor DNA-extractie uit milieumonsters33. Twee verschillende centrifugatiesnelheden - 15.000 x g en 20.000 x g - werden gebruikt op basis van de effecten van differentiële snelheden op DNA-pelleting43. Bij het verhogen van de PEG- en NaCl-concentraties tot respectievelijk 30% en 1,2 M, nam het totale herstel van DNA met ongeveer 70% toe en werden DNA-fragmenten zo klein als 150 basenparen (bp) effectief neergeslagen (Figuur 5). Het verschil in snelheid had niet veel effect op de opbrengst (figuur 6A) en kan te wijten zijn aan de lange centrifugetijd die werd gebruikt. Aangezien het totale DNA-herstel lager was in de oorspronkelijke PEG/NaCl-combinatie, was het mogelijk dat lagere molecuulgewichtbanden, hoewel aanwezig, zich in een concentratie onder de visualisatielimiet bevonden. Om dit te testen, werd de hoeveelheid input-DNA voor precipitatie verhoogd en werd een overmaat aan DNA dat overeenkomt met elke behandeling (1,5 mg) op de agarosegel geladen voor visualisatie. Alleen de behandeling met 30% PEG vertoonde een goed herstel van het laagste molecuulgewicht, d.w.z. de band van 150 bp (figuur 6B).

Precipitatie van circulair DNA (bacterieel genoom- en plasmide-DNA) volgt niet dezelfde trend
E. coli MG155 genoom-DNA en plasmide (pRSV, ~4 kb) werden gebruikt voor precipitatie met verschillende PEG- en NaCl-concentraties. In tegenstelling tot lineair DNA was er geen significant effect van het verhogen van PEG- en NaCl-niveaus (Figuur 7), wat suggereert dat de opbrengsten van circulair DNA en DNA met een hoog moleculair gewicht (meestal intracellulair DNA) niet worden beïnvloed door het verhogen van PEG. Dit in tegenstelling tot eerdere waarnemingen met eiwitprecipitatie44, waarbij de oplosbaarheid sterk afnam met de PEG-concentratie. Aangezien PEG werkt als een verdringingsmiddel, wordt verondersteld dat het oppervlak van het macromolecuul dat beschikbaar is voor interactie een belangrijke rol speelt in de effectiviteit ervan als precipitatiemiddel. Met lineair DNA is het, naarmate de grootte toeneemt, redelijk om te veronderstellen dat het gebied dat beschikbaar is voor interactie ook toeneemt. Met circulair DNA is het mogelijk dat lage PEG-concentraties al voldoende zijn om het molecuul te verzadigen, en het verder verhogen van de concentratie vergroot het effectieve oppervlak voor interactie mogelijk niet.

Slechte opbrengst van DNA uit afvalwater bij voorbewerking van precipitatie met PEG en NaCl wordt weggelaten
Om te testen of de voorbehandeling van afvalwater cruciaal is voor DNA-extractie, werd 20 ml warmte-geïnactiveerd (70 °C, 4 uur) afvalwater verrijkt met 10 mg eerder bereide lineaire standaard en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C (a) zonder PEG + NaCl, (b) met 9% PEG + 0,3 M NaCl (originele combinatie) en (c) met 20% PEG + 1,2 M NaCl (verhoogde PEG en zout). De monsters werden vervolgens verwerkt via de grondkit voor DNA-extractie, zoals uitgelegd in het protocol. Het bleek dat het rendement van geëxtraheerd DNA met 60% toeneemt bij voorverwerking van afvalwatermonsters met 9% PEG + 0,3 M NaCl in vergelijking met geen voorbewerkingsstap (Figuur 8), wat aangeeft dat voorverwerking van PEG- en NaCl-precipitatie van vitaal belang is om DNA met een hoge opbrengst uit afvalwatermonsters te verkrijgen. Het is ook opmerkelijk dat hoewel de totale DNA-opbrengst, inclusief genoom-DNA met een hoog moleculair gewicht (gDNA), lager is wanneer hoge PEG en zout worden gebruikt voor precipitatie, het aandeel DNA met een lager moleculair gewicht wordt verrijkt (Figuur 8). De afname van de totale opbrengst bij het verhogen van PEG en zout kan worden toegeschreven aan de zeer stroperige aard van PEG, wat kan leiden tot verlies van DNA-pellet tijdens het verwijderen van het supernatant. Dit versterkt de argumenten voor de voorgestelde stapsgewijze DNA-extractiemethode (figuur 9), waarbij DNA met een hoog moleculair gewicht eerst kan worden geëxtraheerd met behulp van lage PEG- en NaCl-precipitatie, en het resulterende supernatans kan worden onderworpen aan een nieuwe ronde van voorbewerking met verhoogde PEG en NaCl om het DNA met een laag moleculair gewicht dat aan de eerste precipitatieronde is ontsnapt, efficiënt te extraheren.

figure-results-1
Figuur 1: Voorbewerking van afvalwatermonsters. Schema met de workflow van monsterafname tot DNA-extractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Typisch gelprofiel van DNA geëxtraheerd uit afvalwatermonsters. Een volume van 50-100 ml (zoals aangegeven in de figuur) afvalwater dat op verschillende locaties werd bemonsterd, werd gedurende 4 uur door incubatie bij 70 °C met warmte geïnactiveerd. Het werd vervolgens 's nachts bij 4 °C geïncubeerd met 9% PEG en 0,3 M NaCl en vervolgens verwerkt om DNA te extraheren met behulp van aarde of een waterkit. Ongeveer 150 ng van het totale geëxtraheerde DNA werd geladen op een 1% agarosegel samen met een ladder van 1 kilo-basenparen (kb) als marker en onderworpen aan elektroforese (90 V, 30 min). DNA werd gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht met behulp van de kleurstof SYBR SAFE. De tabel aan de rechterkant geeft details over de bronnen van monsterverzameling, de hoeveelheid verwerkt afvalwater en de kit die wordt gebruikt voor DNA-extractie voor elke baan. (STP: rioolwaterzuiveringsinstallatie; UVR: Ultraviolette straling) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: STP-effluentmonsters laten slechte totale DNA-opbrengsten zien. Een volume van 40 ml afvalwater bemonsterd uit STP-influent en effluent werd door incubatie bij 70 °C gedurende 4 uur door warmte geïnactiveerd. Het werd vervolgens 's nachts bij 4 °C geïncubeerd met 9% PEG en 0,3 M NaCl en vervolgens verwerkt om DNA te extraheren met behulp van een grond- of waterkit of een bacteriële genomische DNA-extractiekit. Ongeveer 150 ng van het totale geëxtraheerde DNA werd geladen op een 1% agarosegel samen met een ladder van 1 kb als marker en onderworpen aan elektroforese (90 V, 30 min). DNA werd gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht met behulp van de kleurstof SYBR SAFE. De concentratie van geëxtraheerd DNA voor de effluentmonsters was lager dan 1 ng/ml afvalwater en kon daarom niet worden gevisualiseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Genereren van een lineaire DNA-groottestandaard om de werkzaamheid van DNA-precipitatie met een laag moleculair gewicht te testen. Vijf DNA-fragmenten van verschillende grootte werden gegenereerd door PCR-amplificatie met behulp van E. coli (MG1655) genoom-DNA als sjabloon en primers en aandoeningen zoals beschreven in Tabel 2. DNA gezuiverd (~1 μg) met de PCR-zuiveringskit werd op een 1% agarosegel geladen samen met een ladder van 1 kb als marker en onderworpen aan elektroforese (90 V, 40 min). DNA werd gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht met behulp van de kleurstof SYBR SAFE. De banen worden gelabeld met gennamen waaruit het fragment is geamplificeerd en de verwachte amplicongrootte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: DNA met een laag moleculair gewicht wordt alleen efficiënt teruggewonnen bij de hoogste (30%) PEG-concentratie. Input-DNA (3,34 μg) van de eerder gegenereerde groottestandaard werd behandeld met verschillende combinaties van PEG en NaCl zoals aangegeven in de figuur en geëxtraheerd zoals gedetailleerd in het protocol. De gebruikte centrifugatiesnelheid was 15.000 x g. Voor Input (baan 3) en 1,2 M NaCl + 30% PEG (baan 7) werd 0,8 μg DNA op de gel geladen. Voor het overige, aangezien de totale opbrengst laag was, werd de totale hoeveelheid DNA geëxtraheerd in 16 μL geladen en werd 1 kb ladder als groottemarker op een 1% agarosegel geladen en onderworpen aan elektroforese (80 V, 45 min). DNA werd gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht met behulp van de kleurstof SYBR SAFE. Het witte vak markeert de laagste band van 150 bp. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Het herstel van DNA met een laag moleculair gewicht wordt bepaald door hoge PEG in plaats van hoge zoutconcentraties. (A) Input-DNA (14 μg) van de groottestandaard werd behandeld met verschillende combinaties van PEG en NaCl, zoals aangegeven in de figuur, en geëxtraheerd met behulp van ethanolprecipitatie zoals beschreven in het protocol. De gebruikte centrifugatiesnelheid was 15.000 x g en 20.000 x g, zoals aangegeven in de figuur. De volledige hoeveelheid input-DNA en geëxtraheerd DNA, samen met een ladder van 1 kb, werd op een 1% agarosegel geladen en onderworpen aan elektroforese (90 V, 30 min). DNA werd gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht met behulp van de kleurstof SYBR SAFE. (B) Input-DNA (15,67 μg) van de eerder gegenereerde groottestandaard werd behandeld met verschillende combinaties van PEG en NaCl, zoals aangegeven in de figuur, en geëxtraheerd zoals gedetailleerd in het protocol. De gebruikte centrifugatiesnelheid was 15.000 x g. Geëxtraheerd DNA (1,5 μg) werd in elke baan geladen en een ladder van 1 kb werd als groottemarker op een 1% agarosegel geladen en onderworpen aan elektroforese (80 V, 45 min). DNA werd gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht met behulp van de kleurstof SYBR SAFE. Het witte vak markeert de laagste band van 150 bp. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Het herstel van genomisch DNA en plasmide-DNA wordt niet significant beïnvloed door een toenemende PEG- en NaCl-concentratie. Input-DNA (9 μg; 4,5 μg plasmide en 4,5 μg genomisch DNA) werd behandeld met verschillende combinaties van PEG en NaCl zoals aangegeven in de figuur en geëxtraheerd zoals beschreven in het protocol. De gebruikte centrifugatiesnelheid was 15.000 x g. De volledige hoeveelheid input-DNA en geëxtraheerd DNA, samen met een ladder van 1 kb, werd op een 1% agarosegel geladen en onderworpen aan elektroforese (90 V, 45 min). DNA werd gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht met behulp van de kleurstof SYBR SAFE. De witte vakjes geven het genoom-DNA en plasmide-DNA aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Voorbewerking van precipitatie met PEG en NaCl is cruciaal voor hoogrenderende extractie van DNA uit afvalwater. Warmte-geïnactiveerd (70 °C, 4 uur) afvalwater (20 ml) werd verrijkt met 10 mg eerder bereide lineaire standaard en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C zonder PEG en NaCl of variërende PEG- en NaCl-concentraties zoals aangegeven in de figuur. Het werd vervolgens verwerkt om DNA te extraheren met behulp van een grondkit. Input-DNA (4 μg) gebruikt voor spiking (baan 1) en DNA geëxtraheerd (4 μg) met een voorbewerkingsstap van 9% PEG + 0,3 M NaCl (baan 3) werd op een 1% agarosegel geladen. Voor de rest van de omstandigheden werd de volledige hoeveelheid geëxtraheerd DNA op de gel geladen, aangezien de opbrengst laag was. Een ladder van 1 kb werd ook geladen als maatmarkering. De gel werd onderworpen aan elektroforese (70 V, 2 uur). DNA werd gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht met behulp van de kleurstof SYBR SAFE. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Voorgestelde stapsgewijze methode van DNA-extractie uit afvalwater om zowel DNA met een hoog als een laag moleculair gewicht te verrijken. Stroomdiagram met een tweestapsmethode voor DNA-extractie uit afvalwater met een eerste voorbewerkingsstap met behulp van een lage PEG- en NaCl-concentratie. Het supernatans uit de eerste stap wordt onderworpen aan een nieuwe ronde van voorbewerkingsprecipitatie met verhoogde PEG en NaCl om zowel DNA met een hoog als een laag moleculair gewicht effectief uit afvalwater te extraheren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Eerder gebruik van PEG en NaCl in onderzoeken voor DNA-extractie uit milieumonsters. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2. Primersequenties en PCR-condities voor standaardgeneratie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3. DNA-opbrengst en -kwaliteit verkregen uit afvalwatermonsters over een periode van twee maanden in 2023. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

AMR staat tegenwoordig in de top 10 van gezondheidsbedreigingen, zoals vermeld door de WHO, en milieutoezicht op AMR wordt over de hele wereld erkend als een belangrijk hulpmiddel. Zoals vermeld in de inleiding, omvat een uitgebreid verslag van AMR in de omgeving DNA met een laag moleculair gewicht, gefragmenteerd en extracellulair DNA. Het hier gerapporteerde voorbewerkingsprotocol met behulp van een hoge concentratie PEG in combinatie met zout (30% PEG en 1,2 M NaCl) bereikt dit resultaat door het aandeel DNA met een laag moleculair gewicht te verrijken zonder de extractie van fracties met een hoger molecuulgewicht (grotendeels genoom- en plasmide-DNA) te beïnvloeden. Dit in tegenstelling tot eerdere concentratiemethoden met een lagere PEG en directe kitprotocollen (zonder voorbewerking), die omslachtig zijn vanwege de noodzaak om grote volumes te verwerken. Voorbewerking met lagere PEG-concentraties was inefficiënt in het terugwinnen van DNA met een laag moleculair gewicht ('laag' verwijst hier naar DNA-banden onder de 600 bp). Wanneer er geen PEG wordt gebruikt tijdens de voorbewerking, is de DNA-extractie slecht, wat resulteert in slechts 10% van het input-DNA dat wordt teruggewonnen, in tegenstelling tot 70% wanneer PEG en NaCl worden gebruikt (Figuur 8). Naast de toevoeging van PEG en NaCl is een andere belangrijke stap het verwijderen van resterende ethanol na DNA-extractie uit de kit om zuiver DNA te krijgen voor stroomafwaartse verwerking. Het is belangrijk om het initiële volume water te bepalen dat nodig is om een totale hoeveelheid van ten minste ~300 ng tot 5 mg DNA in een volume van 30-50 ml bij elutie te krijgen. In tegenstelling tot 1 L of meer water dat doorgaans wordt verwerkt voor DNA-extractie uit afvalwater27,41, bleek dat met de hier voorgestelde voorverwerkingsstap slechts 27,5-40 ml voldoende is om DNA van hoge kwaliteit te krijgen voor stroomafwaartse verwerking. Afvalwater bevat ook deeltjes en organisch materiaal, dat geadsorbeerde bacteriële cellen en extracellulair DNA kan bevatten. Daarom is de desorptie van cellen en DNA die gepaard gaat met cellyse een belangrijke stap om de DNA-opbrengst te verhogen. Hoge PEG-concentraties maken het monster stroperig en kunnen de lysis- en desorptiestappen voor DNA-extractie belemmeren, zoals eerder vermeld. Om dit te voorkomen is een stapsgewijze methode van DNA-extractie voorgesteld, zoals uiteengezet in het stroomschema (figuur 9). Deze methode zal nuttig zijn bij het extraheren van zowel intracellulair DNA met een hoog moleculair gewicht (Figuur 7) als extracellulair gefragmenteerd en circulair DNA met een laag moleculair gewicht.

Een huidige beperking van dit protocol in termen van kosten is de voortdurende verwerking van verrijkt DNA met een laag moleculair gewicht door middel van een kit voor het verbeteren van de kwaliteit. Deze beperking kan mogelijk worden omzeild met behulp van andere methoden voor het opschonen van DNA, zoals fenol-chloroform-extractie. Een andere praktische beperking is het hanteren van hoge PEG-concentraties, aangezien de pellet verloren kan gaan door de hoge viscositeit van de oplossing. Momenteel wordt de voorbewerking met behulp van PEG en NaCl uitgevoerd, gevolgd door een aangepaste versie van een bestaand kitprotocol, d.w.z. dat de kit nog steeds wordt gebruikt voor de uiteindelijke DNA-zuivering. Een kitvrije zuivering van DNA, die een hoge DNA-opbrengst geeft maar van een lage zuiverheid (hier niet gerapporteerd), wordt geoptimaliseerd om de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA te verbeteren. Vanwege de stroperige aard van PEG-oplossingen moet worden gestreefd naar een optimale PEG-concentratie die een volledig scala aan DNA-groottes kan opleveren en toch comfortabel kan worden gehanteerd. Het verlagen van de concentratie tot 20% (figuur 6B) leverde een resultaat op dat gelijk was aan de extractie-efficiënties van lage (9%) en hoge (30%) PEG; Dit kan de moeite waard zijn om in toekomstige werkzaamheden een vervolg te geven.

PEG wordt routinematig gebruikt tijdens verschillende stappen van DNA-extractie uit omgevingsmonsters. Het gebruik van PEG is echter niet gestandaardiseerd voor DNA-extractie in het kader van AMR-surveillance. Afvalwaterbewaking omvat de detectie van antimicrobiële resistentie in veel verschillende niches, waaronder STP's (influent en effluent) en open en gesloten afvoeren 8,27. Hoewel de informatie over AMR in het influent cruciale informatie verschaft over de resistentie die in de gemeenschap circuleert, is de aanwezigheid van AMR-genen in het effluent even belangrijk om het ontstaan van resistentie-uitbraken te meten en mogelijk te voorspellen. Effluentmonsters hebben doorgaans een lage microbiële belasting, aangezien de meeste cellen tijdens het behandelingsproces worden gedood, wat resulteert in een zeer lage cellulaire DNA-opbrengst. Effluenten bevatten echter extracellulair vrij zwevend DNA dat bestaat uit zowel genoom-DNA met een hoog moleculair gewicht als plasmide met een laag moleculair gewicht, fagemiden en gefragmenteerd DNA. AMR-genen die aanwezig zijn in DNA met een laag moleculair gewicht (zowel gefragmenteerd als plasmide/faagimiden) kunnen worden overgedragen naar de resterende levende cellen in het effluent, wat leidt tot de verspreiding van resistentie 30,41,45. Daarom is het belangrijk om extracellulair DNA met een laag moleculair gewicht in afvalwater te detecteren. Andere methoden die worden gebruikt voor DNA-extractie uit afvalwater bij de beoordeling van AMR garanderen doorgaans geen initiële verrijking van DNA met een laag moleculair gewicht. Deze benadering van DNA-extractie uit afvalwater kan worden gebruikt om informatie te verschaffen over een alomvattend weerstandsvermogen van het milieu.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We erkennen de financiële steun van de Rockefeller Foundation (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) als onderdeel van het APSI India-team (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). We zijn ook dankbaar voor de financiële steun van Axis Bank bij het ondersteunen van dit onderzoek en de Trivedi School of Biosciences aan de Ashoka University voor apparatuur en andere ondersteuning.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-seat microcentrifugeEppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Bench top refrigerated centrifugeEppendorf Centrifuge 5920 REP5948000131
ChemiDoc Imaging SystemBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/& ;micro;L + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mLTarsons510051
Molecular Biology Grade Water for PCRHiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi)ThermofisherQ33238
Qubit Assay TubesThermofisherQ32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad rangeThermo ScientificQ32853 (500 assays)
Sodium ChlorideHiMediaTC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)Applied Biosystems4484073
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1125

Referenties

  1. Kirby, A. E., et al. Using wastewater surveillance data to support the COVID-19 response - United States, 2020-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 70 (36), 1242-1244 (2021).
  2. Amman, F., et al. Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-COV-2 at national scale. Nat Biotechnol. 40 (12), 1814-1822 (2022).
  3. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  4. The L. Antimicrobial resistance. The L. Antimicrobial resistance: Time to repurpose the global fund. Lancet. 399 (10322), 335(2022).
  5. Munk, P., et al. Genomic analysis of sewage from 101 countries reveals global landscape of antimicrobial resistance. Nat Commun. 13 (1), 7251(2022).
  6. Parnanen, K. M. M., et al. Antibiotic resistance in European wastewater treatment plants mirrors the pattern of clinical antibiotic resistance prevalence. Sci Adv. 5 (3), 9124(2019).
  7. Grenni, P. Antimicrobial resistance in rivers: A review of the genes detected and new challenges. Environ Toxicol Chem. 41 (3), 687-714 (2022).
  8. Siri, Y., Precha, N., Sirikanchana, K., Haramoto, E., Makkaew, P. Antimicrobial resistance in southeast Asian water environments: A systematic review of current evidence and future research directions. Sci Total Environ. 896, 165229(2023).
  9. Hunter, P. R., Macdonald, A., Carter, R. C. Water supply and health. PLoS Med. 7 (11), e1000361(2010).
  10. Bain, R., et al. Fecal contamination of drinking-water in low- and middle-income countries: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 11 (5), e1001644(2014).
  11. Collignon, P., Beggs, J. J., Walsh, T. R., Gandra, S., Laxminarayan, R. Anthropological and socioeconomic factors contributing to global antimicrobial resistance: A univariate and multivariable analysis. Lancet Planet Health. 2 (9), e398-e405 (2018).
  12. Asghar, H., et al. Environmental surveillance for polioviruses in the global polio eradication initiative. J Infect Dis. 210, Suppl 1 S294-S303 (2014).
  13. Gracia-Lor, E., Rousis, N. I., Hernandez, F., Zuccato, E., Castiglioni, S. Wastewater-based epidemiology as a novel biomonitoring tool to evaluate human exposure to pollutants. Environ Sci Technol. 52 (18), 10224-10226 (2018).
  14. Choi, P. M., et al. economic correlates of food and chemical consumption measured by wastewater-based epidemiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21864-21873 (2019).
  15. Hemalatha, M., et al. Surveillance of SARS-COV-2 spread using wastewater-based epidemiology: Comprehensive study. Sci Total Environ. 768, 144704(2021).
  16. Westhaus, S., et al. Detection of sars-cov-2 in raw and treated wastewater in Germany - suitability for COVID-19 surveillance and potential transmission risks. Sci Total Environ. 751, 141750(2021).
  17. Lamba, S., et al. SARS-COV-2 infection dynamics and genomic surveillance to detect variants in wastewater - a longitudinal study in Bengaluru, India. Lancet Reg Health Southeast Asia. 11, 100151(2023).
  18. Stockdale, S. R., et al. RNA-seq of untreated wastewater to assess COVID-19 and emerging and endemic viruses for public health surveillance. Lancet Reg Health Southeast Asia. 14, 100205(2023).
  19. Bengtsson-Palme, J., et al. Towards monitoring of antimicrobial resistance in the environment: For what reasons, how to implement it, and what are the data needs. Environ Int. 178, 108089(2023).
  20. Bengtsson-Palme, J., Kristiansson, E., Larsson, D. G. J. Environmental factors influencing the development and spread of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 42 (1), 053(2018).
  21. Dunachie, S. J., Day, N. P., Dolecek, C. The challenges of estimating the human global burden of disease of antimicrobial resistant bacteria. Curr Opin Microbiol. 57, 95-101 (2020).
  22. Hughes, D., Andersson, D. I. Evolutionary trajectories to antibiotic resistance. Annu Rev Microbiol. 71, 579-596 (2017).
  23. World Health Organization. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (GLASS). World Health Organization. , (2022).
  24. Walia, K., et al. Establishing antimicrobial resistance surveillance & research network in india: Journey so far. Indian J Med Res. 149 (2), 164-179 (2019).
  25. Hart, A., Warren, J., Wilkinson, H., Schmidt, W. Environmental surveillance of antimicrobial resistance (AMR), perspectives from a national environmental regulator in 2023. Euro Surveill. 28 (11), (2023).
  26. Huijbers, P. M. C., Flach, C. F., Larsson, D. G. J. A conceptual framework for the environmental surveillance of antibiotics and antibiotic resistance. Environ Int. 130, 104880(2019).
  27. Liguori, K., et al. Antimicrobial resistance monitoring of water environments: A framework for standardized methods and quality control. Environ Sci Technol. 56 (13), 9149-9160 (2022).
  28. Hayward, C., Ross, K. E., Brown, M. H., Whiley, H. Water as a source of antimicrobial resistance and healthcare-associated infections. Pathogens. 9 (8), 667(2020).
  29. Booton, R. D., et al. One health drivers of antibacterial resistance: Quantifying the relative impacts of human, animal and environmental use and transmission. One Health. 12, 100220(2021).
  30. Sivalingam, P., Pote, J., Prabakar, K. Extracellular DNA (eDNA): Neglected and potential sources of antibiotic resistant genes (ARGs) in the aquatic environments. Pathogens. 9 (11), 874(2020).
  31. Woegerbauer, M., Bellanger, X., Merlin, C. Cell-free DNA: An underestimated source of antibiotic resistance gene dissemination at the interface between human activities and downstream environments in the context of wastewater reuse. Front Microbiol. 11, 671(2020).
  32. Kittredge, H. A., Dougherty, K. M., Evans, S. E. Dead but not forgotten: How extracellular DNA, moisture, and space modulate the horizontal transfer of extracellular antibiotic resistance genes in soil. Appl Environ Microbiol. 88 (7), 0228021(2022).
  33. Lever, M. A., et al. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front Microbiol. 6, 476(2015).
  34. Lis, J. T., Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2 (3), 383-389 (1975).
  35. He, Z., Zhu, Y., Gu, H. A new method for the determination of critical polyethylene glycol concentration for selective precipitation of DNA fragments. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (20), 9175-9183 (2013).
  36. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. Biotechniques. 49 (3), 631-640 (2010).
  37. Arbeli, Z., Fuentes, C. L. Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples. FEMS Microbiol Lett. 272 (2), 269-275 (2007).
  38. Verma, S. K., Singh, H., Sharma, P. C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 7 (3), 171(2017).
  39. Narayan, A., Jain, K., Shah, A. R., Madamwar, D. An efficient and cost-effective method for DNA extraction from athalassohaline soil using a newly formulated cell extraction buffer. 3 Biotech. 6 (1), 62(2016).
  40. Sapula, S. A., Whittall, J. J., Pandopulos, A. J., Gerber, C., Venter, H. An optimized and robust peg precipitation method for detection of sars-cov-2 in wastewater. Sci Total Environ. 785, 147270(2021).
  41. Calderon-Franco, D., Van Loosdrecht, M. C. M., Abeel, T., Weissbrodt, D. G. Free-floating extracellular DNA: Systematic profiling of mobile genetic elements and antibiotic resistance from wastewater. Water Res. 189, 116592(2021).
  42. Sangamnere, R., Misra, T., Al Bherwani, H. E. t A critical review of conventional and emerging wastewater treatment technologies. Sustain Water Resour Manag. 9, 58(2023).
  43. Weiss, N., Heng, S. W., Lim, H. W. Centrifugation at 30,000 x g. in plasmid DNA precipitation allows better recovery rates and shorter centrifugation times. Application note no: 234, Eppendorf. , Available from: https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/157398_Application/Eppendorf_Centrifugation_Application-Note_234_Centrifuge-5430-familiy_Safe-Lock-Tubes_Centrifugation-at-30_000-x-g-plasmid-DNA-precipitation-allows-better-recovery-rates-shorter-centrifug.pdf (2017).
  44. Atha, D. H., Ingham, K. C. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols. Analysis in terms of excluded volume. J Biol Chem. 256 (23), 12108-12117 (1981).
  45. Sivalingam, P., et al. Extracellular DNA includes an important fraction of high-risk antibiotic resistance genes in treated wastewaters. Environ Pollut. 323, 121325(2023).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

DNA extractie uit afvalwaterantimicrobi le resistentiegenenmilieusurveillancepolyethyleenglycol precipitatiehorizontale genoverdrachtmetagenomische analyseDNA zuiveringextracellulair DNANanodrop spectrofotometrie
Verbeterde extractie van DNA met een laag moleculair gewicht uit afvalwater voor uitgebreide beoordeling van antimicrobiële resistentie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.